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Medicina

開発とマウス免疫寛容樹状細胞の機能解析

Published: May 18, 2018
doi:
10.3791/57637
, ,
1Department of Biochemistry, School of Medicine,Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology,Case Western Reserve University, 3Angie Fowler Cancer Institute, Rainbow Babies & Children’s Hospital,University Hospitals, Cleveland

Summary

ここでは、開発し免疫寛容樹状細胞 (TolDCs) の特徴し、その免疫療法の有用性を評価するためのプロトコルを提案する.

Abstract

外国の抗原に対する調整の応答のタイトなバランスを維持することによって免疫システムが作動して共生生物に由来する抗原と同様に自己抗原に対する応答のない状態を維持します。この免疫恒常性の中断は、慢性炎症、自己免疫疾患の開発につながることができます。樹状細胞 (Dc) は、外国の抗原に対する免疫応答を開始するナイーブ T 細胞を活性化に関与する生得の免疫組織のプロフェッショナルな抗原提示細胞です。しかし、Dc は行動を維持し T 細胞寛容を促進し、どちらか自己免疫または慢性炎症状態の発展に貢献するエフェクター細胞を抑制する TolDCs にも区別できます。TolDCs の私達の理解の最近の進歩は、その分化条件を調節することによって DC 耐性が得られることを示唆しています。この現象は、多数の免疫疾患で免疫寛容を破る原因の TolDC 療法の開発の途方もない成長につながっています。臨床免疫マウスモデルで成功した研究はさらに自己免疫疾患の治療に TolDCs の免疫療法の有用性を検証しました。今日、TolDCs 防御免疫をそのまま残しながら病原性自己免疫反応をターゲットに様々 な免疫疾患における免疫寛容を回復のための診療所で有望な免疫療法のツールとなっています。TolDCs を誘導するために複数のラボで戦略の配列が提案されているが、これらの細胞の機能的な細胞の表現型を特徴付けることは一貫性はありません。このプロトコルは、大量合成部の 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic と TolDCs にそれらを区別するために使用される一意のメソッド内の骨髄由来の Dc の開発のステップ バイ ステップ ガイドを提供します酸-フッ素-プロピル-アミド (CDDO DFPA)、および TolDCs の必須の分子シグネチャの分析を含む、彼らの表現型を確認するための技術。最後に、我々 は多発性硬化症の前臨床モデルでの免疫応答の in vitroとin vivoのテストで TolDC 関数を評価する手法を示す.

Introduction

樹状細胞 (Dc) 生来の免疫システムの不可欠な部分し最初発見され1主プロフェッショナルな抗原提示細胞として、1973 年にラルフ ・ スタインマンと Zanvil コーンによって特徴付けられます。Dc リンク自然免疫と適応免疫システム2に二次リンパ器官の T 細胞と B 細胞で主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) に処理された抗原提示することで免疫活性化に重要な役割を果たすことが示されています。哺乳類の免疫系に骨髄の Dc、Dc (Pdc)3形質としてされている Dc の少なくとも 2 つのカテゴリがあります。従来の Dc (cDCs) CD11c 表現によって特徴付けられる未熟な Dc (Idc)体外骨髄前駆細胞や末梢血単球を用いたからと区別することができますと呼ばれ、また、骨髄性の Dc顆粒球マクロファージ ・ コロニー刺激因子 (GM-CSF) と IL-4 マウスや人間種、それぞれ4で。

『 危険 』 を活性化信号を病原体関連分子パターン (種緑化) または損傷関連分子パターン (湿気がある)、様々 なパターン認識受容体結合を介して成熟した Dc (Mdc) として免疫原性 Dc に向けて Idc 成熟をドライブするなど、DC の表面5。さらに免疫原性 Dc プライム ナイーブ T 細胞の増殖・分化アップレギュレーションを介して MHCII2、共刺激リガンド (CD80、CD86、CD40)6サイトカイン、その他水溶性メディエーター7。免疫原性 DCs からプロ炎症性仲介人の生産のカスケードは、サイトカインを介した T 細胞の分化に不可欠です。たとえば、IFN-γ および il-12 が th1 細胞分化8と IL-1, 必要な IL-6 と IL-23 は重要ナイーブ T 細胞 Th17 細胞9に向かって偏光です。成熟した Dc は、外国の抗原に反応する、自己抗原による自由な DC の活性化が耐アブレーションを原因し、その活性化組織破壊10 につながる自己反応性 T 細胞を生成することによって自己免疫疾患の開発の促進.

最近の報告では、DC の可塑性、その組織微小環境の内で異なるキューとやり取りして異なるエフェクター/サプレッサー DC サブセットに区別するために彼らの能力によって例示の明確な証拠を提供しています。IL-1011TGF-β12HO 113などの抗炎症メディエーターは、Dc (TolDCs) 免疫寛容を誘導することによって免疫抑制に重要な役割を再生する示されています。これらの TolDCs は、規制機能を取得し、14T 細胞増殖を抑制します。また、Dc による共刺激の欠如と TolDCs から抗炎症メディエーターの生産両方は制御性 T 細胞 (Treg) の誘導に貢献、Th1 と th17 細胞分化と拡大15も効果的に抑制します。過去の二十年でに、TolDCs の治療の可能性はいくつかの調査で、報告されています。これらの研究でex vivoの管理自己免疫疾患16の異なる前臨床モデルで TolDCs の改善だけでなく病的症状を生成がまた17 の患者で免疫の許容の開発につながった ,18。興味深いことに、今日 TolDCs 療法として考えられている代替または補助アプローチを含む、いくつかの臨床試験で自己免疫疾患のタイプ 1 糖尿病19、関節リウマチ20, 21、多発性硬化症 (MS)22,23,24Crohn 病25。

各種 TolDCs の開発に採用されているプロトコルがあり、いくつかの研究所は、生成と TolDCs の表現型特性の方法を報告しています。造血前駆細胞からの in vitro TolDCs 再現性をもって生成し、安定して免疫寛容状態体内26,27,28,29でそれらを維持するために、これらのメソッドを使用することができます。Idc は、様々 な免疫調節薬剤や抗炎症性サイトカインへの露出によって TolDCs に変換できます。たとえば、ビタミン D3 は IL-10 生産を増大させる、DCs から IL 12 分泌を抑制し、それにより免疫抑制機能30を後押しする知られているよく知られている薬剤です。また、Dc がリポ多糖 (LPS) などの強力な炎症性刺激にさらされるデキサメタゾン31、ラパマイシン32、コルチコステロイド33などいくつかの薬剤が示されているを誘発する、CD40、CD80、CD86、MHCII34DC 表面発現を減らすことによって TolDC の表現型。IL-10 および TGF-β が DC 耐性35とこれらのサイトカインの両方に複合暴露を誘導するためにほとんど研究抗炎症性サイトカインが Dc36抗原の表現型を誘導するために示されています。

免疫寛容の表現型マーカーではなく、DC は機能特性によって定義される偉大な TolDCs の細胞および機能特性評価のための一貫した方法を開発する必要があります。厳格かつ一貫性のあるプロトコルが一貫性のある評価と免疫寛容 DC 表現型の特性の確立必要があります我々 効果的かつ再現性をもって TolDC の表現型を誘導する新しいエージェントの能力を比較している場合さらに、実験室。ここで提供詳細なプロトコル マウスの造血前駆細胞から Idc を分離してその後 TolDCs、Idc に変換する能力の評価の下で新しいエージェントの有効性を分析するステップ バイ ステップのメソッドを提供する堅牢ですTolDCs の機能および表現型特性の in vitroとin vivoの両方。この説明には、その表面配位子、サイトカインのプロファイル、および体外免疫機能によって TolDCs を特徴づける精巧なメソッドが含まれています。我々 も MS、実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) の前臨床モデルでこれらの TolDCs の潜在的な治療上のアプリケーションを探索する方法の例を提供します。この確立されたプロトコルは TolDCs の誘導を促進するために新しいエージェントのキャパシティを評価する調査官を助け、TolDC 治療開発の範囲を拡大するための努力を容易に。

Protocol

ケース ウェスタン リザーブ大学医学部の制度的動物ケアおよび使用委員会によって承認された手続きに準拠してすべての研究を行った。 1. 骨髄由来樹状細胞 (黒谷) オートクレーブを介してすべての手術器具を滅菌し、クラス II 生物学的安全キャビネット充当安全手順で実験を実行します。 8-10 週齢の c57bl/6 マウスを安楽死させる CO2箱を用いた?…

Representative Results

分化と黒谷の選択: 骨髄前駆細胞は、GM-CSF と il-4 による (図 1 a) の 7 日間の Idc に分化するの存在下で完全 RPMI 培地で培養しました。1 日目、セル サイズが小さかったと球状の形態を示した。3 日目の新鮮な媒体の交換クラスターを形成する細胞を助け、また CD11c の人口を増加する前に PB…

Discussion

Idc を生成し、その後 TolDCs にそれらを区別するために再現性をもって使用できる効率的なプロトコルについて述べるし、この可能性があります、TolDC を誘導する新規分子標的薬の能力の評価に適用することを提案します。表現型。このレポートに記載されている、我々 は、我々 まず表面配位子の TolDC 式フローサイトメトリーで分析した、qRT PCR および elisa 法で測定された DC サイトカイン ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々 はリアータ医薬品が CDDO DFPA を提供することをありがちましょう。また、ジェーンと小児がんの革新 (ジョン Letterio) 李 Seidman 椅子のサポートを認めます。この作品は、米国防総省 [W81XWH-12-1-0452]; によって支えられました。ケース包括的がんセンターでアンジーの野鳥捕獲者の青年や若い成人期のがん研究イニシアチブHsi じゅ魏/キャラハン財団からキャラハン研究科学者賞を受賞。

Materials

CDDO-DFPA (RTA-408) Reata Pharmaceuticals in house synthesis Cell culture
Mouse GM-CSF Peprotech Inc. 315-03 BMDC differentiation
Mouse IL-4 Peprotech Inc. 214-14 BMDC differentiation
Lipopolysaccharides (LPS) Sigma Aldrich Inc. L2880 Cell culture
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich Inc. 516732 Cell culture
Pertussis toxin (PTX) R&D systems 3097 EAE induction
MOG (35–55) peptide 21stCentury Biochemicals in house synthesis EAE induction
Trypan blue Gibco, Life Technologies 15250-061 Cell culture
RPMI-1640 plus L-glutamine ThermoFisher Scientific 11875-093 Cell culture
Non-essential amino acid (100X) ThermoFisher Scientific 11140050 Cell culture
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080 Cell culture
penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122 Cell culture
40 μm cell strainer Corning 352340 Cell isolation
PE-conjugated CD80 BD Biosciences 557227 Flow cytometry
PE-conjugated CD86 BD Biosciences 555665 Flow cytometry
PE-conjugated PD-L1 BioLegend 124307 Flow cytometry
APC-conjugated MHCII Miltenyi Biotec Inc. 130-112-388 Flow cytometry
APC-conjugated CD11c BD Biosciences 340544 Flow cytometry
Isotype matched PE Miltenyi Biotec Inc. 130-091-835 Flow cytometry
Isotype matched APC Miltenyi Biotec Inc. 130-091-836 Flow cytometry
CFSE BioLegend 423801 T cell proliferation assay
Pan dendritic cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
CD4+ T cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
ACK lysing buffer ThermoFisher Scientific A1049201 BMDC differentiation
1 ml syringe BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
3 ml syringe BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
25G needle BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
23G needle BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
BSA Sigma Aldrich Inc. A2058 T cell proliferation assay
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020 T cell proliferation assay
LS Column Miltenyi Biotec Inc. 130-042-401 T cell proliferation assay
Pre-Separation Filter Miltenyi Biotec Inc. 130-095-823 T cell proliferation assay
collagenase D Sigma Aldrich Inc. 11088858001 T cell proliferation assay
HBSS ThermoFisher Scientific 14025076 T cell proliferation assay
ovalbumin (OVA) peptide 323–329 Sigma Aldrich Inc. O1641 T cell proliferation assay
Mouse IFN-γ TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01168134_m1 qRT-PCR
Mouse IL-12a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00434165 qRT-PCR
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA R&D systems DY419-05 ELISA
Mouse EDN-1 ELISA RayBiotech ELM-EDN1-1 ELISA
TNF-α TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00443258 qRT-PCR
Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit R&D systems MTA00B ELISA
IL-6 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00446190 qRT-PCR
Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit R&D systems M6000B ELISA
IL-23a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01160011 qRT-PCR
Mouse IL-23 DuoSet ELISA R&D systems DY1887-05 ELISA
IL-4 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm99999154_m1 qRT-PCR
IL-10 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01288386_m1 qRT-PCR
TGF-β TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01178820_m1 qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 antibody Abcam ab13248 Western blotting
Anti-β-actin antibody Abcam ab8226 Western blotting
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad Inc. qRT-PCR
BD FACSCalibur Cell Analyzer BD Biosciences Flow cytometry
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Riferimenti

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Wei, H., Letterio, J. J., Pareek, T. K. Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (135), e57637, doi:10.3791/57637 (2018).
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