Summary
I denna forskning visar vi en etikett-fri neutrofila separationsmetod från kliniska luftvägarna sekret med slutna drift av spiral tröghetsbaserad mikrofluidik. Den föreslagna metoden skulle expandera de kliniska in vitro- analyserna för olika sjukdomar i andningsorganen.
Abstract
Luftvägarna sekret innehåller ett stort antal immunrelaterade celler, t.ex., neutrofiler, makrofager och lymfocyter, som kan användas som en viktig resurs för att utvärdera en mängd olika lungsjukdomar, både för forskning och kliniska ändamål. Dock på grund av heterogena och trögflytande hur patientens slem finns det för närvarande ingen tillförlitlig dissociation-metod som inte skadar värd immuncellerna i patientens luftvägar utsöndringen. I denna forskning introducerar vi ett prov förberedelse metod som använder tröghetsbaserad mikrofluidik patientens immunförsvar bedömning. Oavsett de heterogena fluidic egenskaperna hos de kliniska proverna, den föreslagna metoden återvinner mer än 95% av neutrofiler från luftvägarna sekretion prover som är utspädda 1.000-faldig med milliliter ren koksaltlösning. Som recirkulerande koncentrerad utdataström till reservoaren utfallsprov, tillhandahålls en hög koncentration, återhämtning och renhet av immuncellerna; återcirkulation är ansedd en kompromiss till singel-kör spruta-baserade operation tröghetsbaserad mikrofluidik. Slutna driften av spiral mikrofluidik ger leukocyter utan fysiska eller kemiska störningar, vilket framgår av den phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA)-inducerad elastase release av sorterade neutrofiler.
Introduction
Eftersom celler är inkapslade i en stor mängd slem i luftvägarna sekret, har funktionell bedömning av leukocyter genom in vitro- test hindrats. Ditiotreitol (DTT) är den vanligaste lyseringsbuffert att dissociera och homogenisera sputum för Cytologisk analys och identifiering av medlare samtidigt som den ger acceptabel lönsamhet för isolerade celler1,2. Dock kan DTT störa yta-bundna antigener av luftvägarna neutrofiler, vilket resulterar i störningar av neutrofil funktion såsom elastase och myeloperoxidas (MPO) release2,3. Få studier av människans luftvägar neutrofil funktion har därför utförts med perifert blod neutrofiler, som inte kan avslöja de fysiologiska egenskaperna av pulmonell4. Under tiden gjort tröghetsbaserad mikrofluidik framsteg isolera cellerna från olika patient biomatrices5,6. Jämvikten mellan tröghetsbaserad hiss styrkor och Dean drar justerar partikel/cellen beroende på deras storlek, vilket gör att etiketten-fri partikel separation7. Vår grupp tidigare infört en prov förberedelse metod för cirkulerande tumör celler8,9, patogener i blod8, celler från en suspension kultur10,11, 12, och polymorfonukleära leukocyter (PMNs) från blodet13,14.
Här introducerar vi ett protokoll för att förbereda immunceller från patientens luftvägar sekret med slutna tröghetsbaserad mikrofluidik för en nedströms i vitro assay, såsom neutrofila elastase (NE) analysen. Denna metod ger både hög koncentration och återhämtning, särskilt när det finns en betydande överlappning i lateral riktning av cell/partikel som den cellen/partikel-of-intressen är att tas bort, vilket är vanligt förekommande i kliniska prover. Genom recirkulerande inre väggen (IW)-fokuserade stora partiklar eller celler tillbaka till ingående prov röret, partikel eller cell-av-intressera koncentrat i ursprungliga behållaren, medan bakgrunden vätskor med små mucin aggregat passera genom avfall reservoaren. Trots de heterogena fluidic egenskaperna hos kliniska prover, den föreslagna metoden återställer konsekvent över 95% av neutrofiler från luftvägarna sekretion prover som är utspädda 1.000-faldig med en ren saltlösning (~ 1 mL). Däremot presenterar metoden lysis ett brett utbud av PMNs återvinningsprocent beroende på provet skick. Föreslagna protokollet fångar leukocyter i ett etikett-fri sätt med inga fysiska eller kemiska störningar, vilket ger möjlighet att skörda känsliga celler från kliniskt utmanande biometri med minimalt invasiva ingrepp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Provsamlingen godkändes av University of Pittsburgh institutionella Review Board (IRB # PRO16060443, PRO10110387). Alla experiment utförs under en biosäkerhet skåp med lämplig personlig skyddsutrustning.
1. anordning tillverkning och mjuk litografi
Obs: Standard mjuk litografi tekniker15,16 användes för att skapa den Polydimetylsiloxan (PDMS) microchannel.
- Blanda PDMS föregångaren i förhållandet 10:1 bas och bota agent.
- Häll 30 g av PDMS föregångare blandningen på mikro-frästa aluminium mögel (se figur 1 för dimensioner) och 20 g av PDMS föregångare blandningen på 100 mm petriskål.
Obs: Petriskål används för att göra den tjocka filmen av PDMS (~ 3 mm) för stödjande skiktet. Det stödjande skiktet av PDMS ger enhetlig fysiska ytegenskaper i hela mikrofluidik. Alternativt kan en tunn PDMS film i glas bilden användas. Den herre mögel med specifik kanal dimensioner ritades och fabricerade av mikro-fräsning i aluminium-bladet. Den spiral kanal som används i denna studie var en 8-loop spiral microchannel med ett inlopp och två uttag, med radien ökar från 8 mm till 24 mm för effektiv storlek-baserade separation. - Placera formen och petriskål i vakuum exsickator att Avlufta tills inga bubblor syns på ytan, vanligen 5-10 min. Använd ett hus-vakuum för exsickatorn.
- Frigör vakuumet och placera mögel och petriskål i en 90 ° C ugn för 1 h.
Obs: En värmeplatta eller andra värmeverktyg kan användas istället för ugn. - Ta bort mögel och petriskål från ugnen och låt den svalna i rumstemperatur i 10 min.
- Försiktigt skär ut konturen och punsch vätska tillgång hålen på enheten med hjälp av en 2 mm hålslag.
Obs: Storleken på stansen kan variera beroende på storleken på guiden slangen eller vätska. - Följa ett band till den kanal sidan av enheten och tjock film av PDMS och skala försiktigt med pincett för att ta bort damm.
- Behandla både kanal sidan av enheten och vanligt PDMS med luft plasma och bond med förberedda stödjande skiktet av vanligt PDMS (figur 1A).
- Placera chipet i 50 x 70 mm glas bilden och placera den i en 70 ° C ugn i minst 30 min att förbättra bindningstyrkan.
2. luftrör sekretion samling från mekaniskt ventilerade patienter
Obs: Luftrör sekret kan erhållas från mekaniskt ventilerade patienter under normala rutinmässiga luftvägarna vård med hjälp av ett protokoll som modifierad från konventionella metoder för att rymma standard, vuxen ventilerade patienten. Proverna var avidentifieras och omedelbart skickas för bearbetning.
- Om luftrör aspiration indikeras, använda en kateter för att extrahera luftvägarna sekret.
- Fram katetern noga halvvägs in i endotrakealtub och ingjuta 5 mL 0.9% steril fysiologisk koksaltlösning från en förfylld 10 mL-spruta.
- När katetern är avancerad fullt eller motstånd är uppfyllt, aspirera sekret och samla i en steril sputum samling behållare.
- Samla 10 mL av luftrör sekret i en steril sputum behållare och placera den på isen. Skicka prover omedelbart för bearbetning.
3. luftrör sekretion provberedning
Obs: Alla experiment måste utföras under en biosäkerhet skåp med lämplig personlig skyddsutrustning.
- Skingra 1 mL av luftvägarna sekretion prover i 9 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) med en plast 10 mL spruta (för en 10 x spädning). Använda en trubbig pipett för att Homogenisera provet slem.
- Sila spädningsvätskan med en 40 µm nylon cell SIL ta bort stora bitar eller blodproppar, som kan blockera mikrofluidik tillgång hålet eller kanalen. Placera provet på isen efter bearbetning.
- Skingra spädningsvätskan av varje prov med hjälp av en 100 x volym av PBS-bufferten, vilket resulterar i en 1.000 x utspädda suspensionen. Placera provet på isen under åtgärden hela dissociation.
4. experimentellt ställa in
Obs: Alla experiment måste utföras under en biosäkerhet skåp med lämplig personlig skyddsutrustning.
- Montera PDMS chip med flytande guide att enhetligt flöde till varje av de fyra spiral mikrokanaler (figur 1B).
Obs: Fyra kanaler användes för att öka genomströmningen av parallelization, samt optimering av volym och cell densiteten av den resulterande suspensionen. Den flytande guiden är designad och tillverkad med en Stereolitografi typ 3D skrivare med tydliga harts. Inlopp och utlopp porten av vätska guide använder honkontakter Luer för enkel anslutning och stabil tätning under operationen. - Anslut en 1/16-tums Luer hankontakt till inloppet, inre vägguttaget (IW) och yttervägg (OW) utlopp porten av vätska guide och en silikon slangar till provet upphängningen.
- Infoga trubbiga tips till varje ände inlopp och butiker att nå botten av reservoaren provet.
- Anslut den peristaltiska pumpen med inlopp slangen.
- Placera i slutet av inlopp slangar och IW utlopp slang i reservoaren prov och placera änden på OW utlopp slang i reservoaren avfall (figur 1 c, D).
- Placera de 50 mL tub av filtrerade PBS utan kalcium och magnesium i reservoaren provet.
- Börja pumpa med en låg flödeshastighet (~ 1 mL/min) till prime enheten.
Obs: När bubblor fångas i kanalen, driva upp på kanalen med denna pincett att destabilisera och eliminera luftbubblor. När enheten är helt fylld med buffertlösning, ändra PBS röret för att förbereda luftvägarna sekretion prov röret. - När provet placeras i reservoaren prov, slå på den peristaltiska pumpen och ställa in flödet på 4 mL/min (figur 1 c, D).
- När provvolymen når den angivna volymen (~ 1 mL), stoppa driften och koppla bort silikon slangar.
Obs: Den föreslagna metoden är mer effektiva på att minska en stor volym spädningsvätska (> 50 mL) i en mikro-centrifugrör volym (~ 1 mL) (figur 2).
5. Flödesanalys flödescytometri
Obs: För att jämföra metoderna dissociation (mikrofluidik och lysis), användes flödescytometri med immunofluorescens.
- Lägg till fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) - konjugerade musen anti-humant CD66b monoklonal antikropp och allophycocyanin (APC) - konjugerad mus anti-human CD45 monoklonal antikropp till inledande suspensioner (steg 3.3) och resulterande suspensioner (steg 4,9) (200 µL av varje antikropp) i förhållandet 1:25 v/v.
- Inkubera proverna vid 4 ° C i mörker i 30 min.
- Analysera både prover på en flödescytometer att kvantifiera PMNs.
Obs: Befolkningen som är FITC-APC dubbel positiv, CD66b positiv och CD45 positiva ansågs vara neutrofiler. Återhämtning beräknades genom förhållandet mellan summacell numrerar av input och den resulterande suspensionen.
6. NE Release analys
Obs: För att jämföra funktionerna i den isolerade neutrofila av metoden mikrofluidik och Lys, en NE analyssats användes.
- Lägg till PMA (tillhandahålls i assay kit) till varje resulterande avstängning (erhålls vid steg 4,9) till en slutkoncentration av 50 nM.
- Inkubera proverna vid 37 ° C i 2 h.
- Centrifugera upphängningarna vid 300 x g i 10 min.
- Över 10 µL av varje supernatanten till en plattan med 96 brunnar (tillhandahålls i assay kit).
Obs: En 96 brunnar mikroplattan med platt botten och svart polystyren kan användas också. - Tillsätt 90 µL utspädda analysbuffert (tillhandahålls i assay kit) till varje brunn.
- Tillsätt 10 µL av elastase substratet (Z-Ala-Ala-Ala-Ala 2Rh110, i assay kit).
- Inkubera i 1,5 timmar vid 37 ° C.
- Läs den plattan med 96 brunnar med en fluorometer vid en magnetisering våglängd av 485 nm och emissionsvåglängden 525 nm.
Obs: Nivån på NE delades av PMN greven från flödet flödescytometri analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi uppnådde transparent immun-cellsuspensioner med båda DTT mucolysis och mikrofluidik dissociation (figur 3A). Mikrofluidik dissociation samlat 4,40 x 105 PMNs i genomsnitt (2,1 x 104 till 5,60 x 105 PMNs, n = 6) från luftvägarna sekretion prover utspädd 1.000-faldig (50 mL totalvolym) i 1 mL ren suspension. Jämfört med ursprungliga spädningsvätskan och 94,0% PMNs (CD66b+/CD45+) återfanns i en liten volym, konsekvent över 6 kliniska prover. Metoden DTT mucolysis visade dock en 53,5% återvinning i genomsnitt med betydande prov till prov variationer (30,8-96,0%) (Figur 3B).
Nästa, frisläppandet av elastase undersöktes med en kommersiell NE assay kit som ett proof-of-concept. Utan extern stimulering, provet utarbetat metoden mucolytic visade en högre NE nivå än provet från metoden mikrofluidik. PMA lades till de resulterande suspensioner från både mikrofluidik och mucolytic dissociation metoder att NE frisättning. Vi testade varje metod med luftvägarna sekretion prover från 6 olika patienter. Immunceller som separeras med mikrofluidik presenteras intakt funktionalitet, visar en ökad mängd NE släppa av PMA stimulering. Å andra celler som utarbetats av metoden mucolytic dissociation visade en inkonsekvent av NE release (figur 3 c).
Figur 1: Spiral mikroflödessystem enhet och experimentella inställningarna. Fotografera bilder av (A) spiral mikrofluidik och (B) enheten monteras med fluidic adaptern. (C) Schematisk bild av slutna separation med spiral tröghetsbaserad mikrofluidik. Genom recirkulerande partikel/cell koncentrerad ström (IW utlopp) tillbaka till den ursprungliga prov reservoaren, immunrelaterade celler var koncentrerade i en liten volym medan den bakgrunden vätska som innehåller mucin aggregat och mindre röda blodkroppar var kontinuerligt bort genom avfall röret ansluts till OW uttag. (D) experiment och fluorescerande bilden av en 10 µm partikel, banan (grön) och uttaget av spiral kanalen (övre högra). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk bild av luftvägarna sekretion provberedningen använder slutna tröghetsbaserad mikrofluidik. Kliniskt inducerad luftvägarna sekretion spridda mekaniskt i 1000 x volym buffertlösning. Spädningsvätskan är koncentrerad av mikrofluidik, vilket resulterar i ~ 1 mL cellsuspension med tydlig bakgrunden. Anpassad med tillstånd från Ryu et al., Copyright (2017) American Chemical Society17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa jämförelser av DTT mucolytic metoden till metoden mikroflödessystem dissociation. (A) luftrör sekret prov (vänster) och mikroskopisk bild efter mikroflödessystem dissociation. (B) fotografisk bild av de ursprungliga och resulterande suspensioner. (C) jämförelse av PMN återvinningsprocent mellan metoderna mucolytic och mikrofluidik. (D) jämförelse av NE release av separerade neutrofiler av mikrofluidik och DTT mucolytic metoder före och efter PMA stimulering. NE release utlöstes betydligt av PMA på prov från mikroflödessystem separation (p < 0,0001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I tröghetsbaserad mikrofluidik lokalisera partikel och celler vid en viss lateral position i en mikro-kanal baserat på deras storlek5,18,19,20. På grund av den kombinerade effekten av dekanus dra kraft och den tröga lyftkraft i böjda microchannel, stora partiklar eller neutrofiler (> 10 µm) är belägna inne i kanalen och små partiklar, slem aggregat och skräp mindre än 6 µm är placerade utanför kanalen på vissa flödeshastigheten villkor10,11,13,14.
Det finns dock en avvägning mellan koncentration och återhämtning av separation när du använder mikrofluidik, särskilt när intervallet separation storlek av partikeln eller cellen sevärdheter överlappar andra celler och partiklar. För att uppnå en hög koncentration av sorterade partiklar och celler, intervallet separation måste vara smala och kräver en finjustering med mikroskopisk observation för varje prov körning; Detta begränsar användningen av tröghetsbaserad mikrofluidik på heterogena biometri, såsom luftvägarna sekret.
Här introducerar vi en klinisk luftvägarna sekret prov förberedelse metod för in vitro- analyser använder slutna tröghetsbaserad mikrofluidik (figur 1B, C). Slutna driften av återcirkulation av partikel/cellen genom en fokusering utlopp uppnåtts både faktorer som hög koncentration och hög återvinningsgrad. OW utlopp flyter in avfall röret och IW uttaget matas kontinuerligt till det ursprungliga prov röret. Celler som är större än 10 µm i diameter kvar i det ursprungliga prov röret, således ökar cell densiteten av provet, medan bakgrunden vätskan elimineras avfall röret. Den kraftig spädning tillåter clearance av bakgrunden vätska, inklusive skräp och slem. Också, oavsett villkora av patientprov, den föreslagna metoden kan jämnt avstånd och isolera immunceller.
DTT är en allmänt använd mucin lyseringsbuffert som klyver disulfide obligationer i proteoglykan aggregering till separata cellinnehållet av Mucilago1,21,22. DTT stör dock enligt uppgift ytantigener vita blodkroppar, vilket kan påverka leukocyt funktion2. I vår studie var cellulära innehållet återkrävas av DTT dissociation inkonsekvent över prover, på grund av icke-enhetlig mucolytic effektivitet och igensättning av filtret. Detta blir mer kritisk för beredning av Utfallsprover med små volymer och relativt tjocka luftvägar sekretion prover. Däremot, aktiverat metoden använda mikrofluidik konsekvent återvinning av cellinnehåll i heterogena patientprover (figur 3 c). Som visas i figur 3B, kunde vi konsekvent isolera cellinnehållet av luftvägarna utsöndringen i en ren buffert oavsett det ursprungliga provet tillståndet, dvs blodiga, envisa eller vattnig. Den föreslagna metoden jämfört med den konventionella metoden, och har mindre skräp i återvunna provet, vilket minimerar risken för påverkan av skräp i nedströms biokemiska analyser.
NE release undersöktes för att utvärdera tagna neutrofiler funktionella integritet av båda anrikningsmetoder (figur 3D). Neutrofiler tar bort främmande organiska molekyler genom NE släppa23,24,25. PMA är vanligen används för att aktivera neutrofiler in vitro-26. Celler som isolerats av mikrofluidik och mucolytic (DTT) metoder stimuleras med 50 nM med PMA. Vi testade varje metod med mänskliga luftvägar sekretion prover (märkt som P173, P174, P176, P177, P181 och P182). Prover som koncentrerade med mikrofluidik visade en ökning i NE av PMA stimulering för alla 6 prover. Däremot kunde bara 3 av DTT behandlade proverna inducera ökad NE aktivitet efter PMA stimulering. Dessutom visade neutrofilerna isolerat av DTT mucolytic metoden mycket högre originalplan aktivitet än neutrofilerna isolerat av mikrofluidik. Dessa resultat visade möjligt kemisk störning av NE maskinen, dvs störningar av ytan bunden antigen2,3, vilket tyder på att mikrofluidik är en förbättrad metod när det gäller bevara den neutrofil funktion än DTT homogenisering. Den föreslagna dissociation-metoden fungerar också på ett automatiserat och komplett sätt, minimera exponeringen av patientprover med potentiella faror för den yttre miljön.
Den föreslagna metoden kräver dock en hög flödeshastighet och därmed en stabil fluidic anslutning. Också, på grund av den inneboende fluktuationen av peristaltiska cirkulationspumpen, dimensionen IW utlopp måste vara större än dimensionen OW utlopp, annars genomströmning kan äventyras. Vi förväntar oss att den föreslagna metoden ger högre genomströmning om det finns en cirkulationspump som kan ge en mer stabil flödeshastighet.
Genom att tillhandahålla en dissociation-protokollet för att fånga neutrofiler från kliniska luftvägarna sekret, är metoden presenteras i denna studie beräknade att utvidga tillämpningsområdet för klinisk forskning om sjukdomar i andningsorganen, såsom lunginflammation, astma, cystisk fibros, och kronisk obstruktiv lungsjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har lämnat in en patentansökan på den teknik som beskrivs här.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH/NIAID (R21AI119042) samt NIH U24 prov Sparing assay program (U24-AI118656).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
References
- Hamid, Q., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).
- van Overveld, F. J., et al. Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells. J Physiol Pharmacol. 56, Suppl 4. 143-154 (2005).
- Qiu, D., Tan, W. C. Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression. J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).
- Usher, L. R., et al. Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection. The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).
- Di Carlo, D.
- Martel, J. M., Toner, M. Inertial focusing dynamics in spiral microchannels. Phys Fluids. 24 (3), 32001 (2012).
- Zhang, J., et al. Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review. Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).
- Warkiani, M. E., et al. Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics. Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).
- Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics. Sci Rep. 5, 11018 (2015).
- Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications. Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).
- Kwon, T., et al. Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture. Sci Rep. 7 (1), 6703 (2017).
- Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section. Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).
- Guan, G., et al. Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation. Sci Rep. 3, 1475 (2013).
- Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J Vis Exp. (8), e319 (2007).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Ryu, H., et al. Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics. Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).
- Xiang, N., et al. Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels. Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).
- Lotvall, J., et al. Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome. J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).
- Houston, N., et al. Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst. J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).
- Janoff, A., Scherer, J. Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).
- Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. The role of neutrophil elastase in acute lung injury. Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).
- Rubin, B. K. Plastic Bronchitis. Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).
- Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system. Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).
