Summary
Ce protocole décrit le calorespirometry, la mesure directe et simultanée de dissipation de la chaleur et la respiration, qui fournit une approche non invasive pour évaluer le métabolisme énergétique. Cette technique est utilisée pour évaluer la contribution des voies aérobies et anaérobies à l’utilisation de l’énergie en contrôlant le flux d’énergie cellulaire totale.
Abstract
Plusieurs lignées de cellules utilisées dans la recherche biologique et biomédicale fondamentale maintiennent l’homéostasie énergétique grâce à une combinaison de la respiration aérobique et anaérobique. Toutefois, la mesure dans laquelle les deux voies contribuent au paysage de la production d’énergie cellulaire est systématiquement négligée. Les cellules transformées cultivées en saturant les niveaux de glucose souvent montrent une dépendance réduite sur la phosphorylation oxydative pour la production d’ATP, qui est compensée par une augmentation de la phosphorylation au niveau du substrat. Ce changement dans l’équilibre métabolique permet aux cellules de proliférer malgré la présence de toxines mitochondriales. En négligeant la poise altérée métabolique des cellules transformées, les résultats d’un criblage pharmaceutique peuvent être mal interprétés depuis le potentiellement mitotoxic effets peuvent ne pas être détectés modèle de lignées de cellules cultivées en présence de forte concentration de glucose concentrations. Ce protocole décrit le couplage des deux techniques puissantes, respirométrie et calorimétrie, qui permet l’évaluation quantitative et non invasive des aérobies et anaérobies contributions à la production d’ATP cellulaire. Respiration aérobie et anaérobie génère de la chaleur qui peut être surveillé par calorimétrie. Pendant ce temps, mesurer le taux de consommation d’oxygène peut évaluer l’ampleur de la respiration aérobie. Lorsque la dissipation thermique et consommation d’oxygène sont mesurés en même temps, le ratio de calorespirometric peut être déterminé. La valeur expérimentale obtenue peut alors être comparée à l’équivalent d’oxycaloric théorique et l’étendue de la respiration anaérobie peut être jugée. Ainsi, calorespirometry fournit une méthode unique pour analyser un large éventail de questions biologiques, y compris le développement de médicaments, la croissance microbienne et fondamentaux bioénergétiques normoxique et des conditions d’hypoxie.
Introduction
Dans les systèmes biologiques, le dégagement de chaleur ou enthalpie changement au cours du métabolisme est généralement contrôlé soit directement (via direct calorimétrie) ou indirectement par l’intermédiaire de la consommation de2 O ou la production de CO2 (via respirométrie). Malheureusement, lorsque ces techniques sont utilisées dans l’isolement, information critique est perdue, comme la contribution des voies anaérobies au métabolisme cellulaire. Calorespirometry est une technique puissante qui s’appuie sur la mesure simultanée de dissipation de la chaleur et la respiration. Calorespirometric travail de pionnier étudié le métabolisme anaérobie dans les cellules de mammifères totalement oxygénés et démontré des cotisations simultanées des voies aérobies et anaérobies à l’homéostasie énergétique malgré les cellules transformées en un environnement complètement oxygéné1. Calorespirometry a depuis lors été appliqué à une grande variété de questions biologiques. Voici quelques exemples : l’étude de l’énergétique animale à faibles teneurs en oxygène, les effets des herbicides et œstrogènes sur les branchies de bivalves, le métabolisme des organismes terrestres et la décomposition microbienne des sols organiques question2, 3 , 4 , 5 , 6. par ailleurs, calorespirometry a révélé comment métabolique préconditionnement avant congélation améliore la cryoconservation de mammifères cellules7. Chaque approche, calorimétrie tant respirométrie, a augmenté indépendamment de notre connaissance de bioénergétique cellulaire et organismique. Cependant, des questions biologiques fondamentales auxquelles on peuvent répondre grâce à l’utilisation de calorespirometry demeurent relativement inexplorées.
Loi de Hess déclare que le changement d’enthalpie totale d’une réaction est indépendant de la voie entre les États initiaux et finaux. Par exemple, le changement d’enthalpie totale pour une voie biochimique est la somme de la variation de l’enthalpie de réaction de tous au sein de la voie. Calorimétrie propose une approche en temps réel pour mesurer la production de chaleur cellulaire, qui permet de détecter sans discernement des voies aérobies et anaérobies. Ceci est basé sur le fondement qu’aucune énergie n’est échangée dans le système, sauf à travers les parois de l' ampoule expérimentales8. Un changement dans la dissipation de chaleur est égal à la variation d’enthalpie, libéré de toutes les réactions métaboliques dans l’ampoule. Ainsi, une enthalpie négative correspond à une perte de chaleur du système. Une recherche exhaustive sur les quatre dernières décennies a caractérisé le paysage thermodynamique du catabolisme et anabolisme. Ceci est représenté par une augmentation régulière des articles de recherche trouvé sous les termes de recherche « biologiques » et « calorimétrie » comme indexée par l’United States National Library of Medicine (NLM) à la National Institutes of Health (PubMed). La recherche révèle qu’avant 1970, un total de 27 publications référence biologique calorimétrique ; pendant ce temps, en 2016 seul, 546 publications a utilisé la technique.
Méthodes calorimétriques sont bien établies pour déterminer la production de chaleur. Cependant, davantage de souplesse est accordée pour régler la valeur respirométriques. La mesure respirométriques peut se composer d’O2, CO2, ou O2 et CO2. En outre, la mesure de O2 ou CO2 peut être accomplie par diverses techniques, dont la consommation, électrodes de type Clark et tunable diode laser absorption spectroscopy7,9,10 ,11. Alors que la production de CO2 est un indicateur précieux dans de nombreuses études respirométriques, le milieu de cellules cultivées utilise souvent un système tampon pH contrôle12,13bicarbonic. Pour éviter les complications de mesure de CO2 dans le système de bicarbonate, le protocole suivant pour la calorespirometry des cellules en culture utilise O2 comme paramètre respirométriques seul.
Parallèlement à la mesure de flux d’oxygène, certaines respiromètres (voir Table des matières) sont conçus pour des évaluations détaillées de la fonction mitochondriale. Substrat-découpleur-inhibiteur-titrages (costume) protocoles sont bien établies et sont compatibles avec les expériences visant à mesurer la membrane potentiels ou réactives de l’oxygène (DRO) formation14. Le protocole présenté pour calorespirometry des cellules intactes est compatible avec l’introduction des découpleurs chimiques tels que le carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) et l’oligomycine F0F1-ATP synthase inhibiteur. Grâce à l’ajout de FCCP, consommation d’oxygène peut être découplée de la production d’ATP, ce qui est utile pour évaluer l’impact de la thérapeutique possible sur peformance mitochondrial15. En outre, l’ajout de l’oligomycine éclaire l’ampleur de la respiration de la fuite. Ainsi, les mesures respirométriques effectuées au cours de la calorespirometry sont compatibles avec longs protocoles conçus pour élucider davantage la physiologie mitochondriale.
La mesure simultanée de dissipation de la chaleur et de flux d’oxygène permet le calcul du ratio calorespirometric (CR). Ce ratio est ensuite comparé à une constante de la Thornton ou l’oxycaloric théorique équivalente, qui s’étend entre-430 à-480 kJ mol-1 selon la lignée cellulaire ou tissulaire d’intérêt et le carbone supplémenté substrats1, 16. ainsi, un ratio de CR plus négatif révèle une augmentation des contributions de voies anaérobies à activité métabolique général. Par exemple, le ratio de CR pour la respiration des tissus musculaire systématique sans l’exécution active du travail varie entre -448-468 kJ mol-1, qui se trouve dans la plage du oxycaloric théorique équivalent17,18. Pendant ce temps, des cellules de mammifères cancéreuses cultivées dans un milieu riche en glucose affichent fermentation lactiques renforcée suite à la glycolyse et relativement faible engagement mitochondrial19. Ce résultats de phénotype ratios CR dans la plage de-490 à-800 kJ mol-1, démontrant une implication accrue des voies anaérobies dans le métabolisme cellulaire, comme l’a indiqué plus négatif CR ratios1,7, 16,20.
Distributeurs commerciaux et sans but lucratif, cellulaires et tissulaires actuellement offre des lignées de cellules provenant de plus de 150 espèces, avec presque 4 000 lignées de cellules dérivée de l’homme. Lignées cellulaires immortalisées sont des outils pratiques pour rapidement évaluer la toxicité d’agents thérapeutiques potentiels, dont plusieurs peuvent interférer directement ou indirectement avec les fonctions mitochondriales. À l’aide de cellules transformées au cours de dépistage des drogues peut être une valeur prédictive limitée en partie à cause de l’effet Warburg, une caractéristique de nombreux cancers. Souvent, les cancers génèrent de l’ATP de phosphorylation de substrat-niveau et maintiennent l’équilibre rédox grâce à la production de lactate sans engager pleinement la mitochondrie sous conditions aérobies19. Développement pharmaceutique est notoirement coûteux et inefficaces, avec environ 8 sur 9 composés testés dans des essais cliniques humains parviennent pas à atteindre le marché approbation21. Alors que le potentiel thérapeutique peut transférer dépistage initial en raison de la faible cytotoxicité dans les lignées cellulaires, il est possible que certains de ces composés sont mitotoxic. Sans une méthode appropriée pour détecter comment ces toxines peuvent nuire à l’équilibre de l’énergie dans les cellules primaires qui n’affichent pas l’effet Warburg, information critique est souvent négligée, désengorgement de développement thérapeutique dans les premiers stades.
Calorespirometry est une approche pratique et non invasive d’analyser l’activité métabolique dans une variété d’échantillons biologiques, y compris les cellules et les tissus. Le noyau du protocole présenté est compatible avec un éventail d’applications. Associée à une complication, cependant, a été identifiée. Les cellules immortalisées sont souvent cultivées dans un milieu sans glucose additionné de galactose afin d’accroître la contribution de la phosphorylation oxydative (OXPHOS) pour la production d’énergie, afin de sensibiliser les cellules à potentiel mitotoxins22, 23. Cette reprogrammation métabolique semble obscure analyse lorsque les échantillons sont placés dans les ampoules en acier inoxydable utilisés par le calorimètre à15. Les cellules cultivées dans un milieu glucosé continuent à s’engager dans l’activité métabolique intense pendant plusieurs heures. Pendant ce temps, les cellules cultivées dans un milieu galactose diminuent de la production de chaleur dans les 30 minutes de leur placement dans l’ampoule, la mesure limitée aux premiers moments expérimentale. Malheureusement, ce comportement, fait obstacle à l’occasion d’évaluer leur prolifération cellulaire. Malgré cette limitation spécifique, la plupart des applications sont compatibles avec l’analyse calorespirometric et informations métaboliques détaillées peuvent être obtenues grâce à cette approche.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Culture cellulaire
- Maintenir les cellules de carcinome (HepG2) hépatocellulaire humaine au moyen de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % sérum fœtal (SVF) et autres substrats (glucose 10 mM, 2 mM de glutamine et pyruvate de 1 mM) à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire (5 % CO2 , air de 95 %, 100 % d’humidité).
Remarque : Utilisez la formulation DMEM ci-dessus lorsque DMEM est référencée dans les étapes ultérieures de respirométrie et calorimétrie. - Plaque des cellules à 1 x 106 cellules par plaque de 100 mm culture et sous-culture eux tous les 7 jours, ou avant d’atteindre 90 % confluence et renouveler le milieu tous les 3-4 jours.
- Réaliser les expériences lorsque les cellules sont confluents de 60 à 80 %.
2. préparation du respiromètre et calorimètre
- Pipeter 2,2 mL de DMEM dans la chambre de respiromètre, insérer le bouchon pleinement et l’ajuster avec l’outil d’entretoise bouchon permettant la diffusion de l’oxygène optimale de l’air au milieu.
- Remuer constamment à 37 ° C jusqu'à ce que la concentration en oxygène (trace bleue) et le flux d’oxygène (trace rouge) sont stables. S’assurer que le logiciel du respiromètre est programmé pour tenir compte de la solubilité de l’oxygène du milieu utilisé dans l’expérience.
Remarque : Différents médias ont des coefficients de solubilité d’oxygène différents (p. ex., DMEM = 0,92). - Après la stabilisation de la concentration en oxygène en DMEM lorsque la chambre est ouverte, sélectionner une partie stable de la trace de concentration de l’oxygène et étalonner pour la saturation de l’air de 100 %.
- Calibrer pour 0 % d’oxygène en sélectionnant une partie stable de la trace de concentration de l’oxygène lorsque aucun oxygène n’est présent dans la chambre. Effectuez cette étape après 20 titrage µL de dithionite de sodium 230 mM ou après que tout l’oxygène est consommé par l’échantillon biologique à la fin d’une expérience.
- Après l’étalonnage de 100 % d’air de la respiromètre, fermez le bouchon et veiller à ce qu’aucune bulle n’est présents dans l’hémicycle.
Remarque : une légère augmentation de flux d’oxygène sera détectée dans la chambre fermée comme le capteur d’oxygène polarographique (POS) consomment l’oxygène afin de mesurer la pression partielle d’oxygène. - Après environ 10 min du bouchon étant fermé, confirmer que le respiromètre est prêt pour les cellules HepG2 en observant un flux d’oxygène stable.
Remarque : Le calorimètre utilisé ici utilise des ampoules en acier inoxydable et nécessite une ampoule à utiliser comme référence. - Ajouter 2,5 mL de H2O (dH2O) [volume égal que les échantillons (étape 4)] à l’ampule de référence du calorimètre et serrer le bouchon, si nécessaire, utiliser des pinces. Nettoyer l’ampoule scellée avec circulation d’air et abaisser lentement l’ampoule sur la position 1 dans la chaîne de référence du calorimètre. Restent en position 1 jusqu'à ce que l’échantillon biologique est préparé.
3. préparation des cellules HepG2 respirométrie et calorimétrie
- Confirmer que le respiromètre calorimètre sont apprêtés et calibré. Chaud DMEM et trypsine à 37 ° C dans un bain d’eau.
- Ajouter DMEM à un frais 100 mm plaque et les placer dans un incubateur pour permettre l’équilibration du milieu pour le CO2 et de température.
Remarque : Ce moyen de communication sera utilisé pour l’expérience de la calorimétrie, donc le volume approprié dépend du nombre d’ampoules qui sera utilisé. - Confirmez avec un microscope inversé de lumière que les cellules sont au confluent de 60 à 80 %, puis lavez le 100 mm plaque de 2 x 10 ml d’une solution saline température ambiante tamponnée au phosphate (PBS).
- Ajouter 3 mL de la trypsine de-37 ° C sur la plaque de 100 mm des cellules et les incuber pendant 7 à 10 min à 37 ° C dans l’incubateur de culture cellulaire. Neutraliser la trypsine avec 3 mL de-37 ° C DMEM et suspendez la doucement il pipetage ~ 20 fois avec une pipette de 5 mL.
- Transférer le 6 mL de cellules resuspendues dans DMEM et trypsine dans un tube conique stérile de 15 mL et il centrifuger à 5 min à 175 x g. supprimera le liquide sans déranger le culot cellulaire.
- Resuspendre le culot dans environ 5 mL de DMEM et pipette soigneusement pour s’assurer que les cellules sont suffisamment dissocié de l’autre.
- Enlever les ~ 100 µL de l’échantillon bien mélangé et effectuer un nombre de cellules complet utilisant tous les 8 champs sur un hémocytomètre pour déterminer le nombre total de cellules. Calculez le volume pour la remise en suspension des cellules afin de générer environ 2 x 106 cellules / µL 50.
Remarque : Ceci assurera que 2 x 106 cellules sont ajoutés à chaque chambre du respiromètre avec déplacement moyen minimal. - Centrifuger les cellules pendant 5 min à 175 x g. remettre le culot dans le volume calculé de DMEM étape 3,7.
- Effectuer un nombre d’éléments pour déterminer le volume nécessaire d’injecter 2 x 106 cellules / chambre dans le respiromètre (cela devrait être ~ 50 µL). Stocker les cellules pour mesurer la respirométrie sur la glace jusqu’au moment.
- Bien que l’échantillon de cellules concentrées sur glace, déterminer la dilution requise pour produire une concentration de 1 x 105 cellules/mL pour la calorimétrie.
- Bien mélanger l’échantillon et préparer environ 3 mL des cellules de 1 x 105 cellules/mL dans du DMEM pour chaque ampoule.
Remarque : Le DMEM utilisé pour la dilution de l’échantillon doit être le milieu équilibré préparé à l’étape 3.3.
4. la calorimétrie
- Assurez-vous que le calorimètre est connecté à l’ordinateur et le signal calorimétrique en µW est observable et stable.
- Ajouter 2,5 mL des cellules à 1 x 105 cellules/mL (~2.5 x 105 cellules) à chaque ampoule, assurant suffisamment d’air se situe entre le couvercle de l’ampoule et le support permettant la diffusion de gaz.
- Immédiatement, bien serrer le bouchon, si nécessaire, utiliser des pinces. Nettoyer l’ampoule scellée, à l’aide de flux d’air pour enlever tous les débris extérieurs et abaisser lentement l’ampoule sur la position 1 du calorimètre. Noter le temps que l’ampoule est abaissé sur la position 1.
- Permettre à l’ampoule de s’asseoir en position 1 pendant 15 min.
Remarque : Pendant cette période de 15 min, les cellules sont être injecté dans le respiromètre (étape 5). Cela garantit que le même intervalle de temps est utilisé pour la production de chaleur et consommation d’oxygène lorsque le rapport de CR est déterminé. - Après 15 min en position 1, abaissez lentement la référence et l’échantillon des ampoules sur la position 2. Noter le temps que les ampoules ont été abaissés et mesure pendant au moins 30 min.
5. respirométrie
- Au cours de l’intervalle de 15 min dans laquelle l’ampoule est en position 1 dans le calorimètre, commencent les études respirométriques.
- Bien mélanger l’échantillon cellulaire en pipettant également, afin d’assurer une solution homogène et injecter < 50 µL de l’échantillon de cellules dans chaque chambre du respiromètre pour une concentration finale de 2 ~ x 106 cellules/chambre. Noter le temps que les cellules sont injectées dans le respiromètre.
- Après l’injection, les cellules HepG2 sont continuellement brassés à 37 ° C. Attendre au moins 20-30 min pour les deux une stabilisation du flux d’oxygène et une diminution constante de la concentration d’oxygène.
- Cliquez sur l’onglet flux de2 O par V sur la droite de l’écran et le mettre en surbrillance une partie stable du flux d’oxygène. Sélectionnez les marques, puis statistiques et enregistrer des données pour le flux2 O par V. Cet enregistrement sera utilisé dans le calcul du ratio CR.
Remarque : Les étapes 5.5 et 5.6 sont facultatives. Fuite la respiration et la respiration maximale découplée seront révélés par les titrages de l’oligomycine et FCCP. - Injecter 1 µL de l’oligomycine 4mg/mL dans chaque chambre et permettre à ~ 10 min pour la stabilisation des flux d’oxygène. Taux de respiration record fuite stable en suivant les étapes effectuées au point 5.4 en mettant en évidence une partie stable de la trace du flux d’oxygène après l’addition de l’oligomycine.
- Titrer les injections 2 µL de 0,2 mM FCCP dans chaque chambre, permettant une stabilisation flux d’oxygène après chaque injection. Continuer les titrages jusqu'à ce que le flux maximal est atteint, comme il est indiqué par une légère baisse dans le titrage FCCP ultérieur. Enregistrer le taux de respiration stable pendant le flux maximal.
6. le calcul du Ratio de Calorespirometric
- Effectuer un nombre de cellules final des échantillons préparés à ~ 1 x 105 cellules/mL, utilisant tous les 8 domaines d’un hémocytomètre pour déterminer le nombre total de cellules ajoutées à l’ampoule (2,5 mL).
- Déterminer un temps aux mesures Records du calorimètre et respiromètre au cours de laquelle les signaux stables sont présents en même temps. Référence que le temps enregistré lorsque l’ampoule a été abaissé à la position 2 et le moment de l’injection de cellules dans le respiromètre.
- La production de chaleur record en plaçant le curseur sur la trace affichant la puissance calorifique pour l’ampule respecté au moment déterminé à l’étape et explicite comme µW/millions de cellules. Recueillir des données sur la consommation d’oxygène et s’assurer qu’elle est exprimée en pmol O2 x s-1 x millions de cellules.
- Pour calculer le taux de CR, commencez par convertir µW kJ/s et puis répartir kJ/s sur mol de O2/s pour obtenir le rapport CR exprimé en kJ/mol O2. NOTE : Le rapport CR est présenté en kJ/mol O2.
(voir dossier complémentaire 1)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La reproductibilité des mesures de calorespirometric repose sur une préparation adéquate et cohérente. Échantillons préparés à partir de cultures cellulaires ne devraient pas servir si les plaques sont envahis par la végétation, des numérations globulaires peuvent devenir inexactes en raison de l’agglutination. Par ailleurs, les flux de chaleur réduite en raison de la diffusion limitée de substrat dans les cellules regroupées peuvent se produire. Par conséquent, lors de l’utilisation de cellules adhérentes, il est essentiel de choisir une plaque avec la confluence entre 60 à 80 % et de changer le support 24 h avant l’expérience.
Entretien et étalonnage instrumental adéquat sont également essentiels pour mesures calorespirometric instructif et reproductible. En suivant les directives du fabricant établi protocole de nettoyage pour le respiromètre, vaste lavages avec de l’éthanol sont mises en œuvre afin que les inhibiteurs et résidus hydrophobes découpleurs sont supprimés et ne compromettent pas les mesures de partiellement mitochondries inhibant ou découplantes. Lorsque la chambre respiromètre fonctionne avant la mesure de l’échantillon, la concentration de l’oxygène et les traces de flux d’oxygène doivent être stables, comme illustré à la Figure 1. Si le POS a besoin de service de capteur, le flux d’oxygène ne se stabilisera pas comme on le voit à la Figure 2. Mesures ne doivent pas être exécutés lorsque le POS n’est pas correctement desservie. En outre, les ampoules utilisées dans le calorimètre devraient être nettoyées, stérilisés et sèche avant utilisation, car la contamination biologique peut interférer avec la production de chaleur de l’échantillon.
Échantillons cellulaires sont préparés après l’étalonnage approprié et la préparation du respiromètre et le calorimètre. Tout d’abord, le bouchon dans le respiromètre est fermé et la chambre est inspectée pour s’assurer qu'aucune bulle d’air n’est présents. Ensuite, les cellules HepG2 sont concentrées à ~ 2 x 10650 µL de respirométrie et immédiatement mis dans la glace. Pour la calorimétrie, HepG2 des cellules de l’échantillon concentré sont dilués dans le milieu DMEM à ~ 1 x 105 cellules/mL. Après que les cellules soient bien mélangés en pipettant également, 2,5 mL de la suspension est ajouté à une ampoule stérile. L’ampoule est hermétiquement scellé, et tous les débris externe sont supprimé en soufflant de l’ampoule avec un flux d’air provenant d’une pompe à air. L’ampoule est ensuite lentement abaissé sur la position 1, où il reste pendant 15 min. Après 15 min a passé, ampoules la référence et l’échantillon sont abaissées ensuite lentement à la position 2 et mesures peuvent commencer à enregistrer une fois la puissance calorifique est stable (Figure 3).
Un comptage cellulaire finale est effectué après que les cellules sont ajoutés à la fois le calorimètre et le respiromètre pour déterminer le nombre exact de cellules introduits dans le calorimètre. La production de chaleur est alors exprimée par million de cellules. Si les cellules HepG2 sont cultivées en absence de glucose et de galactose est complété pour accroître la participation des mitochondries, les cellules ne prolifèrent pas à l’intérieur du calorimètre, mais au contraire diminuent leur activité métabolique après environ 30 min dans l’ampoule. Ceci limite le calcul CR jusqu’au point de temps plus tôt au cours de laquelle la dissipation de la chaleur a été mesurée (Figure 4).
Il est essentiel de noter le temps que les cellules sont ajoutés à l’ampoule afin que les mesures de consommation d’oxygène et de la production de chaleur sont recueillies à des moments identiques. Si cette précaution n’est pas prise, les erreurs expérimentales importantes peuvent être introduits dans la détermination du rapport CR. Au cours de la période de 15 min, alors que l’ampoule est en position 1 dans le calorimètre, les cellules sont suffisamment mixés par pipetage eux et 2 x 106 cellules sont injectées dans le respiromètre via une seringue de Hamilton. Flux d’oxygène se stabilise après que environ 15 min et oxygène concentration diminue de façon constante (Figure 5). Encore une fois, il est essentiel que le temps de l’injection de l’échantillon est enregistré pour l’analyse des données. Le flux d’oxygène stabilisé des cellules se sert de la mère porteuse pour la consommation d’oxygène lors du calcul du ratio de CR. Titrages supplémentaires sont effectuées afin d’évaluer la respiration de fuite (1 µL oligomycine) traduite par une baisse à un flux d’oxygène inférieur et la respiration maximale découplée (3-5 titrages 2 µl FCCP) indiquée par l’incapacité d’augmenter la respiration après successifs Titrages FCCP. Un découplage incomplète ou une inhibition de la respiration ne peut pas être observé si le stock FCCP a expiré (Figure 6).
Étalonnage air figure 1:100 % de respiromètre et statut du capteur d’oxygène polarographique (POS). Les signaux pour la concentration en oxygène (ligne bleue) et le flux d’oxygène (ligne rouge), que tous deux se stabilisent avant l’étalonnage 100 % d’air. Les lignes stables indiquent que le respiromètre est prêt pour l’étalonnage. L’étalonnage doit être effectué en DMEM et non en H2O. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : POS besoin service. Après la stabilisation de la concentration en oxygène (trace bleue), le flux d’oxygène (trace rouge) ne parvient pas à se stabiliser. Le POS ne doit pas être utilisé pour l’expérimentation et le service doit être appliqué comme indiqué par le fabricant. Une instabilité accrue du flux d’oxygène est en corrélation avec une augmentation de la demande pour le service de POS. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Environ 2,5 x 105 HepG2 cellules cultivées dans un milieu glucosé montrent des signes de prolifération dans le calorimètre. ~2.5 x 105 HepG2 cellules cultivées en présence de glucose par l’ampoule de charge génère une production de chaleur constante de -20 à-28 µW au réglage 30-µW sur l’instrument et une production de chaleur accrue au fil du temps est en corrélation avec la prolifération cellulaire à l’intérieur de l’ampoule. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Environ 2,5 x 105 HepG2 cellules cultivées dans un milieu galactose ne prolifèrent pas et diminue au fil du temps la production de chaleur. ~2.5 x 105 HepG2 cellules cultivées en galactose par amène une production de chaleur immédiate des ampoule de charge ~-20 µW. Cependant, la production de chaleur diminue avec le temps et restreint mesures de CR-rapports sur les points de temps au début de l’expérience. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Routine, dételés et fuir la respiration des cellules HepG2. Une fois que les cellules ont été injectées dans le respiromètre, concentration en oxygène diminué régulièrement (trace bleue). Après la stabilisation des flux d’oxygène (trace rouge) pendant la respiration régulière de cellules intactes, l’oligomycine a été ajouté pour inhiber la F0F1-ATP synthase. Ceci est indiqué par la stabilisation des flux d’oxygène après l’addition de l’oligomycine, qui révèle la respiration de la fuite. Environ 3-5 titrages de FCCP doivent être effectuées de découpler la respiration de la synthèse d’ATP et de révéler la capacité de transport d’électrons du système (ETS). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : découplage infructueuse de la respiration cellulaire HepG2. Après addition de cellules, oxygène flux stabilisé (trace rouge) lors de la routine concentration a diminué régulièrement la respiration et l’oxygène (ligne bleue). Titrage de FCCP a entraîné un découplage incomplète et inhibition éventuelle, empêchant l’atteint la capacité maximale des ETS. FCCP était probablement contaminé ou dégradée du stockage à long terme. Si respecté, un stock FCCP frais doit être préparé. En outre, confirment que l’oligomycine n’inhibe pas la capacité des ETS pendant le dételage de la remorque. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L’objectif de calorespirometry est d’évaluer quantitativement les contributions des voies aérobies et anaérobies à activité métabolique et d’obtenir une vue composite de flux d’énergie cellulaire. Ceci est accompli par une mesure simultanée de la dissipation de la chaleur et le flux d’oxygène suivie d’une comparaison entre le ratio calculé de CR avec l’oxycaloric théorique équivalente. Plusieurs étapes critiques doivent être considérés pour des données fiables et reproductibles. Le maintien d’une culture de cellules stériles, en bonne santé est critique. Contamination par des bactéries ou des champignons peut entraîner la consommation production ou oxygène chaleur détournés, rendant le rapport CR dénuée de sens. En outre, une mauvaise numérations, pauvre échantillon de mélange, ou cellules contagieuse peuvent également entraîner un rapport inexact de CR. Une étape cruciale en ce qui concerne le respiromètre est préparation des échantillons appropriés afin que l’injection est inférieure à 50 µL en volume. Ce volume garantit un minimum de moyen est déplacé de la chambre et la consommation d’oxygène est correctement attribuée à 2 x 106 cellules. Une fois que la respiration courante est observée, le protocole proposé est compatible avec les deux titrages supplémentaires (oligomycine et FCCP), qui illuminera la fuite la respiration et la capacité des ETS des mitochondries. Pour cette application, ajout excessif de FCCP peut inhiber la respiration et prévenir un flux maximal ; par conséquent, titrages d’au moins 3-5 doivent être effectuées avant d’atteindre la respiration maximale découplée.
Entretien et étalonnage approprié du respiromètre et calorimètre est critique pour calorespirometry. Le protocole de titration pour la consommation d’oxygène de fond est fortement recommandé et est exécuté avec des titrages par étapes de dithionite d’atteindre des niveaux d’une diminution d’oxygène dans la chambre. Il s’agit d’une mesure essentielle pour confirmer des chambres hermétiques et corriger la diffusion arrière de l’oxygène dans les chambres, surtout si les mesures sont effectuées à une faible tension d’oxygène. Aussi, effectuant un essai de l’agitateur avant l’ajout des cellules peut fournir des informations sur la réactivité des op. Si la réactivité est pauvre ou le flux d’oxygène n’est pas stable (Figure 2), service au POS est nécessaire. Un mauvais nettoyage des chambres respiromètre peut laisser derrière des quantités résiduelles d’inhibiteurs ou découplants, susceptibles d’affecter les expériences ultérieures. Bulles d’air dans l’enceinte étanche sont également capables d’interférer avec les mesures et peuvent être introduits pendant la fermeture de la chambre ou au cours de l’injection de l’échantillon si des bulles d’air sont présents au sein de la seringue. Protocole du calorimètre est plus direct, mais il est également sensible aux erreurs expérimentales. Par exemple, la fermeture incorrecte de l’ampule permettra à évaporation se produire qui change massivement les flux de chaleur.
Une des limites de cette méthode est que pas toutes les cellules peuvent être cultivées en suspension et de nombreuses lignées cellulaires sont adhérentes à la plaque de culture cellulaire ou le substrat. Pour réaliser des expériences, cellules attachées doivent être délogé par voie enzymatique de la plaque par l’utilisation d’agents de la dissociation comme la trypsine. Cellules dans cet État peuvent ne pas être dans la phase de croissance logarithmique et leur physiologie peut-être être modifié. Ainsi, une analyse ultérieure par que le calorimètre et le respiromètre de cellules récemment trypsinisés peuvent évaluer perturbé les activités cellulaires. En outre, une limitation dans le protocole calorimétrique présenté est la sédimentation des cellules dans les ampules de clos, qui peuvent conduire à une hypoxie locale autour des cellules en raison de la diffusion de l’oxygène lente dans des solutions aqueuses. Nous avons déterminé que ~ 3 x 105 cellules constitue la limite supérieure compatible avec les ampoules utilisées dans le présent protocole. Augmentation du nombre de cellules peut générer un environnement hypoxique de la sédimentation des cellules, compromettre les résultats. Ainsi, l’optimisation est critique si une lignée de cellules différentes est l’objet d’une enquête et moyens devraient être considérées comme l’augmentation de la densité moyenne afin de réduire la sédimentation des cellules24. Il existe des ampoules qui permettent en remuant ; Toutefois, il est essentiel de s’assurer qu'un ratio signal-bruit minimal est présent durant le brassage. En outre, calorimètres en plus de celle employée dans le présent protocole sont compatibles avec les calorespirometry et leurs capacités peuvent être au-delà de ce que nous avons présenté. Une autre limitation de calorespirometric analyse via un respiromètre bicaméral est l’incapacité pour une analyse de haut débit, qui serait plus pertinente pour l’élaboration du produit pharmaceutique. Cette restriction, toutefois, est compensée par la capacité pour une caractérisation à haute résolution de l’influence du composé sur la chaîne respiratoire et la physiologie mitochondriale.
La capacité de mesure haute résolution et simultanée des flux de sortie et de l’oxygène de la chaleur du même échantillon est une force importante de cette méthode. Un étalon-or potentiel lors de l’utilisation de cellules adhérentes serait à la fois culture et analyser des cellules cultivées avec des microporteurs perles en suspension. Cette méthode aurait éviter les conséquences fâcheuses de la dissociation de la surface de culture cellulaire et permettent l’analyse des fonctions cellulaires dans différentes phases de la courbe de croissance (phase logarithmique vs inhibées par contact phase7). Malheureusement, à l’aide de perles avec des microporteurs peut être problématique en raison de la vitesse d’agitation élevée requise dans le respiromètre et le potentiel pour le meulage des perles ainsi que de cellules sous la barre de remuer. Malgré ces limites, une large gamme d’applications reste compatible avec calorespirometry. En particulier, cette méthode est prête à faciliter le développement pharmaceutique en identifiant rapidement les composés mitotoxic dans les cellules cultivées.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé en partie par la subvention de la National Science Foundation CHE-160944 à Mary E. Konkle et Michael A. Menze.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HepG2 Cells | American Type Culture Collection | HB-8065 | Cells used for calorespirometry |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | Respirometer |
| LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) | Thermometric AB | Thermometric was purchased by TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | 100x solution added to DMEM medium |
| Fetal Bovine Serum - Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | Added to 10% in DMEM medium |
| Trypsn-EDTA (0.25%) | Thermofisher Scientific | 25200072 | Cell dissociation reagent |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Sigma Aldrich | O4876 | Mitochondrial Inhibitor |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | Mitochondrial Uncoupler |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning Corporation | 430167 | Tissue culture dish |
| Glucose, powder | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose for DMEM medium |
| Galactose, powder | Fischer Scientific | BP656500 | Galactose for DMEM medium |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher Scientific | 25030081 | Glutamine for DMEM medium |
| DMEM, no glucose | Thermofisher Scientific | 11966025 | Cell culture medium |
References
- Gnaiger, E., Kemp, R. B. Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux. Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).
- Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications. Chemistry & Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).
- Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).
- Wadso, L., Hansen, L. D. Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems. Methods. 76, 11-19 (2015).
- Gnaiger, E. Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry. Strategies for Gas Exchange and Metabolism. Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. , Cambridge University Press. London. 149-171 (1991).
- Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism. Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).
- Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation. Cryobiology. 61, 79-88 (2010).
- Webb, P. Human Calorimetry. , ABC-CLIO, LCC. Santa Barbara, CA. In Volume 7 of Endocrinology and Metabolism Series (1985).
- Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism. Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).
- Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis. Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).
- Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry. Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).
- Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry. Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).
- Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues. Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone. Cell and Tissue Research. , (2017).
- Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells. Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).
- Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat. The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).
- Paul, R. J. Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C. Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Kemp, R. B. Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells. Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).
- Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death. Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).
- Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64, 985-993 (2004).
- Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures. Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).
