Name: Manipolazione delle cellule viventi per costruire assieme cellulare 3D stabile senza impalcatura artificiale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Scopri come costruire assiemi cellulari 3D stabili senza impalcature artificiali utilizzando pinze ottiche e polimeri idrofilici come il Dextran. Questo metodo innovativo offre nuove prospettive per l'ingegneria tissutale e la medicina rigenerativa.

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Gli autori ringraziano Shu Hashimoto, Aoi Yoshida e Taeko Ohta a Doshisha University per la loro generosa assistenza con la messa a punto sperimentale. Questo lavoro è stato supportato da KAKENHI (15H 02121, 15 05400 K, 25103012, 50587441) e dal programma MEXT-Supported per la Fondazione di ricerca strategica alle università Private. Questo studio è stato sostenuto anche da una sovvenzione polacca il consorzio scientifico KNOW (leader del centro nazionale ricerche) "Animale – sicuro il cibo sano", decisione del Ministero della scienza e dell'istruzione superiore n. 05-1/KNOW2/2015...

1. preparazione delle celle
<ol><li>Mantenere cellule epiteliali della ghiandola mammaria del topo a NAMRU (cellule NMuMG) con 5 mL di D-MEM contenente 10% (v) siero bovino fetale (FBS) e 1% (v) penicillina-streptomicina (P/S) in un pallone di3 cm 25. Rimuovere Dulbecco per volta medio dell'Aquila (D-MEM), contenente 10% FBS e 1% P/S.</li>
	<li>Aggiungere 3-5 mL di soluzione tampone fosfato (PBS) (-) e 37 ° C al pallone. Si noti che il pH del PBS è 7.1-7.3.</li>
	<li>Rimuovere tutto il PBS dalla beuta utilizzando un aspiratore.</li>
	<li>Aggiungere 1,5 mL di tripsina di 37 ° C (0,25%, p/v) al pallone.</li>
	<li>Incubare la beuta per circa 1-2 minuti a 37 ° C in un incubatore a CO2 .</li>
	<li>Aggiungere 3,5 mL di D-MEM contenente 10% FBS e 1% P/S al pallone. Pipetta per mescolare.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare a esso per 3 min a temperatura ambiente. Notare che il raggio di rotazione e la velocità di rotazione della centrifuga sono 16,6 cm e 1500 giri/min, rispettivamente. In questa circostanza, la forza centrifuga relativa è 417 x g.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di fresco D-MEM (10% FBS e 1% P/S) al pallone dopo avere aspirato il mezzo (se necessario, crioconservare le cellule con soluzione di crioconservazione, seguendo le indicazioni del produttore).</li>
</ol>2. preparazione di destrano (DEX)
<ol><li>Preparare 80 mg/mL di soluzione DEX mescolando 10 mL di D-MEM (10% FBS, 1%P/S) e 0,8 g di DEX. Si noti che la soluzione DEX può essere filtrata con un filtro per siringa (0,22 µm) dopo che le cellule sono coltivate per un tempo sufficiente.</li>
	<li>Preparare una sospensione di cellule contenenti 40 mg/mL di terreno di DEX mescolando 200 µ l di soluzione DEX e 200 µ l di sospensione cellulare preparata al punto 2.1. Si noti che la densità di numero delle cellule nella soluzione è circa 2.3 × 105 cellule/mL.</li>
</ol>3. preparazione per Laser e microscopia
<ol><li>Accendere il laser (onda continua, 1.064 nm lunghezza d'onda) (Figura 1a). Si noti che l'uso di un fascio laser con una lunghezza d'onda nel colore rosso alla regione vicina all'infrarosso è più efficace; Questa regione di lunghezza d'onda si chiama finestra diagnostica e terapeutica10 poiché è minimamente assorbito dalle cellule.</li>
	<li>Fare doppio clic sull'icona del software.</li>
	<li>Fare doppio clic che le icone di fotocamera ① ② diodo luminoso (LED), messa a fuoco ③ per regolare, quindi ④ fase commovente. I display corrispondente ④ ① mostrerà (Figura 1b).</li>
</ol>4. cell manipolazione utilizzando il sistema Laser Trapping
<ol><li>Posto 20 µ l del campione preparato nel passaggio 2.2 il vetro di copertura inferiore (0,17 mm di spessore, dimensione = 30 × 40 mm) e coprire con il vetro di copertura superiore (0,17 mm di spessore, dimensione = 18 × 18 mm), con separazione fornito da due distanziatori (0,17 mm di spessore dimensione = 10 mm × 24 mm), come illustrato nella Figura 2. Si noti che questi occhiali non necessitano di un rivestimento speciale.</li>
	<li>Posizionare la cella del campione preparata nel passaggio 4.1 sulla lente dell'obiettivo inferiore (acqua immersione con ca. 10 μl, ingrandimento = 60 X, distanza di lavoro = 0,28 mm, apertura numerica = 1,2)).</li>
	<li>Fissare l'obiettivo superiore (acqua immersione con ca. 10 μl, ingrandimento = 60 X, distanza di lavoro = 2 mm, apertura numerica = 1.0) nella parte superiore della cella del campione.</li>
	<li>Accendere il LED luce facendo clic sull'icona 2 (Figura 1b).</li>
	<li>Regolare la distanza tra il campione e la lente dell'obiettivo inferiore facendo clic sulle icone sul pannello 3 (Figura 1b) fino a quando non è a fuoco.</li>
	<li>Irradiare i raggi laser in posizione 1 e posizione 2 (Figura 1B) del campione cliccando le icone, I, II e III (Figura 1b).</li>
	<li>Impostare l'intensità di ogni fascio laser a 1.500 mW inserendo questo valore a icona IV (Figura 1b).</li>
	<li>Spostare la fase del campione facendo clic su indicazioni stradali indicando icona 4 (Figura 1b) fino a quando una cella viene intrappolata in posizione 1 (Figura 1b).</li>
	<li>Trascinare il cursore che indica la posizione 2 (Figura 1b) fino a un'altra cella viene intercettato in posizione 2.</li>
</ol>5. costruzione di una struttura di cella 3-dimensionale (3D)
<ol><li>Manipolare una singola cella in modo che sia a contatto con un'altra cella. Mantenere questa condizione per 300 s; cioè, ogni cella è esposta ad un laser per 300 s.</li>
	<li>Registrare l'asse di X-Y, mostrato nella Figura 1b.</li>
	<li>Costruire un assembly arbitrario cella 2D intrappolando e trasportando un'altra cella per le celle.</li>
	<li>Costruire un assembly cellulare 3D spostando su e giù il palco.</li>
	<li>Confermare che l'assembly rimane stabile dopo il laser viene spento.</li>
</ol>

<ol><li>Aloysious, N., Nair, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+survival+and+function+of+islet-like+clusters+differentiated+from+adipose+stem+cells+on+a+three-dimensional+natural+polymeric+scaffold%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced survival and function of islet-like clusters differentiated from adipose stem cells on a three-dimensional natural polymeric scaffold: an in vitro study.</a> Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1508-1522 (2014).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Kirkham, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+assembly+of+complex+cellular+microenvironments+using+holographic+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers.</a> Scientific Reports. 5, 8577(2015).</li>
<li>Liu, Y., Rayatpisheh, S., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+endothelial+cells+on+3D+cultured+smooth+muscle+cells+in+a+biomimetic+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Impact of endothelial cells on 3D cultured smooth muscle cells in a biomimetic hydrogel.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 4 (3), 1378-1387 (2012).</li>
<li>Liu, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran-based+hydrogel+formed+by+thiol-Michael+addition+reaction+for+3D+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%22%5BJournal%5D)">Dextran-based hydrogel formed by thiol-Michael addition reaction for 3D cell encapsulation.</a> Colloids and Surfaces B. 128, 140-148 (2015).</li>
<li>McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+three-dimensional+culture+system+for+long-term+expansion+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells.</a> World Journal of Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).</li>
<li>Sadovska, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29248729">A novel 3D heterotypic spheroid model for studying extracellular vesicle-mediated tumor and immune cell communication.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2017).</li>
<li>Srinivasan, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Salivary+Human+Stem%2FProgenitor+Cells+Undergo+Microenvironment-Driven+Acinar-Like+Differentiation+in+Hyaluronate+Hydrogel+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 110-120 (2017).</li>
<li>Yoshida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2073-4360/9/8/319">Manipulating living cells to construct a 3D single-cell assembly without an artificial scaffold.</a> Polymers. 9, 319(2017).</li>
<li>Anderson, R. R., Parrish, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+photothermolysis%3A+precise+microsurgery+by+selective+absorption+of+pulsed+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Selective photothermolysis: precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation.</a> Science. 220, 524-527 (1983).</li>
<li>Hashimoto, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009261416303207">Formation of Stable Cell-Cell Contact without a Solid/Gel Scaffold: Non-invasive Manipulation by Laser under Depletion Interaction with a Polymer.</a> Chemical Physics Letters. 655, 11-16 (2016).</li>
<li>Rauch, P., Jähnke, T. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/microscopy-today/article/optical-tweezers-for-quantitative-force-measurements-and-live-cell-experiments/D4853D94DFD7AE988E656F49A1DA49FB">Optical Tweezers for Quantitative Force Measurements and Live Cell Experiments.</a> Microscopy Today. 22, 26-30 (2014).</li>
<li>Ichikawa, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18315348">Tilt control in optical tweezers.</a> Journal of Biomedical Optics. 13, 010503(2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Lo studio presente indica un'applicazione concreta del nostro recente report9,11 sull'uso di polimeri solubili per la costruzione di assiemi 3D di cella singola. Tali assemblee sono formate stabilmente nella soluzione di massa quando il numero delle cellule è fino a 10 e possa essere detenuto da un singolo fascio laser. Gli assembly precipitano sulla superficie del vetro quando ci sono più di 10 celle. Anche se gli esperimenti sono ancora in una fase primitiva, ci aspettiamo che la nuova metodologia potrebbe essere un potente strumento per la costruzione di assiemi 3D cella singola generazione, che sono indispensabili per il progresso nel campo della biologia cellulare e medicina rigenerativa.
In una soluzione non contenente alcun polimero, le cellule si respingono a causa della repulsione elettrostatica derivanti dalla carica superficiale, la forza di repulsione di idratazione, effetto di repulsione glicocalice e ondulazione di membrana. Il nostro studio precedente ha mostrato che coppie di cella possono essere stabile per lungo tempo quando le cellule sono trattate con PEG. Ancora più importante, il trasporto di successo di una coppia di cella a una regione senza PEG, dopo che le cellule erano state tenute in contatto per 5 minuti in PEG, suggerisce che il contatto cellulare viene mantenuta in maniera stabile. Questo è ben spiegato in termini di effetto di svuotamento11, ed essenzialmente lo stesso meccanismo si applica agli assembly cellulare generato utilizzando DEX9. I nostri risultati attuali suggeriscono che altri tipi di macromolecole naturali anche potrebbero essere utilizzati per costruire gli assembly cellulari 3D stabili.
Per il trasporto rapido delle cellule, la concentrazione del polimero è importante. Generalmente, la viscosità della soluzione aumenta drasticamente quando il polimero viene sciolto sopra la concentrazione di sovrapposizione. In questa circostanza, è difficile manipolare cellule utilizzando pinzette ottiche. Quindi, l'esperimento deve essere eseguito sotto la concentrazione di sovrapposizione. Per una soluzione DEX, la concentrazione di sovrapposizione è ca. 50 mg/mL (la viscosità cinetica è 5,5 mm2/s). Come mostrato in rif. 9, un'Assemblea cellulare stabile è stata osservata quando la concentrazione di DEX era 10 mg/mL a 40 mg/mL. Questo risultato suggerisce che l'effetto di svuotamento è sufficientemente grande per mantenere il contatto della cellula-cellula stabile anche quando la concentrazione di DEX è inferiore rispetto alla concentrazione di sovrapposizione. Esso ha dimostrato che l'aggiunta di DEX non pregiudica la vitalità cellulare fino a 40 mg/mL 9.
L'istituzione di un metodo per la costruzione di assiemi 3D cellulare è importante nel campo della medicina rigenerativa, dal che imita un in vivo microambiente cellulare strutturando singole cellule può facilitare derivati da cellule staminali del tessuto formazione. Finora, abbiamo usato il presente protocollo per costruire cellulari assembly utilizzando Neuro2A cellule9 oltre a cellule NMuMG. Speriamo di stabilire una metodologia sperimentale per la costruzione di assiemi 3D cellulare di un numero maggiore di cellule di varie morfologie. Il sistema di pinzette ottiche sviluppato da Ichikawa et al. 13 sarebbe applicabile per questo scopo poiché l'orientamento delle cellule può essere controllata. Ulteriori prove lungo queste linee dovrebbero essere promettente.

Mentre tessuti umani sono composti da diversi assembly delle cellule e possono aiutare a mantenere l'omeostasi del corpo, cellule singole da soli anche svolgono ruoli importanti tramite interazione cellula--cellula. Pertanto, è importante chiarire come singole cellule possono essere stimolate dai segnali esterni e come trasferire tali segnali ad altre cellule aderenti. Per questo scopo, sono stati stabiliti metodi diversi per la costruzione di assiemi (3D) 3-dimensionale single-cell-based1,2,3,4,5,6 ,7,8. Tuttavia, i materiali che vengono utilizzati per costruire gli assembly cellulari possono ancora essere migliorati. Ad esempio, gel sintetiche e polimeri quali polietilenglicole (PEG) possiedono determinate proprietà chimico-fisiche chimiche e possono influenzare le cellule bersaglio (ad es., tossicità).
Recentemente abbiamo segnalato un nuovo sistema che potrebbe generare un assembly 3D single-cell-based di celle utilizzando destrano (DEX) stabilendo contatti cellula-cellula stabile9. Abbiamo considerato che questa tecnologia potrebbe essere utile in diversi campi di ricerca, tra cui anche il cancro biologia e medicina rigenerativa. In questo rapporto, descriviamo come manipolare cellule singole e costruire 3-dimensionale assembly cellulare (3D) in presenza di varie biomacromolecole idrofilici compreso DEX senza un'impalcatura artificiale.

<table><tbody><tr><td>Microscopio IX71</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Dextran (200.000; grado di biologia molecolare)</td> <td>Wako</td><td>CAS.NO&nbsp; 9004-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di intrappolamento laser (NanoTracker 2)</td> <td>JPK Instruments</td><td>S / N T-05-0200</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo superiore</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN60XW</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo inferiore</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO60XW</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura superiore</td><td>MATUNAMI</td><td>C022401</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura intermedio (distanziatore)</td><td>MATUNAMI</td> <td>su</td> <td>misura (dimensioni = 10 mm&volte; 10 mm, spessore = 0,17 mm)</td></tr><tr><td>Vetro di copertura inferiore</td><td>MATUNAMI</td><td>C030401</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera</td><td>La sorgente di imaging</td><td>DFK 31AF03</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoTracker2 PFM Software</td><td></td></tr><tr><td>Celle NMuMG&nbsp;</td><td>RIKEN BRC</td><td>RCB2868</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Banca cellulare</td><td>Nippon Zenyaku Kogyo</td><td>ZR621</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM</td><td>Wako Pure Chem. Ind., Giappone</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Coltura cellulare FBS</td><td>Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Giappone</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Wako Pure Chem. Ind., Giappone</td><td>161-23181</td><td></td></tr></tbody></table>

manipolazione delle cellule viventi per costruire assieme cellulare 3d stabile senza impalcatura artificiale

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Medicina rigenerativa e ingegneria tissutale offrono diversi vantaggi per il trattamento di malattie intrattabili, e diversi studi hanno dimostrato l'importanza delle assemblee cellulari di 3-dimensionale (3D) in questi campi. Scaffold artificiali sono stati usati spesso per la costruzione di assiemi 3D cellulare. Tuttavia, i ponteggi utilizzati per costruire gli assembly cellulari a volte sono tossici e possono modificare le proprietà delle cellule. Così, sarebbe utile stabilire un metodo non tossico per facilitare il contatto della cellula-cellula. In questa carta, presentiamo un nuovo metodo per costruire stabile cellulare assembly utilizzando le pinzette ottiche con destrano. Uno dei vantaggi di questo metodo è che esso stabilisce stabile contatto cellula--cellula in pochi minuti. Questo nuovo metodo permette la costruzione di assiemi 3D cellulare in un polimero idrofilo naturale e dovrebbe essere utile per la costruzione di assiemi 3D di cella singola generazione nel campo della medicina rigenerativa e ingegneria tissutale.

La figura 1 Mostra il microscopio e il software utilizzato in questo studio. Figura 2 è una rappresentazione schematica della procedura per l'immissione della soluzione di esempio che contiene le cellule. Figura 3 illustra la formazione di una struttura piramidale con doppio raggio ottiche pinzette. Se l'esperimento è riuscito, queste assemblee cellulari rimangono stabili anche dopo il laser viene spento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig1.jpg"> Figura 1 : (a) il sistema di controllo per il sistema Laser Trapping (NanoTracker2 (11)). Il sistema è attivato accendendo l'interruttore laser ③ ① come segue. (b) il software per il controllo del sistema di cattura di Laser. La fotocamera, LED luce, messa a fuoco regolare, e lo spostamento di fase vengono attivati facendo clic su icone ① ②, ③ e ④, rispettivamente. L'immagine microscopica viene visualizzata nel pannello 1. Il controllo inserita/disinserita per il LED è in pannello 2. La messa a fuoco è controllato nel pannello 3. I raggi laser sono irradiati alle posizioni 1 e 2 facendo clic sulle icone I a IV. I dettagli di questo Laser Trapping Systemare forniti in rif. (12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig2.jpg"> Figura 2: schema rappresentativo per l'immissione il vetro scorrevole. 20 µ l di campione (sospensione cellulare contenente destrano) è inserito nella diapositiva e utilizzato per la manipolazione di laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig3.jpg"> Figura 3 : un) assembly delle cellule epiteliali (NMuMG) di una forma prevista in un mezzo con DEX (40 mg/mL): una piramide è indicata come un esempio di un cluster di 3D. b) una figura schematica dell'Assemblea cellulare 3D a forma di piramide è anche mostrata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Dimostriamo un metodo novello per la costruzione di una single-cell-based Assemblea 3-dimensionale (3D) senza un'impalcatura artificiale.

Manipolazione delle cellule viventi per costruire assieme cellulare 3D stabile senza impalcatura artificiale

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Questa nuova metodologia ci permette di costruire assemblaggi tridimensionali, adattati dalle singole cellule desiderate, in una soluzione tampone acquosa contenente polimero idrofilo aspecifico, stabilendo un contatto stabile cellulare-cellulare. In questo video, dimostreremo come manipoliamo le singole cellule desiderate e costruiamo assiemi cellulari 3D senza impalcatura artificiale. Qui mostreremo la procedura sperimentale nel nostro mezzo con Dextran come esempio.Per iniziare, mantenere le cellule epiteliali della ghiandola mammaria del topo NAMRU con cinque millilitri di DMEM, contenenti 10%FBS e 1%Penicillina-Streptomicina, in un pallone di 25 centimetri cubi per due o tre giorni. Quando è pronto per procedere, utilizzare un aspiratore per rimuovere il DMEM integrato e aggiungere da tre a cinque millilitri di PBS, che viene preriscaldato a 37 gradi Celsius per lavare le cellule. Utilizzando un aspiratore, rimuovere tutto il PBS dal pallone.Aggiungere 1,5 millilitri di tripside che viene preriscaldato a 37 gradi Celsius. Incubare in un incubatore di CO2 a 37 gradi Celsius per almeno uno o due minuti. Successivamente, aggiungere 3,5 millilitri di DMEM contenenti 10%FBS e 1%Penicillina-Streptomicina.Pipetta su e giù per mescolare. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e centrifugarla a 417 volte G per tre minuti a temperatura ambiente. Quindi, aspirare il mezzo.Aggiungere cinque millimetri di DMEM fresco contenente il 10%FBS e l'1%Penicillina-Streptomicina. E se necessario, utilizzare una soluzione di crioconservazione per crioconservare le cellule come indicato dalle istruzioni del produttore. Prima mescolare 10 millilitri di DMEM integrati con 10%FBS e 1%Penicillina-Streptomicina con 0,8 grammi di Dextran, per preparare una soluzione di Dextran da 80 milligrammi per millilitro.Mescolare 200 microlitri di questa soluzione di Dextran con 200 microlitri della sospensione cellulare precedentemente preparata, per creare una sospensione cellulare contenente 40 milligrammi per mezzo di Dextran millilitro. Per iniziare, accendi il laser, nota che l'uso di un raggio laser con una lunghezza d'onda nella regione dal rosso al vicino infrarosso è più efficace. Aprire quindi il software facendo doppio clic sull'icona del software.Fare doppio clic sull'icona della fotocamera e notare che verrà visualizzato il display corrispondente. Quindi fai doppio clic sulle icone per il diodo che emette luce, la regolazione della messa a fuoco e la fase di movimento per aprire anche i loro display. In primo luogo due distanziale in vetro sul vetro di copertura inferiore scivolo.Trasferire 20 microlitri, il Dextran precedentemente preparato ha integrato la sospensione cellulare sul vetrino del coperchio inferiore. Quindi posizionare lo scivolo di vetro del coperchio superiore sui distanziale che coprono le sospensioni cellulari. Posizionare la cella campione sulla lente obiettivo inferiore con 10 microlitri di acqua distillata per la microscopia ad immersione in acqua.Attaccare l'obiettivo superiore nella parte superiore della cella campione utilizzando 10 microlitri di acqua distillata. Fare quindi clic sul pulsante di accensione nella finestra di illuminazione del microscopio per accendere il LED. Fare clic sui pulsanti di direzione nella finestra di posizionamento obiettivo per regolare la distanza tra il campione e l'obiettivo inferiore fino a quando non è a fuoco.Impostare l'intensità di ogni raggio laser su 1500 milliwatt nella finestra di attenuazione del segnale. Quindi, fare clic sulle due icone laser per irradiare i raggi laser in posizione uno e posizionare due. Fare clic sui pulsanti direzionali nella finestra di posizionamento del campione per spostare la fase di campionamento fino a quando una cella non viene intrappolata nella posizione uno.Fare clic e trascinare il cursore indicando la posizione due fino a quando un'altra cella non viene intrappolata nella posizione due. Per iniziare, manipolare una singola cella, in modo che sia a contatto con un'altra cella. Mantenere questa condizione per 300 secondi, in modo che la cella sia esposta a un laser per 300 secondi.Registrare l'asse x-y. Intrappolare un'altra cella e trasportarla alle prime due celle per costruire un assieme di celle 2D arbitrario. Quindi spostare lo stage su e giù per costruire un assieme cellulare 3D.Verificare che l'assieme sia ancora stabile anche dopo lo spegnimento del laser. In questo studio i polimeri solubili vengono utilizzati nella costruzione di assemblaggi a cella singola 3D. Qui viene mostrata una struttura di esempio formata utilizzando le pinzette ottiche a doppio fascio.Se l'esperimento ha esito positivo, questi gruppi cellulari rimangono stabili anche dopo lo spegnimento del laser. Questa nuova metodologia è per la costruzione di assemblaggi cellulari 3D in un mezzo acquoso con polimero idrofilo naturale. Si prevede vivamente di iniziare la costruzione di questo tipo di assemblaggi cellulari di prossima generazione con alcuni dei potenti strumenti nel campo della medicina rigenerativa e dell'ingegneria tissutale.

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Per la creazione di strutture altamente organizzate di tessuti complessi, è necessario assemblare più materiali e tipi di cellule in un composito integrato.  Questo design combinatorio incorpora fogli cellulari stratificati specifici per organo con due materiali distinti di derivazione biologica contenenti una forte base di matrice fibrosa e cellule endoteliali per migliorare la formazione di nuovi vasi.

Ingegneria dei tessuti: Costruzione di un multicellulare 3D Ponteggio per la consegna di Layered fogli Cellulari

Un bioprinter cartesiano è stato progettato e fabbricato per consentire la deposizione di più materiali in geometrie precise e riproducibili, consentendo anche il controllo dei fattori ambientali. Utilizzando il bioprinter tridimensionale, è possibile stampare e riprodurre facilmente costrutti complessi e fattibili.

Viabilità di Bioprinted cellulari Costruisce Utilizzando un dispenser stampante cartesiana Tre

Questo protocollo descrive una piattaforma per la realizzazione di anelli di tessuto auto-assemblati usando una muffa di plastica su misura 3D-stampato di dimensioni variabili. PDMS negativi sono curati nello stampo 3D-stampato; quindi dell'agarosi sono nel cast i negativi PDMS polimerizzati. Le cellule sono seminate nei pozzetti risultante dell'agarosi dove si aggregano in anelli di tessuto.

Fabbricazione di pozzi di agarosio personalizzato per la semina delle cellule e tessuto anello auto-assemblaggio utilizzando stampi 3D-stampato

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere sistemi 3D-cultura in auto-assemblanti peptide impalcature per promuovere la differenziazione dei chondrocytes articolari umani dedifferentiated in cartilagine-come il tessuto.

Coltura di cellule di mammifero in scaffold tridimensionale Peptide

Presentiamo una procedura per controllare la forma di cluster iniziale delle cellule in una matrice extracellulare 3D per ottenere una formazione di reticolo ripetibile. Un dispositivo cubico contenente due diversi idrogeli è impiegato per realizzare multi-direzionale imaging per la formazione del reticolo di tessuto.

Controllo del Cluster iniziale delle cellule 3D in un ibrido Gel cubo dispositivo per reticolo ripetibile formazioni

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo per la produzione di tre diversi tipi di sferoidi in un modo che li rende adatti per lo screening e l'analisi ad alto contenuto su larga scala. Inoltre, vengono presentati esempi che mostrano come possono essere analizzati a livello sferoidale e di singole cellule.

Un metodo robusto per la produzione su larga scala di sferoidi per applicazioni di screening e analisi ad alto contenuto

Gli sferoidi cellulari sono stati considerati un potenziale modello nel campo delle applicazioni biologiche. Questo articolo descrive i protocolli per la generazione scalabile di sferoidi cellulari utilizzando un dispositivo di assemblaggio acustico 3D, che fornisce un metodo efficiente per la fabbricazione robusta e rapida di sferoidi cellulari uniformi.

Dispositivo di assemblaggio acustico tridimensionale per la produzione di massa di sferoidi cellulari

Scopri come costruire assiemi cellulari 3D stabili senza impalcature artificiali utilizzando pinze ottiche e polimeri idrofilici come il Dextran. Questo metodo innovativo offre nuove prospettive per l'ingegneria tissutale e la medicina rigenerativa.

Manipolazione delle cellule viventi per costruire assieme cellulare 3D stabile senza impalcatura artificiale

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