Summary
本文介绍了 果蝇脑的体外钙成像协议。在这种方法中, 自然或合成化合物可以应用到缓冲, 以测试他们的能力, 激活特定神经元的大脑。
Abstract
通过内分泌信号, 例如从外围到大脑, 器官对器官的传播对于维持稳态是必不可少的。作为内分泌研究的动物模型, 具有成熟基因工具和基因组信息的果蝇正在越来越多地被使用。本文介绍了一种用于果蝇脑外植体的钙成像方法。这种方法能够检测到大脑中荷尔蒙的直接信号。众所周知, 许多肽荷尔蒙通过 G 蛋白偶联受体 (受体) 作用, 其活化导致胞内 Ca2 +浓度增加。神经激活还提升了胞内 ca2 +级别, 从 ca2 +的流入和释放 ca2 +存储在内质网 (ER)。钙传感器 GCaMP 可以监视这些 Ca2 +的更改。在该方法中, GCaMP 表达在感兴趣的神经元中, GCaMP 表达的幼虫脑被解剖和培养为前体.然后将试验肽应用于脑外植体, 用装有 CCD 摄像机的旋转圆盘共焦显微镜检测 GCaMP 的荧光变化。使用这种方法, 任何水溶性分子都可以进行测试, 与神经活化相关的各种细胞事件可以使用适当的荧光指示器进行成像。此外, 通过修改成像室, 该方法可用于图像其他果蝇器官或其他动物的器官。
Introduction
器官对器官的沟通是一种进化保守的策略, 用于维持动态平衡以应对环境变化。在人类中, 各种激素 arereleased 从内分泌腺体进入循环。许多这些荷尔蒙的目标是大脑的下丘脑, 它调节新陈代谢过程和基本行为, 如喂养1,2。许多荷尔蒙是用哺乳动物模型发现的。然而, 它们的行动机制, 特别是他们参与的 interorgan 网络, 在很大程度上仍然不清楚。
果蝇已成为研究器官与器官沟通的有用模型。在昆虫中, 许多生理过程是由荷尔蒙控制的。早期研究侧重于生长和变形使用大昆虫。在这些研究中, 特定器官的移除或移植预测了器官间信号分子的存在;后来, 青少年激素 (JH), Prothoracicotropic 激素 (PTTH) 和昆虫蜕皮激素生化纯化3, 4, 5.在昆虫生命周期的6、7中, 大量的细胞间信号肽被认为涉及各种生理事件。大多数这些肽作用于 G 蛋白偶联受体 (受体), 虽然特定的受体最初难以识别使用常规方法。果蝇全基因组序列8的发布是一个突破, 它使果蝇生物活性肽的鉴定与其他昆虫的同源性有关。此外, 用细胞培养为基础的 GPCR 配体结合试验, 从基因组预测的受体中发现了几种多肽受体。其次, 表达分析预测这些肽和受体诱发的器官对器官通路。值得注意的是, 许多假定的肽受体在大脑中表达, 这表明大脑是肽类激素的主要目标9。此外, 在果蝇中, 先进的基因工具有助于鉴定肽 GPCR 组合的生理作用。例如, 基于 GAL4 和莱克萨的二进制转录系统可以在空间和世俗控制的方式下使基因击倒或过度表达。GAL4 是酵母中识别的转录因子, 它与一种称为上游活化序列的特定顺规序列结合在一起。在 GAL4/UAS 系统中, 驱动程序行提供了组织特定的或特定于阶段的 GAL4 表达式, 而应答器线携带感兴趣的基因或构造来驱动 shRNA 表达式的无人机上游。莱克萨/LexAop 系统基于类似的机制。表型分析的组织特异性肽击倒和组织特异性 GPCR 的动物可以揭示的信息, 肽 GPCR 信号的模式和行动地点。然而, 仅仅通过遗传数据就可以得出的结论是有限的。另一方面, 一旦特定肽类激素的假定目标被缩小到组织或细胞类型, 在器官外植体中的活体钙成像可以用来阐明由肽 GPCR 信号介导的器官对器官的传播。在 Gq 耦合的 GPCR 激活后, 由于从 ER10释放 ca2 + , 胞内 ca2 +浓度增加。在大脑中, 神经激活还提升了胞内 Ca2 +级。此类 Ca2 +的增加可以通过钙传感器检测, GCaMP 在 Ca2 +的存在下发生构象变化, 导致荧光发射11。
本文介绍了一种使用果蝇脑外植体的钙成像方法。为了测试多肽激活特定神经元的能力, 将测试肽应用于 GCaMP 表达的脑外植体, 并通过共聚焦显微镜对荧光变化进行监测。GPCR 的参与, 然后确认通过执行相同的化验, 使用突变的大脑缺乏 GPCR。这种成像和遗传学的结合提供了关于多肽受体的器官与器官通讯的精确信息. 还讨论了此协议的可能修改和应用。
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Protocol
1. 幼虫脑外植体的制备
- 制作一个成像室。
注意: 稳定的记录要求将脑外植体拴在一起。这里, 在 Ca2 +成像系统中使用了一个低成本、手工制作的成像室。- 使用镊子, 划伤塑料培养皿 (35 毫米 x 10 毫米) 的底部中心, 为幼虫大脑的腹神经节创造一个凹痕, 使安装更加容易 (步骤 1.3,图 1)。
- 用牙签, 放置一小滴超强力胶水在凹痕的两边, 并附上一个钨棒 (0.125 毫米直径, 6 至7毫米长度) 的胶水。
- 使用一小块腻子样的可重用胶粘剂, 使凹痕 (图 1) 周围的圆形壁 (直径10毫米和3毫米高)。
注: 墙内的空间后将填充磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS; 0.14 米氯化钠, 0.0027 米氯化钾, 0.01 米 PO43-, pH 7.4 @ 0.05 在25°c)。
- 动物制剂
注: 对于钙成像, 钙指示器, GCaMP6s, 是表达的细胞类型的兴趣, 这是通常实现使用组织特定的 GAL4 和UAS-GCaMP6s的组合。为了确保信号通过候选受体介导, GCaMP6s 也表达在受体缺陷的突变体中。- 当对不同基因型如野生型和突变体进行实验比较时, 年龄匹配试验幼虫避免 GCaMP6 表达水平的变化和生理上的差异, 由于发育阶段。
- 保持父母苍蝇 (每性别30苍蝇) 在一个文化小瓶, 其中含有标准的飞行食品8小时, 允许产卵的食物表面。在12小时的光暗循环下, 在25摄氏度和 60-70% 相对湿度下, 培养幼虫的质量。
- 幼虫脑解剖
- 在产卵后90-120 小时 (AEL), 收集幼虫, 用蒸馏水冲洗至少3次, 以除去附着的食物碎片。
- 将一个幼虫放在一个1.5 寸的方形手表玻璃上, 里面装满了冰冷 PBS。
注: 下两步是在这个手表玻璃下进行解剖显微镜。 - 用镊子轻轻抓住幼虫中间部分。使用另一钳抓住嘴钩和拉嘴钩轻轻地把包含大脑的幼虫的前部与身体的其余部分分开。
注: 另外, 可以使用手术剪刀。 - 用镊子抓住前尖, 把幼虫翻出来。除去附着在大脑上的多余的组织, 如形象盘、脂肪体和环腺。轻轻地将大脑与口器分开。
- 将200µL 的 PBS 应用于在成像室中由腻子状可重用胶粘剂制成的环内。用 PBS 轻轻吮吸被解剖的大脑, 然后把它转移到成像室。
- 将大脑设置成成像室
- 使用钳抓取肌肉纤维从腹神经节延伸。将大脑轻轻插入钨线下面的凹痕。
- 使用另一个钳, 将钨线稍稍向上拉, 将大脑置于正确的成像位置 (图 1)。
2. 获取 Ca2 +荧光图像
注: 在 PBS 中浸泡的脑外植体采用荧光显微镜, 配备20X 水浸泡物镜 (0.5)。PBS 不会激活大脑中的细胞。如果需要 Z 轴图像, 物镜将与压电激活的透镜移动器一起安装。采用旋转圆盘共焦头, 提高了时间分辨率。对于低光成像, 电子倍增电荷耦合装置相机安装在显微镜上。GCaMP6s 荧光成像 (激发/发射: 488/509 nm) 需要一个 488 nm 激光器的励磁与分色光束分配器和发射过滤器 (e. g, 528, 38 nm 带通滤波器)。
- 在显微镜下放置包含脑外植体的成像室。
- 降低物镜, 直到它触及 PBS。在光明场光照下, 定位大脑并将其聚焦。切换到荧光灯, 并调整 GCaMP6s-labeled 细胞的焦点。
注意: GCaMP6s 的基底绿色荧光应该是可见的。 - 使用适当的采集软件 (e. g, µManager), 在水冷模式下以 512 x 512 像素的分辨率开始获取250毫秒/帧。调整曝光时间, 在 CCD 摄像机的动态范围内获得荧光值, 但不低于 1000 (任意单位), 具有16位图像 (动态范围 0-65,535)。
注意: 低曝光时间应用于减少 GCaMP6s 的光漂白。在每个实验中应优化曝光时间, 因为这取决于 GCaMP6 的表达水平和检测系统的灵敏度。这是 100 ms 在我们的实验中使用dilp2 > GCaMP6s.当给定成像深度需要 z 段时, 可以根据曝光时间和帧间隔来获取多个 z 剖面图像。如果相机有足够的空间分辨率, 则应增加 binning 大小 (芯片上的寄存器数, 将作废成一个数字像素), 以减少曝光时间。 - 一旦确定了成像参数, 在肽管理之前采取1分钟的图像来检测基线信号强度 (F0)。
- 应用试验肽;为此, 在 PBS 中溶解100µL 肽溶液, 并将其直接注入幼虫浴中, 以产生最佳浓度。
注: 肽溶液应缓慢注射 (例如, 流速20µL/秒) 进入浴缸溶液使用吸管。在 PBS 中溶解的不相关合成肽被用作阴性对照。 - 记录 GCaMP6s 发射数分钟。
3. 数据分析
注意: 图像数据与 ImageJ 进行离线分析。在时间推移成像, 吹打导致幼虫大脑移动。因此, 在分析前应纠正序列图像的位置畸变。更正可以使用 ImageJ 插件执行, TurboReg 如下所示。
- 打开分析软件, 并使用第一帧 (在多肽应用程序之前) 作为参考图像。
- 选择插件 |注册 |TurboReg。
- 选择串行图像文件作为Source , 并将引用图像作为目标。
- 检查刚体(图像的平行位移和旋转) 和精确("快速") 的处理方法和质量分别是粗而快速的分析。
- 单击批处理开始图像处理。
- 使用分析 | "选择多个感兴趣的区域 (ROIs)" |工具 |ImageJ 中的 ROI 管理器。
- 单击更多 |多项措施 |OK在 ROI 管理器窗口中。
- 计算ΔF0 = (f f0)/f0, 其中 f 是刺激时的 ROI 强度, 而 f0是在特定实验事件之前 (例如, 30 帧之前) 的时间窗口中的强度。刺激发作)。
- 用多个脑样本重复实验, 进行统计处理, 获得平均 (SEM) 在每个时间点的平均值和标准误差。
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Representative Results
利用这一协议, 研究了肽类激素 CCHa2 对脑胰岛素生成细胞的活化作用。野生型脑的化学品方案使用dilp2GAL412 (来自 Rulifson 博士的礼物) 和UAS-GCaMP6s13 (金博士的礼物) 的组合标记了 GCaMP6s。采用合成 CCHa2 肽对幼虫脑外植体进行治疗, 并实时记录 GCaMP6s 的荧光。在这个实验中, 图像是从一个单一的焦平面获得的。每个 IPC 群集包含大约14个单元格14, 并且检测到来自3到6个单元格的信号。GCaMP6s 信号强度在 CCHa2 管理 (图 2A、电影 1) 上显著增加。野生类型的大脑并没有表现出对生长激素或孤啡肽 (分别为电影 2和 3) 的明显反应, 它们是没有果蝇同系物的哺乳动物肽荷尔蒙。这些结果表明, CCHa2 的活化是对 CCHa2 的特定反应。为了澄清 CCHa2 是否通过 CCHa2-R 的行为, 使用 CCHa2-R 突变体大脑进行了同样的分析。在突变体大脑 CCHa2 管理后, 没有观察到信号强度的增加 (影片 4)。统计分析表明, 野生型和CCHa2-R突变体之间的信号强度差异在 CCHa2 应用后2分钟内变得显著, 并维持至少7分钟 (图 2B)。这些结果表明, CCHa2 通过 CCHa2-R 特别激活了化学品方案。本研究使用的所有肽均由 PBS 稀释, 最终浓度为 10-9 m。
图 1.成像室
(A)培养皿 (35 毫米 x 10 毫米), 带有小凹痕和拉杆。(B) 环形墙体, 由腻子状可重复使用的粘合剂制成。(C) 在成像室中插入幼虫脑外植体。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.幼虫脑外植体的钙成像研究
野生类型 (dilp2-Gal4/UAS-GCaMP6s) 大脑暴露于 CCHa2、生长激素和孤啡肽。CCHa2-R突变体 (dilp2-Gal4, CCHa2-RTAL-34/UAS-GCaMP6s, CCHa2-RTAL-34) 大脑暴露于 CCHa2。250 ms/框架共聚焦显微镜检测了 GCaMP6s 信号。所选时间点的静止图像显示在 (A) 中。图像 pseudocolored, 以更好地可视化不同的信号强度。每个时间点的ΔF0在 (B) 中绘制。ΔF0是从5到10种不同的准备工作计算出来的。ROIs 被设置在同一焦平面上检测到的细胞体上。实线表示5到10个样本的平均值, 虚线标记平均值的标准误差的上下限。阴影区域表示实验中信号的变化。刻度条指示50µm。该图由佐野et . 调整而成。15.请单击此处查看此图的更大版本.
影片1。暴露于 CCHa2 15 的野生类型化学品方案 请单击此处查看此视频。(右键单击可下载)
影片2。暴露于胃饥饿素的野生型化学品方案15 请单击此处查看此视频。(右键单击可下载)
影片3。暴露于孤啡肽15的野生类型 化学品方案请单击此处查看此视频。(右键单击可下载)
影片 4.CCHa2-R向 CCHa2 公开的变种人化学品方案15 请单击此处查看此视频。(右键单击可下载)
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Discussion
此处描述的 Ca2 +成像方法是一种用于测试大脑中荷尔蒙功能的有用系统。在体内,大脑接收来自各种内分泌器官的荷尔蒙。此外, 大脑不断感知上升的感官信息, 这会导致自发的神经元活化。此前体系统消除了此类噪音, 并产生了比体内成像更好的信号/噪声比。在这个系统中, 分子可以单独或组合测试。除了肽荷尔蒙, 任何水溶性分子, 包括天然或合成化合物, 都可以应用于脑外植体。
对于 Ca2 +成像, 脑外植体需要拴在一起。为此, 用低熔点琼脂糖或纤维蛋白制成的凝胶基质以前使用过16,17。这些凝胶基质可以稳定地保存样品, 但是, 组织加热在30摄氏度以上。这种温度会引起 poikilothermic 动物如昆虫的热休克反应。为了避免热应力, 大脑可以被拴在身体上。附着在角质层上的大脑与昆虫引脚固定在一起18。我们的方法使用钨线提供简单和稳定的样品持有。该系统易于准备和可重用, 并允许兴奋剂比凝胶嵌入方法更容易到达靶细胞。因此, 这将是有用的配体筛选。
荧光指示器的选择取决于目标神经元的类型, 神经元中表达的受体类型, 以及正在处理的生物学问题。为检测各种时间 Ca2 +动态而优化的一系列 GCaMP6 变体已生成13。特别是, GCaMP6 变种在他们的反应动力学不同: GCaMP6s (慢), GCaMP6m (媒介) 和 GCaMP6f (快速)。GCaMP6s 和6m 的衰变时间相对较慢 (i. e, τ1/2 , 在海马切片准备中有10动作电位), 而对于 GCaMP6f 来说则是快速的 (τ1/2在1动作电位之后)。其他类型的神经活动荧光指示器包括 EPAC 阵营 (阵营), Synapto-pHluorin (突触释放), 和震波女 (膜电位) 19, 20, 21.这些基因编码的荧光指示器可以用特定的细胞类型表达。因此,前体成像系统可以检测所需神经元中的各种响应。
此协议中有几个关键步骤。首先, 必须从大脑中取出多余的组织以获得清晰的图像。使用锋利的钳和外科剪刀减轻微妙的工作。第二, 解剖的大脑应该固定到位。偶尔, 大脑样本从吹打 (范围大约5µm) 略有移动。为了防止大脑移动, 在成像室中的钨线高度应调整到大脑样本的大小。另外, 还可以安装重力给料灌注系统进行温和刺激。第三, 大脑成像的结果应该谨慎解释。在大脑中应用的配体可能刺激意想不到的神经元, 进而激活目标神经元。为了检测激素对特定神经元的直接影响, 应在 targetneurons 中对受体进行击倒。在这种情况下, 荧光指示器的表达可以与使用 Gal4/UAS 系统的受体 rna 干扰相结合。
该协议的一个次要限制是, 由于大脑样本的最终损伤, 成像的持续时间是有限的。在我们的手中,果蝇大脑可以被成像最多约60分钟使用此协议。淋巴样的溶液, 如 HL3.1 盐水22和激光强度可以使长期成像。此外, 目前的成像设置不适合重复刺激相同的样本。对于这样的实验, 可以使用灌注浴。
最后, 该协议具有多种应用。通过修改成像室, 成人大脑和其他的果蝇组织或其他动物的组织可以被成像。在非模型生物中, 缺乏基因工具使得在基因组中引入荧光指示器变得困难。然而, 最近开发的 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术为这些动物的基因工程开辟了大门。因此, 本议定书可用于研究各种动物的器官间信号。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了来自 jsp (15K07147、17K07419)、佐野基金会研究补助金 (HI) 和发展医学联合使用/研究中心 (Ishimoto) 的援助资助, 在熊本大学分子胚胎学与遗传学研究所 (HS)。我们感谢梓 Kamikouchi 博士和山田 Daichi 先生在使用成像系统方面的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten rod | A-M systems, Sequim, WA, USA | 717000 | |
| Blu Tack | Bostik, Paris, France | 3049100 | putty-like reusable adhesives |
| Watch glass, square, 1 5/8 in | Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA | 742300 | |
| PBS | TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan | T900 | Phosphated buffered salts |
| CCHa2 | SCRUM Inc., Tokyo, Japan | Custum-synthesized peptide | |
| Ghrerin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4372-s | |
| Nociceptin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4313-v | |
| Axio Imager A2 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Axio Imager A2 | fluorescence microscope |
| Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | 420957-9900-000 | water-immersion objective lens |
| P-725 PIFOC objective scanner with long travel range | Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | N/A | piezoelectric-activated lens mover |
| Confocal Scanner Unit CSU-W1 | Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan | CSU-W1 | spinning disc confocal head |
| ImagEM C9100-13 | Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan | C9100-13 | EM-CCD camera |
| OBIS 488 nm LS 60 mW | Coherent, Santa Clara, CA, USA | 1178770 | 488-nm laser |
| 488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock, Rochester, NY, USA | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | dichroic beam splitter |
| 528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock, Rochester, NY, USA | FF01-528/38-25 | emission filter |
| µManager | Open Imaging, Inc. | N/A | https://micro-manager.org |
| ImageJ | U. S. National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| TurboReg | Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne | N/A | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ |
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