Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Het genereren van een lymfkliertest Orthotopic uitgezaaide borst kanker Model en het uitvoeren van lymfkliertest radicale mastectomie

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/57849
Automatic Translation
1, 1, 2,3,4,5, 1,6,7,8,9,10
1Breast Surgery, Department of Surgical Oncology, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, 2Holy Cross Hospital Michael and Dianne Bienes Comprehensive Cancer Center, 3Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 4Department of Surgery, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Surgery, Nova Southeastern University School of Medicine, 6Department of Surgery, University at Buffalo Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, 7Department of Breast Surgery and Oncology, Tokyo Medical University, 8Department of Surgery, Yokohama City University, 9Department of Surgery, Niigata University Graduate School of Medical and Dental Sciences, 10Department of Surgery, Fukushima Medical University

Summary

Wij introduceren een lymfkliertest orthotopic borst kanker en radicale mastectomie model met bioluminescentie technologie te kwantificeren van de last van de tumor om na te bootsen menselijke borst kanker progressie.

Abstract

In vivo Muismodellen te beoordelen borst kanker progressie zijn essentieel voor kankeronderzoek, met inbegrip van preklinische drug ontwikkelingen. De meerderheid van de praktische en technische details worden echter vaak weggelaten in gepubliceerde manuscripten die daarom maakt het uitdagend om te reproduceren van de modellen, met name als het gaat om chirurgische technieken. Bioluminescentie technologie maakt het mogelijk voor de evaluatie van kleine hoeveelheden van kankercellen zelfs wanneer een tumor niet voelbaar is. Gebruik makend van kankercellen luciferase-uitdrukken, stellen wij een borst kanker orthotopic inoculatie techniek met een hoge tumorvorming tarief. Long metastase wordt beoordeeld met behulp van een ex vivo -techniek. Wij stellen vervolgens een mastectomie model met een lage lokale herhaling tarief voor het beoordelen van de last van uitgezaaide tumor. Hierin, beschrijven wij, in detail, de chirurgische technieken van orthotopic implantatie en mastectomie voor borstkanker met een hoge tumorigenesis rente en lage lokale herhaling tarieven, respectievelijk om borst kanker model efficiëntie te verbeteren.

Introduction

Dierlijke modellen spelen een belangrijke rol in kankeronderzoek. Wanneer een hypothese is bewezen in vitro, moet deze in vivo te evalueren van de klinische relevantie worden getest. Progressie van kanker en metastase zijn vaak beter gevangen door dierlijke modellen ten opzichte van in vitro modellen, en het is essentieel voor het testen van een nieuwe drug in een dierlijk model als een preklinische studie voor1,2van de ontwikkeling van de drug. De technische details van dierproeven zijn echter vaak niet goed beschreven in gepubliceerde artikelen, maken het uitdagend om te reproduceren het model met succes. Inderdaad, de auteurs die deze orthotopic inoculatie en mastectomie modellen gevestigd ging door lange en strenge processen van trial and error. Het slagingspercentage van tumorvorming na kanker cel inoculatie is een van de belangrijkste factoren om te bepalen het succes en de efficiëntie van een dier studie3. De cellijn en het aantal cellen om te enten, de inoculatie-site en de stam van de muizen zijn allemaal belangrijke factoren. Het is algemeen bekend dat er enorme variaties in de resultaten van dierproeven als gevolg van individuele verschillen, ten opzichte van in vitro technieken zijn. Daarom is het belangrijk om stabiele resultaten, ter verbetering van de efficiëntie van dierproeven, en om te voorkomen dat misleidende resultaten te verkrijgen met behulp van een reeds lang gevestigde model met een standaard techniek.

Dit witboek biedt gevestigde technieken4 voor het genereren van borst-kanker orthotopic en mastectomie Muismodellen. De doelstellingen van deze methoden zijn 1) na te bootsen menselijke borst kanker progressie en behandeling cursussen, en 2) bij de uitvoering van in vivo experimenten met meer efficiëntie en hogere slagingspercentages in vergelijking met andere borst kanker inoculatie of mastectomie technieken. In orthotopic kanker cel inoculatie, om na te bootsen menselijke borst kanker progressie, kiezen we de #2 borstklier vet pad als een inenting site, die is gelegen in de borst. In de meeste van de studies, de borstkankercellen subcutaan worden geïnoculeerd5. Deze techniek vereist geen chirurgie en, dus, het is eenvoudig en ongecompliceerd. De subcutane communicatie is echter heel anders dan de melkklier communicatie, wat in verschillende kanker progressie en zelfs Moleculaire profielen6,7 resulteert. Sommige studies de melkklier #4, die zich in de buik bevindt, als een inenting site6gebruiken. Echter, aangezien #4 borstklieren bevinden zich in de buik, de meest voorkomende metastatische patroon is peritoneale carcinomatosis7, die met minder dan 10% van uitgezaaide borst kanker8 plaatsvindt. Kanker van de borst gegenereerd door de techniek hier, gepresenteerd in de melkklier #2 metastasizes aan de Long, die tot de meest voorkomende borst kanker metastatische sites9 behoort.

Met deze techniek is het doel ook om het bereiken van een hoger tarief van tumorvorming met minimale tumor grootte variabiliteit in vergelijking met andere borst kanker inoculatie technieken. Om dit te doen, worden de kankercellen opgeschort in een mengsel van de gelatine-achtige eiwitten onder direct zicht via een mediane voorste borst muur incisies geïnoculeerd. Deze techniek produceert een hoge tumorvorming tarief met minder variabiliteit in de tumor grootte en vorm ten opzichte van subcutane of niet-chirurgische injectie, zoals eerder gemeld3,7.

Ook introduceren we een muis radicale mastectomie techniek waarin de orthotopic borst tumor met de omringende weefsels en de oksellymfeklieren is gereseceerd. De standaard van zorg voor borstkankerpatiënten zonder verre metastase ziekte is in de klinische setting, mastectomie10,11. Voordat een borstamputatie, is axillaire lymfeklieren metastase gepolst door beeldvorming en sentinel biopsie van de lymfeklier. Als er geen bewijs van axillaire lymfeklieren metastase is, wordt de patiënt vervolgens behandeld met een totale of gedeeltelijke mastectomie, waarbij de axillaire lymfeklieren resectie is weggelaten. Totale mastectomie is een techniek om de resect van borstkanker met het hele borstweefsel en bloc, overwegende dat gedeeltelijke mastectomie resect kanker van de borst met een marge van omringende normale borstweefsel alleen, dus het behoud van het resterende normale borstweefsel in de patiënt. Patiënten die behouden normaal borstweefsel overblijft na een gedeeltelijke mastectomie echter postoperatieve radiotherapie om te voorkomen dat lokale herhaling10. Patiënten die axillaire lymfeklieren metastase ondernemen radicale mastectomie die de borstkanker met alle normale verwijdert weefsel en axillaire lymfeklieren borstkanker en vielen weefsels nl blok10,11. In het muismodel is toezicht voor axillaire lymfeklieren metastase en/of postoperatieve straling niet redelijk of haalbaar. Dus, we gebruik maken van de radicale mastectomie techniek om te voorkomen dat lokale of axillaire lymfeklieren metastase.

Kanker cel inoculatie via de ader van de staart is de meest voorkomende Long metastase muis model12, de zogenaamde "experimentele metastase". Dit model is eenvoudig te genereren en vereist geen chirurgie; echter is het niet na te bootsen menselijke borst kanker progressie die in andere gemetastaseerde ziekte gedrag resulteren kan. Om te bootsen de menselijke borst kanker behandeling cursus waar metastase treedt vaak op na borstamputatie, is de primaire tumor verwijderd na orthotopic kanker cel inoculatie. Deze techniek produceert minder lokale herhaling in vergelijking met eenvoudige tumor resectie, als eerder gemeld13, en is nuttig voor roman therapeutiek, preklinische studies, en voor uitgezaaide borst kanker onderzoeken. De technieken die hier worden beschreven zijn van toepassing voor de meeste borst kanker orthotopic model experimenten. Het is echter belangrijk om te bedenken dat het mengsel van de gelatine-achtige eiwitten kan invloed hebben op de communicatie en chirurgie kan invloed hebben op de stress/immuun reactie14. Onderzoekers bestuderen de communicatie en/of de stress/immuunrespons moet daarom rekening houden met potentieel verstorende factoren zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Goedkeuring van het Roswell Park uitgebreide kanker centrum institutionele Animal Care en gebruik Comité werd verkregen voor alle experimenten.

Opmerking: Negen tot twaalf weken oude vrouwelijke BALB/c muizen worden verkregen. 4T1-luc2 cellen, een muis borstklier adenocarcinoom cellijn afgeleid van BALB/c muizen die is ontworpen om uitdrukkelijke luciferase, worden gebruikt. Deze cellen worden gekweekt in Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 medium met 10% foetale runderserum (FBS).

1. voorbereiding van de instrumenten

  1. Ontdooi een mengsel van bevroren gelatine-achtige eiwitten (bijvoorbeeld Matrigel) op het ijs in de kap van een weefselkweek.
  2. Schoon en autoclaaf twee sets van chirurgische instrumenten (microdissection-schaar, Adson pincet en de houder van een naald) voorafgaand aan de operatie. Bereiden van gesteriliseerde 5-0 zijde hechtingen en droog sterilant (als seriële chirurgie zijn gepland).
  3. Clip van de middelste borsthaar van de muizen met behulp van een klipper en mark de muizen voor identificatie door ponsen van het oor tijdens de operatie.
  4. De tabel van de procedure, die onmiddellijk kan worden gebruikt voor de bewerking voorbereiden.
    1. Verspreid een absorberend stootkussen en de hoeken vast met tape, herstellen van anesthesie neus kegels met tape, sterilant en ontsmettingsmiddel (chloorhexidine, Jood, en 75% ethanol) naast de operationele ruimte plaatst van de muizen in volgorde van de operatie.

2. voorbereiding van cellen (10 muizen)

Opmerking: De cellen moeten worden geënt binnen 1 uur na wordt losgekoppeld van de schotel te vermijden verminderde levensvatbaarheid. In het bijzonder moet de celsuspensie worden gemengd in het mengsel van de gelatine-achtige eiwitten binnen 15 min na het loskoppelen van de cellen van de schotel te handhaven hun levensvatbaarheid.

  1. Cultuur 4T1-luc2 cellen, een muis borstklier adenocarcinoom cellijn uiten luciferase, in RPMI 1640 media met 10% FBS in een bevochtigde incubator bij 37 ° C in 5% CO2.
  2. Wassen het aanhangend 4T1-luc2-cellen in een 10-cm schotel met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van serologische Pipetteer 10 mL. Voeg vervolgens 1 mL van 0,25% trypsine met behulp van een precisiepipet P1000 en, vervolgens, Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Voeg vervolgens 4 mL groei media (RPMI-1640 met 10% FBS) met behulp van een 5 mL serologische Pipetteer en de celsuspensie overbrengen in een conische buis van 15 mL in de kap van een weefselkweek. Centrifugeer de celsuspensie bij 180 x g gedurende 5 min.
  3. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen in 2 mL PBS; vervolgens met behulp van de hemocytometer cellen te tellen.
  4. 2 x 106 4T1-luc2 cellen in 40 μL van koude PBS (pH 7.4, 4 ° C) in de weefselkweek kap opschorten.
  5. Meng de 40-μl celsuspensie met 360 μl van het mengsel van de gelatine-achtige eiwitten in een 1,5 mL microcentrifuge buis op ijs in de weefselkweek kap.
    Opmerking: De eindconcentratie is 1 x 105/20 μL (1:9 PBS: mengsel van de gelatine-achtige eiwitten). Voor het orthotopic model (geen mastectomie), werd 1 x 104/20 μL van de uiteindelijke concentratie gebruikt, om te voorkomen dat het bereiken van euthanasie criteria (tumor grootte > 2 cm) binnen twee weken.

3. kanker cel inoculatie

  1. Zet de muizen in de anesthesie inductie kamer met 2-4% Isofluraan en 0.2 L/min zuurstof stroom totdat de muizen rustig ademen (2-3 min).
  2. Pak de muis en buprenorfine 0,05 mg/kg subcutaan te injecteren in zijn schouder.
  3. Bevestig voldoende verdoving door het ontbreken van een reactie op een snuifje teen. Plaats van de muis neus in het gat van het masker muis, waarmee respiratoire anesthesie met 2-4% Isofluraan en 2 L/min zuurstof stroom is aangesloten op een houtskool busje eenheid.
  4. Beperken van de muis ledematen met behulp van lab-tape en steriliseren van de huid met behulp van chloorhexidine, Jood, en 75% ethanol, met behulp van katoenen wissers.
  5. Maken van een incisie huid 5 mm in het midden van de voorste borstwand met behulp van steriele microdissection schaar, lift de rechterkant huid naast de incisie en loskoppelen van de huid van de borstwand met behulp van de schaar, en vervolgens het omkeren van de huid om te bloot het recht #2 borstklier vet pad.
  6. Zorgvuldig injecteren 20 μL van kanker celsuspensie met behulp van een insuline spuit van 1 mL met een 28.5 G naald in het vet pad onder direct zicht door middel van de wond.
    Opmerking: De naald gaat via de wond, niet de huid. Houd houden de naald in het vet pad voor 5 s voorafgaande aan te trekken, waardoor de tijd voor het mengsel van de gelatine-achtige eiwitten te stollen.
  7. Sluit de huid insnijdingen door stiksels, met behulp van steriele 5-0 niet-absorbeerbare draadjes.
  8. Na de operatie, keren de dieren naar een schone kooi en volgen ze totdat ze zijn hersteld en vrij gaan (na ~ 1-2 min). Als een dier niet lijkt te zijn in goede gezondheid binnen de 24u van chirurgie, beheren buprenorfine (0,2 mg/kg).
  9. Verwijderen van de hechtingen onder verdoving (zie stap 3.1) 7 d na de operatie.

4. mastectomie

Opmerking: De timing van de borstoperatie is zeer belangrijk. Als het is te vroeg gedaan, Long metastase treedt niet op. Als het te laat is gedaan, heeft de primaire tumor grote bloedvaten, waardoor een volledige oncologische resectie uitdagende binnengevallen. Dus werden meerdere tijdstippen getest voor mastectomie om te bepalen welk tijdstip de juiste balans in afwachting van metastase voordat resectie te uitdagend werd geproduceerd. Na te doen in meer dan 50 muis experimenten, blijkt dat mastectomie op 8 dagen na inoculatie van kanker cel (of wanneer de grootte van de tumor 5 mm bereikt) het ideale punt om te bereiken dat evenwicht13tijd.

  1. Een muis met 2-4% ingeademd Isofluraan anesthetize en injecteren van buprenorfine (zie stap 3.1 en 3.2).
  2. Beperken van de muis en steriliseren van de huid (zie stap 3.4).
  3. Maak een 5 mm huid incisie 2 mm naar links van de chirurgische litteken dat werd gedaan op de eerste kanker cel inoculatie, met behulp van de microdissection-schaar. Uitbreiden van de incisie naar de hoofdmap van de voorpoot te verwijderen van de tumor, de huid, met inbegrip van het chirurgische litteken, en de laesie in contact met de tumor, evenals de axillaire lymfeklieren bekken waarin het merendeel van de tijd die geen zichtbare lymfeklier ten tijde van de mastect bestaat bevorderd13. Zorg ervoor dat niet te beschadigen de axillaire ader.
  4. Sluit de gebreken van de huid door de stiksels, met behulp van steriele 5-0 niet-absorbeerbare draadjes in de vorm van een "Y".
  5. Gelijk aan stap 3.8, keren de muis naar een schone kooi en de monitor totdat zij hebben teruggekregen.
  6. Verwijderen van de hechtingen onder verdoving (zie stap 3.1) 7 dagen na de operatie.

5. bioluminescente kwantificering van de primaire Tumor (Orthotopic inoculatie zonder mastectomie) of longkanker metastase (mastectomie Model)

Opmerking: Voor primaire tumor last kwantificering is de Bioluminescentie gemeten 2 x per week vanaf de dag na de inoculatie van de orthotopic. Voor longkanker metastase kwantificering is de Bioluminescentie gemeten 2 x per week vanaf de dag na de borstoperatie.

  1. D-luciferine ontbinden in Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) om een eindconcentratie van 15 mg/mL in een weefselkweek kap. ALIQUOT in licht afgeschermd 1,5 mL microcentrifuge buizen. Opslaan van de verdunde oplossing bij-80 ° C.
    Opmerking: Voor een muis van 20 g is 200 µL van verdunde D-luciferine vereist.
  2. Open de denkbaar software en klik op initialiseren.
    Opmerking: Het duurt ongeveer 15 minuten afkoelen van de charge - coupled device (CCD). Wanneer de CCD de ingestelde temperatuur bereikt, verandert de kleur van de temperatuur bar van rood in groen.
  3. Anesthetize van de muizen met 2-4% Isofluraan in een speciale inductie-zaal voorafgaand aan de beeldvorming (zie stap 3.1).
  4. Weeg de muizen.
  5. Injecteren van 150 mg/kg D-luciferine intraperitoneally op het punt van de halverwege buik, met behulp van een naald 28.5 G.
  6. Past elke muis met een neus kegel binnen het imaging systeem in de liggende positie (plaats een maximum van vijf muizen tegelijk). Handhaven verdoving op 1-3% Isofluraan (in 100% zuurstof) via de neus kegels tijdens imaging.
  7. Een opname elke 5 min voor het detecteren van de piek bioluminescentie gedurende 50 minuten (of tot de bevestigde piek bioluminescentie).
    1. Selecteer luminescentie als Auto, weggooien als Mediumen gezichtsveld als D.
    2. Klik op ophalen om de opname.
  8. De muizen terug naar hun cage(s) en volgen ze totdat ze hebben hersteld (zie stap 3.8).

6. lung metastase Tumor last kwantificering door Ex Vivo Imaging

Opmerking: Long metastase kwantificering is van toepassing voor orthotopic inoculatie zowel met als zonder mastectomie modellen. In het model van de mastectomie, is ex vivo imaging of overleving observatie gekozen, afhankelijk van het doel. In het orthotopic inoculatie (zonder mastectomie) model produceren meestal primaire tumor groottecriteria euthanasie (> 2 cm) ongeveer 21 dagen na inoculatie.

  1. Kwantificeren Long metastatische laesies 21 dagen na de inenting van de kanker-cel door ex vivo imaging.
  2. Anesthetize van de muizen met 2-4% Isofluraan in een speciale inductie-zaal (zie stap 3.1).
  3. Weeg de muizen.
  4. Injecteren van 150 mg/kg D-luciferine intraperitoneally (zie stap 5.6).
  5. Euthanaseren de muizen door cervicale dislocatie, 15 min na de injecties.
  6. Open de buik door het snijden van de huid en buikvlies op de halverwege buik, met behulp van gebogen Mayo schaar. De incisie aan zowel rechts als links uitbreiden Uitlichten van de lever met de pincet totdat het middenrif is gevisualiseerd; Vervolgens snijd het middenrif.
  7. Met behulp van de gebogen schaar Mayo, het delen van de bilaterale ribben van caudad (12e ribben) naar craniale (1ste ribben) de longen door de muur anterior thorax flipping bloot te stellen.
  8. Identificeren van de thoracale slokdarm, die eruit als een snoer aansluiten van de longen op de wervelkolom ziet, door het opheffen van de longen met behulp van Tang en knip de slokdarm met behulp van de microdissection-schaar.
  9. Til de bilaterale longen en hart met pincet (tractie trekken naar beneden, in de richting van craniale tot caudad toe te passen) en, knip de luchtpijp en de grote schepen aan de apex van de longen op de craniale, met behulp van microdissection-schaar.
    Opmerking: Dit zorgt voor de isolatie van de longen en het hart van het lichaam.
  10. Verwijder het hart uit de longen met behulp van microdissection-schaar.
  11. Zet de longen in een 10 cm petrischaal.
  12. De opname van de bioluminescentie (zie stap 5.7.1 en 5.7.2) 5 min na euthanasie (20 minuten na de injectie luciferine).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het doel van het orthotopic-model is om na te bootsen menselijke kanker progressie (dat wil zeggen, de groei van de primaire tumor gevolgd door lymfeklier metastase en vervolgens verre Long metastase)15. Na kanker cel inoculatie, de Bioluminescentie regelmatig wordt gekwantificeerd (twee tot drie keer / week) (figuur 1A). De bioluminescentie in de longen is dieper en kleiner dan de primaire laesie. De Bioluminescentie weerspiegelt voornamelijk de primaire tumor last in levende muizen3 (figuur 1B en 1 C). De grootte van de tumor werd ook gemeten door meting van de remklauw. Het volume van de tumor was geschat aan de hand van de volgende vergelijking: volume = (lengte) x (breedte)2/2 (Figuur 1 d). Kwantificering van de last van de tumor door bioluminescentie en een remklauw meting bleek vergelijkbare trends in de representatieve resultaten (figuur 1B en 1 D); echter, ondervonden we soms verschillen. We aannemen dat de last van de primaire tumor met behulp van bioluminescentie kwantificeren nauwkeuriger ten opzichte van de grootte van de tumor te meten door remklauw wanneer de grootte van de tumor minder dan 1,5 cm is. Omdat het getuigt van levensvatbare kunnen kankercellen, zelfs die een klein aantal cellen kan worden gedetecteerd door bioluminescentie, en alleen kankercellen worden gedetecteerd binnenkant van de tumor, niet met inbegrip van immuuncellen infiltreren of omringende stromale cellen3. Dit model is handig bij het evalueren van de werkzaamheid van tumor regressie gemedieerd door anti-kanker drug en immuunrespons op3,7,16. De last van de tumor van de metastasen longkanker kan ook worden gekwantificeerd door ex vivo imaging in dit model (figuur 1E); de beperking is echter dat de muizen euthanized moeten worden om te kwantificeren van de last van uitgezaaide tumor.

Het doel van het model van de mastectomie is 1) het reproduceren van de standaard van zorg behandeling van menselijke borstkanker, oftewel de chirurgische verwijdering van de primaire tumor17, en 2) de seriële kwantificering van de last van uitgezaaide tumor in vivo. Dit model is vooral handig in de preklinische studie van de ontwikkeling van nieuwe therapieën13. Als eerder gepubliceerde, toonde een Src-remmer, AZD0530, die de werkzaamheid toonde in de preklinische muizen model maar mislukt in een klinische proef voor de behandeling van de kanker van de borst, werkzaamheid in de primaire laesie met behulp van orthotopic inoculatie zonder mastectomie maar niet in Long metastase met behulp van het model van de mastectomie hier gepresenteerd. Hoewel anti-kanker medicijnen (bijvoorbeeld anthracyclines) soms bij de mens als neoadjuvante therapie gebruikt worden voor het behandelen van primaire borst tumoren, worden de overgrote meerderheid van drugs gebruikt als adjuvante therapie waar drugs worden gegeven na de operatie om het risico van herhaling door behandeling van klinisch niet detecteerbaar kanker of als palliatieve behandeling voor gemetastaseerde kanker1,7,18. Dus dit model mastectomie opgericht, die de menselijke behandeling proces11nabootst.

Acht dagen na de inenting van kanker cel, de primaire tumor operatief is verwijderd (Figuur 2). Als u wilt testen een van de efficacies van de drug voor gemetastaseerde laesies, moet het na de borstamputatie worden bestuurd. Dit model zorgt voor longkanker metastatische laesie kwantificering, evenals de gehele lichaam metastatische laesie kwantificering, zolang de last uitgezaaide tumor heeft een detecteerbare bioluminescentie met behulp van in vivo imaging. Het voorste borst muur lokale herhaling tarief is vrij laag. In onze ervaring was de lokale herhaling tarief minder dan 5% in meer dan 50 muizen experimenten. Overschrijdt de Bioluminescentie postoperatieve dag 1 1.00E + 06 fotonen (10 x groter dan andere personen), is er echter een hoge kans van een lokale resterende tumor13. Als overblijfsel kankercellen aanwezig, verschijnt een tastbaar tumor er binnen twee weken. Wanneer er een lokale resterende tumor, weerspiegelt de Bioluminescentie voornamelijk dat lokale herhaling in plaats van elke metastatische laesies. Lokale residuele tumoren is bekend dat gedragen zich heel anders dan verre metastasen19; Dus, die dieren met lokale herhaling (< 5% in onze ervaring) een verdere analyse moeten worden uitgesloten. Dit model mastectomie voorziet ook seriële uitgezaaide tumor last toezicht zonder te euthanaseren van de dieren. Bovendien, dit bioluminescente toezicht kan worden bevestigd door ex vivo Long metastase kwantificering. In plaats van het kwantificeren van de Long metastasen door ex vivo imaging, aldus moetend euthanaseren van de dieren, muizen voortbestaan na de chirurgische behandeling kan ook worden gevolgd als een vertaalbare klinisch eindpunt (figuur 2D). Aangezien er geen primaire laesie, muizen niet kunnen voldoen aan euthanasie tumor criteria die in het algemeen worden gedefinieerd als de grootte van een tumor van > 2 cm of ulceratie van de primaire tumor. In dit 4T1 mastectomie model overleed alle muizen binnen 60 dagen na kanker cel inoculatie als gevolg van metastase.

Figure 1
Figuur 1: overzicht van het orthotopic-model zonder mastectomie. (A) dit paneel toont een tijdsverloop van het orthotopic model met behulp van de 4T1 syngeneic model. (B) dit paneel toont de Bioluminescentie van het gehele lichaam van een orthotopic model dat voornamelijk de primaire tumor weerspiegelt. De foutbalk geeft de standaardfout van het gemiddelde (n = 10). (C) dit paneel toont seriële beelden van gehele lichaam bioluminescentie (van de dezelfde muis). Schaal geeft de balk 1 cm. (D) dit paneel de omvang van de werkelijke tumor van paneel B toont, gemeten door de remklauwen. De foutbalk geeft de standaardfout van het gemiddelde (n = 10). (E) dit paneel toont Long ex vivo bioluminescentie beelden van 10 orthotopic model muizen (n = 10). Geeft de balk schaal 1 cm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: overzicht van het model van de mastectomie. (A) dit paneel toont een tijdsverloop van de mastectomie model na 4T1 orthotopic syngeneic implantatie. 1 cm. (B) dit paneel toont de gehele lichaam bioluminescentie van de mastectomie model, waarin voornamelijk metastatische laesie, zo geeft de schaal-balk. De foutbalk geeft de standaardfout van het gemiddelde (n = 10). (C) dit paneel toont seriële beelden van gehele lichaam bioluminescentie (van de dezelfde muis). Gebruik makend van ex vivo imaging, werd bevestigd dat de signalen afkomstig uit Long metastase waren, en geen lokale herhaling werd bevestigd door het gehele lichaam imaging na verwijdering van de longen. Schaal bar = 1 cm. (D) dit paneel toont de Kaplan-Meier overleving curve van de mastectomie model zonder een medicamenteuze behandeling. Muizen werden euthanized wanneer ze euthanasie criteria met een ziekelijke aandoening bereikt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Voor het laatste decennium, hebben wij meerdere lymfkliertest kanker-modellen, met inbegrip van borst kanker modellen3,7,13,16,20,21oprichten. Eerder, we toonden aan dat borst kanker cel orthotopic inoculatie in het weefsel van de melkklier onder direct zicht een grotere tumor geproduceerd met minder variabiliteit van de grootte in vergelijking met het injecteren van cellen rond de tepel zonder een chirurgische incisies7 . Dit model is verbeterd door gebruik te maken van een celsuspensie in een mengsel van de gelatine-achtige eiwitten. De vormen van de tumor die is gegenereerd door de cellen van de gelatine-achtige eiwitten mengsel-opgeschort waren rond met minder variabiliteit, overwegende dat degenen die zijn gegenereerd door PBS-geschorst cellen werden verspreid in de melkklier3.

We verder geverifieerd dat de tumoren gegenereerd door de chirurgische orthotopic implantatie methode gepresenteerd hier zeer uitgesproken de genen waarvan interactienetwerken belangrijk in de progressie van kanker in vergelijking met degenen die zijn gegenereerd door niet-chirurgische of subcutane zijn injectie7. Deze bevindingen impliceren dat dit model menselijke borstkanker beter in vergelijking met niet-chirurgische orthotopic of onderhuidse implantatie7 nabootst. We toonden ook aan dat dit model is geschikt om te evalueren van de immuun-gemedieerde regressie van kanker van de borst met behulp van allogene afwijzing3. Huid incisie kan echter ook leiden tot ontsteking rond de tumor14. Daarom, afhankelijk van de hypothese is getest door de onderzoeker, het is belangrijk dat de ontsteking als een mogelijke storende factor.

Dan de neoadjuvante instellen, worden de overgrote meerderheid van systemische therapieën toegediend nadat de primaire borst tumor operatief verwijderde11 is. Tot op heden, evalueren de meerderheid van de preklinische studies voor nieuwe Geneesmiddelenontwikkeling drug reactie in de primaire tumor, maar niet in de gemetastaseerde laesies1,18. Deze discrepantie tussen diermodellen en menselijke behandeling is belangrijk, omdat het profiel van de gene van de metastatische laesies verschilt aanzienlijk van die van de primaire laesie22, die belangrijke implicaties voor de Kankerbiologie en de behandeling heeft , met name in het tijdperk van gerichte therapie22. Daarom dient de werkzaamheid van het geneesmiddel voor adjuvante therapie worden geëvalueerd in de gemetastaseerde laesies, niet alleen in de primaire tumor. We geverifieerd de timing van de lymfeklier en longkanker metastase vorming na inoculatie van de orthotopic, gebruik makend van de 4T1 borst kanker orthotopic model16. We toonden ook aan dat een resectie van de primaire tumor verbeterd overleven in de uitgezaaide borstkanker met behulp van de mastectomie model23. Dus, we hebben geprobeerd om een mastectomie model na orthotopic kanker cel implantatie. Een lange tijd werd echter besteed om dit lage lokale herhaling-model. Omdat kankercellen worden geïnjecteerd door chirurgische incisies, migreren kankercellen gemakkelijk in de wond. Daarnaast binnendringen kankercellen weefsels in direct contact met de tumor, zoals de omliggende borst muur spier en de huid. De kankercellen metastaseren ook naar axillaire lymfeklieren zonder de vorming van een zichtbare axillaire massa ten tijde van de mastectomie. Terwijl het verwijderen van de tumor kan een eenvoudiger techniek, is doen dus niet vertaalbaar naar mastectomie in de behandeling van de kanker van de borst als het lokale herhaling13veroorzaakt. Dus, deze "radicale mastectomie model" werd opgericht om te verwijderen alle kankercellen uit de voorste borstwand en axillaire lymfeklieren bekken, zoals beschreven in Figuur 2. We Long metastase van histologie en longkanker ex vivo imaging bevestigd, en er was geen glanzende laesie aanwezig door het gehele lichaam imaging na verwijdering van de longen. In dit model 4T1 orthotopic metastaseren kankercellen uiteindelijk naar de longen, in alle gevallen binnen 21 dagen. Echter, de timing van metastase is afhankelijk van de grootte van de primaire tumor; dus minder primaire tumor grootte is variabiliteit belangrijk voor de controle van niet alleen de primaire tumor, maar ook de lasten van uitgezaaide tumor. Met behulp van het mengsel van de gelatine-achtige eiwitten, kan tumor grootte variabiliteit worden geminimaliseerd. Het mengsel van de gelatine-achtige eiwitten kan echter ook invloed hebben op de communicatie van de tumor. Daarom, het potentieel verstorende factoren die samenhangen met gelatine-achtige eiwitten mengsel gebruik moet worden beschouwd, afhankelijk van de hypothese van de onderzoeker.

Met behulp van deze technieken en kankercellen luciferase-uiten toestaan voor tumor last kwantificering met minder meetfout, zelfs in niet-tastbare tumoren. Er zijn twee systemen van de verslaggever, bioluminescente en fluorescerende, om de signalen in levende dieren te visualiseren. Terwijl er werd gemeld dat het signaal van zowel bioluminescentie en fluorescentie helder genoeg voor kwantificering, zijn kan wanneer het signaal van de doelgroep zeer laag is, is het signaal van de achtergrond van de fluorescentie hoger, wat de nauwkeurigheid van de test vermindert. Daarentegen wordt bioluminescentie gedetecteerd met een grotere nauwkeurigheid bij een lagere signaal met minder achtergrond interferentie24. Dienovereenkomstig, de meeste onderzoekers liever met bioluminescentie verslaggever systemen in levende dier experimenten24,25. Tumor last kwantificering door bioluminescentie heeft echter zijn beperkingen. Luciferase-uiten cellen schitteren wanneer luciferine de kankercellen door cardiovasculaire perfusie26 bereikt. Als de laesie een oppervlakte van hypoxie en/of hypoperfusie heeft, luciferine wordt niet geleverd aan de cellen en de Bioluminescentie waarde kan vervolgens worden gemeten om te lager zijn dan de werkelijke tumor Last. Inderdaad, wij hebben het ervaren van ongepaste bioluminescentie kwantificering wanneer de grootte van de tumor meer dan 1,5 cm bereikt. Wij gaan ervan uit dat er als gevolg van de beschreven hypoxische en/of hypoperfused voorwaarde. Dus, als de tumor een tastbaar grootte bereikt, de tumor last wordt gekwantificeerd door zowel de Bioluminescentie en de meting van de remklauw. Een belangrijke beperking van bioluminescentie kwantificering te overwegen is de zwarte vacht van muizen. Zelfs nadat de vacht is verwijderd, is er pigment op de huid-27. Terwijl bioluminescentie kan worden gedetecteerd en worden gekwantificeerd in muizen met zwarte vacht, het is gedaald en het is daarom belangrijk om te muizen van dezelfde kleur vacht met elkaar vergelijken om de storende effecten van de kleur van de vacht op bioluminescente kwantificering. Het gebruik van cellen luciferase-uiten biedt sommige unieke modaliteiten voor studie. Bijvoorbeeld zijn secretable luciferase bruikbaar voor tumor last kwantificering meten bloed of urine bioluminescentie28. In het model gepresenteerd hier, directe tumor last kwantificering van levensvatbare kankercellen in levende dieren met niet-secretable luciferase is eenvoudig en duidelijke, die vereist geen bloed- of urinetests monsters verzamelen.

Vergelijkbaar met de modellen die geïntroduceerd hier, de productie van een meer efficiënte dierlijke experiment door overlegging van een hoger succespercentage van tumorvorming met minder variabiliteit is de sleutel tot het bewijzen van de bevindingen. In het huidige model, zodra een onderzoeker heeft geleerd van de techniek, is het gemakkelijk te bereiken van een tumorigenesis van 100%. Wij hebben ook bereikt hogere tumorvorming tarieven dan de modellen die we hebben ingevoerd; Bovendien hebben we een dikke darm kanker orthotopic model met behulp van celsuspensie in een mengsel van de gelatine-achtige eiwitten, samen met bioluminescentie technologie te kwantificeren van de tumor last21opgericht. Ter afronding: de hier gepresenteerde diermodel voorziet een geschikt lymfkliertest model voor het onderzoek van de kanker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de NIH-subsidie R01CA160688 en Susan G. Komen Foundation onderzoeker geïnitieerd onderzoek subsidie (IIR12222224) met R.C. muizen bioluminescentie beelden werden verworven door gedeelde bron translationeel Imaging gedeelde Resource in Roswell Park Uitgebreide Cancer Center, dat werd gesteund door de kanker Center ondersteuning Grant (P30CA01656) en gedeelde Instrumentation grant (S10OD016450).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Dissection Scissors Roboz RS-5983 For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps Roboz RS-5233 For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder Roboz RS-7830 For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo Roboz RS-6873 For ex vivo
5-0 silk sutures Look 774B For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500) Braintree Scientific GER 5287-120V For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper Wahl 9908-717 For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel Corning 354234 For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt GOLD-Bio LUCK-1K For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640 Gibco 11875093 For cell culture
Fetal Bovine Serub Gibco 10437028 For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056 For cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rashid, O. M., Takabe, K. Animal models for exploring the pharmacokinetics of breast cancer therapies. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 11 (2), 221-230 (2015).
  2. Schuh, J. C. Trials, tribulations, and trends in tumor modeling in mice. Toxicologic Pathology. 32, 53-66 (2004).
  3. Katsuta, E., et al. Modified breast cancer model for preclinical immunotherapy studies. Journal of Surgical Research. 204 (2), 467-474 (2016).
  4. Sidell, D. R., et al. Composite mandibulectomy: a novel animal model. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 146 (6), 932-937 (2012).
  5. Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Research. 25, 3905-3915 (2005).
  6. Kocaturk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
  7. Rashid, O. M., et al. An improved syngeneic orthotopic murine model of human breast cancer progression. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (3), 501-512 (2014).
  8. Bertozzi, S., et al. Prevalence, risk factors, and prognosis of peritoneal metastasis from breast cancer. SpringerPlus. 4, 688 (2015).
  9. Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
  10. Valero, M. G., Golshan, M. Management of the Axilla in Early Breast Cancer. Cancer Treatment and Research. 173, 39-52 (2018).
  11. National Comprehensive Cancer Network. Breast Cancer, NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf (2018).
  12. Versteeg, H. H., et al. Inhibition of tissue factor signaling suppresses tumor growth. Blood. 111 (1), 190-199 (2008).
  13. Katsuta, E., Rashid, O. M., Takabe, K. Murine breast cancer mastectomy model that predicts patient outcomes for drug development. Journal of Surgical Research. 219, 310-318 (2017).
  14. Veenhof, A. A., et al. Surgical stress response and postoperative immune function after laparoscopy or open surgery with fast track or standard perioperative care: a randomized trial. Annals of Surgery. 255 (2), 216-221 (2012).
  15. Wei, S., Siegal, G. P. Surviving at a distant site: The organotropism of metastatic breast cancer. Seminars in Diagnostic Pathology. 35 (2), 108-111 (2018).
  16. Nagahashi, M., et al. Sphingosine-1-phosphate produced by sphingosine kinase 1 promotes breast cancer progression by stimulating angiogenesis and lymphangiogenesis. Cancer Research. 72 (3), 726-735 (2012).
  17. Jones, C., Lancaster, R. Evolution of Operative Technique for Mastectomy. Surgical Clinics of North America. 98 (4), 835-844 (2018).
  18. Rashid, O. M., Maurente, D., Takabe, K. A Systematic Approach to Preclinical Trials in Metastatic Breast Cancer. Chemotherapy (Los Angeles). 5 (3), (2016).
  19. Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nature Genetics. 33 (1), 49-54 (2003).
  20. Aoki, H., et al. Murine model of long-term obstructive jaundice. Journal of Surgical Research. 206 (1), 118-125 (2016).
  21. Terracina, K. P., et al. Development of a metastatic murine colon cancer model. Journal of Surgical Research. 199 (1), 106-114 (2015).
  22. Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model? Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
  23. Rashid, O. M., et al. Resection of the primary tumor improves survival in metastatic breast cancer by reducing overall tumor burden. Surgery. 153 (6), 771-778 (2013).
  24. Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).
  25. Adams, S. T. Jr, Miller, S. C. Beyond D-luciferin: expanding the scope of bioluminescence imaging in vivo. Current Opinion in Chemical Biology. 21, 112-120 (2014).
  26. Close, D. M., Xu, T., Sayler, G. S., Ripp, S. In vivo bioluminescent imaging (BLI): noninvasive visualization and interrogation of biological processes in living animals. Sensors (Basel). 11 (1), 180-206 (2011).
  27. Chen, H., Thorne, S. H. Practical Methods for Molecular In Vivo Optical Imaging. Current Protocols in Cytometry. 59 (1224), (2012).
  28. Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
  29. Aoki, H., et al. Host sphingosine kinase 1 worsens pancreatic cancer peritoneal carcinomatosis. Journal of Surgical Research. 205 (2), 510-517 (2016).

Tags

Geneeskunde kwestie 141 muis borst kanker model orthotopic syngeneic mastectomie metastase bioluminescentie IVIS
Het genereren van een lymfkliertest Orthotopic uitgezaaide borst kanker Model en het uitvoeren van lymfkliertest radicale mastectomie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O.… More

Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O. M., Takabe, K. Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy. J. Vis. Exp. (141), e57849, doi:10.3791/57849 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter