Summary
Qui, presentiamo un protocollo per l'estrazione dell'acido nucleico rapido virus dal sangue intero virus-inattivato. L'estrazione viene eseguita direttamente nei tubi di raccolta sangue e non richiede attrezzature o elettricità. Il metodo non è dipendente da strutture di laboratorio e può essere utilizzato ovunque (ad esempio, in ospedali da campo).
Abstract
La diagnosi rapida di un'infezione è essenziale per la gestione di scoppio, contenimento del rischio e cura del paziente. Precedentemente abbiamo indicato un metodo per la rapida comodino inattivazione del virus dell'Ebola durante il prelievo di sangue per i test di sicurezza dell'acido nucleico (NA) con l'aggiunta di un buffer di lisi/associazione commerciale direttamente nei tubi di raccolta del sangue di vuoto. Utilizzando questo approccio di inattivazione comodino, abbiamo sviluppato un sicuro, rapido e semplificato sul comodino NA metodo di estrazione per il successivo rilevamento di un virus nel sangue intero inattivato di buffer di lisi/associazione. L'estrazione di NA avviene direttamente nei tubi di raccolta sangue e non richiede alcuna attrezzatura o elettricità.
Dopo il sangue viene raccolto nel buffer di lisi/associazione, i contenuti sono mescolati girando a mano il tubo e la miscela viene incubata per 20 min a temperatura ambiente. Particelle di vetro magnetico (MGPs) vengono aggiunti al tubo, e il contenuto è mescolato girando a mano il tubo di raccolta. I pop sono poi raccolti sul lato del tubo di raccolta sangue usando un supporto magnetico o un magnete e un elastico. Il MGPs vengono lavati tre volte, e dopo l'aggiunta di tampone di eluizione direttamente nel tubo di raccolta, il NAs è pronto per i test di NA, quali qPCR o amplificazione isotermica loop (lampada), senza la rimozione di MGPs dalla reazione. Il metodo di estrazione NA non è dipendente da qualsiasi strutture di laboratorio e può essere facilmente utilizzato ovunque (ad esempio, in ospedali da campo e reparti ospedalieri isolamento). Quando questo metodo di estrazione del NA è combinato con la lampada e uno strumento portatile, una diagnosi può essere ottenuta entro 40 min della raccolta sangue.
Introduction
In epidemie di virus, quando i pazienti sono limitati per i reparti di isolamento dell'ospedale o quando è necessaria una diagnosi veloce, sicura, semplice ed accurata diagnosi molecolare point-of-care è di importanza fondamentale per il contenimento di cura e rischio paziente. I due recenti focolai virali, del virus dell'Ebola (EBOV) in Africa occidentale (2013) e il virus di Zika in Sud America (2015), hanno aumentato l'interesse per migliorato point-of-care test diagnostici molecolari, come ad esempio isotermica mediata da loop trascrizione inversa amplificazione (RT-LAMP)1,2 e ricombinasi polimerasi amplificazione (RPA)3,4. RPA e RT-lampada sono rapidi, sensibili e specifici test molecolari che possono essere eseguite sui preparativi di esempio semplificato. Per il virus di Zika, RT-LAMP è stato combinato con un'analisi di flusso laterale (LFA), in grado di rilevare virus di Zika in campioni di sangue intero di non purificate entro 30 min1; Tuttavia, per EBOV, che è classificato come agente patogeno del gruppo 4 di rischio ed è altamente contagiosa, i campioni devono essere gestite sotto biosicurezza 4 (BSL-4) condizioni di livello e inattivati prima di possono eseguire qualsiasi sicuro procedure diagnostiche.
Metodi di inattivazione semplificata per EBOV, come l'aggiunta di buffer di lisi per il campione2,3,4,5, sono stati usati durante lo scoppio; Tuttavia, questi metodi richiedono una gestione in condizioni di BSL-4 con apparecchiature di laboratorio, quali biosicurezza BSL-3, centrifughe, blocchi di riscaldamento e pipette, come minimo. Questa apparecchiatura normalmente non è presente nei reparti di isolamento o in ospedali da campo. Per superare questa sfida, sono stati tentativi di eseguire la diagnostica in valigie3, e diversi dispositivi portatili e le macchine sono state sviluppate [ad esempio, un dispositivo portatile per estrazione di acidi nucleici (NA)]6. Tuttavia, i campioni positivi EBOV devono ancora essere inattivati prima che questi dispositivi possono essere utilizzati.
Precedentemente abbiamo segnalato un metodo di inattivazione rapida virus sul comodino per il EBOV7e la Vaccinia virus del Cowpox virus8 tramite l'aggiunta di un buffer di lisi/associazione commerciale in provette di raccolta del sangue di vuoto ordinario, consentendo per la diretta trasferimento di sangue dal paziente nel buffer inattivazione7. Questa inattivazione diretta e immediata in un sistema chiuso Elimina la necessità di gestire i campioni utilizzando qualsiasi contenimento rigoroso, ad esempio BSL-4 condizioni7, e i campioni possono essere gestiti in condizioni normali di BSL-2. Questo metodo di inattivazione è compatibile con diversi sistemi di estrazione di NA, come robot e mano purificazione Kit7; Tuttavia, questi metodi richiedono apparecchiature di laboratorio, come robot, centrifughe e l'elettricità, che non sono sempre presenti nel campo impostazioni o all'interno di reparti ospedalieri isolamento.
In questo rapporto, descriviamo un sicuro, rapido e semplificato NA estrazione metodo manuale per la successiva rilevazione molecolare di un virus nel sangue intero inattivato di buffer di lisi/associazione. Il metodo di estrazione NA non richiede attrezzature diverse da un supporto magnetico/magnetico. Nessun centrifughe, riscaldamento isolati, o energia elettrica sono necessari per l'estrazione di NA. Quindi, questo metodo non è dipendente da strutture di laboratorio e può essere facilmente utilizzato ovunque (ad esempio, in ospedali da campo, in reparti ospedalieri di isolamento o con impostazioni di risorse limitate). Il metodo di estrazione del NA è rapida e semplice e può essere utilizzato direttamente in qualsiasi test NA a valle, quali qPCR, RT-qPCR, lampada o RT-LAMP. Quando questo metodo di estrazione del NA è combinato con uno strumento portatile a batteria isotermico e lampada, una comodino diagnosi possono essere ottenuta in 40 min della raccolta sangue.
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Protocol
Il Comitato etica della ricerca biomedica, regione della capitale ha dato il consenso informato, e tutti i metodi descritti qui sono stati esentati da una recensione del sistema del comitato etico, in conformità con la legge danese sui progetti di sviluppo di analisi.
1. preparazione di provette sottovuoto per inattivazione di Virus e NA rapida estrazione
Attenzione: Il buffer utilizzato per questo protocollo contiene tiocianato di guanidinium (GITC) e un tensioattivo non ionico, che sono irritanti. Misure di sicurezza di laboratorio appropriati, utilizzare una cappa a flusso e indossare guanti durante la manipolazione di esso. Evitare qualsiasi contatto pelle e occhi. Se il buffer è stato versato, la superficie contaminata non dovrà essere disinfettata mai direttamente con cloramina o ipoclorito di sodio (i principi attivi in "bleach") perché questa miscela può condurre alla formazione di cianuro tossico. In primo luogo, pulire il buffer versato con il tessuto assorbente. Successivamente, pulire la superficie con etanolo al 70% e poi con acqua e infine, utilizzare cloramina o ipoclorito di sodio.
- Per preparare i tubi a vuoto raccolta sangue, iniettare 1.6 mL di buffer di lisi commerciale specifico in un tubo a vuoto EDTA 4 mL perforando il coperchio del tubo usando un ago 25 x 1 e una siringa da 3 mL.
Nota: Non rimuovere il coperchio del tubo a vuoto. Il vuoto deve essere mantenuto. - Conservare i tubi a vuoto contenente il tampone a temperatura ambiente fino all'utilizzo.
Nota: I tubi sono stabili per almeno 1 anno dopo la loro preparazione.
2. preparazione del buffer per l'estrazione di NA
- Per preparare i buffer per un'estrazione di NA, posizionare due 1.8 mL, due 4.5 mL e un 3,6 mL tubi in un rack.
- Aggiungere, pipettando, 960 µ l di particelle di vetro magnetico (pop) a un tubo pulito 1,8 mL e un'etichetta con MGPs. Risospendere la sospensione MGP completamente prima di esso il pipettaggio.
Nota: Il MGPs tendono a raccogliere rapidamente nella parte inferiore del tubo. - Aggiungere, pipettando, 4 mL di tampone di lavaggio sono in una provetta pulita 4,5 mL ed etichettarlo come WB-1.
Attenzione: Il tampone di lavaggio I contiene cloruro di guanidinio, che è irritante. Misure di sicurezza di laboratorio appropriati, utilizzare una cappa a flusso e indossare guanti durante la manipolazione di esso. Evitare qualsiasi contatto pelle e occhi. - Aggiungi, pipettando, 1,5 mL di tampone di lavaggio II in una provetta pulita 3,6 mL ed etichettarlo come WB-2.
- Aggiungere, pipettando, 3 mL di tampone di lavaggio III in una provetta pulita 4,5 mL ed etichettarlo come WB-3.
- Aggiungi, pipettando, 100 µ l di tampone di eluizione in una provetta pulita 1,8 mL ed etichettarlo come EB.
- Memorizzare i buffer aliquotati a temperatura ambiente fino all'utilizzo.
Nota: I tubi sono stabili per almeno 1 mese dopo la loro preparazione.
3. sangue raccolta dai pazienti con segni e sintomi di un'infezione da Virus
Attenzione: Prendere misure di sicurezza di laboratorio appropriati durante la raccolta di sangue intero dal paziente. Indossare guanti e occhiali. Se il paziente è in isolamento, si prega di seguire le procedure di livello 4 di biosafety.
- Per raccogliere endovenosa intero sangue dal paziente, utilizzare un ago a farfalla con tubo di prolunga di piccolo calibro e una vuoto provetta contenente un tampone di lisi/associazione. Appoggiare il braccio del paziente in una posizione verso il basso e posizionare il tubo di raccolta inferiore l'ago a farfalla. Inserire l'ago a farfalla nella vena del paziente e fissare il tubo di vuoto di sangue insieme all'estensione di piccolo calibro.
Nota: Questo impedirà il riflusso. - Dopo la raccolta del sangue, mescolare il contenuto del tubo girando il tubo 5 - 10 volte.
Nota: A causa del vuoto restante nel tubo di raccolta sangue contenente 1,6 mL di tampone di lisi/associazione, il volume del campione raccolto sarà automaticamente 1,6 mL. - Disinfettare la parte esterna del tubo utilizzando etanolo al 70%.
- Incubare le provette per 20 min a temperatura ambiente.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui e i tubi di raccolta sangue intero possono essere conservati a-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C o 37 ° C per almeno 1 mese7. - Continuare direttamente per il metodo di estrazione NA semplificato.
4. semplificato NA estrazione del sangue intero
- Per purificare NA dal Lisi/associazione buffer-inattivato sangue prelevato, miscela il contenuto della provetta lanciando il vuoto tubo a mano 5-10 volte.
- Rimuovere con cautela il coperchio del tubo e il coperchio di scarico.
- Versare il preparato aliquota di MGPs (1 mL) direttamente nel tubo di raccolta sangue.
- Posto un nuovo coperchio da un tubo di raccolta sangue inutilizzati nella provetta contenente il campione.
- Appoggiare un dito sul coperchio per garantire che il tubo sia ben chiuso e mescolare il contenuto del tubo girando il tubo di raccolta sangue a mano 5 - 10 volte.
- Posizionare il tubo nel supporto magnetico e tieni un dito sul coperchio per garantire che il tubo sia ben chiuso.
- Capovolgere il supporto magnetico con il tubo di un paio di volte di mano per assicurarsi che tutti i pop sono raccolti sul lato del tubo con il magnete.
Nota: Il supporto magnetico può essere sostituito con un magnete di forma allungato e un elastico. - Rimuovere il coperchio del tubo ed eliminare il contenuto della provetta utilizzando una pipetta monouso o semplicemente versando il contenuto in un tubo di raccolta da 50 mL.
Nota: Evitare di aerosol dal tubo 50 mL collezione chiudendo il tubo con un coperchio. - Versare il preparato aliquota di WB-1 (4 mL) direttamente nel tubo di raccolta di sangue.
- Mettere il coperchio sul tubo e posizionare un dito sul coperchio per garantire che il tubo sia ben chiuso.
- Rimuovere il tubo dal supporto magnetico, tenere il coperchio ben serrato con un dito.
Nota: Se si utilizza un magnete e un elastico, semplicemente rimuovere il magnete e la banda di gomma dal tubo. - Risospendere il MGPs girando il tubo di raccolta sangue a mano 5 - 10 volte.
- Ripetere i passaggi da 4.6-4.8.
- Versare il preparato aliquota di WB-2 (1,5 mL) direttamente nel tubo di raccolta di sangue.
- Mettere il coperchio sul tubo e rimuovere il tubo dal supporto magnetico.
Nota: Se si utilizza un magnete e un elastico, semplicemente rimuovere il magnete e la banda di gomma dal tubo. - Appoggiare un dito sul coperchio per garantire che il tubo sia ben chiuso.
- Risospendere il MGPs girando a mano il tubo di raccolta sangue per pochi secondi.
- Ripetere il passaggio 4.6-4.8.
- Versare il preparato aliquota di WB-3 (3 mL) direttamente nel tubo di raccolta di sangue.
- Mettere il coperchio sul tubo e rimuovere il tubo dal supporto magnetico.
Nota: Se si utilizza un magnete e un elastico, semplicemente rimuovere il magnete e la banda di gomma dal tubo. - Appoggiare un dito sul coperchio per garantire che il tubo sia ben chiuso.
- Risospendere il MGPs girando il tubo di raccolta sangue a mano 5 - 10 volte.
- Ripetere i passaggi da 4.6-4.8.
- Versare il preparato aliquota di EB (100 µ l) direttamente nel tubo di raccolta di sangue.
- Mettere il coperchio sul tubo e rimuovere il tubo dal supporto magnetico.
Nota: Se si utilizza un magnete e un elastico, semplicemente rimuovere il magnete e la banda di gomma dal tubo. - Risospendere il pop in EB toccando il tubo di raccolta sangue 5 - 10 volte con un dito.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui, e i tubi possono essere conservati a-20 ° C. - Trasferire una goccia (5-8 µ l) del sedimento MGPs alla miscela di reazione di amplificazione NA a valle utilizzando una pipetta monouso 1,5 mL (qualsiasi amplificazione di NA diagnostica a Valle saggio come lampada/RT-LAMP o saggi qPCR/RT-qPCR possono essere utilizzati).
Nota: Il NAs verrà stick per il pop, quindi assicuratevi di utilizzare il MGPs nella reazione di amplificazione NA a valle. Mescolare la sospensione MGP prima dell'uso. Dopo la miscelazione, il MGPs raccoglierà nella parte inferiore del tubo.
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Representative Results
Il protocollo presentato qui è semplice ed efficace e può essere ampiamente applicato a qualsiasi analisi molecolare deve essere eseguita su campioni di sangue intero infettiva inattivati con il buffer di lisi/associazione. Il flusso di lavoro per l'inattivazione di sangue e l'estrazione di NA è illustrato nella Figura 1, compresa la preparazione di sangue raccolta tubi a vuoto7 (Figura 1A), la raccolta di sangue7 (Figura 1B), l'estrazione di NA ( Figure 1 - 1 H) e l'analisi di NA a valle (Figura 1I).
Dovuto il protocollo di estrazione NA semplificato, il pop non vengono rimossi dalla fase di eluizione, e, di conseguenza, il NAs tende ad attaccarsi per il pop. Qualsiasi analisi molecolari a valle, quali qPCR o analisi di lampada, devono essere eseguita direttamente su MGPs (Figura 1I e Figura 2) per garantire un risultato positivo.
Il metodo di estrazione del NA è campioni di sangue intero efficiente e RNA o DNA-virus-positivi con carichi virali più bassi 130-3.000 copie/mL possono essere estratti e analizzati utilizzando qPCR o RT-qPCR (Figura 3).
Utilizzando il metodo di estrazione di NA, lampada o RT-LAMP e un dispositivo isotermico batteria portatile per campioni di sangue intero virus-positivo, una diagnosi può essere ottenuta entro 40 min dalla raccolta sangue (Figura 4).
Figura 1 : Flusso di lavoro per l'estrazione di NA semplificata di campioni di sangue intero. (A) preparare che la raccolta di sangue sotto vuoto buffer di lisi/associazione tubi usando un ago e una siringa. (B) raccogliere il sangue usando un ago a farfalla. (C) inserire il tubo di raccolta di sangue in un supporto, rimuovere il coperchio e versare il MGPs nella provetta. (D) chiudere il tubo con un nuovo coperchio e mescolare il contenuto girando a mano il tubo. (E) raccogliere la MGPs sul lato del tubo di raccolta sangue lanciando il tubo nel supporto magnetico. (F) rimuovere il surnatante con una pipetta monouso. (G) versare i buffer di lavaggio o eluizione direttamente nel tubo di raccolta sangue e ripetere le azioni mostrate nei pannelli D - F. (H), questo pannello mostra MGPs pronto per l'uso diretto in un qPCR, RT-qPCR, lampada o RT reazione. (io) trasferimento una goccia (5-8 µ l) di MGPs in una provetta di reazione PCR o lampada utilizzando una pipetta monouso 1,5 mL. Pannello A e B: questa figura è stata modificata da Rosenstierne et al. 7. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Rilevazione di NA di 28 campioni di sangue intero virus-positivi di estratti utilizzando il metodo di estrazione NA semplificato. Sangue intero i campioni testati negativi (1,6 mL) per un virus sono stati diluiti con sia un DNA-virus [virus di Epstein - Barr (EBV) (2,0 x 104 - 1.0 x 103 copie/mL)] o un virus a RNA [virus epatite C (HCV) (6.0 x 105 - 3.0 x 103 copie/mL)] o un virus Dengue (DENV) (1,7 x 108 - 1,7 x 106 copie/mL). NAs sono stati estratti utilizzando il metodo sopra descritto, e il NAs Estratto sono stato analizzato in duplicato da specifiche qPCR in-House, RT-PCR, lampada o RT-LAMP, con o senza MGPs. La x-asse = il metodo di rilevazione di NA, y-asse = la percentuale di campioni positivi in qPCR/lampada. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Sensibilità del metodo di estrazione NA semplificato. Per una prova di concetto del metodo, sangue intero negativo virus è stato addizionato con preparazioni differenti di RNA o DNA virus contenente un carico virale definiti e NAs sono stati estratti utilizzando il metodo di estrazione NA semplificato. (A) sangue intero negativo (1,4 mL) è stato addizionato con 200 µ l di 10 volte diluizioni dello standard EBOV preparato per scopi diagnostici (ENIVD), che è stato preparato dalla recente epidemia in Guéckédou/Guinea (2.0 x 106 copie/mL). Il NAs Estratto sono stato analizzato in duplicato da un in-House di EBOV specifiche RT-qPCR7 utilizzando un termociclatore MX3005P. (B) sangue intero (1,2 mL) è stato addizionato con 400 µ l di 10 volte diluizioni di un campione di siero standardizzato di HCV che (1.2 x 106 UI/mL). Il NAs Estratto sono stato analizzato in duplicato da un in-House RT-qPCR HCV-specifici utilizzando un termociclatore MX3005P. (C) sangue intero (1,2 mL) è stata aggiunta con 400 µ l di concentrazioni differenti di EBV (2.0 x 104 copie/mL, 8.0 x 103 copie/mL, 2.7 x 103 copie/mL e 9,3 x 102 copie/mL). Il NAs Estratto sono stato analizzato in duplicato da un in-House qPCR di EBV-specific. (D) sangue intero (1,2 mL) è stata aggiunta con 400 µ l di 10 volte diluizioni di un virus di BK (1,3 x 104 copie/mL). Il NAs Estratto sono stato analizzato in duplicato da un in-House qPCR BK-specifiche. La x-asse = la concentrazione finale di un virus nel campione di sangue intero a spillo (copie/mL o IU/mL), la y-asse = Ct-valore (media ± SD). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Semplificato NA estrazione e RT-LAMP o lampada utilizzando un dispositivo portatile isotermico. (A) a causa della mancanza di campioni di sangue intero di EBOV positivi al dipartimento di Virus & diagnostica microbiologica speciale, Statens Serum Institut, Danimarca, 1,4 mL di sangue intero negativo è stato addizionato con 200 µ l di diverse diluizioni dell'EBOV norma elaborata per scopi diagnostici (ENIVD). I campioni arricchiti hanno subito un'estrazione NA utilizzando il metodo di estrazione NA semplificato e sono stati analizzati da una reazione di EBOV specifiche RT-LAMP. Come controllo negativo, un campione di sangue intero negativo era incluso. La x-asse = la concentrazione finale di EBOV nel campione di sangue intero a spillo (copie/mL), la y-asse = min a positivo. (B) per un proof of concept, aliquote di sangue intero (1,6 mL) da 7 pazienti, diagnosticati positivi per EBV (13.000-500 copie/mL) al dipartimento di Virus & diagnostica microbiologica speciale, Statens Serum Institut, Danimarca, ha subito un NA estrazione con il metodo di estrazione NA semplificato e sono stati analizzati da una reazione di EBV-specific lampada usando il batteria Genie II isotermico dispositivo portatile. Come controllo negativo, un campione di Parvo B19-positivo è stato incluso. La x-asse = il carico virale di EBV nel campione del paziente (copie/mL), la y-asse = min a positivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo rapporto, descriviamo un sicuro, rapido e semplice manuale sul comodino NA metodo di estrazione per la rilevazione molecolare a valle di un virus nel sangue intero inattivato di buffer di lisi/associazione. Il metodo di estrazione NA descritto è stato sviluppato per essere eseguito direttamente su campioni di sangue intero raccolti in provette sottovuoto contenente la lisi/binding buffer (Tabella materiali)7. Questo buffer specifico inattiva EBOV7 ed è la componente fondamentale nel metodo. Dopo la raccolta del sangue, si consiglia di incubando il tubo per almeno 20 min7 al fine di garantire una completa inattivazione del campione. L'inattivazione di EBOV comodino Elimina la necessità per la gestione di eventuali campioni positivi EBOV in condizioni di contenimento rigoroso, come condizioni BSL-4 e permette i campioni da trattare in condizioni normali di BSL-2. È probabile che altri rischio gruppo quattro agenti patogeni, come il virus di Lassa, il virus di Marburg e il virus della febbre emorragica di Crimea Congo anche sono inattivati da questo buffer, ma questo rimane per essere mostrato.
Il metodo di estrazione NA descritto è stato sviluppato per essere eseguito accanto a un paziente in un reparto di isolamento ospedaliero o in un ospedale da campo e, pertanto, non richiede nessuna attrezzatura di laboratorio, come centrifughe, blocchi di riscaldamento o energia elettrica. Tutto ciò che il metodo di estrazione NA richiede sono tubetti contenenti un volume fisso di MGPs o buffer di lavaggio, un supporto magnetico e pipette monouso. La pre-preparazione delle provette contenenti buffer semplifica il protocollo perché elimina la necessità per pipette, e invece, i buffer aliquotati sono versati direttamente nelle provette campione. Il supporto magnetico intercetta MGPs contenente il NA e media la manovrabilità facile delle fasi di lavaggio. Il supporto magnetico può essere sostituito con un magnete ordinario e un elastico nel caso in cui un supporto magnetico non è disponibile; Tuttavia, il supporto magnetico riduce il rischio di hands-on di far cadere il tubo e versare il contenuto quando si applica il magnete e la banda di gomma. A causa della viscosità del campione di sangue di intero inattivato di buffer di lisi/associazione, pipette monouso sono usati per rimuovere il surnatante/liquido/wash buffer dal tubo. Le pipette monouso possono essere sostituite da un versamento diretto del contenuto dal tubo in un tubo di raccolta dei rifiuti, ma si prega di essere consapevole di non creare eventuali gocce all'esterno del tubo. Se le goccioline vengono create, la superficie contaminata non dovrà essere disinfettata mai direttamente con cloramina o ipoclorito di sodio (i principi attivi in "bleach") perché questa miscela può condurre alla formazione di cianuro tossico. Pertanto, se versato in primo luogo, pulire la fuoriuscita con un panno assorbente. Successivamente, pulire la superficie con etanolo al 70% e poi con molta acqua e infine, utilizzare cloramina o ipoclorito di sodio. Questo include tutti i rifiuti che sono stato a contatto con il buffer di lisi/associazione (tra cui il tubo di raccolta dei rifiuti e le pipette monouso). Al contrario, raccogliere tutti i rifiuti in un contenitore per rifiuti separato e disinfettare solo all'esterno del contenitore con etanolo al 70%.
NAs normalmente vengono eluite dal MGPs durante una fase di riscaldamento, ma questa fase di riscaldamento è stato rimosso dal protocollo di estrazione NA semplificata per eliminare l'uso di energia elettrica e attrezzature. Pertanto, il NAs tende ad attaccarsi a MGPs, che, pertanto, deve essere aggiunto per il test di rilevamento di NA a valle per un rilevamento positivo di NA. Il MGPs vengono trasferiti il mix di reazione a valle utilizzando una goccia da una pipetta monouso 1,5 mL. Questa aggiunta non è precisa come l'aggiunta normale utilizzando una pipetta di punta di pinna; Tuttavia, l'aggiunta di imprecisione di NA/MGPs alla lampada, RT-LAMP, qPCR o RT-qPCR mix di reazione non inibisce la reazione o influenzare il segnale di fluorescenza nella nostra analisi diagnostica in-House. Tuttavia, questo può essere diverso da dosaggio a dosaggio, e si consiglia che ogni test NA a valle viene convalidato e che la sensibilità del dosaggio viene testata utilizzando il metodo di estrazione NA semplificato. Il metodo di estrazione del NA è relativamente sensibile e campioni di sangue intero contenenti un DNA o RNA virus basse come 3.000 copie/mL può essere facilmente estratte e rilevato nei test molecolari a valle, quali qPCR. La carica virale in campioni clinici è solitamente molto alta durante la fase acuta di un'infezione e febbre emorragica virale, come ad esempio il EBOV, Lassa virus e virus di febbre emorragica di Crimea Congo, solitamente contengono più di 105 copie/mL9 ,10,11. Di conseguenza, virus in questi campioni possono essere facilmente individuate utilizzando questo metodo di estrazione di NA. Tuttavia, l'inattivazione di MPLB di virus tranne il7EBOV, Vaccinia e del Cowpox virus8 rimane per essere mostrato.
Il metodo di estrazione NA semplificato può essere eseguito in reparti ospedalieri di isolamento o in impostazioni del campo ed è ideale per la diagnostica molecolare di point-of-care. Tuttavia, il metodo non è applicabile per le estrazioni di NA ad alta velocità a causa della gestione pratica di un tubo aperto. Se sono necessarie le estrazioni di NA di alto-rendimento, i campioni di sangue intero inattivato possono essere facilmente purificati utilizzando NA estrazione robot7. Un altro svantaggio è la manipolazione dei reagenti nocivi come quelli del tampone Lisi/binding buffer [20-30% polietilene glicole p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenil etere e 30-50% tiocianato di guanidinium (GITC)]17 e lavare io (30-50% guanidinio cloruro)17 in un tubo aperto all'esterno di una cappa a flusso. Il buffer di lisi/associazione in forma concentrata è contenuto all'interno del tubo a vuoto e con la raccolta del sangue 1:1 (v/v), la concentrazione è ridotta prima che il tubo è aperto. L'apertura del tubo a vuoto e l'aggiunta/rimozione di MGPs o tampone di lavaggio è eseguita in pochi secondi e, quindi, il rischio di inalazione di aerosol è minimo. Dopo la rimozione del tampone di lavaggio-ho, dal tubo, nessun altri reattivi nocivi sono utilizzati nel protocollo.
Molti dispositivi e rapid point-of-care test molecolari sono stati sviluppati dopo lo scoppio EBOV nel 20133,6,12,13,14,15,16 . Tuttavia, molte di queste prove richiedono una movimentazione a Monte di infettive materiale, biosicurezza BSL-3 e a un minimo, attrezzature di laboratorio, come pipette, centrifughe e blocchi di riscaldamento o energia elettrica. L'uso di biosicurezza complica e prolunga una rapida diagnosi. L'inattivazione di virus comodino descritto con la raccolta diretta di sangue nelle provette di inattivazione del virus combinato con il metodo di estrazione NA semplificato elimina la necessità di biosicurezza, elettricità e strutture di laboratorio. Inoltre, perché il metodo di estrazione NA semplificato possa essere eseguito accanto al paziente e combinato con una reazione di lampada in un dispositivo isotermico batteria portatile, una sicura diagnosi molecolare comodino possono essere ottenuta in 40 min.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Susanne Lopes Rasmussen e Solvej Kolbjørn Jensen per la loro assistenza tecnica e per la gestione dei campioni clinici. Questo progetto fa parte del Consorzio EbolaMoDRAD, che ha fruito di un finanziamento innovativo medicina iniziativa 2 impresa comune sotto concessione contratto N ° 115843. Questa impresa comune riceve supporto da EFPIA e programma di innovazione e ricerca Orizzonte 2020 dell'Unione europea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
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