Summary
Zebrafisch sind eine natürliche Vibrio Cholerae zu hosten und zu rekapitulieren und studieren den gesamten ansteckenden Zyklus von der Kolonisierung Übertragung verwendet werden. Hier zeigen wir wie Sie V. Cholerae Kolonisation Ebenen zu bewerten und Durchfall im Zebrafisch quantifizieren.
Abstract
Vibrio Cholerae ist am besten bekannt als das infektiöse Agens, das die menschliche Krankheit Cholera verursacht. Außerhalb der menschlichen Wirt besteht V. Cholerae in erster Linie in der aquatischen Umwelt, wo sie mit einer Vielzahl von höheren Wasserlebewesen interagiert. Wirbeltier Fisch sind dafür bekannt, eine ökologische Gastgeber zu sein und sind eine potenzielle V. Cholerae Reservoir in der Natur. V. Cholerae und teleost Fischarten Danio Rerio, allgemein bekannt als Zebrafisch, stammen aus dem indischen Subkontinent, was auf eine langjährige Interaktion in der aquatischen Umwelt. Zebrafisch sind eine ideale Modellorganismus für viele Aspekte der Biologie, einschließlich Infektionskrankheiten zu studieren. Zebrafisch kann einfach und schnell von V. Cholerae nach Exposition im Wasser kolonisiert. Intestinale Kolonisation von V. Cholerae führt zu die Produktion von Durchfall und die Ausscheidung von replizierten V. Cholerae. Diese Bakterien können ausgeschieden dann weitergehen, um neue Fisch-Hosts zu kolonisieren. Hier zeigen wir wie Sie V. Choleraebewerten-intestinale Kolonisation im Zebrafisch und wie V. Choleraezu quantifizieren-induzierte Zebrafisch Durchfall. Die Kolonisation-Modell sollte Forscher nützlich, die studieren ob Gene von Interesse für Host Kolonisation und/oder Umwelt Überleben von Bedeutung sein können. Die Quantifizierung der Zebrafisch Durchfall sollte sinnvoll, Forscher Darm-Erreger, die Zebrafisch als Modellsystem interessieren.
Introduction
Vibrio Cholerae ist eine aquatische, gramnegatives Bakterium, das bewirkt, die menschliche Krankheit Cholera sowie sporadische Durchfall1,2 dass. V. Cholerae findet sich in der Umwelt in vielen Bereichen der Welt, oft in Verbindung mit anderen Wasserlebewesen. Diese verknüpfen Organismen gehören Plankton, Insekten Ei Massen, Schalentiere und Wirbeltier Fisch Arten3,4,5,6,7. Mehrere Studien haben V. Cholerae aus Darm-Trakt von Fischen in verschiedenen geographischen Gebieten7,8,9,10isoliert. Das Vorhandensein von V. Cholerae in Fisch zeigt, dass Fische als eine ökologische Reservoir fungieren können. Fisch könnte auch in der Übertragung der Krankheit auf den Menschen und die geographische Verbreitung von V. Cholerae Stämme6verwickelt werden.
Zum besseren Verständnis der Interaktion von V. Cholerae mit Fisch wurde Danio Rerio, besser bekannt als Zebrafisch als Modellsystem zur Untersuchung V. Cholerae11entwickelt. Zebrafisch stammen aus Südasien, einschließlich der Bucht von Bengal Region, die vermutlich das früheste Reservoir von V. Choleraewerden. Vor dem ersten Cholera pandemic Beginn im Jahre 1817 berichtete Cholera nicht außerhalb von, was jetzt Indien und Bangladesch ist. Daher Zebrafisch und V. Cholerae grenzender einander zugeordnet über evolutionäre Zeitskalen, was darauf hindeutet, dass Zebrafisch sind vielfältige V. Cholerae in der natürlichen Umwelt12.
Der Zebrafisch-Modell für V. Cholerae ist einfach durchzuführen und kann verwendet werden, um die gesamte pathogenen studieren V. Cholerae Lebenszyklus. Fische sind V. Cholerae durch Baden im Wasser ausgesetzt, die mit einer bekannten Anzahl von V. Choleraegeimpft worden. Innerhalb von wenigen Stunden findet intestinale Kolonisation statt, gefolgt von der Herstellung von Durchfall. Durchfall besteht aus Mucin, Proteine, ausgeschiedenen Bakterien und anderen Darminhalt. Der Grad der Durchfall kann mit ein paar einfachen Messungen13quantifiziert werden. V. Cholerae , das durch infizierte Fische ausgeschieden worden ist kann dann weiter zu naiv Fische infizieren Abschluss des ansteckenden Zyklus. Daher, rekapituliert der Zebrafisch-Modell der V. Cholerae menschliche Krankheit Prozess12,14.
Die am häufigsten verwendeten V. Cholerae Tiermodelle wurden historisch Mäusen und Kaninchen14,15,16,17,18. Diese Modelle waren maßgeblich an der Zugabe unseres Wissens von V. Cholerae Pathogenese. Jedoch weil Mäuse und Kaninchen nicht natürliche V. Cholerae sind Gastgeber, gibt es Einschränkungen, welche Aspekte des Lebenszyklus V. Cholerae studiert werden können. Die V. Cholerae Besiedlung von Mäusen und Kaninchen erfordert in der Regel das Fehlen von intestinalen Mikrobiota oder eine Vorbehandlung mit Antibiotika, um die intestinale Mikrobiota beschädigen. Beide Modelle erfordern entweder Magensonde einzuführen die Bakterien den Magen-Darm-Trakt oder chirurgische Manipulation die Bakterien direkt in den Darm zu injizieren. Zebrafisch haben den Vorteil, dass Erwachsene Fische mit einem intakten Darm Microbiota sind leicht besiedelt und die infektiöse Prozess geschieht auf natürliche Weise, ohne jede Manipulation erforderlich.
Die vorliegende Arbeit zeigt die Auslastung der Zebrafisch als Model in V. Cholerae Infektion. Die Infektion, Dissektion, Aufzählung der Kolonisation V. Choleraeund die Quantifizierung der Durchfall von V. Cholerae verursacht werden beschrieben12,13. Dieses Modell wird voraussichtlich für Wissenschaftler, die sowohl in den Krankheitsprozess V. Cholerae V. Cholerae ökologischen Lebensstil nützlich sein.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Wayne State University genehmigt. Diese Methode wurde zuerst in Runft Et Al. beschrieben. 12
1. Bestimmung der intestinalen Besiedlung
Hinweis: Intestinale Kolonisation ist die nützlichste Metrik im Zebrafisch-Modell, wie es verwendet werden kann, um die relative Fitness der verschiedenen V. Cholerae Stämme oder die Auswirkungen von Mutationen oder gen Knockouts zu vergleichen.
- Inokulation von Zebrafisch durch Untertauchen
Hinweis: Diese Art der Exposition gleicht den natürlichen Verlauf der Infektion.- Vorbereitung von V. cholerae
- 5 mL Lysogeny Brühe (LB) mit einem isolierten V. Cholerae impfen Kolonie von einer LB Platte und inkubieren sie bei 37 ° C mit schütteln (180 u/min) für 6 – 8 Stunden (über Nacht Kultur).
- 25 mL frisch autoklaviert LB-Medium in einem 250 mL konische Kolben mit 50 µL der oben genannten über Nacht Kultur zu impfen. 16 – 18 h bei 37 ° C mit schütteln (150 u/min) inkubieren.
- Lesen Sie die Extinktion bei 600 nm (OD600) einer Verdünnung von 1/10 der Nacht Kultur zur Schätzung der Anzahl der Bakterien pro mL (OD600 = 1 beträgt ~ 109 KBE/mL.)
- Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 6.000 g für 10 Minuten entfernen Sie die Medien mit einer Pipette oder Gießen Sie sie in einer Desinfektionslösung. Die Zellen in sterilen PBS auf die gewünschte Konzentration, in der Regel zwischen 1 x 107 bis 1 x 1010 pro ml PBS aufzuwirbeln.
Hinweis: Hier, verweisen wir auf autoklaviert Umkehrosmose-Wasser mit Meersalz von 60 mg/L als sterile Infektion Wasser.
-
Impfung und Inkubation
- Legen Sie vier oder fünf Zebrafisch in eine 400 mL-Becher mit 200 mL sterile Infektion Wasser.
- Fügen Sie 1 mL V. Cholerae (aus Schritt 1.1.1.4..), um die gewünschte Infektion Konzentration (in der Regel 5 x 104 bis 5 x 107 KBE/mL) in 200 mL Wasser Infektion zu bekommen.
- Decken Sie das Becherglas mit einem perforierten Deckel zu verhindern, dass die Fische springen; der Spitze einer 200 µL-Tipp-Box funktioniert gut für diese.
- Beschriften Sie jedes Becherglas und legen Sie sie in eine Glasfront Inkubator für die Dauer des Experiments auf 28 ° C eingestellt.
-
Verfahren zur vorübergehenden Exposition
Hinweis: Eine vorübergehende Exposition gegenüber V. Cholerae (in der Regel 6 h) gefolgt von der Beseitigung der Impfkeimen Bakterien eignet sich für das Studium der Übertragungs und für die genauere Quantifizierung der ausgeschiedenen Bakterien.- Gießen Sie nach 6 h der Exposition das Becherglas Wasser durch ein Netz um die Fische zu sammeln. Entsorgen Sie das infizierte Wasser in einen Behälter mit Bleichmittel, die V. Choleraezu töten.
- Legen Sie die entfernten Fisch in einen Becher mit 200 mL sterile Infektion Wasser. Lassen Sie die Fische schwimmen in diesem sauberes Wasser für 5 min um die Oberflächen Bakterien aus dem Fisch zu entfernen.
- Wiederholen Sie das Nettoverfahren (Schritt 1.2.2) und legen Sie den Fisch in einen neuen Becher 200 mL sterile Infektion Wasser. Halten Sie den Fisch in diesem Becher für die Dauer des Experiments.
- Vorbereitung von V. cholerae
- Euthanasie
- Wenn das Experiment der gewünschte Endpunkt erreicht hat, nehmen Sie eine Probe der Infektion Wasser (15 mL ist in der Regel ausreichend) ermöglicht ausgeschiedenen bakterielle zählt und die Messung von Durchfall (z. B. Mucin-Assay, Proteingehalt oder OD), wenn gewünscht (Abschnitt 2).
- Gießen Sie den Rest des Wassers durch ein Netz (um die Fische zu sammeln) in Bleichmittel, die V. Cholerae im Wasser zu töten.
- Legen Sie den Fisch in ein Becherglas mit Wasser Infektion plus 336 µg/mL von Ethyl-3-Aminobenzoate-Methanesulfonate (Tricaine) und inkubieren Sie die Fische in dieser Tricaine-Lösung für 20 min bei RT
Hinweis: Die Netzstrümpfe waren mit einer 10 %-chloridlösung sterilisiert.
- Dissektion
- Zubereitung von Fisch
- Scoop ein Fisch aus der Tricaine-Lösung mit einem Einweg-Plastik Löffel und legen Sie es auf der sezierenden Oberfläche.
- Position der Fisch mit der Bauchseite nach oben weisend und Pin es durch den Unterkiefer mit dem stumpfen Ende des Stiftes abgewinkelt, Weg von der Mitte des Körpers. Legen Sie eine andere Pin nur posterior bis zum Anus, auch vom Körper abgewinkelt.
- Exposition des Darm-Trakt
- In 70 % igem Ethanol getaucht Tupfer der ventralen Oberfläche der Fische mit einem fusselfreien Tuch.
- Ein Skalpell und Schere Vannas durch Eintauchen in 70 % igem Ethanol und brennen sie zu sterilisieren.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt längs in den Bauch direkt unter der Haut durch Eindringen in die Waage und das Skalpell verwenden. Achten Sie darauf, dass Sie nicht zu tief Schneiden der Darm-Trakt befindet sich direkt unter der Haut.
- Erweitern Sie mit der Schere, Schnitt sorgfältig entlang der Länge des Körpers, nicht tiefer als hautniveau schneiden und den Anus zu vermeiden.
- Zwei seitliche Einschnitte zu machen, mit der Schere in Richtung zum Kopf des Fisches zu eine Öffnung des Schnittes zu ermöglichen.
- Heften Sie die Haut auf jeder Seite die seitliche Einschnitte an der sezierenden Oberfläche, Angeln die Stifte heraus, vom Körper weg.
Hinweis: Die Spitzen der Stifte waren zuvor sterilisiert durch Abflammen sie mit Alkohol.
-
Entfernung von Darm-Trakt
Hinweis: Der Darm-Trakt sollte als eine blasse, sehr dünne Röhre auf die anderen Organe sichtbar sein.- Sterilisieren Sie die Zange Flamme zu und dann nutzen sie, um den gesamten Darm-Trakt (in der Regel 12-15 mm Länge) zu entfernen. Legen Sie den Darm in eine Homogenisierung Röhrchen mit Glasperlen (siehe Schritte 1.4.1–1.4.2) und 1 mL 1 x PBS oder LB auf Eis.
- Zubereitung von Fisch
- Homogenisierung
- Bereiten Sie die Homogenisierung Rohre im Voraus durch strömenden ~1.5 g von 1 mm Glasperlen in 2 mL Schraubverschluss-Röhrchen (füllen sie etwa halb) und dann durch Autoklavieren zu sterilisieren.
- Fügen Sie 1 mL sterile LB oder 1 X PBS.
- Sobald der Zebrafisch-Darm Schritt wurde hinzugefügt (1.3.3.1.) an den Rohren, Schraube die Kappen auf sehr eng wurden, und sichern Sie dann die Rohre in der Wirbel-Homogenisator.
- Die Proben für 1 min auf die maximale Einstellung zu homogenisieren, dann kühlen sie auf Eis für 1 – 2 min. wiederholen Homogenisierung noch einmal für eine vollständige Homogenisierung.
Hinweis: Mehrere Alternativen für die Homogenisierung werden auch funktionieren.
- Quantifizierung der intestinalen Besiedlung Ebenen
- Bereiten Sie Röhren (kleines Glas Reagenzgläser oder Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL) für die serielle Verdünnung der Homogenat indem Sie jedes Rohr 900 µL LB oder 1 X PBS hinzufügen. Für jeden Fisch bereiten Sie 5 – 6 Röhren und machen 10-divisibel serielle Verdünnungen der intestinalen Homogenat durch Zugabe von 100 µL Homogenat der ersten Röhre Vortexen es zu mischen, und dann hinzufügen 100 µL aus der ersten Röhre mit dem zweiten Rohr.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Verdünnungen vorbereitet worden sind.
- Platte 100 – 200 µL jeder Verdünnung auf LB-Agar-Platten mit 100 µg/mL von Streptomycin (bei Verwendung von Streptomycin-resistenter Stämme) und 40 µg/mL X-GAL (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). Inkubieren Sie die Platten bei 30 ° C für 16 – 18 h.
- Zählen Sie nach der Übernachtung Inkubation V. Cholerae Kolonien auf den Platten, entweder mit einem automatisierten Kolonie Zähler oder manuell zählen der Kolonien; Es ist hilfreich, um den gezählten Kolonien mit einem Marker-Spitze zu markieren.
- Bestimmen Sie die KBE pro Fisch Darm durch Multiplikation der Keimzahl mit der Verdünnungsfaktor der Suspension, unter Berücksichtigung das Volume, das überzogen war.
2. Messung der Fisch Durchfall
Hinweis: Vier verschiedene Messwerte wurden verwendet, um Fisch Durchfall zu beurteilen: die Mucin-Ebenen in das Wasser, die gesamte ausgeschiedenen proteingehalte in das Wasser, die OD600 von Wasser und die V. Cholerae KBE in der Wasser-13. Durchfall wird normalerweise optisch deutlich ca. 6 Stunden nach der Exposition der Zebrafisch, V. Cholerae wie oben beschrieben.
-
Mucin zu bestimmen
Hinweis: Mucin-Sekretion wird während der Kolonisierung V. Cholerae induziert und ist ein gutes Maß der Ausscheidung Ebenen, besonders früh in der Infektion13. Der Mucin-Assay ist eine Abwandlung der Mikrotiter Perjodsäure Schiff Assay19.- Bereiten Sie die folgenden Materialien: 50 % (w/V) Perjodsäure-Stammlösung und 0,1 % Perjodsäure Arbeitslösung (10 µL der 50 % Perjodsäure bestand bis 5 mL 7 % Essigsäure hinzugefügt – verwenden Sie unmittelbar nach der Herstellung), Mucin Standards, 96-Well Mikrotiter-Platten, Schiff Reagenz.
- Mucin-Standards durch die Aussetzung der folgenden Mengen Mucin (von einem Schwein Magen Typ III) in einem Natrium-Acetat-Puffer (100 mM Natrium Acetat, 5mM EDTA pH 5,5 mit Eisessig) vorbereiten: 400 µg/mL, 300 µg/mL, 200 µg/mL, 150 µg/mL , 100 µg/mL, 75 µg/mL, 50 µg/mL, 25 µg/mL und 10 µg/mL.
Bereiten Sie die Platte durch Zugabe von 100 µL einer Infektion Wasser in jede Vertiefung, die in der Probe wie folgt verwendet werden: leer, 1 X PBS; Mucin-Standards wie oben beschrieben, oder eine Wasserprobe aus der Fisch-Infektion. Jede Probe in dreifacher Ausfertigung zu tun.
- Mucin-Standards durch die Aussetzung der folgenden Mengen Mucin (von einem Schwein Magen Typ III) in einem Natrium-Acetat-Puffer (100 mM Natrium Acetat, 5mM EDTA pH 5,5 mit Eisessig) vorbereiten: 400 µg/mL, 300 µg/mL, 200 µg/mL, 150 µg/mL , 100 µg/mL, 75 µg/mL, 50 µg/mL, 25 µg/mL und 10 µg/mL.
- Fügen Sie 50 µL frische 0,1 % Perjodsäure Lösung jeweils gut mit einer Mehrkanal-Pipette und mischen Sie es mit nach oben und unten mehrmals pipettieren.
- Die Platte fest in Frischhaltefolie wickeln und bei 37 ° C für 1-1,5 h inkubieren.
- Kühlen Sie die Platte bis auf Raumtemperatur für 5 – 10 min. hinzufügen 100 µL Fuchsin-Lösung (Schiff's Reagenz) zu jedem Brunnen und pipettieren rauf und runter zu mischen.
- Wickeln Sie die Platte in Plastikfolie und inkubieren Sie es bei Raumtemperatur auf einem schaukelnden Plattform, bis Farbe entwickelt hat; die Farbe entsteht in der Regel innerhalb von 20 min. lesen die Extinktion bei 560 nm mit einem Teller-Reader.
- Zeichnen Sie eine Standardkurve Mucin (OD560vs. µg/mL Mucin standard). Bestimmen Sie die Mucin-Ebenen der unbekannten identifizieren, wo die OD-560 jeden unbekannten fällt auf der Standardkurve und lesen die entsprechenden Mucin-Konzentration für diesen Wert.
- Bereiten Sie die folgenden Materialien: 50 % (w/V) Perjodsäure-Stammlösung und 0,1 % Perjodsäure Arbeitslösung (10 µL der 50 % Perjodsäure bestand bis 5 mL 7 % Essigsäure hinzugefügt – verwenden Sie unmittelbar nach der Herstellung), Mucin Standards, 96-Well Mikrotiter-Platten, Schiff Reagenz.
-
Protein-Ebene bestimmen
Hinweis: Abgesehen von Mucin sind insgesamt Proteinspiegel im Wasser einen anderen Proxy für die Ebenen von Durchfall (bewölkt, flüssigen Stuhl) produziert von den Fischen. Dieses Verfahren nutzt eine standard Bradford-Test, um Proteingehalt zu schätzen. Protein-Ebene werden basierend auf einer Standardkurve Rinderserumalbumin (BSA) geschätzt.- Mischen Sie 100 µL einer der BSA Standards (siehe Hinweis weiter unten) oder 100 µL der Infektion (Wasser aus den Becher mit den infizierten Fisch) mit 900 µL Bradford Assay Reagenz (Pierce Protein Assay Reagenz eignet sich gut für diese) in eine Einweg-Küvette. Inkubieren Sie alle Proben bei Raumtemperatur für 2 min.
Hinweis: Die folgenden BSA Standards wurden verwendet: 1.800 µg/mL, 1.000 µg/mL, 750 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL, 50 µg/mL und 25 µg/mL. Die BSA-Standards wurden in autoklaviert destilliertem Wasser verdünnt. - Lesen Sie der OD-660 jeder Norm oder probieren Sie sie mit einem Spektrophotometer.
- Plot der BSA Standardkurve (OD660vs. µg/mL). Die proteingehalte der unbekannten durch die Identifizierung wo OD660 jeden unbekannten fällt auf der BSA Standardkurve und lesen Sie die entsprechenden Mucin-Konzentration für diesen Wert zu bestimmen.
- Mischen Sie 100 µL einer der BSA Standards (siehe Hinweis weiter unten) oder 100 µL der Infektion (Wasser aus den Becher mit den infizierten Fisch) mit 900 µL Bradford Assay Reagenz (Pierce Protein Assay Reagenz eignet sich gut für diese) in eine Einweg-Küvette. Inkubieren Sie alle Proben bei Raumtemperatur für 2 min.
-
Maßnahme OD600
Hinweis: Das Vorhandensein von Durchfall (bewölkt, flüssigen Stuhl) ist sichtlich erkennbar, nachdem mehrere h und eine einfache OD600 Ermittlung verwendet werden können, um diese zu quantifizieren.- Invertieren Sie das Rohr mit dem Infektion Wasser mehrmals um den Inhalt gleichmäßig zu verteilen. Ein Einweg-Küvette 1 mL der Wasserprobe hinzufügen. Verwenden Sie 1 mL sterile Infektion Wasser als die negativ-Kontrolle.
- Führen Sie eine "leere" Messung mit dem Spektralphotometer bei 600 nm mit der Negativkontrolle Probe. Lesen Sie jede Wasserprobe bei 600 nm und Aufzeichnung der Ergebnisse.
-
Bestimmung der ausgeschieden V. Cholerae KBE/mL nach der Infektion
Hinweis: Ein wichtiger Bestandteil der Durchfall von dem Zebrafisch produziert wird ausgeschieden V. Cholerae. Die Bestimmung der KBE/mL kann für Zwecke wie die Abschätzung der bakteriellen Replikations in den Fisch-Darm-Trakt und als Maß für eine infektiöse Dosis in Übertragung Experimente verwendet werden. Diese Maßnahme erfolgt am besten, wenn eine vorübergehende Infektion stattgefunden hat. Wenn eine 24 h-Infektion verwendet wird, wird dieser Test das kombinierte Inokulum plus ausgeschiedenen V. Choleraemessen.- Nehmen Sie eine Wasserprobe zum gewünschten Zeitpunkt und Seriell zu verdünnen Sie, wie zuvor beschrieben.
- Platte die serielle Verdünnungen auf selektivmedien (LB-Agar mit Streptomycin oder einem anderen geeigneten Antibiotikum oder DCLS) und inkubieren sie bei 30 ° C für 24 h.
- Zählen der Kolonien. Berechnen Sie die KBE pro mL Wasser, wie in Schritt 1.5 beschrieben.
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Representative Results
V. Cholerae Besiedlung der Zebrafisch-Darm-Trakt
Um ein Beispiel für die typische Besiedlung Ebenen zu bieten, die wir beobachten, geimpft wir 5 x 106 KBE der EL Tor V. Cholerae Pandemiestamm N16961 in 200 mL Wasser in einen Becher mit mehreren Zebrafisch. Nach 6 h von Infektion waren die Fische in frischem Wasser gewaschen und in einen Becher mit 200 mL autoklaviert Infektion Wasser wie im Protokoll beschrieben übertragen. 18 h nach der Übertragung (oder 24 h nach der Primärinfektion), die Fische wurden eingeschläfert, und ihre Därme wurden ergriffen, um die Besiedlung Ebenen bestimmen. Ca. 105 106 V. Cholerae Zellen pro Fisch Darm in der Regel in den Darmtrakt 24 h nach der Infektion (Hpi) (Abbildung 1) mit der 5 x 106 Inokulum Größe beobachtet wurden.
Quantifizierung der Fisch Durchfall
Durchfall wurde mit Hilfe der vier einfache Assays, die oben beschriebenen quantifiziert. Der erste Test, der KBE ausgeschiedenen V. Cholerae, ist in Abbildung 1dargestellt. Verdünnungsreihen Wasser 24 Hpi wurden vergoldet, um die V. Cholerae KBE zählen. Relativ hohen Niveau der ausgeschiedenen V. Cholerae werden in der Regel eingehalten; in diesem Beispiel etwa 105 V. Cholerae pro mL Wasser erkannt wurden. Nicht infizierte Fische produzieren keine feststellbaren V. Cholerae (Daten nicht gezeigt).
Der zweite Test verwendet, um Durchfall zu quantifizieren ist ausgeschiedene Mucin. Abbildung 2 zeigt die Wirkung von drei verschiedenen V. Cholerae infektiöse Dosen auf den Mucin-Niveaus im Wasser 24 Hpi. Eine höhere infektiöse Dosis korreliert mit einer höheren Ausscheidung von Mucin ins Wasser. Als Kontrolle vier Fische wurden in einer identischen Becher mit Wasser gelegt, aber PBS wurde anstelle der Aussetzung V. Cholerae hinzugefügt. Die Kontrolle Fische ausgeschieden sehr wenig Mucin.
Die dritte Durchfallerkrankungen Quantifizierung-Assay ist die OD600 Wasser 24 Hpi. Wie in Abbildung 3dargestellt, war die OD600 dieses Wassers signifikant höher in den Becher mit Zebrafisch mit V. Cholerae als in den Becher mit nicht infizierten Zebrafisch infiziert.
Zu guter Letzt wurden die gesamten proteingehalte im Wasser gemessen. Wasser mit den infizierten Fischen enthaltenen Gesamt-Protein Ebenen fast doppelt so viel, die in das Wasser mit den nicht infizierten Fischen (Abbildung 4) beobachtet. Kollektiv, veranschaulichen diese vier Tests die Auswirkungen hat V. Cholerae Infektion am Zebrafisch Ausscheidung.
Abbildung 1: Intestinale Kolonisation der Zebrafisch von V. Cholerae. Die Fische waren infiziert für 6 h, dann gewaschen und für insgesamt 24 h inkubiert. Die linke Seite der Abbildung zeigt die gesamte KBE pro Darm vier Fische (schwarze Punkte). Den rechten Teil der Abbildung zeigt die V. Cholerae KBE pro mL gemessen in Wasser 24 Hpi (schwarze Quadrate). Die Mittel der beiden Datensätze sind mit einer großen horizontalen Linie gezeigt und die Standardabweichung von Fehlerindikatoren angedeutet sind. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Mucin Assay. Drei verschiedene V. Cholerae infektiöse Dosen verwendet wurden, zusammen mit einem nicht infizierten Steuerelement wie angegeben unter der X-Achse. Die Mittelwerte der Mucin im Wasser durch die modifizierte Perjodsäure Schiff (PAS) assay erkannt werden durch die schwarzen Balken oben jede infektiöse Dosis angegeben. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Die Sternchen geben p < 0,05 durch Schüler der ungepaarten t-Test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: OD600 Assay als Proxy für Durchfall. Die OD600 von 1 mL Wasser aus den Becher mit beiden V. Cholerae infiziert oder nicht infizierten Fische gemessen wurde. Die schwarzen Balken zeigen den Mittelwert und die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Die Sternchen geben p < 0,05 durch Schüler der ungepaarten t-Test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Total Proteinspiegel im Wasser. Die gesamte-Protein wurde durch ein Bradford-Test wie beschrieben geschätzt. Die schwarzen Balken zeigen die Mittelwerte und die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Die Sternchen geben p < 0,05 durch Schüler der ungepaarten t-Test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Der Zebrabärbling ist ein relativ neues Modell für die Untersuchung V. Cholerae aber viel verspricht für die Zukunft Entdeckung der bisher unbekannte Aspekte von V. Cholerae Biologie und Pathogenese11,12,13 . Die Erwachsenen Zebrafisch-Modell hat die Vorteile der beiden natürlichen V. Cholerae Host, die intakt, Reife intestinalen Mikrobiota und ein Umweltmodell enthält. Nachteile des Modells sind die zwei großen menschlichen Virulenzfaktoren, Cholera-Toxin und Toxin-coregulated Pilus, nicht für Zebrafisch Kolonisierung oder Pathogenese12erforderlich. Dies könnte jedoch Alternativ betrachtet werden, als ein weiterer Vorteil, die die Identifizierung des Romans V. Cholerae Besiedlung ermöglichen könnte Faktoren und erleichtern das Studium der Schadstoffexpositionen V. Cholerae . Dies ist besonders relevant für die überwiegende Mehrheit der nicht-O1/O139 "Umwelt" V. Cholerae Stämme, von denen meisten nicht produzieren Cholera Toxin oder Toxin coregulated Pilus zu tun und noch kann noch verursachen Krankheit20,21.
Die Probleme am ehesten entstehen mit Hilfe dieses Modells beziehen sich auf die reichlich vorhandenen intestinale Mikrobiota. Beschichtung auf obstructions Medien wird dieses Modell im wesentlichen unbrauchbar machen es unmöglich, die V. Cholerae Kolonien zu identifizieren werden. Selbst mit selektiven oder teilweise selektiven Medien wie LB plus Streptomycin oder DCLS, wird ein Hintergrund der Kolonien von intestinalen Mikrobiota anwesend sein. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Kolonien, die gezählt werden bona-fide V. Cholerae sind durch das Ausbessern der Kolonien durch die Beschichtung auf weniger selektivmedien auf einem sehr selektiven Medium wie TCBS produziert. Alternativ wäre die Einfügung eines besser selektive Marker in das Genom eines Stammes von Interesse die Identifizierung von V. Cholerae aus Darm Homogenates erheblich vereinfachen.
Der Vorteil der Assays zur Quantifizierung der Zebrafisch Durchfall ist, dass sie einfach und kostengünstig zu13ausführen. Der Nachteil ist, dass diese Tests weitgehend unspezifisch sind, abgesehen von zählen ausgeschiedenen V. Cholerae KBE direkt, und es schwieriger kann zu bestimmen, ob der Durchfall direkt durch V. Cholerae Pathogenese oder einige andere Stressor ist . Die Variationen dieser oder anderen Assays zur Verbesserung ihrer Spezifität wird wahrscheinlich Entwicklungshilfe in Zukunft Messungen von V. Cholerae Pathogenese im Zebrafisch.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Dank Melodie Neely, Jon Allen Basel Abuaita und Donna Runft für ihre Bemühungen bei der Entwicklung des Zebrafisch-Modells. Die Forschung hier berichtet wurde durch das National Institute of Allergy and Infectious Diseases von den National Institutes of Health unter Award Nummern R21AI095520 und R01AI127390 (zu Jeffrey H. Withey) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific, Edison, NJ | Excella E25 | |
| Incubator | NUAIRE, Plymouth, MN | Auto Flow | |
| Spectrophotometer | Thermo, Waltham, MA | Geaesys 6 | |
| Vortex homogenizer | Minibeadbeater24 | 112011 | |
| Weighing Machine | Ohaus, Columbia, MD | Adventurer Pro | |
| Heat Stirer | Corning, Corning, NY | PC-420D | |
| Burner | |||
| automated colony counter | REVSCI | 120417B | |
| Materials | |||
| 400 ml glass beakers | Pyrex | ||
| perforated lids | Microtip holder with holes from tip box | ||
| disposable plastic spoons | Office Depot, Boca Raton, FL | D15-25-7008 | |
| Fish Tank System | Aquaneering, San Diego, CA | ||
| RO Water Purifier | Aqua FX | TK001 | |
| Fish net | Marina | ||
| fish food | Tetra fin | ||
| Brine Shrimp | Red jungle brand | O.S.I. pro 80 | |
| Styrofoam board | |||
| Pins | |||
| Scalpels | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 10000-10 | |
| Forceps | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 11223-20 | |
| Vannas scissors | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 15000-11 | |
| 2 ml screw cap tubes | Fisher Scientific, Hampton, NH | 02-681-375 | |
| 1 mm glass beads | Bio Spec | 11079110 | |
| Glass beads for spreading | Sigma, St. Louis, MO | 18406-500G | |
| Petri plate | Fisher Brand, Hampton, NH | FB0875713 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Midsci, Valley Park, MO | AVSS1700 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning Falcon, Corning, NY | 352098 | |
| Test tubes | Pyrex | 9820 | |
| Glass Pipette | Fisher Brand, Hampton, NH | 13675K | |
| Micro pipettes | Sartorius Biohit, Göttingen, Germany | m1000/m200/m20 | |
| Tips | Genesee Scientific, San Diego, CA | 24-150RS/24-412 | |
| Chemicals | |||
| Instant Ocean salts | |||
| phosphate buffered saline | VWR Life Science, Radnor, PA | K813-500ml | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma, St. Louis, MO | A5040 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | Sigma, St. Louis, MO | 10651745001 | |
| Schiff’s reagent | Sigma, St. Louis, MO | 84655-250 mL | |
| periodic acid | Fisher Scientific, Hampton, NH | 10450-60-9 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma, St. Louis, MO | M2378-100G | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific, Hampton, NH | 9046-46-8 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Reagent | Thermo, Waltham, MA | 22660 | |
| LB medium | |||
| Trypton | BD Biosciences, San Jose, CA | 211705 | |
| Teast Extract | BD Biosciences, San Jose, CA | 212750 | |
| NACL | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP358-212 | |
| Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 214010 | |
| TCBS Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 265020 | |
| DCLS Agar | Sigma, St. Louis, MO | 70135-500gm | |
| Software | |||
| Microsoft office | |||
| Prism 5 |
References
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