Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fabrikasjon av Gradient Nanopattern av termisk Nanoimprinting teknikk og Screening av responsen av menneskelig Colony-forming endotelceller

Published: July 1, 2018 doi: 10.3791/57661
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2, 1
1School of Biomedical Engineering, Korea University, 2Department of Cardiology, Korea University Anam Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en protokoll for fabrikasjon av gradient nanopattern plater via termisk nanoimprinting og metode for screening svar av menneskelig endoteliale progenitor celler å nanostrukturer. Bruker den beskrevet teknologien, er det mulig å produsere et stillas som kan manipulere celle oppførsel ved fysisk stimuli.

Abstract

Nanotopography finnes i ulike ekstracellulære matriser (ECMs) rundt kroppen og er kjent for viktige forskrifter tiltak på mobilnettet reaksjoner. Det er imidlertid vanskelig å fastslå forholdet mellom størrelsen på en nanostructure og svar av celler på grunn av mangel på skikkelig screening verktøy. Her viser vi utviklingen av reproduserbar og kostnadseffektiv gradient nanopattern plater for manipulering av mobilnettet svar. Bruke anodic aluminiumoksid (AAO) som en master mold, gradient nanopattern plater med nanopillars av økende diameter områder [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) og 280-360 nm (GP 280/360)] ble fabrikkert av en termisk preging teknikk. Disse gradient nanopattern platene ble designet for å etterligne ulike størrelser på nanotopography i ECM og ble brukt til skjerm svarene på menneskelig colony-forming endotelceller (hECFCs). I denne protokollen beskriver vi fremgangsmåte å fabrikere gradient nanopattern plater for cellen engineering, teknikker dyrke hECFCs fra eksterne menneskeblod og dyrking hECFCs på nanopattern plater.

Introduction

Sist, responsen av celler av fysisk stimulering av form har vært profilert innen celle engineering1,2,3,4. Derfor har mer oppmerksomhet vært fokusert på tredimensjonale nanostrukturer på cellen vedlegg overflaten5. Det har blitt rapportert at integrin som er overflaten anerkjennelse enheten cellen, overfører fysiske stimulans drevet av mikro-nano strukturer av ECM gjennom mechano-signaltransduksjon6. Denne mekanisk stimulering regulerer celle atferd gjennom kontakt veiledning7 og induserer cellen cytoskjelett omorganisering skifte form, i tillegg til fokal adhesjon og stivhet av celler8.

Menneskelige endoteliale progenitor celler (hEPCs) i kroppen samhandle tett med microenvironment av omkringliggende ECM9. Dette angir at den fysiske tilstanden på ECM fungerer som en viktig parameter for bestemte cellen matrise vedheft komplekse formasjonen som skjæring stress avledet fra blodet flyt10. Det er rapportert at overflaten nanotopography forbedrer i vitro dannelsen av omfattende kapillarrør nettverk av hEPCs11 og at en ECM/bio løselig faktor kombinert systemet lar hEPCs å gjenkjenne dysfunksjonelle underlag og fremmer sår helbredelse12,13. Likevel, forholdet mellom ECM og hEPCs er ikke klart forstått.

Selv om mange forskere forsøkt å avklare forholdet mellom cellen svar og fysiske signaler fra forskjellige underlag14,15,16, disse studiene brukte bare fast størrelsen på en nanostructure eller nanopatterns med uregelmessig arrangementer som har en begrensning å belyse forholdet mellom størrelsen på nanostructure og celle virkemåten. Problemet her er mangel på egnet verktøy for screening mobilnettet svar som kan erstatte eksisterende kjedelig og repeterende tilnærminger for å finne den optimale størrelsen på nanostructure. En enkel teknikk er derfor nødvendig for screening celle reaksjoner på fysiske stimulations uten repetisjon.

Her beskriver vi en metode som brukes i våre tidligere rapporter17,18,19 for å produsere en gradient nanopattern der diameteren på den arrangert nanopillars gradvis øker. Dessuten, beskrevet vi også hvordan å dyrke og analysere atferden til hECFCs på gradient nanopattern plater å bestemme effekten av fysisk stimuli på cellene. En mild anodization, gradvis etsning og anti-stikker lag belegg metoden ble brukt til å dikte opp gradering AAO mold. Ved å vedta en termisk preging litografi teknikk, ble identiske polystyren gradient nanopatterns produsert i en kostnadseffektiv og lettvint måte. Bruke gradient nanopatterns, er det mulig å fastslå hvilke størrelse av nanostructure har stor innvirkning på celle atferd i ett sett av eksperimentet. Vi forventer at denne gradient nanopattern vil være nyttig i å forstå mekanismene som samspillet mellom blod-avledet hECFC eller andre celler og ulike størrelser av nanostrukturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne studien ble godkjent av institusjonelle anmeldelsen bord på Korea University Anam Hospital (IRB nr. ED170495). Alle prosedyrer ble utført i samsvar med Helsingfors erklæringen og senere kjemikalier.

1. utarbeidelse av aluminium (Al) substrat av Electropolishing

Forsiktig: Electropolishing løsningen er etsende og giftig. Bruk personlig verneutstyr inkludert nitrilhansker, briller og Laboratoriefrakk. Utføre dette trinnet i avtrekksvifte.

  1. Forberede electropolishing løsning ved å blande ethyl alkohol (C2H5OH, 99,9%) og perchloric syre (HClO4, 60%) i en 1 liters Dobbel jakke kanne (C2H5OH:HClO4 = 4:1).
  2. Dobbel jakke begeret tilkobles en Sirkulator og sette temperaturen på 7 ° C. Dobbel jakke begeret oppføre en magnetisk rørestang. La løsningen under omrøring i minst 30 min før temperaturen synker til 7 ° C.
  3. Fordype ultrapure Al platen (99,999%, 20 × 50 × 1 mm3) og karbon counter elektroden i electropolishing løsningen krokodille klipp og kobbertråd. Juster plasseringen av Al platen og karbon counter elektroden mot hverandre.
    Merk: Det er nødvendig å installere dem forsiktig for ikke å ta løsningen. Når i kontakt med løsningen, kan urenheter strømmer ut fra klippene forurense Al platen.
  4. Koble Al platen til positiv terminal og karbon counter elektrode til den negative terminalen, av en likestrøm (DC) strømforsyning.
  5. Slå av magnetisk rørestang og bruke en spenning på 20 V. vedlikeholde denne tilstanden for 4 min.
  6. Slå på magnetisk rørestang, og la den gjeldende for flyten for en annen 6 min.
    Merk: Statisk tilstanden fjerner de fleste urenheter og råhet fra Al plate, og betingelsen dynamisk forbedrer den endelige kvaliteten på electropolishing.
  7. Slå av strømforsyningen og manuelt skille Al platen fra klippet. Grundig vask Al platen med deionisert vann for å fjerne alle resterende løsning.
  8. Tørr Al platen med nitrogen og butikken under inert gass. Gjennomføre denne tørkeprosessen på slutten av alle eksperimenter i trinn 1 og 2.
    Merk: Når sprøytebruk komprimert luft, gjør luftstrømmen fra polert del i motsatt side. I motsatt fall, kan urenheter flykte fra delen ikke-polert og forurense Al platen.

2. fabrikasjon av Gradient AAO Mold med fosforsyre elektrolytt

Forsiktig: Metyl alkohol og dens røyk er okulær giftig. Kontinuerlig eksponering for krom kan føre til alvorlige krom forgiftning. Utføre dette trinnet i avtrekksvifte.

  1. Primær anodization
    1. For å forberede 1 L fosforsyre elektrolytt, Legg 590 mL deionisert vann i en glassflaske.
    2. Legge til 400 mL metyl alkohol (CH3OH, 99%) og 10 mL av fosforsyre (H3PO4, 85%) i glassflaske. Bland løsningen godt av risting manuelt eller med magnetiske omrøring.
    3. Hell 500 mL elektrolytt i en 1 liters Dobbel jakke kanne. Dyppe polert Al plate og karbon counter elektroden i løsningen med krokodille klipp og kobbertråd.
    4. Hell ekstra elektrolytt å finne grensen electropolishing 2-3 mm over overflaten av løsningen.
      Merk: Hvis anodization er gjennomført med grensen til electropolishing rørende løsningen, Al platen tendens til å brenne under anodization.
    5. Installere en vertikal aksel på en U-form pidestall. Knytte en overhead rørestang og pumpehjulet ved hjelp av metall klemmer. Plasser propellen av pumpehjulet nær den nedre enden av begge elektrodene. Angi rotasjonshastigheten på overhead rørestang mellom 200 og 300 rpm.
    6. Dobbel jakke begeret tilkobles en Sirkulator og satt temperaturen til-10 ° C. La systemet for minst 1 time under omrøring til temperaturen synker til-10 ° C.
      Merk: Ikke bruk vann som kjølevæsken. Fordi vannet fryser ved lave temperaturer, vil sirkulasjon ikke fungere normalt. Det anbefales å bruke en blanding av vann og etylalkohol i forholdet 1:1 som kjølevæsken.
    7. Bruke en spenning på 195 V under omrøring 16 h.
      Merk: Hvis gjeldende mer enn 50 mA i 2 eller 3 h etter at spenningen, sannsynligheten for at brenner vil skje er svært høy. Umiddelbart stoppe prosessen og erstatt Al platen med en ny. Hvis dette skjer flere ganger, kontroller at det er ingen abnormitet i temperaturkontroll av Sirkulator. Hvis det er ingen unormalt, endre elektrolytten.
    8. Stopp strømforsyningen og manuelt skille Al platen fra klippet. Vask anodisert Al platen med deionisert vann for å fjerne alle resterende løsning.
  2. Alumina etsning
    1. Forberede chromic acid etsing løsningen smelte 9.0 g av krom oksid (CrO3) og 20,3 mL av fosforsyre (H3PO4, 85%) i 500 mL deionisert vann.
    2. Hell etsing løsningen i 1 L Dobbel jakke begeret. Still inn temperaturen på 65 ° C.
    3. Fordype anodisert Al platen i etsing løsningen for minst 10 h under omrøring. Forsegle toppen av begeret med aluminiumsfolie.
    4. Skyll etset Al platen flere ganger med deionisert vann.
  3. Sekundær anodization
    1. Angi samme eksperimentelle forhold som trinn 2.1.1 til 2.1.7.
    2. Last etset Al platen til anoden av systemet og bruke en spenning på 195 V 6 h. Deretter slå av strømforsyningen og manuelt skille Al platen fra klippet. Vask straks anodisert Al platen med deionisert vann.
      Merk: Når tidspunktet for vask er forsinket, øker porestørrelse av AAO utilsiktet på grunn av den gjenværende fosforsyre.
  4. Gradient pore utvidelse
    1. Forbered en pore økende løsning ved oppløsning 5.765 g av fosforsyre i 500 mL deionisert vann. Hell løsningen i en 1 liters Dobbel jakke kanne.
    2. Koble Dobbel jakke begeret til Sirkulator og Still inn temperaturen på 30 ° C. Plass en lineær bevegelse scene loddrett ved siden av begeret. Fest en klemme den bevegelige delen av lineær scenen.
    3. Angi den bevegelige delen av lineær scenen til utgangsstillingen. Fest klippet til braketten og laste anodisert Al platen.
    4. Manipulere plasseringen av Al platen manuelt slik at Al platen kommer rett over overflaten av løsningen.
      Merk: I dette trinnet bør Al platen ikke berøres løsningen. Pore utvide prosessen begynner så snart Al platen når løsningen.
    5. Gradvis dyppe Al platen i løsningen med en hastighet på 4.86 µm/s for 120 min å gjøre en 35 mm AAO mold størrelse gradient fra 120 nm til 200 nm (GP 120/200). Starte en stoppeklokke for øyeblikket Al platen berører overflaten av løsningen.
    6. For å gjøre GP 200/280 og GP 280/360 mugg, fordype hele området i GP 120/200 mold i pore utvide løsningen for 2 eller 4 h, henholdsvis.
    7. Skyll gradient Al platen flere ganger med deionisert vann.

3. deponering av anti-stikker lag på Gradient AAO Mold med selv montert Monolayer

Merk: Utfør trinnene 3.2.1 til 3.3.3 i en hanskerommet. Koble en vakuumpumpe og tørr nitrogen gass injektor til i hanskerommet. Sett alle prøver, reagenser og apparatene i hanskerommet før dehumidification prosessen. Gjenta evakuering og nitrogen gass injeksjon syklusen mer enn tre ganger for å fjerne tilstrekkelig fuktighet fra i hanskerommet. La tørr nitrogen strømme gjennom eksperimentet.

  1. Hydroksyl modifisering av AAO mold med Piranha behandling
    1. Hell 140 mL av svovelsyre (H2SO4, 95%) i en polytetrafluoroethylene (PTFE) kanne. Legg til 60 mL av Hydrogenperoksid dropwise (H2O2, 30%). Lar det i 30 min før løsningen avkjølt.
      Forsiktig: Vær svært forsiktig når du gjør Piranha løsning. Fra øyeblikket av tilføyer hydrogenperoksid, løsningen kraftig koker og genererer høye temperaturer. Utføre eksperimentet i avtrekksvifte.
    2. Fordype AAO mold i løsningen for 30 s med en nonmetallic tweezer.
    3. Skyll AAO mold flere ganger med deionisert vann. Nyt mold i deionisert vann i 30 min og putte den i metyl alkohol for en annen 30 min.
      Forsiktig: Når kaste brukte Piranha løsningen, fortynne løsningen med rikelig med vann fra springen.
    4. Helt tørr AAO mold under vakuum for 3t.
  2. Utarbeidelse av 20 × HDFS lagerløsning
    Merk: HDFS er en forkortelse av (heptadecafluoro-1,1,2,2, - tetrahydrodecyl) dimethylchloro-silane
    1. Fyll en tredjedel av en 1 L n-heksan flaske med molekylær sikter. Seal flasken med parafin film og lagre det under tørre nitrogen 24 h.
    2. Filtrere det 200 mL av n-heksan bruker glass sprøyte og 0,2 µm PTFE sprøyte filter.
    3. Hell den 80 mL filtrerte n-heksan i en 100 mL glassflaske. Legg 2 mL HDFS.
  3. Selv montert monolayer avsettelse
    1. Last 57 mL filtrerte n-heksan i et 100 mL beaker. Dyppe AAO mold i løsemiddelet.
    2. Legge til 3 mL HDFS lagerløsning n-heksan gjøre 2.9 mM HDFS løsning. Vente 10 min for at reaksjonen skal fortsette.
    3. Overføre AAO mold til frisk n-heksan. Lukk og forsegle alle reagensflasker. Lukke ventilen nitrogen, så trekke ut prøver fra i hanskerommet.
      Merk: HDFS er svært følsom for fuktighet. Lagre alle reagenser som inneholder HDFS i en desiccator.
    4. Suge AAO mold i 60 mL methoxynonafluorobutane (C10H6F18O2, 99%). Ultrasonically Rengjør AAO mold i et beaker for 10 s per én gang for å fjerne fysisk adsorbert HDFS molekyler. Gjenta rengjøring 10 ganger.
      Merk: Utsette AAO mold å ultralyd for lenge uten intervaller vil skade oksid laget.
    5. Helt tørr AAO mold under vakuum for 24 timer.
      Merk: Et vellykket avsatt anti-stikker lag er super vannresistent og stabil i måneder når lagret i en desiccator. Protokollen kan pauses her.

4. fabrikasjon av Gradient Nanopattern plater av varme preging

Merk: Utfør trinnene 4.2 til 4.7 i et rent rom.

  1. Cut et 1.1 mm tykt polystyren ark til en størrelse på 2,9 mm bred ved 3.7 mm lang med en kretskort board (PCB) kutter.
  2. Kuttet AAO mold 35 mm fra bunnen med en nipper. Merk eksempel navn og dato for produksjon på baksiden.
  3. Rengjør en 8.0" kjeks med en liten dose etylalkohol. Sette polystyren arkene på kjeks, så montere AAO mold.
  4. Sett filmen nederst i skuffen til en termisk trykkverktøy. Fest toppen pakningen.
  5. Sette kjeks på bunnen filmen. Plass pakningen på kjeks. Kontroller at det er ingen støv på kjeks.
  6. Lukk skuffen til den termisk trykkverktøy. 165 ° C varme og 620.52 kPa press for 100 s.
  7. Cool prøven til romtemperatur. Forsiktig vri polystyren arket for å frigjøre AAO mold.

5. sterilisering og hydrofile endring av Gradient Nanopattern plater

  1. Plass nanopattern platene på en firkantet rett. Hell 100 mL 70% etylalkohol og avsløre ultrafiolett lys i 30 min.
  2. Tørr nanopattern platene med nitrogen. Overføre nanopattern platene til en oksygen plasma generator.
  3. Evakuere kammeret til den når 1,33 Pa. Deretter injisere oksygen med en hastighet på 30 cm3/min. gjelder en radiofrekvensen strøm på 60 W. vedlikeholde oksygen plasma for 90 s.
    Merk: Det anbefales å bruke plasma-behandlet nanopattern plater innen 14 dager.
  4. Fest nanopattern platen til bunnen av en celle kultur parabol med en dråpe toluen.
  5. Seal prøvene i en pose og sterilisere med lav temperatur plasma sterilisere.

6. dyrking av hECFCs

Merk: Gjennomføre alle centrifuging prosedyrer på 4 ° C med mindre annet er angitt.

  1. Før isolere perifert blod Inkuber mononukleære celler (PBMCs), en kollagen-belagt 12-vel kultur parabol på 37 ° C i 1 time.
  2. Vask 12-brønnen parabolen med 1 × sterilt fosfat bufret saltvann (PBS).
  3. Samle 50 mL av menneskeblod bruker en heparin hemmer rør.
  4. Sette 6 mL av hydrofile polysakkarid løsning i en 15 mL tube og legge 8 mL blod til hydrofile polysakkarid løsningen.
    Merk: Sakte Pipetter blodet i hydrofile polysakkarid løsningen.
  5. Sentrifuge røret 1020 x g for 20 min å pellets cellene.
  6. Høste ugjennomsiktig celle laget, og overføre til en ny 15 mL tube.
  7. Legge til 10% fosterets bovin serum (FBS)-inneholdt PBS og sentrifuge røret 1020 x g for 10 min å pellets cellene.
  8. Fjern nedbryting og legge røde blodlegemer lyseringsbuffer. Hold på is 5 min.
  9. Legg til 10% FBS-inneholdt PBS og sentrifuge røret 1020 x g for 5 min til pellets cellene.
  10. Fjern nedbryting og legge 10% FBS-inneholdt PBS. Sentrifuge røret 1020 x g for 5 min til pellets cellene.
  11. Fjern nedbryting og tilsett 1 mL av endothelial celle ekspansjon medium med 10% FBS. Frø 8.0 × 106 celler per brønn for hver kollagen-belagt rett.
  12. Endre kultur medium hver dag for 1 uke. Deretter endre kultur medium hver 2 dager.
    Merk: hECFCs finner du etter kultur dag 10-14. hECFCs viser typisk brosteinsbelagte-lignende morfologi og danne en koloni som kan observeres i fase kontrast mikroskopi. Immunofluorescence farging av vaskulær endotelial cadherin (CD144) og von Willebrand faktor (vWF) kan også utføres for karakterisering av hECFCs etter ytterligere celleutvidelse.
  13. For å dyrke hECFCs, bruke endothelial celle ekspansjon middels med 5% FBS og penicillin/streptavidin på 37 ° C i en fuktet atmosfære som inneholder 5% CO2. Erstatt medium en gang om dagen.
  14. Etter hECFC induksjon, vokse cellene til passasje 7 for videre studier.

7. celle såing og kultur på Gradient Nanopattern plater

Merk: Trinn 7 beskriver kultur hECFCs på gradient nanopattern plate, men kildene cellen kan også bli brukt.

  1. Coat gradient nanopattern platene med 1 mL 0,1% protein belegg i PBS i 10 min ved romtemperatur.
    Merk: 0,1% protein belegget dekker ikke funksjonene for nanopillar.
  2. Gjør en hECFCs suspensjon fra kultur parabol med en standard celle-splitting metode bruke trypsin.
  3. Fortynne celle suspensjon for å oppnå ønsket samløpet. Frø hECFCs på gradient nanopattern platene og flat kontroll (f.eks 1.0 × 104 celler/cm2).
    Merk: Når hECFCs er seeded på 1,0 × 104 celler/cm2 på gradient nanopattern plater, når de celle confluency vanligvis til 70-80% etter 2 dager.
  4. Kultur cellene i flat eller graderte nanopattern plater for 2 dager i inkubator.

8. observasjon og analyse

  1. Scanning elektron mikroskop (SEM) bildebehandling
    1. Fastsette hECFCs kultivert på flat eller graderte nanopattern plater med 2,5% glutaraldehyde på 4 ° C for overnatting.
    2. Behandle 1% osmium tetroxide 1t ved romtemperatur. Vask prøver med PBS.
    3. Tørke prøver med etylalkohol fra lav til høy konsentrasjon (50%, 70%, 80%, 90% og 100%) i 10 min per hvert trinn.
    4. Behandle hexamethyldisilazane (HMDS) i 15 min ved romtemperatur. Etter det, vaske utvalg fersk HMDS og la prøvene under avtrekksvifte minst 1 dag til den gjenværende HMDS fordamper helt.
    5. Coat prøvene med platina frese coater for 5 min og undersøke prøvene med en SEM.
  2. Transmission elektron mikroskop (TEM) bildebehandling
    1. Fastsette hECFCs kultivert på flat eller graderte nanopattern plater med 2% paraformaldehyde og 2,5% glutaraldehyde blandingen i PBS på 4 ° C for overnatting.
    2. Utføre etter fiksering bruker 1% osmium tetroxide og tørke prøver å bruke metoden i 8.1.3.
    3. Bygge inn eksempler i epoxy harpiks. Gjør 60 nm tykke snitt fra blokker og Plasser en på et TEM rutenett.
    4. Stain delen med blanding av 10 mg uranyl acetate i 100 mL metyl alkohol og 0,1 mg bly citrate i 100 mL destillert vann. Skaff bilder med en TEM.
  3. Fluorescens flekker
    1. Fastsette hECFCs kultivert på flat eller graderte nanopattern plater med 4% paraformaldehyde i romtemperatur i 15 min.
    2. Permeabilize og blokkere prøver med 5% geit serum og 0,1% octylphenol ethoxylate i PBS (PBST) i romtemperatur i 30 min.
    3. Inkuber prøver med anti-menneskelige vinculin primære antistoff (1:500 i PBST) ved romtemperatur for 2 h. skyll prøver tre ganger med PBST.
    4. Inkuber prøver med fluorescens-konjugerte phalloidin (1:1, 000 i PBST), fluorescens-konjugerte sekundære antistoff (1:1, 000 i PBST) ved romtemperatur for 2 h. skyll prøver tre ganger med PBST.
    5. Inkuber prøver med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1,000 i PBST) ved romtemperatur for 5 min.
    6. Slippe 10 µL av montering medium på overflaten av gradient nanopattern. Plass en dekkglassvæske på montering mediet.
    7. Plasser prøven opp ned på utvalg scenen og hente bilder med AC confocal fluorescens mikroskop.
  4. Bildeanalyser
    1. Overføre bildene av hECFCs til et bilde analysesystem.
    2. Velg feltet tilfeldig phalloidin flekker bilde. Juster terskelen og opprette en binær image der celler er forskjellig fra bakgrunnen.
    3. Tegn konturer rundt celler å måle celle område og perimeter og manuelt antall filopodia per celle.
    4. Velg feltet tilfeldig vinculin flekker bilde. Juster terskelen og opprette en binær image fokal vedheft områder.
      Merk: Justere bildet terskelen riktig for å unngå kunstige over - eller under - filling fokal vedheft områder.
    5. Telle antall fokal vedheft av hver celle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results


Figur 1 viser SEM bilder av fabrikkerte gradient AAO formene deres type og plassering. Figur 2 viser SEM bilder av gradient nanopattern plater med vanlig-avrundet nanopillars og Figur 3 er kvantifisering data av nanopillar diameter. Tabell 1 viser egenskapene til de ferdige nanopillars.

Figur 4A viser ordningen av dyrking av blod-avledet hECFCs. Figur 4B viser fase kontrast bildet av thecultivated hECFCs. Figur 4C viser hECFC markører farget med CD144 (grønn), vWF (rød) og kjernen (blå). Figur 5A viser representant SEM bilder av hECFCs etter 2 dager med kultur på flat, GP 120/200, GP 200/280 og GP 280/360 plater. Figur 5B og C viser kvantitative data på cellen område og perimeter i forhold til leiligheten. Kvantifisering dataene viser at celler dyrket på nanopillar overflater av mindre størrelse viste redusert celle areal og omkrets. Figur 5 d er representativt SEM bilder av hECFCs som viser morfologi av eksisterende filopodia. Figur 5E viser kvantitative data på filopodia nummer i forhold til leiligheten. Betydelig filopodial utvekst ble observert i celler kultivert på GP 120/200, mens ingen betydelige endringer ble observert i GP200/280 eller GP280/360 med flat. Figur 5F viser representant TEM bilder av hECFCs etter 2 dager med kultur på flat og graderte nanopattern plater.

Figure 1
Figur 1. Gradient AAO mold. SEM bilder graderingen AAO former for GP 120/200 GP 200/280 og GP 280/360 plater etter plasseringen av muggsopp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Gradert nanopattern plater. SEM bilder av pilarer type gradient nanopattern plater for GP 120/200 GP 200/280 og GP 280/360 plater etter plassering av plater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Størrelse gradering av nanopillar diameter. Kvantifisering data viser gradient av nanopillar diameter for GP 120/200, GP 200/280 og GP 280/360 plater, henholdsvis. Stolper representerer standardfeil. Dette tallet ble endret fra [Acta Biomaterialia] 20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Youngs modul (GPa) Nanopillar Diameter (nm) Nanopillar Pitch (nm) Midtpunkt til midtpunkt avstand (nm) Nanopillar høyde (nm) Nanopillar stivhet (N/m)
Flatskjerm 2.43±0.19 - - - - -
GP 120/200 1.74±0.11 120-200 320-240 440 276.9±21.9 9.35
GP 200/280 2.01±0.05 200-280 240-160 440 268.1±25.9 55.78
GP 280/360 2.1±0.13 280-360 160-80 440 293.6±23.6 134.15

Tabell 1. Kjennetegner fabrikkerte nanopillars. Kvantifisert data viser Youngs modulus, diameter, pitch, midtpunkt til midtpunkt avstand, høyde og stivhet av fabrikkerte nanopillars. Denne tabellen ble endret fra [Acta Biomaterialia] 20.

Figure 4
Figur 4 . Karakterisering av hECFCs. (A) skjematisk diagram viser tidsplan for hECFCs avledet fra voksen perifert blod. (B) fase kontrast bildet av hECFC kolonien, avledet fra voksen perifert blod på dag 14. (C) Immunofluorescent bildene viser CD144 (grønn), vWF (rød) og cellekjernen farget med DAPI (blå). Dette tallet ble endret fra [Acta Biomaterialia] 20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . hECFCs kultivert på flat og graderte nanopattern plater for 2 dager. (A) representant SEM bildet av hECFCs kultivert på Flat, GP 120/200, GP 200/280 og GP 280/360 plater. (B og C) Kvantifisering data av areal og omkrets av hECFCs (n = 50). * p <.05 i forhold til leiligheten. (D) representant SEM bilder av forkanten av hECFCs på flat og graderte nanopattern plater. (E) kvantifisering data antall filopodia per en hECFC (n = 20). * p <.05 i forhold til leiligheten. (F) representant TEM bildet av hECFC kultivert på Flat og graderte nanopattern plater. Hvite pilene angir samhandling poeng mellom hECFCs og substrat overflate. Dette tallet ble endret fra [Acta Biomaterialia] 20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Utfyllende Figur 1. Vann kontakt vinkel uberørte AAO og HDFS behandlet AAO. Kontakt vinkel mål viser hydrofobe egenskapene for HDFS montert selv monolayer (A) før og, (B) etter behandling. Klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende figur 2. SEM bilder av fabrikkerte gradient nanopattern plater med samme AAO mold. Komparativ SEM bilde setter for å bekrefte holdbarheten av AAO mold. (A) Gradient nanopattern plate produsert med nystekte mold. (B) Gradient nanopattern plate produsert med AAO mold etter preging 15 ganger. Klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende figur 3. Påvirkning av protein belegg. SEM bilder av hECFCs som ble kultivert på GP 120/200, GP 200/280 eller GP 280/360 gradient nanopattern plater (A) uten eller (B) med protein belegget. Dette tallet ble endret fra [Acta Biomaterialia] 20 Klikk her for å laste ned dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fabrikasjon av en AAO ofte lider av defekter som sprekker, irregulær form av porene og brenning. Hovedårsaken til disse feilene kalles en elektrolytisk sammenbrudd, som er sterkt påvirket av typen metall substrater blir eloksert og resistivitet av elektrolytt21. Siden resistivitet av elektrolytt varierer avhengig av sin temperatur, er eliminere varme kontinuerlig fra elektrodene det kritiske punktet for beliggenhet temperaturen på elektrolytten stabil i en slik høy spenning anodiserings tilstand. I denne protokollen laget vi AAO formene ved å endre Masudas totrinns anodization22,23. Erstatter nesten halvparten elektrolytt med metyl alkohol ikke bare hindrer at elektrolytt frysing ved lave temperaturer men også fratar elektroden i varmen av fordamping nederst i pore24. Årsaken ved hjelp av en overhead rørestang og pumpehjulet i stedet for en magnetisk rørestang er også å sikre temperaturkontroll. Den typiske magnetisk rørestang har en høy sannsynlighet for tomgang på grunn av utilsiktet misalignment av magnetiske feltet under langsiktig drift. Dette problemet forårsaker feil sirkulasjonen av elektrolytt, heve sin temperatur, og fører til brenning.

For å gi en størrelse gradient til AAO mold, oppslukt vi gradvis AAO i en fosforsyre etsing løsningen. Porene er utvidet til tiden AAO forblir i etsing løsningen, som vist i figur 1. Under denne tilstanden er pore økning gjennomsnittskursen 0.67 nm/min. manipulere immersing fart og tid vil endre hellingen på størrelse gradient og maksimum pore diameteren på AAO. Maksimal mulig pore diameter er 400 nm. Når pore diameter overstiger 400 nm, avstand veggen mellom porene blir så tynn at det ikke kan tolerere trykket under termisk preging prosessen.

En HDFS selv montert monolayer er kjent for å legge til en hydrofobe egenskapen til de materielle overflate25. HDFS molekylet gjør en sterk kovalent binding med hydroksyl grupper på AAO overflaten introdusert av Piranha behandling26. Derfor, som vist i supplerende figur 1, en solid selv montert monolayer kan dannes når et stort antall hydroksyl grupper finnes på underlaget overflaten. For optimal kvalitet med en HDFS selv montert monolayer anbefaler vi gjennomfører reaksjonen i en dehumidified atmosfære. Når HDFS er utsatt for fuktighet, en side reaksjon med vann danner dimers, trimers og selv oligomers silane molekyler, og reduserer kvaliteten selv montert monolayer.

Ved hjelp av AAO mold med en størrelse gradient i termisk nanoimprinting, ble celle kultur plater med en gradient nanopillars innhentet figur 2 og Figur 3. Termisk nanoimprinting metoden har en fordel i at den kan produsere et stort antall identiske nanopattern plater ved hjelp av en AAO master mold. Supplerende figur 2 viser at det er ingen forskjell i kvaliteten på nanopattern produsert, selv etter femten preging prosesser, sammenlignet med nanopattern produsert av nye AAO mold. Grunnen til å velge polystyren som materiale for å overføre en nanopattern er at polystyren har en riktig glass overgang temperatur (100 ° C) for termisk preging, og det er mye brukt i kommersielle celle kultur retter fordi dens gjennomsiktig og nontoxic egenskaper.

Det er vanskelig å fabrikere nanostrukturer med høy størrelsesforhold bruker termisk nanoimprinting metoden. Fordi, når prosessen forhold, som presset og tid økning, blir mold dypt forankret i polymer underlaget, gjør det vanskelig å skille mold fra underlaget. Derfor er det svært utfordrende å produsere nanopatterns har et sideforhold på 1:3 eller mer og våre nanoimprinting teknikk. Men ifølge TEM bilder vi observerte figur 5C, vi har funnet en interessant faktum at membran av celler på nanopatterns ikke var i kontakt med nederst i nanopattern. Med andre ord, var alle fysiske stimuli som kan manipulere en respons av cellene stammer fra de øvre delene av nanopattern. Derfor i denne studien trenger vi ikke å vurdere størrelsesforholdet i å studere svar på cellen å nanopattern. Som vist i supplerende Figur 3, 0,1% protein belegg løsning ikke hadde noen innflytelse på feste hECFCs på nanopillar overflater. Videre redusert disse nanoscaled stimuli fra gradient nanopattern platene celle areal og omkrets av hECFCs og økt filopodial utvekst figur 5.

I sammendraget etablert vi gradient nanopattern plater ved å manipulere en respons av hECFCs i vitro. For å vite nøyaktig hva størrelsen på nanostrukturer cellene sterkt påvirket, er en fremtidig arbeid nødvendig for å utforme en celle-spesifikke store nanopillar ved å justere skråningen av størrelse gradient og minimum-maksimale diameter på nanopillars. Vi forventer denne gradient nanopattern til fascinerende verktøyet skjerm samspillet mellom cellene og nanostrukturer samt gi avansert celle nisjer som nanostrukturer fritt stilles i størrelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av grunnleggende vitenskap forskningsprogrammet gjennom National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] og Bio- og medisinske teknologiutvikling Programmet for NRF finansiert av departementet for vitenskap, IKT og fremtid planlegger [NRF-2017M3A9C6029563].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perchloric acid 60% Daejung Chemicals & Metals 6512-4100
Ethyl alcohol, absolute 99.9% Daejung Chemicals & Metals 4118-4100
Phosphoric acid 85% Daejung Chemicals & Metals 6532-4400
Methyl alcohol 99.5% Daejung Chemicals & Metals 5558-4400
Chromium(VI) oxide Daejung Chemicals & Metals 2558-4400
Sulfuric acid 95% Daejung Chemicals & Metals 7781-4100
Hydrogen peroxide 30% Daejung Chemicals & Metals 4104-4400
n-hexane 95% Daejung Chemicals & Metals 4081-4400
Toluene 99.5% Daejung Chemicals & Metals 8541-4400
(heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane Gelest SIH5840.4 Moisture sensitive
Methoxynonafluorobutane 99% Sigma aldrich 464309
Collagen solution Stemcell #4902
Gelatin Sigma aldrich G1890 Protein coating solution
Ficoll-Paque GE Heathcare 17-1440-03 Hydrophilic polysaccharide solution
EGM-2MV Lonza CC-3202 Endothelial cell expansion medium
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Phosphate buffered saline Gibco 10010031
Fetal bovine serum Gibco 12483-020
Paraformaldehyde Sigma aldrich P6148
Glutaraldehyde Sigma aldrich G5882-100ML
Osmium tetroxide Sigma aldrich 201030-1G
Hexamethyldisilazane Sigma aldrich 440191
Triton X-100 Sigma aldrich X100-100ML Octylphenol ethoxylate 
Goat serum Gibco 26050-088
anti-human vinculin primary antibody  Sigma aldrich V9131
F-actin probe Molecular Probes A12379 Fluorescence-conjugated phalloidin
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody Molecular Probes A11001 Fluorescence-conjugated secondary antibody 
4',6-diamidino-2-phenylindole  Sigma aldrich D9542
Mounting medium DAKO S3023
Anti-human vWF primary antibody  DAKO A0082
Anti-human CD144 primary antibody  BD Biosciences #555661
Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA Ted Pella 18012 Epoxy resin
Uranyl Acetate, 25g Ted Pella 19481
Lead Citrate, Trihydrate, 10g Ted Pella 19312
Ultra pure aluminum plate Goodfellow 26050-088
Polystyrene sheet Goodfellow ST313120
8.0" silicon wafer Siltron 29-01024-03 Single side polished, 725 µm thick
Vacuum desiccator, 4.4 L Kartell KA.230
Vacuum pump Vacuumer V3.VOP100
Power supply Unicorntech UDP-3003
Magnetic stirrer Daihan scientific SL.SMS03022
Overhead stirrer Daihan scientific HT120DX
Circulator Daihan scientific WCR-P12
Linear moving stage Zaber A-LSQ300A-E01-KT07
Angle bracket, 90 degrees Zaber AB90M Accessory of the linear moving stage
PMP forcep, 145 mm Vitlab 67995 Nonmetallic tweezer
PTFE beaker, 250 mL Cowie CW007.25
Ultrasonic cleaner Branson B2510MTH
PCB cutter Hozan Tool Industrial K-110
Nanoimprint device Nanonex NX-2000
Oxygen plasma generator Femto Science CUTE
Low temperature sterilizer Lowtem Crystal 50
CO2 Incubator Panasonic MCO-18AC
Confoal laser scanning microscope Carl Zeiss LSM700
Scanning electron microscope JEOL JSM6701
Transmission electron microscope Hitachi H-7500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
  2. Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W. Nanotopographic Regulation of Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (48), 41794-41806 (2017).
  3. Naganuma, T. The relationship between cell adhesion force activation on nano/micro-topographical surfaces and temporal dependence of cell morphology. Nanoscale. 9 (35), 13171-13186 (2017).
  4. Han, J., Lin, K. H., Chew, L. Y. Study on the regulation of focal adesions and cortical actin by matrix nanotopography in 3D environment. Journal of Physics: Condensed Matter. 29 (45), 455101 (2017).
  5. Liu, X., Wang, S. Three-dimensional nano-biointerface as a new platform for guiding cell fate. Chemical Society Reviews. 43 (8), 2385-2401 (2014).
  6. Turner, L. A., Dalby, M. J. Nanotopography-potential relevance in the stem cell niche. Biomaterials science. 2 (11), 1574-1594 (2014).
  7. Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
  8. Yim, E. K., Darling, E. M., Kulangara, K., Guilak, F., Leong, K. W. Nanotopography-induced changes in focal adhesions, cytoskeletal organization, and mechanical properties of human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (6), 1299-1306 (2010).
  9. Davis, G. E., Senger, D. R. Endothelial extracellular matrix. Circulation research. 97 (11), 1093-1107 (2005).
  10. Nakayama, K. H., Surya, V. N., Gole, M., Walker, T. W., Yang, W., Lai, E. S., Ostrowski, M. A., Fuller, G. G., Dunn, A. R., Huang, N. F. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano letters. 16 (1), 410-419 (2015).
  11. Bettinger, C. J., Zhang, Z., Gerecht, S., Borenstein, J. T., Langer, R. Enhancement of in vitro capillary tube formation by substrate nanotopography. Advanced materials. 20 (1), 99-103 (2008).
  12. Katz, B. Z., Zamir, E., Bershadsky, A., Kam, Z., Yamada, K. M., Geiger, B. Physical state of the extracellular matrix regulates the structure and molecular composition of cell-matrix adhesions. Molecular biology of the cell. 11 (3), 1047-1060 (2000).
  13. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  14. Tajima, S., Chu, J., Li, S., Komvopoulos, K. Differential regulation of endothelial cell adhesion, spreading, and cytoskeleton on low-density polyethylene by nanotopography and surface chemistry modification induced by argon plasma treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (3), 828-836 (2008).
  15. Mohiuddin, M., Pan, H. A., Hung, Y. C., Huang, G. S. Control of growth and inflammatory response of macrophages and foam cells with nanotopography. Nanoscale research letters. 7 (1), 394 (2012).
  16. Kyle, D. J., Oikonomou, A., Hill, E., Bayat, A. Development and functional evaluation of biomimetic silicone surfaces with hierarchical micro/nano-topographical features demonstrates favourable in vitro foreign body response of breast-derived fibroblasts. Biomaterials. 52, 88-102 (2015).
  17. Seo, H. R., Joo, H. J., Kim, D. H., Cui, L. H., Choi, S. C., Kim, J. H., Cho, S. W., Lee, K. B., Lim, D. S. Nanopillar Surface Topology Promotes Cardiomyocyte Differentiation through Cofilin-Mediated Cytoskeleton Rearrangement. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (20), 16803-16812 (2017).
  18. Hwang, J. H., Lee, D. H., Byun, M. R., Kim, A. R., Kim, K. M., Park, J. I., Oh, H. T., Hwang, E. S., Lee, K. B., Hong, J. H. Nanotopological plate stimulates osteogenic differentiation through TAZ activation. Scientific Reports. 7 (1), 3632 (2017).
  19. Bae, D., Moon, S. H., Park, B. G., Park, S. J., Jung, T., Kim, J. S., Lee, K. B., Chung, H. M. Nanotopographical control for maintaining undifferentiated human embryonic stem cell colonies in feeder free conditions. Biomaterials. 35 (3), 916-928 (2014).
  20. Cui, L. H., Joo, H. J., Kim, D. H., Seo, H. R., Kim, J. S., Choi, S. C., Huang, L. H., Na, J. E., Lim, I. R., Kim, J. H. Manipulation of the response of human endothelial colony-forming cells by focal adhesion assembly using gradient nanopattern plates. Acta biomaterialia. 65, 272-282 (2017).
  21. Lee, W., Park, S. J. Porous anodic aluminum oxide: anodization and templated synthesis of functional nanostructures. Chemical reviews. 114 (15), 7487-7556 (2014).
  22. Masuda, H., Fukuda, K. Ordered metal nanohole arrays made by a two-step replication of honeycomb structures of anodic alumina. science. 268 (5216), 1466 (1995).
  23. Masuda, H., Satoh, M. Fabrication of gold nanodot array using anodic porous alumina as an evaporation mask. Japanese Journal of Applied Physics. 35 (1B), L126 (1996).
  24. Zaraska, L., Sulka, G. D., Jaskuła, M. The effect of n-alcohols on porous anodic alumina formed by self-organized two-step anodizing of aluminum in phosphoric acid. Surface and Coatings Technology. 204 (11), 1729-1737 (2010).
  25. Yang, K. Y., Kim, J. W., Byeon, K. J., Lee, H. Selective deposition of the silver nano-particles using patterned the hydrophobic self-assembled monolayer patterns and zero-residual nano-imprint lithography. Microelectronic engineering. 84 (5), 1552-1555 (2007).
  26. Park, B. G., Lee, W., Kim, J. S., Lee, K. B. Superhydrophobic fabrication of anodic aluminum oxide with durable and pitch-controlled nanostructure. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 370 (1), 15-19 (2010).

Tags

Bioteknologi problemet 137 anodic aluminiumoksid nanoimprint litografi gradient nanopattern plater ekstracellulær matrix fysisk stimulering menneskelige colony-forming endotelceller
Fabrikasjon av Gradient Nanopattern av termisk Nanoimprinting teknikk og Screening av responsen av menneskelig Colony-forming endotelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, D. H., Cui, L. H., Seo, H. R.,… More

Kim, D. H., Cui, L. H., Seo, H. R., Joo, H. J., Choi, S. C., Lim, D. S., Lee, K. B. Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells. J. Vis. Exp. (137), e57661, doi:10.3791/57661 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter