Summary
Este artículo describe una metodología detallada del uso de un caucho de silicón radiopaco con base de plomo para inundar la vasculatura murina para la cuantificación del diámetro aórtico en un modelo murino de aneurisma aórtico y disección.
Abstract
Disección y aneurisma de aorta se asocia con una morbilidad significativa y mortalidad en la población y puede ser altamente letales. Si bien existen modelos animales de enfermedad aórtica, en vivo las imágenes de la vasculatura ha sido limitada. En los últimos años, micro-automatizado tomografía (micro-CT) se ha convertido en una modalidad preferida para grandes y pequeños vasos de la proyección de imagen en vivo y ex vivo. Junto con un método de riego vascular, hemos utilizado con éxito micro-CT para caracterizar la frecuencia y la distribución de la patología aórtica en ratones C57/Bl6 tratados con β-oxidasa. Limitaciones técnicas de este método incluyen variaciones en la calidad de la perfusión por mala preparación de animales, la aplicación de metodologías adecuadas para la cuantificación del tamaño de buque y la no supervivencia de este procedimiento. Este artículo detalla una metodología para la perfusión intravascular de un caucho de silicón radiopaco con base de plomo para la caracterización cuantitativa de aortopathy en un modelo murino de aneurisma y disección. Además de visualizar patología aórtica, este método puede utilizarse para examinar otras camas vasculares en vivo o vascular camas quitar post mortem.
Introduction
La incidencia de la disección aórtica es de 3 casos por 100.000 por año1. Disección aórtica y aneurisma enfermedades representan más de 10.000 muertes en los Estados Unidos cada año, 1-2% de todas las muertes en los países occidentales2. La disección aórtica se inicia por un desgarro en la capa íntima del vaso con la propagación de la sangre a través de las capas de la pared aórtica en presiones fisiológicas. Presión de pulso elevada de pacientes está asociados con una mayor incidencia de disección y complicaciones. Esfuerzo cortante de pared creciente se asocia con la expansión de la pared aórtica a un aneurysm formación3,4. Las consecuencias de la disección aórtica incluyen la obstrucción del flujo de sangre a órganos distantes como el cerebro, riñones, intestinos y extremidades, la formación de aneurismas crónica, ruptura o muerte5,6,7.
En la actualidad, los procesos bioquímicos y celulares implicados en la iniciación y progresión de los aneurismas aórticos y disecciones son todavía poco conocidos. Modelos animales reproducibles de aneurisma aórtico y disección son clave para comprender su fisiopatología. Β-oxidasa (BAPN) es un inhibidor de oxidasa lisil, que evita que el cross-linking de colágeno y elastina y se ha demostrado para alterar significativamente la estructura de la matriz extracelular de la pared de recipiente y su integridad biomecánica6, 8. Roedores tratados con BAPN se han utilizado como modelo animal común de aneurisma aórtico y disección9,10.
Modalidades de imágenes vasculares son instrumentales en la identificación de patología vascular, confirmar la permeabilidad del vaso y evaluar la perfusión de órganos. Recientemente, la tomografía micro computada (micro-CT) se ha utilizado para el estudio de la vasculatura de ratones y animales de tamaño. A diferencia del hueso, la proyección de imagen axial de los vasos sanguíneos por la tomografía computada es limitada, ya que sangre intraluminal es inherentemente relativamente radiolúcido. Cuando se combina con agentes de contraste intravascular, sin embargo, micro-CT permite reconstrucciones tridimensionales detalladas de vasculatures animal para el estudio de patología vascular anatómica macro11.
El agente de contraste seleccionados (véase la Tabla de materiales) es un caucho de silicón radiopaco que contiene cromato de plomo y sulfato de plomo. En perfusión en presencia de un catalizador, rápidamente se endurece para formar un elenco de la vasculatura con mínimas alteraciones en la arquitectura macro anatómicas de los vasos, hacer la vasculatura altamente radiopaco en contraste con los tejidos de fondo cuando examen radiográfico. Este agente del contraste es ventajoso porque es fácil de manejar y evita la degradación del tejido y pérdida de la nave debido a la fractura a menudo asociado con la corrosión del molde vascular. Como cura con la contracción mínima12, vasos despejados sangre quedan patentes y permiten una evaluación precisa de la macro-vasculatura animal en experimentos de supervivencia no. Trabajo previo ha utilizado goma de silicón radiopaco-contraste en una variedad de estudios en animales. Específicamente, se ha demostrado la aplicabilidad en visualizar las coronarias, glomerular, placenta y las circulaciones cerebral11,12,13,14,15 . En este artículo, detallaremos la metodología de punción ventricular izquierda abierta para la perfusión intravascular del caucho de silicón radiopaco con base de plomo para caracterizar cuantitativamente patología aórtica BAPN-inducida en un modelo de ratón por el micro-CT.
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Protocol
Los protocolos para el manejo de animales fueron aprobados por el cuidado institucional de Animal y uso de la Universidad de Maryland, Baltimore (número de protocolo animal 0116024) y realizados según los estándares de AAALAC International.
1. preparación de reactivos
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Heparina
- Diluya 250 μl de 1000 sulfato de heparina U/mL en 50 mL de fosfato tampón salino para una concentración final de 5 U/mL.
- Caliente la heparinizada (5 U/mL) fosfato tampón salino, que sustituirá a la sangre en la vasculatura en un baño de agua a 37 ° C.
- Preparar la bomba mediante la conexión de la tubería necesaria y vacío de 2 jeringas de 10 mL, 1 para el buffer salina heparinizada y 1 para el agente de contraste.
- Llenar el tubo con el cálido heparinizada tamponada de fosfato salino y eliminar las burbujas de aire en el tubo de la bomba de presión.
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Agente de contraste
Nota: Consulte la Tabla de materiales para los componentes de kit de agente de contraste.- Mezclar un compuesto pigmentado con un diluyente para conseguir un tinte 1:6 al cociente de diluyente.
- Inmediatamente antes de su uso (paso 2.3.12), añadir 200 μL de un agente endurecedor para cada alícuota de 5 mL del compuesto pigmentado diluido y mezclar bien (4% en volumen).
Nota: El fabricante informó que el tiempo de trabajo es de 40 minutos. El agente de contraste de caucho de silicona comienza a polimerizar 20 minutos después de la adición del agente de curado, es importante preparar la solución inmediatamente antes de su infusión.
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Agua potable BAPN
- Β-oxidasa (BAPN) se disuelven en el agua potable para crear una concentración final de 3 g/L (adaptado de protocolos previamente descritos en la literatura)9,16,17.
- Administrar el agua potable que contiene BAPN a un grupo de ratones, una vez que son 4 semanas de edad hasta el momento de la perfusión para micro-CT.
2. quirúrgico
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Preparación de animales
- Destetar a los ratones a las 3 semanas de edad, mantener un ciclo oscuro h 12 h luz/12 y alimentarlos chow roedor estándar. Para el grupo tratado con BAPN, administrar el agua potable BAPN recién preparado para 16-26 semanas ad libitum. Proporcionan que los animales de control con consumo estándar de agua ad libitum.
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Técnica anestésica
Nota: se realiza 24 horas antes el análisis de CT, el siguiente procedimiento. Procedimientos quirúrgicos son promulgados para preparar a la muestra para una perfusión intracardiaca post mortem.- Inducir una anestesia a través de un tanque de inducción con 100% O2 y 3% isoflurano suministra a través de un vaporizador de precisión. Después de la inducción de la anestesia, deje el isoflurano y limpie la cámara con O2. Mantener la anestesia con isoflurano % 2-2.5 y 1 L/min de O2 a través de un cono de nariz.
- Conecte la cámara de inducción y la máscara a un tesoro carbón para adsorción de gases residuales para proteger al personal. Para asegurar un adecuado plano anestésico, demostrando que no hay ninguna respuesta a los estímulos nocivos (pellizco del dedo del pie).
- Preparar un campo operatorio que consiste en una bandeja quirúrgica y el instrumental quirúrgico necesario.
- Transferir el animal al campo quirúrgico y posición de recumbency dorsal.
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Técnica operativa
- Con unas tijeras, hacer una incisión de línea media a través de la piel y tejidos blandos de a medio camino entre la sínfisis púbica a la escotadura esternal, extendiéndose a través de la piel y tejidos blandos que cubren el esternón.
- Usando las tijeras, crear un orificio en el diafragma en el proceso del xiphoid para entrar en la cavidad torácica.
- Utilice tijeras para diseccionar la membrana de la pared ventral del tórax, bilateral.
- Corte a través de los cartílagos costales para separar las costillas el esternón en el borde derecho esternal.
- Se aplica una pinza hemostática fina en la punta del esternón (cerca del proceso xifoides) y mover la pinza cranially por lo que se coloca sobre la cabeza del ratón. Esto retraerá el timo y el esternón lejos del corazón, exponiendo el corazón y grandes recipientes para la manipulación de otros.
- Disecan agudamente cualquier accesorio entre el corazón y la pared torácica.
- Conecte la aguja de calibre 27 IV catéter a una jeringa pre cargada con 10 mL de solución salina heparinizada tamponada de fosfato (5 U/mL) y completar todos los tubos con el tampón para eliminar las burbujas de aire de los tubos de la bomba de presión.
- Tenga cuidado mientras se prepara el líquido de burbujas en la línea de líquido puede impedir el llenado de recipientes más pequeños. Limitar el número de vasos que están dañados durante la preparación del animal, ya que el agente de contraste para escaparse de los vasos de cortado, cambiar el volumen requerido para un llenado completo y la introducción de artefactos en la imagen final.
- Punción del ventrículo izquierdo con una aguja de calibre 27 que se estabiliza con una abrazadera de ángulo recto. Inmediatamente haga una incisión en el ventrículo derecho o vena cava inferior para drenar la solución de heparina y sangre.
Nota: Se utiliza heparina como anticoagulante para evitar que la sangre de la coagulación en los vasos después de la muerte del animal. - Inundar el animal a una velocidad constante de 2 mL por minuto, usando una sola bomba. Observe la palidez visible de los órganos. Continuar la perfusión hasta que la solución de drenaje de la circulación venosa de la sangre (aproximadamente 5-6 mL). Parar la bomba.
- Desconecte el tubo del catéter IV de la jeringa de 10 mL, cuidando de no para alterar la posición de la aguja en el ventrículo izquierdo.
- Inmediatamente después de la completa exsanguinación, separar la solución de agente de contraste en alícuotas de 5 mL y agregue el agente endurecedor en este momento (vea el paso 1.2). Mézclelos bien. Elaboración de 5 mL de la mezcla del agente de contraste en una jeringa de 10 mL y perfusión el animal con él.
- Para un llenado completo de los vasos (arterias y venas), continuar la infusión más allá del punto cuando se ve salir la solución venosa. Buscar signos de una perfusión exitosa incluyendo la visualización de un agente de casting en las arterias coronarias, arterias pulmonares, del intestino y vasculatura hepática.
- El agente de contraste se cura después de aproximadamente 20 minutos a temperatura ambiente. Curado, cosecha los órganos individuales, según sea necesario y fijar en 10% formalina tamponada neutra. Fijar canales todo si las muestras no se utilizan para el día siguiente la exploración micro-CT. Si las canales va a utilizar el día siguiente, colocar en una bandeja de metal y coloque en el refrigerador a 4 ° C para curar durante la noche.
3. micro-exploración del CT y los parámetros
Nota: Los parámetros de adquisición de imagen específica dependerá la máquina en uso.
- Adquirir imágenes de la tomografía computada de la radiografía de cada ratón el día siguiente la perfusión utilizando un tomógrafo micro con una tensión de tubo de rayos x de 55 kVp, una corriente de 150 mA, un factor de ampliación del sistema de 2.19 y CCD cámara pixel binning factor de 2. Esto produce un tamaño de píxeles efectivos de 29 μm.
- Coloque la carcasa del ratón supina sobre la mesa micro-CT escáner y obtener a un scout scan de rayos x.
- El detector de campo de visión de 57,4 mm (axial) x 37,1 mm (transaxial) se centran en el torso a la imagen de toda la longitud de la aorta.
- Adquirir 180 proyecciones de imagen con un incremento de rotación de 2 grados y tiempo por proyección de 2800 ms.
- Reconstruir las imágenes usando un algoritmo modificado de Feldkamp; el tamaño del voxel reconstruido es de 29 x 29 x 29 μm3 (espesor de la rebanada = 29 μm) usando la visualización 3D Multimodal plug-in para el software utilizado aquí.
4. post procesamiento y representación
- Convertir los datos del CT en un formato DICOM usando el software apropiado.
- Analizar las imágenes para identificar si un aneurisma estaba presente. Mida el diámetro del eje menor en el punto más ancho del arco aórtico, aorta torácica, descendente y aorta abdominal como describió anteriormente18 (figura 1).
Nota: En nuestro estudio, imágenes fueron analizadas por dos observadores independientes (uno ciego) utilizando un visor DICOM para identificar si un aneurisma estaba presente. Se midió el diámetro del eje menor en el punto más ancho del arco aórtico, descendente aorta torácica y aorta abdominal como se describió anteriormente19 (figura 1). Significa no aneurismática segmentos arteriales de los ratones no tratados BAPN establecieron diámetros de vaso normal como los valores de edad comparable del control. - Los aneurismas se definen como una dilatación localizada o difusa de los segmentos aórticos para diámetros mayores al 50% del diámetro de referencia. Localizar estos basados en las mediciones anteriores.
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Representative Results
Para evaluar este protocolo, 20 ratones adultos machos, del fondo mixto como se describió anteriormente19 y de 20-30 semanas de edad, con o sin tratamiento BAPN, fueron perfundidos con un caucho de silicón radiopaco con base de plomo (véase el tabla de materiales ) utilizando el protocolo detallado arriba. Experimentaron la exploración micro-CT en el día siguiente (figura 1 y figura 2). No hubo diferencias significativas en la edad de los ratones entre cualquiera de los grupos comparados.
Diámetros de eje menores luego se cuantificaron en estos ratones. El diámetro medio de la aorta ascendente en los ratones tratados con BAPN fue significativamente mayor que la de los controles de edad comparable no tratados (0,56 mm 1.43 vs. 0.93 ± 0,11 mm; p = 0.023, desapareado estudiantes t-test). La inhibición de la lisil oxidasa con BAPN no tuvo un efecto significativo sobre la media descendente diámetros aórticos torácicos o abdominales en comparación con los controles pareados por edad (p > 0,082, desapareado estudiantes t-test, figura 3).
Un aneurisma se define como 1.5 x el diámetro medio del grupo sin tratamiento. Hubo un aumento significativo en el número de ratones con aneurismas en el BAPN tratados, en comparación con los controles sin tratamiento BAPN (50% de lo ratones tratados con BAPN vs. 0% de los ratones no tratados; P = 0,042) por prueba exacta de Fisher. Aneurismas en los ratones tratados con BAPN fueron identificados exclusivamente en la aorta, con la mayoría en la aorta torácica (8 de 10 aneurismas identificados). 4 ratones desarrollaron más 1 aneurisma con BAPN-tratamiento (tabla 1).
Figura 1: imágenes representativas de micro-CT en transversales. A. se trata de una proyección de imagen seccionada transversalmente de los ratones no tratados BAPN. B. se trata de una proyección de imagen seccionada transversalmente de los ratones tratados con BAPN. Las mediciones de diámetro del eje menor se hacen a nivel del arco aórtico.
Figura 2: reconstrucción tridimensional de ratón aneurysm aórtico y disección identificadas por micro-CT. A. se trata de una reconstrucción 3-d representativa de un ratón tratado con BAPN con un aneurisma sacular de aorta abdominal y un aneurisma de arco aórtico. B. este panel demuestra un representante descendente disección aórtica torácica de un ratón tratado con BAPN. El lumen verdadero y falso son separados por la aleta íntima. El lumen verdadero (TL) es el paso normal de la sangre y la falsa luz (FL) es el pasaje recién creado.
Figura 3: efecto del tratamiento con BAPN en diámetros aórticos. Estos paneles muestran el media eje menor diámetros de recipiente medidos por micro-CT en ratones machos BAPN no tratados y tratados con BAPN. Los ratones determinadas que un aneurisma se destacan en rojo. La media del grupo no tratado se representa como una línea de puntos en cada panel. a. se trata del aorta ascendente: arco (arco AAo); 0.93 ± 0.11 frente a 1,43 ± 0,56 mm; p = 0.023. b. se trata de la aorta torácica descendente (DTA); 0,82 ± 0,04 vs 1.11 ± 0,43 mm; p = 0.0817. c. se trata de la aorta abdominal; 0.66 0.11 vs 0,89 ± 0,58 mm; p = 0.296. Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| No BAPN (n = 8) |
BAPN (n = 12) |
|
| Total animales con aneurisma | 0 | 6 * |
| Número total de aneurismas | 0 | 10 |
| ARCO DE AAO | 0 | 5 |
| DTA | 0 | 3 |
| AORTA ABD | 0 | 2 |
Tabla 1. Distribución anatómica de los aneurismas identificados en ratones machos con y sin tratamiento BAPN. Esta tabla muestra la incidencia de aneurismas por micro-CT (n = 20). AAO = aorta ascendente; DTA = descender aorta torácica; AORTA ABD = aorta abdominal. p < 0.05.
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Discussion
Micro-CT en la proyección de imagen puede utilizarse para proporcionar reconstrucciones altamente detalladas y tridimensionales de la patología vascular en modelos animales. Mediante el uso de medios de contraste intravasculares, no mejora los tejidos blandos, como el lumen de un vaso sanguíneo, se pueden distinguir de aquellos que están mejorando. Láser Doppler, microangiography, angiografía por resonancia magnética, histología con microscopia confocal y dos fotones puede utilizarse para evaluar vasculares camas, suelen centran en un área limitada del estudio o se limitan a las evaluaciones de dos dimensiones. Micro-CT proporciona un medio rentable de obtener imágenes detalladas de estructuras vasculares, que pueden ayudar en la obtención de una comprensión de la angiogénesis subyacente y biología vascular. Métodos adicionales de animales pequeños de la proyección de imagen incluyen en vivo micro-TC y angiografía por sustracción digital. Similar a la técnica descrita aquí, en vivo micro-CT se basa en un agente de contraste exógeno para aumentar la resolución. Fenestra VC y Isovue 370 son 2 tales sangre-piscina contraste agentes que están disponibles para micro-CT. ventana VC se ha utilizado y se divulga para tener una mejora media máxima de ~ 620 unidades de Hounsfield en la aorta 20 min tras la inyección de20. Otros agentes de contraste a base de nanopartículas han mostrado potenciales en CT y MRI. La cateterización ventricular izquierda sin necesidad de abrir el pecho es otro método de perfusión de todo ratón para microfilmes que ha sido descrito21. Imágenes por ultrasonido para las medidas longitudinales de un diámetro del vaso son un método final que puede ser utilizado en estudios de supervivencia.
Durante este procedimiento, perfusión adecuada requiere un alto grado de atención a los detalles. Es importante que la vasculatura que se exsanguinated completamente antes de la perfusión con un agente de contraste. Si el hígado no blanch y mantiene su color rojo oscuro, más lavado con una solución salina heparinizada puede ser necesaria antes de la perfusión con contraste. Exsanguination incompleta de la vasculatura puede afectar la calidad de imagen final, que aparecen como defectos en la vasculatura de relleno o artifactual oclusiones vasculares distales. Además, la inserción de la aguja hacia el ventrículo izquierdo es un procedimiento delicado que puede rasgar la pared ventricular o cortar a través del ventrículo derecho. Si la aguja se inserta en el ventrículo derecho, los pulmones se perfunde rápidamente y se amarilla durante la perfusión, a una incompleta de la perfusión vascular. La ruptura de un vaso es una complicación final que lleva a una perfusión incompleta. La posibilidad de una ruptura de un vaso puede ser minimizada por asegurar un drenaje adecuado de la circulación venosa antes de iniciar la perfusión a través del árbol arterial. Inyección retrógrada es un método alternativo para perfundiendo un lecho vascular, que anteriormente se ha descrito a la imagen de la vasculatura coronaria11. Elegimos un método anterógrado de perfusión ya que representa más exactamente flujo sanguíneo fisiológico en la aorta torácica y abdominal. La calidad de la imagen obtenida con micro-CT en limitar la capacidad de evaluar la aorta para trombo intramural o hematoma. Sin embargo, el tejido blando se puede visualizar muy bien dependiendo de cómo se formula el protocolo TAC. Para nuestros estudios, nos dimos cuenta de los segmentos de la aorta con el relleno de defectos probablemente debido a la estenosis del trombo intraluminal. La técnica descrita es mejor para evaluar el espacio intravascular.
En Resumen, este protocolo proporciona una técnica segura para la exploración de alta resolución de la vasculatura de un modelo murino de aneurisma aórtico y disección. Análisis cuantitativo puede lograrse fácilmente mediante micro-CT en imágenes, que son capaces de proporcionar un molde exacto de la vasculatura. A los efectos de los experimentos ilustrados en esta publicación, hemos optado por medir el diámetro aórtico mayor para imitar la medida de los aneurismas aórticos en la práctica clínica. Una combinación de rebanada ubicación distancias y puntos de referencia anatómicos puede ser utilizada para medir segmentos específicos de la aorta si procede. También está demostrado que la vasculatura animal inundada puede ser reflejada y digitalmente separada del fondo esquelético a la cantidad deseada para crear una representación tridimensional de los vasos sanguíneos principales y sus ramas distales más pequeños. Este protocolo preserva los tejidos vasculares de interés, que puede ser embebido en parafina y utilizado para secciones histológicas para la examinación adicional.
Micro-CT es una modalidad prometedora proyección de imagen para el estudio de la biología vascular. Con su alta resolución espacial, ofrece una oportunidad para evaluar la estructura, organización y patología de los vasos sanguíneos. El procedimiento descrito en este manuscrito requiere de múltiples habilidades y técnicas incluyendo manejo de animales, preparación, adquisición de imágenes y la cuantificación de los resultados. Este artículo ha demostrado exitosamente una aplicación de la perfusión vascular para identificar aortopathies en ratones. Se necesitan estudios adicionales para evaluar su aplicabilidad en otros modelos animales y procesos de la enfermedad.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Mark Smith por su ayuda con la proyección de imagen radiográfica. Este trabajo es apoyado por la concesión de T32 de NIH para la investigación interdisciplinaria en la enfermedad Cardiovascular (BOA), la Asociación Americana de corazón (SMC) y la subvención NIH del R35 (DKS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microfil | Flow Tech, Inc | MV-122 | We use yellow, a different color can be ordered as desired. Kit includes MV-Compound, MV-Diluent, and MV-Curing Agent. |
| Heparin (1000 U/mL) | Sagent Pharmaceuticals | 25021-400-10 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CV | |
| Isoflurane | Vet One, MWI | 502017 | |
| 3-Aminopropionitrile fumarate salt | Sigma-Aldrich | A3134 | |
| Single syringe pump | Fisher Scientific | 14-831-200 | |
| 27-gauge scalp vein set needle | Exel Int | 26709 | 27G x 3/4", 12" tube |
| Inveon Micro-CT scanner | Siemens Medical Solutions | ||
| Osirix MD | Pimxmeo SARL | Version 8.0.2 | |
| Inveon Research Workplace | Siemens Medical Solutions | Version 4.2 | |
| Rodent Chow | Harlan Teklad | 2018sx |
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