Summary
Vi demonstrere en roman metode til at beregne en enkelt-celle-baserede 3-dimensionelle (3D) forsamling uden en kunstig stillads.
Abstract
Regenerativ medicin og vævsmanipulering tilbyder flere fordele for behandlingen af vanskelige sygdomme, og flere undersøgelser har påvist betydningen af 3-dimensionelle (3D) cellulære forsamlinger i disse felter. Kunstige stilladser har ofte været brugt til at konstruere 3D cellulære forsamlinger. Men stilladser bruges til at konstruere trådløse enheder er undertiden giftige og kan ændre egenskaberne for cellerne. Det ville således være gavnligt at indføre en ikke-toksiske metode for at lette celle-celle kontakt. I dette papir præsentere vi en roman metode til at opbygge stabile cellulære assemblies ved hjælp af optisk pincet med dextran. En af fordelene ved denne metode er, at det etablerer stabil celle til celle kontakt inden for et par minutter. Denne nye metode giver mulighed for opførelse af 3D cellulære assemblies i en naturligt hydrofil polymer og forventes at være nyttig for at bygge næste generation 3D encellede forsamlinger inden for regenerativ medicin og vævsmanipulering.
Introduction
Mens humane væv er sammensat af flere samlinger af celler og kan hjælpe med at opretholde homeostase i kroppen, spille enkelt celler i sig selv også vigtige roller via celle-til-celle interaktion. Det er derfor vigtigt at belyse hvordan enkelt celler kan stimuleres af eksterne signaler, og hvordan de overføre signaler til andre vedhængende celler. Til dette formål, er flere metoder blevet fastlagt for bygningen af enkelt-celle-baserede 3-dimensionelle (3D) forsamlinger1,2,3,4,5,6 ,7,8. De materialer, der bruges til at konstruere trådløse enheder kan dog stadig forbedres. For eksempel, syntetiske geler og polymerer herunder polyethylenglycol (PEG) besidder visse kemiske fysisk-kemiske egenskaber og kan påvirke target-cellerne (f.eks. toksicitet).
Vi har for nylig rapporteret en roman system, der kan generere en enkelt-celle-baseret 3D forsamling af celler ved hjælp af dextran (DEX) ved at etablere stabile celle-celle kontakt9. Vi mente, at denne teknologi kunne være nyttige i flere forskningsområder, herunder regenerativ medicin og endog kræft biologi. I denne rapport beskriver vi hvordan vi manipulere enkelt celler og konstruere 3-dimensionelle (3D) cellulære forsamlinger i overværelse af forskellige hydrofile biomacromolecules herunder DEX uden en kunstig stillads.
Protocol
1. forberedelse af celler
- Opretholde NAMRU mus mælkekirtlen epitelceller (NMuMG celler) med 5 mL af D-MEM indeholdende 10% (v) føtal bovint serum (FBS) og 1% (v) Penicillin-Streptomycin (Poulsen) i en 25 cm3 kolbe. Fjern Dulbecco ændret Eagle's medium (D-MEM), som indeholder 10% FBS og 1% P/S.
- Kolben tilsættes 3-5 mL af 37 ° C fosfatbufferet saltopløsning (PBS) (-). Bemærk, at pH i PBS 7.1-7,3.
- Fjerne alle PBS fra kolben ved hjælp af en betjent sug.
- Kolben tilsættes 1,5 mL af 37 ° C trypsin (0,25%, w/v).
- Inkuber kolben i ca 1-2 minutter ved 37 ° C i en CO2 inkubator.
- Der tilsættes 3,5 mL af D-MEM indeholdende 10% FBS og 1% P/S til kolben. Pipette til at blande.
- Overføre cellesuspension til en 15 mL centrifugeglas og centrifugeres det i 3 min ved stuetemperatur. Bemærk, at rotationen radius og rotationshastighed af centrifugen er 16,6 cm og 1500 rpm, henholdsvis. Under denne tilstand er den relativ centrifugalkraft 417 x g.
- Der tilsættes 5 mL frisk D-MEM (10% FBS og 1% P/S) til kolbe efter sugning mediet (hvis det er påkrævet, cryopreserve celler med kryopræservering løsning, efter producentens anvisninger).
2. forberedelse af Dextran (DEX)
- Forberede 80 mg/mL af DEX løsning ved at blande 10 mL af D-MEM (10% FBS, 1%P/S) og 0,8 g af DEX. Bemærk at DEX løsning kan være filtreret med en sprøjte filter (0,22 µm) efter cellerne har kulturperler i en tilstrækkelig lang tid.
- Forberede en cellesuspension indeholdende 40 mg/mL DEX medium ved at blande 200 µL af DEX løsning og 200 µL af cellesuspension forberedt i 2.1. Bemærk, at nummer tætheden af celler i løsningen er ca. 2.3 × 105 celler/mL.
3. forberedelse til Laser og mikroskopi
- Drej på laser (kontinuerlig bølge, 1,064 nm bølgelængde) (figur 1en). Bemærk, at brug af en laserstråle med en bølgelængde i rød til nær-infrarøde område er mest effektive; denne bølgelængde regionen kaldes diagnostisk og terapeutisk vindue10 da det minimalt optages af celler.
- Dobbeltklik på ikonet software.
- Dobbeltklikke på ikonerne for ① kamera, ② light - emitting diode (LED), ③ fokus justere og ④ flytter scenen. Viser den svarende til ①-④ vil dukke op (figur 1b).
4. celle Manipulation ved hjælp af Laser diffusering System
- Sted 20 µL af den prøve, der tilberedes i trin 2.2 på bunden cover glas (0,17 mm tykkelse, størrelse = 30 mm × 40 mm), og dække det med den øverste dække glas (0,17 mm tykkelse, størrelse = 18 mm × 18 mm), med adskillelse af to afstandsstykker (0,17 mm tykkelse size = 10 mm × 24 mm), som vist i figur 2. Bemærk at disse briller ikke kræver en speciel belægning.
- Placere cellen prøve forberedt i trin 4.1 på lavere mål linsen (vand fordybelse med ca. 10 μl, forstørrelse = 60 X, arbejde afstand = 0,28 mm, numerisk blænde = 1,2)).
- Fastgør den øverste mål linse (vand fordybelse med ca. 10 μl, forstørrelse = 60 X, arbejde afstand = 2 mm, numerisk blænde = 1,0) øverst i cellen prøve.
- Drej på LED lys ved at klikke på ikonet 2 (figur 1b).
- Justere afstanden mellem prøven og lavere mål linsen ved at klikke på ikonerne på panelet 3 (figur 1b) indtil det er i fokus.
- Bestråle laserstråler på Position 1 og Position 2 (figur 1B) i eksemplet ved at klikke på ikonerne I, II og III (figur 1b).
- Angive intensiteten på hver laserstråle til 1.500 mW ved at indtaste denne værdi på ikonet IV (figur 1b).
- Flyt den prøve fase ved at klikke på ikonet 4 der angiver retninger (figur 1b) indtil en celle er fanget på Position 1 (figur 1b).
- Træk markøren angiver Position 2 (figur 1b) indtil en anden celle er fanget på Position 2.
5. opførelse af en 3-dimensionel (3D) cellestruktur
- Manipulere en enkelt celle, så det er i kontakt med en anden celle. Opretholde denne tilstand for 300 s; dvs. hver celle er udsat for en laser til 300 s.
- Optage X-Y-aksen, vist i figur 1b.
- Konstruere en vilkårlig 2D celle forsamling af fældefangst og transport af en anden celle til cellerne.
- Konstruere en 3D cellulære forsamling ved at flytte scenen op og ned.
- Bekræfte, at forsamlingen forbliver stabil efter laseren er slukket.
Representative Results
Figur 1 viser mikroskop og software, der anvendes i denne undersøgelse. Figur 2 er en skematisk fremstilling af proceduren for ibrugtagning prøveopløsningen celler. Figur 3 viser dannelsen af en pyramide struktur ved hjælp af dobbelt-beam Optisk pincet. Hvis eksperimentet er vellykket, forbliver disse cellulære forsamlinger stabilt selv efter laseren er slukket.
Figur 1 : (a) kontrolsystem for Lasersystemet diffusering (NanoTracker2 (11)). Systemet er aktiveret ved at dreje på den laser skifte efter trin ①-③. (b) software til at styre Laser diffusering System. Kameraet, førte lys, fokus justere og flytte fase er aktiveret ved at klikke på ikonerne ① ②, ③, og ④, henholdsvis. Det mikroskopiske billede vises i panel 1. Tænd/sluk kontrol for LED er i panelet 2. Fokus er kontrolleret i panelet 3. Laserstråler er bestrålet på position 1 og 2 ved at klikke på ikonerne I til IV. Denne Laser diffusering Systemare oplysninger i Ref. (12). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative skematisk for at placere den lysbillede glas. 20 µL af prøven (cellesuspension indeholdende dextran) er placeret på diaset og anvendes til laser manipulation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : en) forsamlinger af epitelceller (NMuMG) på en bestemt figur i et medium med DEX (40 mg/mL): en pyramide er vist som et eksempel på en 3D klynge. b) en skematisk figur af den pyramide-formet 3D cellulære forsamling er også vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den nuværende undersøgelse viser en konkret anvendelse af vores nylige rapporterne9,11 på anvendelse af opløselige polymerer til opførelsen af 3D encellede forsamlinger. Sådanne forsamlinger dannes stabilt i bulk løsning, når antallet af celler er op til 10, og kan afholdes af en enkelt laserstråle. Assemblies udfældes på glasoverfladen, når der er mere end 10 celler. Selvom forsøgene er stadig i en primitiv scene, vi forventer, at den nye metode kunne være et effektivt redskab til opførelse af næste generations 3D encellede assemblies, som er nødvendige for fremskridt inden for cellebiologi og regenerativ medicin.
I en opløsning, der indeholder ingen polymer, frastøde celler hinanden på grund af den elektrostatiske frastødning som følge af den overflade afgift, hydrering frastødning kraft, glycocalyx frastødning effekt og membran bølgebevægelse. Vores tidligere undersøgelse viste, at celle par kan være stabil i lang tid når cellerne behandles med PIND. Endnu vigtigere, tyder den vellykkede transport af en celle til et område uden PIND, når cellerne var blevet afholdt i kontakt i 5 minutter i PIND, på, at cellulære kontakt opretholdes på en stabil måde. Dette er godt forklaret i form af iltsvind effekt11, og stort set den samme mekanisme gælder for de cellulære forsamlinger genereret ved hjælp af DEX9. Vores nuværende resultater tyder på, at andre typer af naturlige makromolekyler også kunne bruges til at konstruere stabil 3D cellulære forsamlinger.
For hurtig transport af celler er koncentrationen af polymer vigtigt. Generelt, viskositet af løsningen drastisk øger når polymeren er opløst over overlapning koncentration. Under denne tilstand er det vanskeligt at manipulere celler ved hjælp af optisk pincet. Derfor bør eksperimentet udføres under overlapning koncentration. For en DEX løsning, overlapning koncentration er ca. 50 mg/mL (kinetic viskositeten er 5,5 mm2/s). Som vist i Ref. 9, konstateredes en stabil cellulære forsamling, når koncentrationen af DEX var 10 mg/mL til 40 mg/mL. Dette resultat tyder på at effekten udtynding er tilstrækkelig stor til at opretholde stabile celle-celle kontakt, selv når DEX koncentration er lavere end overlapning koncentrationen. Det har vist sig at tilsætning af DEX ikke påvirker cellernes levedygtighed op til 40 mg/mL 9.
Etablering af en metode til opførelse af 3D cellulære forsamlinger er vigtigt inden for regenerativ medicin, siden efterligne en i vivo cellulære mikromiljø ved strukturering single celler kan lette stamcelle-afledt væv dannelse. Indtil videre har vi brugt denne protokol til at konstruere cellulære assemblies ved hjælp af Neuro2A celler9 ud over NMuMG celler. Vi håber at kunne etablere en eksperimentel metode til at konstruere 3D cellulære forsamlinger af et større antal celler af forskellige morfologier. Den optiske pincet system udviklet af Ichikawa et al. 13 ville være relevant til dette formål, da orientering af celler kan kontrolleres. Yderligere forsøg i den retning bør være lovende.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Shu Hashimoto, Aoi Yoshida og Taeko Ohta Doshisha Universitet for deres generøse støtte med opsætningen af eksperimenterende. Dette arbejde blev støttet af KAKENHI (15H 02121, 15K 05400, 25103012, 50587441) og MEXT-Supported Program for den strategiske forskningsfond på Private universiteter. Denne undersøgelse blev også støttet af en polsk tilskud fra KNOW (førende nationale Forskningscenter) videnskabelige konsortiet "Sunde dyr - sikre fødevarer", afgørelse af Ministeriet for videnskab og videregående uddannelser nr. 05-1/KNOW2/2015...
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope IX71 | Olympus | IX71 | |
| Dextran(200,000; molecular biology-grade) | Wako | CAS.NO 9004-54-0 | |
| Laser Trapping System (NanoTracker 2) | JPK Instruments | S/N T-05-0200 | |
| Upper Objective Lens | Olympus | LUMPLFLN60XW | |
| Lower Objective Lens | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Top Cover Glass | MATUNAMI | C022401 | |
| Intermediate Cover Glass (Spacer) | MATUNAMI | - | custom-made (size = 10mm×10mm, thickness = 0.17mm) |
| Bottom Cover Glass | MATUNAMI | C030401 | |
| Camera | The Imaging Source | DFK 31AF03 | |
| Software | JPK Instruments | NanoTracker2 PFM software | |
| NMuMG cells | RIKEN BRC | RCB2868 | |
| PBS | Wako | 166-23555 | |
| Cell banker | Nippon Zenyaku Kogyo | ZR621 | |
| D-MEM | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 044-29765 | |
| FBS | Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan | 172012-500ML | |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 161-23181 |
References
- Aloysious, N., Nair, P. D. Enhanced survival and function of islet-like clusters differentiated from adipose stem cells on a three-dimensional natural polymeric scaffold: an in vitro study. Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1508-1522 (2014).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Kirkham, G. R., et al. Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers. Scientific Reports. 5, 8577 (2015).
- Liu, Y., Rayatpisheh, S., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. Impact of endothelial cells on 3D cultured smooth muscle cells in a biomimetic hydrogel. ACS Applied Materials & Interfaces. 4 (3), 1378-1387 (2012).
- Liu, Z. Q., et al. Dextran-based hydrogel formed by thiol-Michael addition reaction for 3D cell encapsulation. Colloids and Surfaces B. 128, 140-148 (2015).
- McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells. World Journal of Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).
- Sadovska, L., et al. A novel 3D heterotypic spheroid model for studying extracellular vesicle-mediated tumor and immune cell communication. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2017).
- Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 110-120 (2017).
- Yoshida, A., et al. Manipulating living cells to construct a 3D single-cell assembly without an artificial scaffold. Polymers. 9, 319 (2017).
- Anderson, R. R., Parrish, J. A. Selective photothermolysis: precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation. Science. 220, 524-527 (1983).
- Hashimoto, S., et al. Formation of Stable Cell-Cell Contact without a Solid/Gel Scaffold: Non-invasive Manipulation by Laser under Depletion Interaction with a Polymer. Chemical Physics Letters. 655, 11-16 (2016).
- Rauch, P., Jähnke, T. Optical Tweezers for Quantitative Force Measurements and Live Cell Experiments. Microscopy Today. 22, 26-30 (2014).
- Ichikawa, M., et al. Tilt control in optical tweezers. Journal of Biomedical Optics. 13, 010503 (2008).
