Qui, presentiamo un protocollo per l'estrazione dell'acido nucleico rapido virus dal sangue intero virus-inattivato. L'estrazione viene eseguita direttamente nei tubi di raccolta sangue e non richiede attrezzature o elettricità. Il metodo non è dipendente da strutture di laboratorio e può essere utilizzato ovunque (ad esempio, in ospedali da campo).
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Articolo metodologico
Rapido, sicuro e semplice manuale sul comodino estrazione dell'acido nucleico per la rilevazione del Virus in campioni di sangue intero
In questo articolo
Sommario
Abstract
La diagnosi rapida di un'infezione è essenziale per la gestione di scoppio, contenimento del rischio e cura del paziente. Precedentemente abbiamo indicato un metodo per la rapida comodino inattivazione del virus dell'Ebola durante il prelievo di sangue per i test di sicurezza dell'acido nucleico (NA) con l'aggiunta di un buffer di lisi/associazione commerciale direttamente nei tubi di raccolta del sangue di vuoto. Utilizzando questo approccio di inattivazione comodino, abbiamo sviluppato un sicuro, rapido e semplificato sul comodino NA metodo di estrazione per il successivo rilevamento di un virus nel sangue intero inattivato di buffer di lisi/associazione. L'estrazione di NA avviene direttamente nei tubi di raccolta sangue e non richiede alcuna attrezzatura o elettricità.
Dopo il sangue viene raccolto nel buffer di lisi/associazione, i contenuti sono mescolati girando a mano il tubo e la miscela viene incubata per 20 min a temperatura ambiente. Particelle di vetro magnetico (MGPs) vengono aggiunti al tubo, e il contenuto è mescolato girando a mano il tubo di raccolta. I pop sono poi raccolti sul lato del tubo di raccolta sangue usando un supporto magnetico o un magnete e un elastico. Il MGPs vengono lavati tre volte, e dopo l'aggiunta di tampone di eluizione direttamente nel tubo di raccolta, il NAs è pronto per i test di NA, quali qPCR o amplificazione isotermica loop (lampada), senza la rimozione di MGPs dalla reazione. Il metodo di estrazione NA non è dipendente da qualsiasi strutture di laboratorio e può essere facilmente utilizzato ovunque (ad esempio, in ospedali da campo e reparti ospedalieri isolamento). Quando questo metodo di estrazione del NA è combinato con la lampada e uno strumento portatile, una diagnosi può essere ottenuta entro 40 min della raccolta sangue.
Introduzione
In epidemie di virus, quando i pazienti sono limitati per i reparti di isolamento dell'ospedale o quando è necessaria una diagnosi veloce, sicura, semplice ed accurata diagnosi molecolare point-of-care è di importanza fondamentale per il contenimento di cura e rischio paziente. I due recenti focolai virali, del virus dell'Ebola (EBOV) in Africa occidentale (2013) e il virus di Zika in Sud America (2015), hanno aumentato l'interesse per migliorato point-of-care test diagnostici molecolari, come ad esempio isotermica mediata da loop trascrizione inversa amplificazione (RT-LAMP)1,2 e ricombinasi polimerasi amplif....
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Protocollo
Il Comitato etica della ricerca biomedica, regione della capitale ha dato il consenso informato, e tutti i metodi descritti qui sono stati esentati da una recensione del sistema del comitato etico, in conformità con la legge danese sui progetti di sviluppo di analisi.
1. preparazione di provette sottovuoto per inattivazione di Virus e NA rapida estrazione
Attenzione: Il buffer utilizzato per questo protocollo contiene tiocianato di guanidinium (GITC) e un tensioattivo non ionico, che sono irritanti. Misure di sicurezza di laboratorio appropriati, utilizzare una cappa a flusso e indossare guanti durante la manipolaz....
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Risultati
Il protocollo presentato qui è semplice ed efficace e può essere ampiamente applicato a qualsiasi analisi molecolare deve essere eseguita su campioni di sangue intero infettiva inattivati con il buffer di lisi/associazione. Il flusso di lavoro per l'inattivazione di sangue e l'estrazione di NA è illustrato nella Figura 1, compresa la preparazione di sangue raccolta tubi a vuoto7 (Figura 1A), la raccolta di.......
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Discussione
In questo rapporto, descriviamo un sicuro, rapido e semplice manuale sul comodino NA metodo di estrazione per la rilevazione molecolare a valle di un virus nel sangue intero inattivato di buffer di lisi/associazione. Il metodo di estrazione NA descritto è stato sviluppato per essere eseguito direttamente su campioni di sangue intero raccolti in provette sottovuoto contenente la lisi/binding buffer (Tabella materiali)7. Questo buffer specifico inattiva EBOV7.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Susanne Lopes Rasmussen e Solvej Kolbjørn Jensen per la loro assistenza tecnica e per la gestione dei campioni clinici. Questo progetto fa parte del Consorzio EbolaMoDRAD, che ha fruito di un finanziamento innovativo medicina iniziativa 2 impresa comune sotto concessione contratto N ° 115843. Questa impresa comune riceve supporto da EFPIA e programma di innovazione e ricerca Orizzonte 2020 dell'Unione europea.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette Vacutainer K2 EDTA (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Prelievo di sangue | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 ago | Becton Dickinson | 300800 | |
| SIRINGA LUER LOK (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Ago a farfalla con tubo di prolunga di piccolo diametro | Jø rgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lisi/Tampone legante - Ricarica | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Kit di isolamento dell'acido nucleico totale | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Provette criogeniche per biobanche e colture cellulari (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Provette criogeniche per biobanche e colture cellulari (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Provette criogeniche per biobanche e colture cellulari (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Pipetta di trasferimento (3,5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco&commercio; Pipette per trasferimento puntali fini (1,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc&commercio; Provette da centrifuga sterili coniche in polipropilene da 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
Riferimenti
- Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).
- Benzine, J. W., Brown, K. M., et al.
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Ristampe e permessi
