Summary
Эта работа предоставляет метод для изготовления на основе капелька microfluidic платформ и применение полиакриламида микросферы для микросфер ПЦР-амплификации. Микросфера PCR метод делает возможным получить одноцепочечной ДНК ампликонов без разделения двуцепочечной ДНК.
Abstract
На основе капелька микрофлюидика возможность надежного производства однородных микросфер в канале microfluidic, предоставляя контролируемый размер и морфология полученные микросфер. Микросфера Сополимеризованная с acrydite ДНК-зонд был успешно сфабрикованы. Различные методы, такие как асимметричное PCR, при exonuclease пищеварение и изоляции на стрептавидина покрытием магнитные бусы может использоваться для синтеза ДНК одноцепочечной (ssDNA). Однако эти методы не могут эффективно использовать большие объемы высокоочищенных ssDNA. Здесь мы описываем микросферы ПЦР протокола, детализируя как ssDNA можно эффективно усиливается и отделены от dsDNA просто дозирование из трубки реакции PCR. Амплификация ssDNA может применяться как потенциальные реагенты для microarray ДНК и ДНК-SELEX (систематической эволюции лигандов на экспоненциальное обогащения) процессов.
Introduction
Одноцепочечной ДНК (ssDNA) широко рассматривается как элемент молекулярного распознавания (MRE) из-за его внутренние свойства для ДНК-ДНК гибридизации1,2. Разработка ssDNA синтетических систем может привести к биологических приложений, таких как ДНК microarrays3, oligotherapeutics, диагностика и комплексной молекулярной зондирования на основе взаимодополняющих взаимодействия4,5.
На сегодняшний день, Микрометр шкала полимерные частицы были успешно продемонстрированы используя microfluidic приборы. Несколько методов microfluidic доказали быть мощным для производства весьма однородной микросфер на непрерывный поток в микроканальные среды6,7.
В исследовании Lee et al. 8, на основе капелька microfluidic платформа для microfluidic синтеза copolymerizable oligo микросферы и ssDNA амплификации было сообщено. Microfluidic платформа состоит из двух слоев PDMS (полидиметилсилоксан): Верхняя часть с microfluidic канала сети для генерации микросфер и дно плоской части. Они состоят из трех видов PDMS аэрогидродинамических каналов: 1) поток канал для поколения капелька, 2) серпантином канал для смешивания двух решений и 3) последовательных полимеризации канал для микросфер затвердевания. После того, как в один канал аэрогидродинамических PDMS вводятся две Несмешивающиеся потоков, потоков может быть принужден через узкие отверстия структуру. Потока поведения, таких как канал геометрии, скорость потока и вязкость влияет на размер и морфология микросфер. Таким образом основной поток жидкости можно подразделить микромасштабной monospheres9,10.
Здесь подробные микросферы ПЦР протокола предоставляется для амплификации ssDNA. Во-первых описан процесс проектирования устройств на базе капелька microfluidic. Затем объясняется способ, в котором полиакриламида микросферы можно функционализированных с случайных ДНК шаблон на взаимодополняющей основе. Наконец показана микросферы ПЦР протокола для усиления ssDNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изготовление PDMS Microfluidic платформа
- Подготовка 20 мл жидких PDMS форполимера путем смешивания базового полимера и катализатором в том соотношении 10:1. Залейте 10 мл жидкости PDMS на подготовленной прессформы Су-8 на кремниевой пластины для верхней части microfluidic сети. Для нижней равнинной части Налейте такой же объем жидких PDMS на кремниевой пластины без структуры формы.
Примечание: Сеть microfluidic разработан в программе CAD и затем преобразуется в фотошаблонов для того, чтобы изготовить мастер, с помощью процесса типичный фотолитографии (см. Дополнительные цифры). Этот мастер состоит из негативного фоторезиста Су-8 плесень на кремниевых пластин11. - Место два кремниевых пластин с покрытием с жидким PDMS форполимера на горячей пластине и лечения при 75 ° C за 30 мин.
- Вручную слезает вылечить PDMS слой от плесени Су-8. Совместите диаметром 1,5 мм круглые отверстия перфорации инструмент для нефтяной порт в реплицированной microfluidic сети для интерфейсов каналов потока микрон шкала с образцами жидкости макрос. Выбивать через отверстие вручную.
- Повторите это штамповка процесс три раза для формирования двух решений и выход порта.
- Выполните гидрофильные обработка поверхности на верхней и нижней PDMS слои с помощью ручных Корона Протравливатель12 на несколько секунд на сэмпл.
- Стек две плазмы лечение PDMS слои и тепла на 90 ° C за 30 минут с помощью плита для процесса склеивания PDMS-PDMS. Снабжения водой под давлением, с использованием шприцевый насос в три входе портов для Структурное склеивание и утечки тестирование готовых устройства.
2. производство полиакриламида Oligo микросферы
- Подготовьте шарик смесь, подробно изложены в таблице 1.
- Вихрь и кратко центрифуги acrydite Стандартный ssDNA помечены зонд (Ap, 100 мкм) и acrylamide:bis (19:1) раствор.
- Приготовляют раствор я путем смешивания 25 мкл 40% акриламида бис решение, 10 мкл ssDNA (acrydite зонд), 10 мкл буфера 5 x TBE (1,1 М трис; 25 мм ЭДТА, Борат 900 мм) и 5 мкл воды. Готовят раствор II с 50 мкл Персульфат аммония 20%.
- Подготовить два шприцы индивидуально заполнены раствором решение II и я и смонтировать их на насос, чтобы внедрить решение потоки в microfluidic платформа. Подготовить минерального масла, смешанного с 0,4% TEMED для поверхности затвердевание микросфер.
Примечание: TEMED известен как стабилизатор свободных радикалов. Свободные радикалы могут ускорить скорость образования полимера с Персульфат аммония (APS) для того, чтобы стимулировать полимеризации акриламида. - Заполните стеклянной бутылке с 4 мл минерального масла для создания постоянного потока.
- Вставьте две трубы для двух портов в Крышка стеклянная бутылка как microfluidic водохранилище: пневматические порт для применения сжатого воздуха в стеклянной бутылке от воздушный компрессор и жидкости порта для подачи под давлением масла микро канала сети из стеклянной бутылке. Соедините трубы между стеклянной бутылки и нефтяной порт в microfluidic устройства.
- Подключите трубы к портам два решения в microfluidic устройство для того чтобы поставить два решения от шприца насосов. Вставка трубы выход порта для передачи сгенерированный микросфер в стакан.
- Установите скорость потока насоса шприца до 0,4 - 0,7 мл/ч. Отрегулируйте давление сжатого воздуха компрессора с помощью регулятора (82-116 кПа). Задайте скорость вращения (500 об/мин) Магнитная мешалка бар в стеклянный стакан на горячей плите. Управлять шприцевый насос и подачи сжатого воздуха, порожденных внешнего компрессора в стеклянной бутылке с помощью элемента управления вкл/выкл электромагнитный клапан13.
- Наблюдать за формирование микросфер в поток упором геометрии и затвердевания сгенерированный микросфер в стеклянный стакан с цифровой микроскоп.
Примечание: Размер и производство скорость Микросфера зависит от расхода растворов и давление потока минерального масла (таблица 2).
3. выполнение полиакриламида Oligo микросферы графов
- Горяева количественной оценки взять небольшое количество (около 100 мкл) водный раствор полиакриламида oligo микросферы и место на Горяева стекла и аккуратно заполнить Микросфера подвеска хорошо Счетной палаты.
Примечание: Для получения более подробной информации, смотрите http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer. - Использование микроскопа и ручной подсчет счетчик для подсчета микросфер в одном наборе 16 квадратов. Затем переместите Горяева к следующему набору камеры и вести подсчет до тех пор, пока все четыре свода 16 углы отсчитываются.
- Определить средний микросфер и рассчитать количество микросфер в оригинальные подвески из бисера.
- Передавать 100 мкл микросфер пробки microcentrifuge 1,5 мл. Удалите супернатант через мягкое центрифугирование (400 x g) и закупорить.
4. выполнение гибридизации ДНК на поверхности полиакриламида Oligomicrosphere
Примечание: Идентичные ДНК зонд с 5'-NH2-группа вместо 5'-acrytide модификации добавляется в решение, я и испытаны для Ap содержащих микросферы параллельно. ДНК гибридизации результаты показаны на рисунке 2. Cy3-меченых взаимодополняющих олигонуклеотида зонды (Кап) решение должно находиться в темной комнате.
- Ресуспензируйте Cy3-колпачок с использованием 100 мкл буфера 1xTE (TE буфера: 10 мм трис и 1μM ЭДТА, рН 8,0) для достижения конечной концентрации 100 мкм. Например Ресуспензируйте 1 пмоль Кап в 100 мл TE буфера и передачи microcentrifuge трубки покрыта алюминиевой фольгой.
Примечание: Для стренги последовательностей, см. таблицу 3. - Добавьте 100 мкм Cy3-Кап в стерильных 1,5 мл microcentrifuge трубка, содержащая Ap Сополимеризованная микросфер.
- Нажмите трубке несколько раз перемешать и инкубировать в темноте за 1 ч при комнатной температуре.
- Отменить супернатант и удалить остаточные буфера через закупорить.
- Промойте три раза с 500 мкл буфера TE.
- Ресуспензируйте микросферы, осторожно нажав пробки microcentrifuge. Затем повторите шаг 4.4.
- Место микросфер на стеклянное скольжение (75 x 50 мм) и накрыть алюминиевой фольгой до изображений.
5. Асимметричное PCR для усиления ssDNA
- Подготовьте асимметричной смеси реагентов ПЦР для усиления ssDNA для анализа. Оттепель реагентов в таблице 4 на льду. Не держите энзима полимеразы Taq (50 U/мкл) на льду, но скорее хранить его при-20 ° C до тех пор, пока требуется.
- Аккуратно водоворот все реагенты и затем кратко центрифуга трубы на 10000 x g 10 s.
- Объединить все реагенты, как описано в Таблица 4.
- Поместите образцы в Термоциклер и начать Асимметричное PCR при следующих условиях: 25 циклов (95 ° C за 30 s, 52 ° C за 30 s и 72 ° C для 30 s), 85 ° C за 5 мин, удерживайте при 4 ° C.
6. микросферы-ПЦР для усиления ssDNA
Примечание: Этот раздел описывает протокол для усиления ssDNA в пробке реакции PCR. Микросфера-ПЦР-реакции были исполнены в 50 мкл реакции тома. В таблице 5перечислены подробные последовательностей, используемых для того чтобы усилить ssDNA. В этом случае Ap на поверхности микросферы можно отжига для случайных ДНК шаблоны на взаимодополняющей основе. Это очень важный шаг для производства дополнительных нитей ДНК (антисмысловых стренге дна, рис. 3). Продлен ДНК используется в качестве шаблона для микросфер ПЦР-амплификации.
- Подготовка смеси реагентов микросферы PCR. Оттепель реагентов в таблице 6 на льду; Однако не держите энзима полимеразы Taq на льду. Храните его при 20 ° C до тех пор, пока требуется.
- Аккуратно водоворот все реагенты и затем кратко центрифуга трубы на 10000 x g 10 s.
- Получите примерно ~ 25 микросферы через микроскопические подсчета.
Примечание: Количество микросфер в одном реакция трубки рассчитываются с использованием световой микроскоп с увеличением 40 X. Около ~ 25 микросферы применяются для микросфер ПЦР-амплификации. Более подробная информация содержится в шаге 3. - Объединить все реагенты, как описано в Таблица 6.
- Поместите образцы в Термоциклер и начать Асимметричное PCR при следующих условиях: 25 циклов (95 ° C за 30 s, 52 ° C за 30 s и 72 ° C для 30 s), 85 ° C за 5 мин, удерживайте при 4 ° C.
- Следующие амплификации, добавить 8 мкл 6 x загрузки буфера и загрузить 15 мкл каждого образца в 2% агарозном геле. Затем выполните электрофорез на 100 V 35 минут в 1 x TAE (Tris ацетат ЭДТА, 40 мм ацетата Tris, 1 мм ЭДТА, рН 8,2) буфера.
7. confocal микроскопии приобретение
Примечание: Под конфокального микроскопа отражаются результаты микросферы ДНК гибридизации зонда. Анализ изображений осуществляется с помощью ImageJ.
- Исправьте гибридизированные микросфер на этап микроскопа в держатель.
- Выберите лазер (гелий/неоновый лазер, 543 Нм линия) и включите его в лазерной управления.
- Выберите объектива микроскопа управления.
- Выберите требуемый фильтр для Cy3 и канала в конфигурации управления.
- Запустите эксперимент и наблюдать за образец. Параметры для confocal микроскопа резюмируются в таблице 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Готовых полимерных на основе капелька microfluidic платформа состоит из двух слоев PDMS (рис. 1a). Три вида microfluidic канала сети используются для генерации микросферы: 1) потока упором геометрии, как показано на рис. 1b, 2) серпантином канал для смешивания решения I и решения II и 3) полимеризации канал для микросфер затвердевания. Высота всех каналов было 60 мкм. Длина канала для смешивания и полимеризации были 74.35 мм и 94.45 мм, соответственно. Ширины микроканальные для двух несмешивающихся жидкостей потоков и один для потока минерального масла были 100 мкм и 200 мкм, соответственно. Отверстие структура, используемая для формирования Микросфера был 50 мкм длиной и шириной 25 мкм. Угол в структуре диффузор был 37°. На базе лаборатории контроля пневматические системы для непрерывного потока минерального масла и два шприца насосы для раствора потока (рис. 1С) были использованы для генерации микросфер в microfluidic платформа (рис. 1 d). Скорость производства микросфер было около 30 микросфер в секунду, когда скорость потока решений и приложенного давления соответственно на 0,6 мл/ч и 108 кПа, (Таблица 2). Его диаметр в микро канал — 78,7 ± 2,5 м. На поток синтез микросферы можно успешно манипулировать, используя microfluidic устройства. Размеры бисера были измерены после набухания. Средний диаметр результате микросферы был 150.4 ± 12,8 м. Размер вариации были около 8,5%. Микросферы проходят набухание в воде, что привело к увеличению огромных размеров.
Свойство copolymerizable микросфер может изменяться. Мы включили 5'-acrydite ДНК-зонд в Микросфера решение (решения, см. таблицу 1). После сополимеризации, взаимодополняющих ДНК-зонд помечается Люминесцентную краску, Cy3, при комнатной температуре в течение 1 ч. Confocal микроскопии могут использоваться для доказать синтез copolymerizable oligomicrospheres а как функциональные гибридизации на поверхность микросфер. Флуоресцентного изображения Микросфера показаны на рисунке 2. Если микросферы правильно функционализированных с 5'-acrydite ДНК-зонд, они должны привести к освещение флуоресцентные деятельности на поверхности во время эксперимента гибридизации. Если сополимеризации не было правильно, оптических Микросфера изображение будет экспонат внутреннего загрязнения внутри микросфер. Как показано на рисунке 2, нет никакого вмешательства случайных интерьер ориентации. Этот результат позволил нам провести презентацию зонд ДНК в 3-мерной (3-D) договоренности и микросферы PCR. Следует отметить, что идентичные ДНК зонд с 5'-NH2-группа вместо 5'-acrytide модификации сделали не copolymerize во время синтеза по потока Микросфера8.
При работе с микросферы, манипулируя поверхность с олиго ДНК-зонд является гораздо быстрее процесса14. Таким образом платформа синтеза микросфер на поток может обеспечить инструмент для ssDNA амплификации и очистки, как указано на рисунке 3. Шаблон анти смысле ДНК (-, дополнительный шаблон) может быть расширена путем добавления случайного ДНК шаблон (+ шаблон). В этом случае, первоначально Сополимеризованная 5'-Ap обеспечивает 3'-OH-конец для полимеризации ДНК после отжига дополнительный шаблон (76 nt). Микросфера-PCR может выполняться в одной Микропробирка PCR используя функционализированных микросферы, шаблон случайных ДНК и грунтовка Tag вперед. Для того, чтобы отличить от случайных ДНК шаблон результирующей ssDNA ампликонов (+ шаблон, 76 nt), Форвард грунт имеет дополнительный тег 24 нуклеотидов. Если вперед грунт не имеют дополнительный тег последовательности, это очень трудно признать между ssDNA ампликонов и первоначальный шаблон случайных ДНК.
Асимметричное PCR эксперимент был выполнен. Мы имели возможность наблюдать dsDNA загрязнители, как показано на рисунке 4. В большинстве случаев это необходимо изолировать ssDNA с помощью стрептавидина покрытием магнитные бусы и exonuclease пищеварение. Однако микросферы PCR делает эффективное использование единого грунтовка (праймер Tag вперед) накопить ssDNA в водной фазе. Ожидается, что dsDNA загрязнителей будет приложить к поверхности микросферы. Таким образом ssDNA ампликонов можно получить через закупорить без необходимости центрифугирования. Результирующая ssDNA была продемонстрирована, сравнивая его синтетических размер маркеров (76 nt ssDNA и 100 nt ssDNA) путем анализа электрофореза геля.
Рисунок 1: microfluidic платформа. () сфабрикованы microfluidic платформа, (b) расширить представление потока упором геометрии, экспериментальная установка (c) и (d) захватил изображения показаны непрерывной поколения микросфер. 1: структура микро канал для потока, сосредоточив внимание геометрии, 2: для перемешивания растворов, 3: для микросфер затвердевания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: флуоресцентные индикация гибридизации ДНК на поверхности микросфер. 5'-Acrydite модифицированные ДНК зонды (Ap) были способны гибридизировать с взаимодополняющими Cy3 помечены ДНК-зондов (ПСП). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Иллюстрация микросферы ПЦР протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: сравнение между обычными Асимметричное PCR и микросферы ПЦР. M; ssDNA маркер (76mer и 100mer), переулок 1; Асимметричное PCR, переулок 2; Микрошарики PCR. Перепечатано с разрешения от предыдущей работы8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Реагент | Объем в смеси (μL) | Конечная концентрация | |
| Решение я | 40% Acrylamide:bis раствор (19:1) | 25 | 10% |
| 100 мкм Acrydite зонд (Ap, 5' - Acrydite-(TTTTTTT, компоновщик последовательности) Ага TTG CAC TTA CTA TCT-3') | 10 | 10 МКМ | |
| 5 x TBE буфера (Tris-base ЭДТА) | 10 | 0.5 X | |
| Воды | 5 | - | |
| Решение II | Персульфат аммония 20% | 50 | 10% |
| Решение III | TEMED (N,N,N′N′-Tetramethylethylenediamine) | 8 | 0,40% |
| Минеральное масло | 1000 | - | |
Таблица 1. Смесь компонентов реагент для на потока полиакриламида Микросфера синтеза.
| Оперативные условия | Микросфера скорость производства |
|
| Решение расхода | Давление масла | |
| (мл/ч) | (кПа) | (/ сек) |
| 0.4 | 82 | 7.1 |
| 0.5 | 94 | 13.3 |
| 0.6 | 108 | 28,9 |
| 0,7 | 116 | 36,5 |
Таблица 2. Краткое изложение условий эксплуатации и производства микросфер.
| ДНК-зонд | Последовательности |
| Cy3 помечены взаимодополняющих олигонуклеотида зонд (Кап) | 5'-Cy3-AGATAGTAAGTGCAATCT-3' |
| Тег (первый 24 nt)-вперед грунтовка | 5'-GGT AAT ACG АКТ CAC TAT AGG КЛЯП ATA ОСО GCT TAT TCA ATT-3' |
Таблица 3. Информация о последовательности ДНК-зондов.
| Реагент | Объем за 1 x реакции (μL) | Конечная концентрация |
| Случайные ДНК шаблон | 1 | 1 нг/мкл |
| Тег вперед грунт | 1 | 0,4 МКМ |
| Обратный грунтовка | 1 | 0,02 МКМ |
| 10 x буфер Taq | 5 | 1 X |
| 10 мм dNTP | 4 | 2.5 мм |
| Ex taq (1000U) | 0.2 | 1 U |
| Воды | 37,8 | - |
| Итого | 50 | - |
Таблица 4. Асимметричное PCR реагент смешать компоненты в 20 Л реакции.
| Шаблон | Последовательность | Длина (nt) |
| Случайные ДНК шаблон | 5'-Ата ОСО GCT ТАТ TCA ATT (случайной последовательности, 40 mer) Ага тег TAA GTG УГА TCT-3' | 76 |
| Тег-вперед грунт (Tag-F) | 5'-GGT AAT ACG АКТ CAC TAT AGG КЛЯП ATA ОСО GCT TAT TCA ATT-3' | 42 |
| Обратный грунтовка | 5'-АГА TTG CAC TTA CTA TCT-3' | 18 |
Таблица 5. Сведения о последовательности для микросфер-PCR.
| Реагент | Объем за 1 x реакции (μL) | Конечная концентрация |
| AP микросферы | ~ 25 микросферы | - |
| Случайные ДНК шаблон | 1 | 1 нг/мкл |
| Тег-вперед грунт | 1 | 0,4 МКМ |
| 10 x буфер Taq | 5 | 1 X |
| 10 мм dNTP | 4 | 2.5 мм |
| Ex taq (1000U) | 0.2 | 1 U |
| Воды | 37,8 | - |
| Итого | 50 | - |
Таблица 6. Микросфера-ПЦР реагент смешивать компоненты в 50 Л реакции.
| Режим сканирования | Самолет |
| Масштабирование | X: 2.49 мкм, Y: 2,49 мкм |
| Размер стека | X: 1272.79 мкм, Y: 1272.79 мкм |
| Сканирования зум | 0,7 |
| Цель | M27 ЕС план Neofluar 10 x / 0.3 |
| Среднее | 1 |
| Пинхол | СН2: 104 мкм |
| Фильтры | Ch3: LP 420 |
| Пучка сплиттер | MBS: HFT 488 / 543, DBS1: зеркало, DBS2: NFT 515, FW1: нет |
| Длина волны | 543 Нм 100,0% |
Таблица 7. Параметры для confocal микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Загрязнители dsDNA являются серьезной проблемой в ssDNA амплификации. Он по-прежнему трудно свести к минимуму dsDNA амплификации в обычных Асимметричное PCR амплификация15. Кроме того хотя технические усовершенствования для генерации ssDNA позволили нам увеличить эффективность образца пропускной способности, ssDNA изоляция по-прежнему проблематичным из-за ее высокой стоимости и неполной очистки урожайности.
Асимметричное PCR является одним из самых сложных методов, используемых при работе с ssDNA. Этот метод применяет неравное количество грунтовки (например, в соотношении 20: 1) для того, чтобы генерировать большое количество ssDNA. Однако это очень трудно оптимизировать каждый реакции амплификации приносить ssDNA. Таким образом побочные продукты (dsDNA) должны быть устранены с результирующими4.
Для того, чтобы генерировать ssDNA без разделения дополнительных шагов, мы подготовили полиакриламида микросферы подвергать ДНК-зонды, основанную на методе сополимеризации acrydite. Наша ДНК вложения метод легко было приспособлено с помощью на основе капелька microfluidic платформа. Сополимеризованная oligomicrospheres, диаметром микромасштабной успешно были произведены. Следовательно микросферы PCR был использован для того чтобы усилить ssDNA в однотрубных реакции. Конечно чтобы адаптировать эту процедуру для других экспериментов, ПЦР, обычно необходимые корректировки (например, изменив цикл амплификации, отжига температура и шаблон последовательности) требуются. В заключение микросферы PCR подробно здесь, делая его доступным для разработки биопроб, секвенирования ДНК и ДНК анализ microarray.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.
Acknowledgments
Это исследование поддерживается проекта под названием «Совместная программа исследований для сельскохозяйственной науки и технологического развития (проект № PJ0011642) «финансируется администрацией сельского развития, Республика Корея. Это исследование было также частично при поддержке гранта (СР 2017R1A2B4012253) основной программы исследований науки через Национальный фонд исследований (NRF) финансируется министерством науки, ИКТ и будущего планирования, Республика Корея. Это исследование было также поддержано Грант (N0000717) программы образования для творческих и промышленные конвергенции, финансируемого министерством торговли, промышленности и энергетики, Республика Корея.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| 40% Acrylamide:bis solution (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Components of Copolymerizable oligo-microsphere |
| Ammonium persulfate, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Hardener of acrylamide:bis solution |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalyst of ammonium persulfate |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M5904 | Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents |
| Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes | Bioneer | synthesized | Table 3. Sequence information |
| ssDNA acrydite labeled probe | Bioneer | synthesized | Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents |
| Tris | Biosesang | T1016 | Components of TE buffer, pH buffer solution |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA amplification |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface |
| Light Microscope | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Caculating number of microspheres |
| T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA amplification |
| Hand-held Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Laboratory Corona Treater | Hydrophilic surface treatment |
| Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
| Syringe pump | kd Scientific | 78-1100 | Uniform flow of Solution I and Solution II |
| Compressor | Kohands | KC-250A | Flow control of Solution III |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Caculating number of microspheres |
References
- Smith, A. J. The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method. Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).
- Sekhon, S. S., et al.
- Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray. Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).
- Sekhon, S. S., et al. Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP). Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).
- Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'-->5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma. Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).
- Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics. Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).
- Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets. Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).
- Lee, S. H., et al. On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification. PLoS One. 11 (7), e0159777 (2016).
- Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).
- Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device. Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
- Olsen, T. R., et al. Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics. Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).
- Dorris, D. R., et al. Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios. BMC Biotechnology. 3, 6 (2003).
- Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).
