Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

عزل وتوصيف والتفريق في القلب من الخلايا الجذعية من قلب الماوس الكبار

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58448
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Cellular and Integrative Physiology, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Anesthesiology, University of Nebraska Medical Center

Summary

والهدف العام لهذه المادة توحيد البروتوكول لعزل وتوصيف، وتمايز الخلايا الجذعية القلبية (CSCs) من قلب الماوس الكبار. هنا، يمكننا وصف أسلوب الطرد المركزي تدرج كثافة لعزل CSCs موريني ووضع أساليب لديوان الخدمة المدنية الثقافة وانتشارها، والتمايز في cardiomyocytes.

Abstract

احتشاء عضلة القلب (ميتشيغن) سبب الرئيسي للاعتلال والوفيات العالم. أحد الأهداف رئيسية للطب التجديدي لتغذية عضلة القلب الميت بعد مي. وقد استخدمت عدة استراتيجيات لتجديد عضلة القلب، العلاج بالخلايا الجذعية لا تزال نهجاً رئيسيا لتغذية عضلة القلب الميت قلب مي. تتراكم الأدلة تشير إلى وجود الخلايا الجذعية القلب المقيم (CSCs) في قلب الكبار وآثارها الغدد الصماء و/أو باراكريني على تجديد القلب. ومع ذلك، CSC عزل وتوصيف والتمايز تجاه الخلايا احتشاء عضلة القلب، ولا سيما كارديوميوسيتيس، لا يزال يشكل تحديا تقنية. في هذه الدراسة، قدمنا طريقة بسيطة لعزل وتوصيف، والتفريق بين CSCs من قلب الماوس الكبار. هنا، يمكننا وصف أسلوب تدرج كثافة لعزل CSCs، حيث يهضم القلب بحل الثاني كولاجيناز 0.2%. تميز CSCs معزولة، يمكننا تقييم التعبير عن علامات CSCs/القلب Sca-1، NKX2-5، و GATA4، وعلامات بلوريبوتينسي/ستيمنيس OCT4، SOX2، ونانج. كما عقدنا العزم إمكانات الانتشار CSCs معزولة باستزراع لهم في طبق بتري وتقييم التعبير عن علامة الانتشار كي-67. لتقييم إمكانيات التمايز CSCs، اخترنا CSCs بين سبع وعشر أيام مثقف. نحن نقلتهم إلى لوحة جديدة مع وسيلة تمايز كارديوميوسيتي. أنها هي المحتضنة في حاضنة ثقافة خلية لمدة 12 يوما، بينما متوسطة التمايز يتم تغييره كل ثلاثة أيام. CSCs المتباينة التعبير عن علامات محددة كارديوميوسيتي: أكتينين وتروبونين أنا. وهكذا، CSCs معزولة مع هذا البروتوكول ستيمنيس وعلامات القلب، ولديهم إمكانيات للانتشار والتفرقة تجاه النسب كارديوميوسيتي.

Introduction

مرض القلب الاقفاري، بما في ذلك احتشاء عضلة القلب (ميتشيغن)، سبب رئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم1. ويظل العلاج بالخلايا الجذعية لتجديد عضلة القلب الميت نهجاً رئيسيا لتحسين وظيفة القلب مي2،القلب3،،من45. استخدمت أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية لتجديد عضلة القلب الميت وتحسين وظيفة القلب قلب مي. يمكن تصنيفها على نطاق واسع في الخلايا الجذعية6 وبالغ في الخلايا الجذعية الجنينية. استخدمت في الخلايا الجذعية البالغة، أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية، مثل الخلايا وحيدات النوى المشتقة من نخاع العظام7،8، الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظام9،10، الأنسجة الدهنية 11،12، والحبل السري13و14،CSCs15. الخلايا الجذعية يمكن تعزيز إنعاش القلب عن طريق الغدد الصماء و/أو paracrine الإجراءات16،17،18،،من1920. ومع ذلك، قيداً رئيسيا للعلاج بالخلايا الجذعية هو الحصول على عدد كاف من الخلايا الجذعية التي يمكن أن تتكاثر و/أو التفريق نحو21،محددة نسب القلب22. زرع الخلايا الجذعية الذاتي و allogenic يشكل تحديا هاما في العلاج بالخلايا الجذعية9. ويمكن CSCs نهج أفضل لإنعاش القلب نظراً لأنها مشتقة من القلب، وأنها يمكن أن تكون أكثر سهولة متباينة في الأنساب القلب من الخلايا الجذعية غير القلب. وهكذا، فإنه يقلل من خطر تيراتوما. وبالإضافة إلى ذلك، آثار CSCs، والغدد الصماء وباراكريني مثل اكسوسوميس وميرناس المستمدة من CSCs، يمكن أن يكون أكثر فعالية من أنواع أخرى من الخلايا الجذعية. وهكذا، CSCs يبقى خيار أفضل لإنعاش القلب23،24.

على الرغم من أن CSCs أفضل مرشح لتجديد القلب في قلب مي سبب أصلهم القلب، قيداً رئيسيا مع CSCs هو أقل العائد نظراً لعدم وجود طريقة العزل الفعال. قيد آخر يمكن التفريق بين CSCs البصر نحو cardiomyocytes النسب2،25،،من2627. للالتفاف على هذه القيود، من المهم وضع بروتوكول فعال لعزل وتوصيف التمايز تجاه النسب القلب ديوان الخدمة المدنية. هناك لا علامة مقبولة واحدة ل CSCs وعزله محددة سطح الخلية المستندة إلى علامة من CSCs غلة أقل CSCs. هنا، علينا توحيد نهج الطرد المركزي تدرج بسيطة لعزل CSCs من قلب الماوس التي هي فعالة من حيث التكلفة ويؤدي زيادة غلة CSCs. يمكن تحديد هذه CSCs معزولة لعلامات سطح الخلية المحددة بخلية تنشيط fluorescence المكشوف. بالإضافة إلى العزلة CSCs، قدمنا بروتوكولا للثقافة ديوان الخدمة المدنية، وتوصيف والتمايز تجاه النسب كارديوميوسيتي. وهكذا، فإننا نعرض طريقة أنيقة لعزل وتوصيف، الثقافة، والتفريق بين CSCs من قلوب الماوس الكبار (الشكل 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الإسكان، والتخدير، والتضحية بالفئران أجريت بعد البروتوكول IACUC المعتمدة من المركز الطبي في جامعة نبراسكا.

1-المواد

  1. 10-12 أسبوع استخدام C57BL/6J الأسود يمكن أيضا أن الفئران الذكور، أبقى داخلية في منشأة الحيوان المؤسسية، لعزل CSCs. CSCs تكون معزولة من الفئران الإناث غير الحوامل.
  2. تعقيم كل الأدوات الجراحية اللازمة، بما في ذلك المقص الجراحي والمقصات الجراحية الدقيقة وعرقوب منحنى ملقط وشفرة جراحية، بالتعقيم لهم قبل القتل الرحيم للماوس.
  3. تجهيز المخازن المؤقتة لعزل ديوان الخدمة المدنية في حالة معقمة وتخزينها في 4 درجات مئوية على الجليد. وتشمل هذه المخازن المؤقتة بوليسوكروسي وحل دياتريزواتي صوديوم تعدل بكثافة 1.077 غ/مل، ناقصة دولبيكو تعديل المتوسطة النسر، 1 x لحم الخنزير متوازنة الحل الملح (هبس)، والخلية الثقافة-الصف 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). إعداد 1% كولاجيناز الثاني أسهم حلاً (التي تمت تصفيتها وتعقيمها) وإيجاد حل عملي 0.2% في حبس.
  4. الحفاظ على هذه المواد زراعة الأنسجة في حالة معقمة في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، بما في ذلك طبق بيتري 10 ملم ولوحة 6-جيدا وصفيحة 24-جيدا، و T-25 و T-75 قوارير الثقافة، أنابيب مخروطية الشكل 15 مل و 50 مل والمتاح الممصات المصلية مع 40 ميكرومتر و 100 --مصافي خلية ميكرومتر مع المرشحات 0.22 ميكرومتر.
  5. تعقيم 10 ميليلتر، 200-ميليلتر، ونصائح ماصة 1,000 ميليلتر من اﻷوتوكﻻف.
  6. استخدام القفازات خالية من مسحوق النتريل والايثانول 70% للحفاظ على شرط عقيمة طوال التجربة.
  7. استخدام التبييض 10% كمطهر.
  8. استخدام ديوان الخدمة المدنية المتاحة تجارياً الصيانة المتوسطة والمتوسطة التمايز كارديوميوسيتيس للثقافة والتفريق بين CSCs، على التوالي.

2-الأسلوب عزل الخلايا الجذعية القلب

  1. Euthanize أربع أو خمس الذكور البالغين (أو الإناث غير الحوامل) الفئران باستخدام دائرة2 CO. إصلاح الأسلحة الماوس كل على الورق المقوى تشريح مستقل مع دبابيس أو الأشرطة اللاصقة.
  2. رش الإيثانول 70% على الماوس للتخلص من الجراثيم خارج والحفاظ على شرط معقمة أثناء الحصاد للقلب. شق بالمقص في منتصف البطن وقطع الجلد من البطن يصل إلى الصدر في خط مستقيم. إزالة الجلد من كلا الجانبين من قطع الأوسط لمسح منطقة البطن من الجلد والشعر. باستخدام مقص وملاقط، قطع الحجاب الحاجز أدناه القفص الصدري.
  3. فتح تجويف الصدر من الماوس بالقص في القفص الصدري داخل غطاء محرك السيارة. كشف القلب وإزالة الدم القرب من القلب. تغسل المنطقة المحيطة للقلب مع برنامج تلفزيوني المثلج للتخلص من أي دم محيط القلب.
  4. تشريح القلب باستخدام المقص الجراحي وملاقط. مكان القلب في طبق بتري 100 ملم التي تحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني المثلج.
  5. بالبيتاتي القلب باستخدام الملقط عرقوب المنحنية وإزالة بقايا الدم داخل القلب.
  6. استخدام القلب كله لعزل CSCs.
  7. نقل جميع قلوب كل أربعة أو خمسة إلى أنبوب 50 مل مخروطية التي تحتوي على 10 مل هبس المثلج. إبقاء الأنبوب على الجليد حتى مزيد من المعالجة.
  8. يمسح داخل وخارج السلامة الأحيائية مجلس الوزراء مع الإيثانول 70% لخلق بيئة معقمة. تعقيم الأنبوب الذي يحتوي على قلب وغيرها من المواد المطلوبة مع الإيثانول 70%. ضع الأنبوبة المحتوية على القلب في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء لمزيد من المعالجة.
  9. نقل القلوب إلى طبق بتري 100 ملم التي تحتوي على 10 مل هبس المثلج. أغسل القلوب مرة أخرى قبل بالباتينج لإزالة أي بقايا الدم داخل القلب. تغيير الحل حبس بعد كل غسل لضمان الإزالة الكاملة للدم.
  10. قطع القلوب إلى قطع صغيرة باستخدام مقص جراحي غرامة أو شفرة جراحية في طبق بتري 100 ملم يحتوي على 5-7 مل من محلول حبس. يعقد كل قلب مع زوج من الملقط واستخدام زوج من مقص غرامة الجراحية أو شفرة جراحية لقطع القلب إلى قطع 2-4 مم. تغيير الحل حبس كثيرا لضمان حبس خالية من الدم. فرم القلوب في حل هبس.
  11. الطرد المركزي الأنسجة مفروم في 500 x g عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية وإبقاء بيليه.
  12. ريسوسبيند بيليه في 5-6 مل من 0.2% كولاجيناز الحل الثاني في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. كولاجيناز الحل ينبغي أن يكون الحجم تقريبا 1.5-إلى 2-إضعاف حجم بيليه.
    ملاحظة: لهضم الأنسجة، 0.2% كولاجيناز أنا والحل ديسباسي U/mL 2.5 يمكن الاستعاضة عن 0.2% كولاجيناز الثاني. استخدام وحدة تخزين متساوية تقريبا لحل ديسباسي كولاجيناز أنا الحل.
  13. مزيج دقيق بيليه مع 0.2% كولاجيناز الحل الثاني بالتحريض الأنبوب أو بواسطة هزاز الأنبوب على شاكر في س 75 ز لمدة 45-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. اهتز الأنبوب بقوة باليد بعد كل 20-30 دقيقة لتعزيز تحلل.
  14. تريتوراتي ميكس تفكيك النسيج باستخدام ماصة مصلية 5 مل وتلميح ماصة 1 مل أن تنأى المقطوع الأنسجة في تعليق خلية واحدة.
    ملاحظة: للحصول على استرداد الحد الأقصى CSCs، تريتوراتي تحلل المزيج لمدة 5 دقائق على الأقل. إذا كانت كتل الأنسجة الكبيرة نسبيا، قص غيض من تلميح ماصة 1 مل مع مقص أو شفرة جراحية واستخدامها تريتوريشن.
  15. إيقاف تحلل الانزيمية الأنسجة بإضافة ديوان الخدمة المدنية المتاحة تجارياً الصيانة المتوسطة. أضف تقريبا 2-3 × قدر متوسط صيانة كحجم الأنسجة ليسيد في الخطوة 2، 14.
  16. يمر بتعليق خلية هضمها مصفاة خلية 100 ميكرون لإزالة أي قطع الأنسجة عسر الهضم.
  17. كرر الخطوة 2.16 استخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
  18. فصل الخلايا عن طريق الكثافة المتدرجة الطرد المركزي. لفصل الخلايا، تراكب بلطف بحجم متساوية فيلتراتي على حل دياتريزواتي بوليسوكروسي والصوديوم. على سبيل المثال، أولاً، إضافة 20 مل حل دياتريزواتي بوليسوكروسي والصوديوم في أنبوب 50 مل مخروطية وثم إضافة 20 مل فيلتراتي من الخطوة 2.17 على الحل دياتريزواتي بوليسوكروسي والصوديوم.
    ملاحظة: بريوارم بوليسوكروسي، ومحلول دياتريزواتي الصوديوم عند 37 درجة مئوية قبل استخدام مع الخلايا. إضافة فيلتراتي من الخطوة 2.17 على الحل دياتريزواتي بوليسوكروسي والصوديوم جداً بعناية وببطء لتجنب أي خلط الحلول اثنين. وهذا يعتبر خطوة حاسمة.
  19. الطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي على كل الحلول في 500 x ز لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام أجهزة الطرد مركزي في دلو سوينغ. تعيين أجهزة الطرد المركزي سرعة التسارع والتباطؤ أقل لتجنب الخلط بين الحلين والفصل السليم بين CSCs. هذا خطوة هامة في معزل عن ديوان الخدمة المدنية. وضع الأنبوب الذي يحتوي على خليط التدرج ببطء شديد دون اضطراب داخل أجهزة الطرد المركزي وإعداده للطرد المركزي.
  20. إخراج معطف بافي جنبا إلى جنب مع حل إضافي من الطبقة العليا باستخدام ماصة 1 مل أو من بلاستيك ماصة باستور في أنبوب معقم 15 مل. ستحتوي هذه الطبقة بافي CSCs.
    ملاحظة: اتخاذ الاحتياطات الإضافية أثناء بيبيتينج معطف بافي لا لإخراج الطبقة الحل دياتريزواتي بوليسوكروسي والصوديوم لأنها سامة ل CSCs.
  21. إضافة وحدة تخزين متساوية من ديوان الخدمة المدنية الصيانة المتوسطة إلى تعليق خلية من الخطوة 2.20 ومزجها بشكل صحيح لتحييد بوليسوكروسي المتبقية والحل دياتريزواتي الصوديوم، إذا كانت موجودة.
  22. الطرد المركزي من تعليق خلية أعلاه في 500 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
  23. ريسوسبيند بيليه في 7-10 مل من غير مكتملة دميم المتوسطة والطرد المركزي أنه في 500 x ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية للتخلص من أي بقايا بوليسوكروسي والحل دياتريزواتي الصوديوم.
  24. جمع بيليه، الذي يحتوي على CSCs المنقي.
  25. ريسوسبيند بيليه في 1 مل من ديوان الخدمة المدنية الصيانة المتوسطة، عد ديوان الخدمة المدنية، واستخدام بيليه للثقافة. لعد CSC، استخدم تلطيخ تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير. مع أربعة ذكور الفئران القلوب، هو عائد CSCs ~1.8 مليون.
  26. المغلفة البذور CSCs في لوحة ثقافة 6-جيدا مع محلول جيلاتين 0.02% يحتوي على 0.5% فيبرونيكتين. استخدام 2 مل متوسطة صيانة كاملة للبذر. احتضان لوحة الثقافة في حاضنة في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
  27. استبدال وسيلة للثقافة CSCs مع ديوان الخدمة المدنية كاملة الصيانة المتوسطة كل يوم حتى اليوم الثالث. بعد ذلك، قم بتغيير المتوسطة الأيام بديل.
  28. تحديد نمو CSCs بمراقبة لهم تحت مجهر.

3-ثقافة الصيانة ومرور القلب من الخلايا الجذعية

  1. الثقافة CSCs معزولة في متوسط صيانة متوفرة تجارياً. استبدال المتوسطة الثقافة المتوسطة صيانة جديدة في أيام بديلة. عندما وصلت الثقافة ديوان الخدمة المدنية كونفلوينسي، نقل CSCs إلى لوحة جديدة مغلفة بالجيلاتين وفيبرونيكتين، كما هو مذكور في الخطوة 2.26. فصل CSCs مثقف بخلية الانزيمية الانفصال من المخزن المؤقت. يتبع البروتوكول القياسي من تفكك خلية من لوحة الثقافة. وفي هذه المرحلة، تعتبر CSCs في المرور 0 (P0) المرحلة.
  2. الثقافة P0 CSCs في الجيلاتين جديد ولوحة فيبرونيكتين المغلفة في ديوان الخدمة المدنية كاملة الصيانة المتوسطة عند 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة، تسمح لهم بأن تكون متموجة، وثم اتبع الخطوة 3.1 للحصول على ممر 1 (P1) CSCs. مخزن P1 CSCs في النتروجين السائل أو استخدامها اكسبيري الإدلاء بالبيانات.
  3. بذور الخلايا 0.5 مليون في لوحة 6-جيدا أو الخلايا 1 مليون في T-25 للحفاظ على ثقافة CSC في مرحلته الأولى.
  4. مرور CSCs عندما تصبح روافد 85% إلى 90%. يمكن أن يكون مثقف CSCs في الأجلين المتوسط وصيانة ما يصل إلى أربعة إلى ستة أسابيع.
    ملاحظة: الاحتفاظ كثافة البذر الأولية CSCs عالية نسبيا (40-50%) لأنه، في أقل كثافة بذر، قد تتغير CSCs بهم مورفولوجيا مسطحة وممدود.

4-وصف للقلب من الخلايا الجذعية

  1. وصف CSCs مثقف، مراقبة لهم تحت بالعاثية-على النقيض أو مجهر الحقل مشرق. ضع اللوحة التي تحتوي على ديوان الخدمة المدنية على الهدف من مجهر فلوري. تعيين منخفضة إلى حد ما التكبير (10 X) للتركيز الخلايا. استخدام الفتحة المرحلة عالي التباين لمراقبة الخلايا. زيادة التكبير إلى 20 X بتغيير العدسة الهدف والصورة CSCs. زيادة الهدف إلى 40 س والصورة CSCs. في اليومين الماضيين، CSCs تظهر جولة تقريبا في الشكل، ولكن حجم هذه الزيادات الخلية مع مرور الوقت، وفي غضون سبعة أيام، تظهر CSCs أسطواني تقريبا في الشكل (الشكل 1A - ج 1).
  2. أداء إيمونوستينينج CSCs مع علامات بلوريبوتينسي/ستيمنيس (OCT4، SOX2، أو نانج)، انتشار (كي-67) (الشكل 2 ألف - 2D)، وخلايا القلب المنشأ/السلف (Sca-1 أو NKX2-5 GATA4) (الشكل 3 ألف - 3 ج).
    1. إيمونوستينينج CSCs، البذور CSCs 10,000 في لوحة ثقافة 24-جيدا.
    2. في اليوم التالي (بعد 18-24 ساعة)، إصلاح CSCs في 300 ميليلتر من بارافورمالدهيد 4% لمدة 10 دقائق.
    3. أغسل CSCs مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني المثلج، x 3 مع فترات 5-دقيقة.
    4. بيرميبيليزي CSCs مع 300 ميليلتر من 0.2% X-100 تريتون المخفف في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق.
    5. أغسل CSCs مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني المثلج، x 3 مع فترات 5-دقيقة.
    6. القيام بحظر CSCs مع 300 ميليلتر من جيش صرب البوسنة 1% المخفف في ببست (برنامج تلفزيوني + 0.1% 20 توين) أو 300 ميليلتر من الدجاج العادي 10% مصل مخفف في ببست ح 1.
    7. احتضان CSCs في 200 ميليلتر من جسم الابتدائي المخفف في عرقلة الحل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تضعف جسم الأولية حسبما أوصت به ورقة البيانات من الأجسام المضادة أو وفقا للتوحيد القياسي.
    8. أغسل CSCs مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني المثلج، x 3 مع فترات 5-دقيقة.
    9. احتضان CSCs في 200 ميليلتر من جسم الثانوي المخفف في عرقلة الحل (راجع الخطوة 4.2.6) ح 1 في درجة حرارة الغرفة. تضعف جسم الثانوي حسبما أوصت به ورقة البيانات من الأجسام المضادة أو وفقا للتوحيد القياسي.
    10. أغسل CSCs مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني المثلج، x 3 مع فترات 5-دقيقة.
    11. كونتيرستين CSCs مع 200 ميليلتر من DAPI المخفف (1 ميكروغرام/مل) في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
    12. أغسل CSCs 1 x مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني المثلج. ثم إضافة 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني المثلج في كل بئر.
    13. إجراء التصوير باستخدام مجهر الأسفار. اتبع تعليمات الفلورسنت التصوير، مثل تجنب الضوء المباشر على اللوحة. تبقى لوحة الثقافة تحت المجهر. وتركز الخلايا في تكبير مختلفة. مراقبة الخلايا ضمن مرحلة التباين و/أو عوامل الإثارة المختلفة وحفظ الصور.
    14. تخزين اللوحة في الظلام في 4 درجات مئوية.

5-التفريق في القلب من الخلايا الجذعية في كارديوميوسيتي

  1. للتفريق بين CSCs، البذور CSCs 500,000 في لوحة 6-جيدا مع 2 مل من ديوان الخدمة المدنية المتاحة تجارياً بريوارم (37 درجة مئوية) الصيانة المتوسطة.
  2. احتضان لوحة تتضمن CSCs في حاضنة2 CO في 37 درجة مئوية. السماح CSCs بإرفاق وتتكاثر حتى النمو دون المتلاقية. إذا كان المتوسط يتحول إلى اللون الأصفر، يستبدل المتوسطة الثقافة المتوسطة صيانة جديدة.
  3. في كونفلوينسي 85% إلى 90%، يحل محل المتوسطة الصيانة مع 2 مل كارديوميوسيتيس بريوارم (37 درجة مئوية) متوسطة التمايز. احتضان اللوحة في حاضنة2 CO في 37 درجة مئوية لتصل إلى 2-3 أسابيع.
  4. تغيير متوسطة التمايز كل دال 2-3 مراقبة مورفولوجيا CSCs تحت مجهر كل مرة أثناء المتوسطة تغيير لضمان شروط ثقافة جيدة.
  5. بعد 12 د الثقافة ديوان الخدمة المدنية في متوسطة التمايز، بروتوكول الصورة CSCs لعلامات التمايز بعد إيمونوستينينج قياسية (انظر الخطوات 4.2.1-4.2.14). حفظ الصور الفلورية للتعبير عن علامات كارديوميوسيتيس (الشكل 4A - 4B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذه الدراسة، ونحن عزل CSCs من 10 إلى 12 أسبوع-عمرها C57BL/6J قلوب الفئران الذكور. هنا، وقد قدمنا طريقة بسيطة لعزل ديوان الخدمة المدنية، وتوصيف استخدام علامات بلوريبوتينسي. كما قدمنا طريقة أنيقة للتمايز CSC وتوصيف CSCs متباينة تجاه النسب كارديوميوسيتيس. لاحظنا مورفولوجية شكل مغزل من 2-إلى 3-يوما-مثقف CSCs تحت مجهر تباين مرحلة (الشكل 1A و 1B). ووجدنا تغييرا في مورفولوجية CSCs في 7 أيام للثقافة في الصيانة المتوسطة، خلال الوقت الذي تصبح الخلايا الجذعية ممدود (الشكل 1). تتميز CSCs لعلامات بلوريبوتينسي، ووجدت أن يعربون عن OCT4، SOX2، ونانج (الشكل 2 ألف - 2 (ج)). كما وجدنا أن CSCs تنتشر في الثقافة المتوسطة، والتعبير عن علامة الانتشار كي-67 (الشكل 2D). لوصف أصل القلب CSCs، عقدنا العزم على التعبير عن علامات القلب Sca-1، NKX2-5، و GATA4 في CSCs. نحن وجدنا تعبيراً عن علامات القلب CSCs المستزرعة (الشكل 3 ألف - 3 ج). لتحديد التفريق بين CSCs تجاه النسب كارديوميوسيتي، نحن مثقف CSCs في متوسطة التمايز كارديوميوسيتي لمدة 12 يوما. وبعد 12 يوما، نحن تصويرها CSCs المتباينة لعلامات كارديوميوسيتي أكتينين وتروبونين أنا. ولاحظنا أن علامات كارديوميوسيتي أبديت في CSCs المتباينة (الشكل 4A - 4B). عموما، هذه النتائج تثبت أننا معزولة بنجاح CSCs من قلب الماوس وأن هذه CSCs يمكن أن تتكاثر والتمييز تجاه النسب كارديوميوسيتيس.

Figure 1
رقم 1: مورفولوجية مثقف CSCs. وتظهر هذه اللوحات تصوير المرحلة--على النقيض من مثقف CSCs، هما الممثل CSCs بعد يومين من استزراع في الصيانة المتوسطة في (A1) 20 X والأهداف (A2) 40 X، CSCs الممثل بعد 3 أيام من استزراع في الصيانة المتوسطة في ( B1) 20 X والأهداف (B2) 40 X CSCs الممثل بعد 7 أيام من استزراع في الصيانة المتوسطة في (C1) 20 X والأهداف (C2) 40 س. هي أشرطة مقياس 100 ميكرومتر لتكبير X 40 و 200 ميكرون لتكبير X 20.

Figure 2
رقم 2: وصف CSCs لعلامات بلوريبوتينسي- إظهار هذه اللوحات تصوير fluorescence الممثل من CSCs مثقف لعلامات بلوريبوتينسي (OCT4، SOX2، ونانج) وانتشار (كي-67). لوحات إظهار تعبيرات OCT4 (الأخضر) و DAPI (الأزرق) في CSCs في (A1) 20 X وتكبير (A2) 40 س. لوحات ب إظهار تعبيرات SOX2 (الأخضر) و DAPI (الأزرق) في CSCs في (B1) 20 X وتكبير (B2) 40 س. لوحات ج إظهار تعبيرات نانج (الأخضر) و DAPI (الأزرق) في CSCs في (C1) 20 X وتكبير (C2) 40 س. لوحات د إظهار تعبيرات لكي-67 (أحمر) و DAPI (الأزرق) في CSCs في (D1) 20 X وتكبير (D2) 40 س. هي أشرطة مقياس 100 ميكرومتر لتكبير X 40 و 200 ميكرون لتكبير X 20. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: وصف CSCs لعلامات القلب. إظهار هذه اللوحات تصوير fluorescence الممثل من CSCs مثقف لعلامات القلب. لوحات إظهار تعبيرات Sca-1 (أحمر) و DAPI (أزرق) في CSCs في (A1) 20 X وتكبير (A2) 40 س. لوحات ب إظهار تعبيرات NKX2-5 (الأخضر) و DAPI (الأزرق) في CSCs في (B1) 20 X وتكبير (B2) 40 س. لوحات ج إظهار تعبيرات GATA4 (أحمر) و DAPI (الأزرق) في CSCs في (C1) 20 X وتكبير (C2) 40 س. هي أشرطة مقياس 100 ميكرومتر لتكبير X 40 و 200 ميكرون لتكبير X 20.

Figure 4
الشكل 4: وصف التمايز CSC تجاه النسب كارديوميوسيتي. هذه اللوحات إظهار الممثل المرحلة-التباين وتصوير الأسفار 12-أيام متباينة CSCs. (أ) هذا الفريق يظهر التعبير عن كارديوميوسيتي علامة أكتينين في CSCs متمايزة، مع () صورة عقد مرحلة، (ب ) صورة fluorescence DAPI (نواة المصبوغة)، (ج) الأسفار صورة أكتينين (الأخضر)، والصورة (د) المدمجة للوحات - ج. تكبير من 40 س. (ب) هذا الفريق يظهر التعبير عن تروبونين العلامة كارديوميوسيتي متباينة في CSCs، مع () صورة عقد مرحلة، والصورة (ب) الأسفار من DAPI (نواة المصبوغة)، (ج) الأسفار صورة تروبونين الأول (الأخضر)، و (د) صورة مدمجة للوحات - ج. تكبير من 40 س. هي أشرطة مقياس 100 ميكرومتر لتكبير X 40 و 200 ميكرون لتكبير X 20. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: التمثيل التخطيطي للخطوات المختلفة لعزل ديوان الخدمة المدنية، والثقافة، والتمايز. كنا قلوب إزالتها جراحيا من أربعة إلى خمسة من الفئران الكبار لعزل CSCs. وترد عملية تدريجية CSC العزلة والثقافة، والتمايز تجاه الأنساب كارديوميوسيتيس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

فيما يلي الخطوات الأساسية لهذا البروتوكول العزلة ديوان الخدمة المدنية. 1) يجب المحافظة على شرط معقمة لاستخراج القلوب من الفئران. وقد خرق أي تلوث أثناء استخراج قلب نوعية CSCs. 2) يجب إزالة الدم تماما قبل تنميق القلب، والتي تتم بواسطة عدة يغسل القلب كله والقلب القطع مع الحل هبس. 3) يجب أن يكون تفكيك القطع القلب تماما في تعليق خلية واحدة مع الحل كولاجيناز. 4) يجب أن يكون بريوارميد بوليسوكروسي والصوديوم دياتريزواتي التدرج الحل للفصل بين الخلايا. 5) يجب أن يكون بريوارميد المتوسط للثقافة ديوان الخدمة المدنية. 6) التقاء CSCs أثناء البذر في صحن ثقافة يجب أن تكون عالية، في كونفلوينسي منخفضة، قد تتغير CSCs التشكل. 7 أن سجل) رقم ديوان الخدمة المدنية بعد العزلة من القلب وقبل الطلاء إلى طبق ثقافة. ويشير عدد CSCs إلى كفاءة العزل من القلب. عد CSCs مهم لبذر CSCs في لوحة الثقافة.

كنا الفئران الكبار لعزل CSCs، التي تم استخدامها من قبل المحققين الآخرين في نماذج القوارض23،28. يمكن أن يكون CSCs معزولة من قلوب القوارض المواليد29،30 وحتى من خزعة قلب الإنسان31. بروتوكولات العزلة CSC المبلغ عنها سابقا ببعض القيود، مثل أقل الغلة، وإجراء عزل معقدة، مدة طويلة للتمايز، وأقل كارديوميوسيتي التمايز المحتمل32،33، 34. البروتوكول العزلة "ديوان الخدمة المدنية" المقدمة هنا بسيط: أنها تستغرق وقتاً أقل وفعالة من حيث التكلفة وأكثر كفاءة في الغلة ديوان الخدمة المدنية. وعلاوة على ذلك، CSCs معزولة هي هيئة الأوراق المالية-1+ ve (علامة مقبولة تماما للماوس CSCs) (1A1 الأرقام - 2 3). للتفريق بين CSCs، البروتوكولات الأخرى بحاجة إلى ثلاثة أو أربعة أسابيع35،36. ومع ذلك، يتطلب هذا البروتوكول 12 يوما (4A الأرقام - 4B). عزل التدرج CSC المستندة إلى استخدام الطرد المركزي المقدمة هنا غلة ~1.8 CSCs مليون من قلوب أربعة ذكور الفئران.

على الرغم من ارتفاع عائد CSCs، حد من هذا البروتوكول هو التوحيد ونقاء CSCs معزولة. لأنه لا يوجد أي علامة مقبولة واحدة ل CSCs، من الصعب استخدام علامة وحيدة الخلية من السطح لتحديد CSCs. ومع ذلك، يمكن استخدامها CSCs معزول بواسطة هذا البروتوكول للحصول على عدد سكانها CSCs استناداً إلى علامة معينة أو عدة علامات CSCs، استخدام الفرز fluorescence تنشيط خلية موحدة. وهكذا، هذا الأسلوب لعزل CSC فعالة من حيث التكلفة مع عائد عالية ولديه الخيار للحصول على عدد سكان CSC موحدة تستند إلى marker(s) سطح الخلية المحددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا العمل تدعمه، في أجزاء، منح "المعاهد الوطنية للصحة" HL-113281 و HL116205 إلى الفقرات كومار ميشرا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice The Jackson laboratory, USA Stock no. 000664
Antibodies:
OCT4- Abcam ab18976 (rabbit polyclonal) OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
SOX2 Abcam ab97959 (rabbit polyclonal) SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Nanog Abcam ab80892 (rabbit polyclonal) Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Ki67 Abcam ab16667 (rabbit polyclonal) Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Sca I Millipore AB4336 (rabbit polyclonal) Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
NKX2-5 Santa Cruz sc-8697 (goat polyclonal) NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
GATA4 Abcam ab84593 (rabbit polyclonal) GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
MEF2C Santa Cruz sc-13268 (goat polyclonal) MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Troponin I Millipore MAB1691 (mouse monoclonal) Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Actinin Millipore MAB1682 (mouse monoclonal) Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
ANP Millipore AB5490 (mouse polyclonal) ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Alex Fluor-488 checken anti-rabbit Life technology Ref no. A21441
Alex Fluor-594 goat anti-rabbit Life technology Ref no. A11012
Alex Fluor-594 rabbit anti-goat Life technology Ref no. A11078
Alex Fluor-488 checken anti-mouse Life technology Ref no. A21200
Alex Fluor-594 checken anti-goat Life technology Ref no. A21468
Name Company Catalog Number Comments
Culture medium:
CSC maintenance medium Millipore SCM101 Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells
cardiomyocytes differentiation medium Millipore SCM102
DMEM Sigma-Aldrich D5546
Name Company Catalog Number Comments
Cell Isolation buffer:
polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) Sigma 10771
HBSS Gibco 2018-03
Collagenase I Sigma C0130
Dispase solution STEMCELL Technologies 7913
PBS LONZA S1226
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermoscientific A1110501
Other reagents:
BSA Sigma A7030
Normal checken serum Vector laboratory S3000
DAPI solution Applichem A100,0010 Dapi, working concentration-1 µg/mL
Trypan blue Biorad 145-0013
Trypsin Sigma T4049
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher Scientific A1110501
Formaldehyde Sigma 158127
Triton X-100 ACROS Cas No. 900-293-1
Tween 20 Fisher Sceintific Lot No. 160170
Ethanol Thermo Scientific
Name Company Catalog Number Comments
Tissue culture materials:
100 mm petri dish Thermo Scientific
6-well plate Thermo Scientific
24-well plate Thermo Scientific
T-25 flask Thermo Scientific
T-75 flask Thermo Scientific
15 ml conical tube Thermo Scientific
50 mL conical tube Thermo Scientific
40 µm cell stainer Fisher Scientific 22363547
100 µm cell stainer Fisher Scientific 22363549
0.22 µm filter Fisher Scientific 09-719C
10 mL syring BD Ref no. 309604
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips Fisher Scientific
5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette Thermo Scientific
Name Company Catalog Number Comments
Instruments
Centrufuge machine Thermo Scientific LEGEND X1R centrifuge
EVOS microscope Life technology
Automated cell counter Biorad
Cell counting slide Biorad 145-0011
Pippte aid Thermo Scientific S1 pipet filler
Name Company Catalog Number Comments
Surgical Instruments:
Surgical scissors Fine Scientific Tool
Fine surgical scissors Fine Scientific Tool
Curve shank forceps Fine Scientific Tool
Surgical blade Fine Scientific Tool

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146 (2017).
  2. Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review. The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).
  3. Emmert, M. Y., et al. Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction - From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model. Biomaterials. 122, 48-62 (2017).
  4. Silvestre, J. S., Menasche, P. The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure. EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).
  5. Terzic, A., Behfar, A. Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency. Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).
  6. Yamada, S., et al. Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy. Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).
  7. Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).
  8. Vrtovec, B., et al. Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up. Circulation Research. 112, 165-173 (2013).
  9. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).
  10. Guijarro, D., et al. Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial. International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).
  11. Bobi, J., et al. Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 6, (2017).
  12. Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease. World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).
  13. Gao, L. R., et al. Intracoronary infusion of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial. BMC Medicine. 13, 162 (2015).
  14. Simpson, D. L., et al. A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts. Circulation. , S46-S53 (2012).
  15. Kazakov, A., et al. C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload. Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).
  16. Ong, S. G., et al. Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer. Circulation. 130, S60-S69 (2014).
  17. Sahoo, S., Losordo, D. W. Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction. Circulation Research. 114, 333-344 (2014).
  18. Zhang, Z., et al. Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair. Journal of the American Heart Association. 5, (2016).
  19. Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy. Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).
  20. Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair. Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).
  21. Menasche, P. Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).
  22. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
  23. Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration. PLoS One. 6, e25265 (2011).
  24. Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. NPJ Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).
  25. Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet? Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).
  26. Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).
  27. Oh, H., Ito, H., Sano, S. Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases. Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).
  28. Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).
  29. Rutering, J., et al. Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).
  30. Saravanakumar, M., Devaraj, H. Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart. Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).
  31. Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circulation Research. 121, 113-124 (2017).
  32. Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles. European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).
  33. Dergilev, K. V., et al. Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs. Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).
  34. Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts. Circulation. 121, 1992-2000 (1992).
  35. Wang, H., et al. Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue. BMC Biotechnology. 14, 75 (2014).
  36. Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).

Tags

علم الأحياء، العدد 143، Sca-1، OCT4، نانج، كي-67، NKX2-5، أكتينين GATA4، تروبونين أنا
عزل وتوصيف والتفريق في القلب من الخلايا الجذعية من قلب الماوس الكبار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yadav, S. K., Mishra, P. K.… More

Yadav, S. K., Mishra, P. K. Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart. J. Vis. Exp. (143), e58448, doi:10.3791/58448 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter