Summary
ICP0 は、HSV-1 感染核-細胞質転流を受けます。このイベントの分子メカニズムは知られていません。ここで我々 は将来解明で ICP0 転座を定量的に解析の基盤 HSV-1 感染の ICP0 運動を定量化するためのツールとしての共焦点顕微鏡の使用をについて説明します。
Abstract
単純ヘルペス ウイルス (HSV-1) の 1 の感染細胞内蛋白質 0 (ICP0) は、リング型 E3 ユビキチンリ ガーゼを含む即時初期タンパク質です。その後ウイルス遺伝子の活性化とホストの制限要因のプロテアソームの責任です。ICP0 には、標準的な核局在化シーケンス (NLS) が含まれています。デノボ合成直後に核に入り、核を中心にその対策の生体防御機能が実行されます。しかし、感染後の ICP0 のみにある細胞質、HSV-1 感染核-細胞質移行が示唆されました。おそらく ICP0 転座により別の感染段階でその細胞レベル下の場所によるとその機能を調節するための ICP0 です。生物学的機能と ICP0 核・細胞質移行の調節機構を示すために、ICP0 は、HSV-1 感染時に人身売買を監視するための蛍光顕微鏡観察法を変更しました。このプロトコルは、免疫蛍光染色、共焦点顕微鏡イメージング、および核と細胞質分布解析を含みます。このプロトコルの目的は、溶菌感染中 ICP0 運動の定量的なドキュメントに時間コースで撮影した定常共焦点画像を適応することです。ライブ イメージング技術を伴うことがなく他のウイルスや細胞の蛋白質の細胞質局在原子力対を定量的に解析するこの方法を一般化できることを提案します。
Introduction
単純ヘルペス ウイルス (HSV-1) の 1 により軽度口唇ヘルペス、性器ヘルペス、間質性角膜炎、脳炎など重症のヘルペス性疾患の広い範囲です。一度感染すると、ウイルスは神経節ニューロンに終生潜伏感染を確立します。時折、ウイルスの場合は、発熱、ストレス、免疫抑制1、再発ヘルペス感染症につながるなど様々 な理由で再アクティブ化できます。感染細胞内蛋白質 0 (ICP0) は、溶解と潜熱の HSV-1 感染の重要なキーのウイルス レギュレータです。それは下流のウイルス遺伝子を介してホスト組み込み/自然の抗ウイルス防御2,3に対抗する transactivates します。ICP0 は、プロテアソーム依存低下3のいくつかの細胞因子を対象とする E3 ユビキチン リガーゼ活性があります。それはまた様々 な細胞経路の活動を規制する、その後ホスト抗ウイルスの制限3を相殺すると対話します。ICP0 は、別の細胞内コンパートメントに感染が進む3,4,5を検索する知られています。タンパク質はリジン/アルギニンが豊富な核ローカリゼーションのシグナル (NLS) 残基 500 に 5066時位置します。初期の HSV-1 感染のde novo合成時に ICP0 すぐに核にインポートされます。それは最初構造と呼ぶ核ドメイン 10 (ND10) 動的核で検出は7。ICP0 ユビキチン E3 リガーゼ活性をトリガー ND10 オーガナイザー タンパク質、前骨髄球性白血病 (PML) 蛋白質およびまだらタンパク質 100 kDa (Sp100)8,9,10の劣化。主催者蛋白質の損失の後 ND10 核ボディに分散され、全体の核4,11に合わせて ICP0 を拡散します。
興味深いことに、ウイルスの DNA 複製の発症後、ICP0 は核から消えます。HSV-1 感染4,12後半核-細胞質移行が示唆された、細胞質にあるのみ。DNA 複製の要件は、HSV-1 ICP04,12の細胞質の転流を促進することで後半ウイルス蛋白の潜在的な関与を意味します。どうやら ICP0 時空ファッションの様々 な携帯電話経路にその相互作用を調節するために権限を与える ICP0 は伝染の間に別のコンパートメントの間で人身売買とその座標罰金に複数機能のバランスを調整溶解と潜在的な HSV-1 感染13。ICP0 多面的と溶菌感染全体の ICP0 の機能ドメインの連携を理解し、私たちは慎重に動的 ICP0 転座12の分子基盤を解剖しました。機構研究以前に報告された12を実施するには、共焦点顕微鏡の下の別の感染状態で ICP0 内局を可視化する蛍光染色法を適用した.我々 はまた分布を分析する核と細胞質 ICP0 の共焦点のソフトウェアを使用して量的なプロトコルを開発しました。感染症の段階で感染した HSV-1 セルの人口を一覧表し、異なる生化学的治療12歳未満、ICP0 運動の動向を分析しました。ここで詳細なプロトコル HSV-1 感染でそのドキュメント ICP0 転座について述べる。ライブ イメージング ライブ イメージングがために該当する場合に代替として使用できる他のウイルスや細胞蛋白質のため核と細胞質移行を検討する一般的な方法としてこの方法を採用できることを提案します。メソッド、信号強度、または蛋白質量のラベル付けなどの問題。
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Protocol
1. 細胞とウイルス感染
- 20-24 h ウイルス感染前に、シード 5 x 10 の4 (HEL) ひと胎児肺線維芽細胞や他の細胞成長培地 (ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 胎児ウシの 4 も 11 mm ずらしてスライドの検討血清 (FBS))。5% 二酸化炭素 (CO2) 37 ° C でセルを孵化させなさい。
注: 各よく必要があります 70-80% のセル confluency 感染症の時に。 - 次の日に成長培地を削除し、4-10 pfu/セルの範囲に媒体 199 のウイルスの細胞に感染します。37 ° C で 1 時間のウイルスに感染した細胞を孵化させなさい潜伏期間中にスライドを揺れ続けてください。
- 1 時間培養後削除中 199 培地で補うので。
注: この手順またはウイルス吸収する前に、フェーズ別の感染を妨げる薬を追加できます。 - 5% CO2感染期間の様々 な長さの 37 ° C でウイルスに感染した細胞を孵化させなさい。
2. 固定・透過
- 適切な感染症時に、すぐに 3 回リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で感染した細胞を洗浄し、200 μ L の PBS で作りたての 4% パラホルムアルデヒドを追加します。各ウェルに、細胞を修正する室温で 8-10 分のパラホルムアルデヒドとセルを孵化させなさい。
- パラホルムアルデヒドを吸引し、3 回 200 μ L の PBS で洗浄します。完全に 3rd洗浄後 PBS を吸い出しなさい。
- 5-10 分のセルを permeabilize 各ウェルに 100 μ L の 0.2% 非イオン性界面活性剤を追加します。
- 非イオン性界面活性剤を吸引し、3 回 200 μ L の PBS で洗浄します。
3. 免疫蛍光染色
- 完全に PBS を吸引各ウェル内のブロック バッファー (1% ウシ血清アルブミン (BSA) および PBS で 5% 馬血清) 200 μ L を追加し、一晩 4 ° C、1 時間室温で孵化させなさい。
- ブロック バッファーで一次抗体 (ウサギ抗 ICP0 抗体12) の実験的決定の濃度を追加し、4 ° C、2 時間室温で一次抗体を一晩インキュベートします。
- 10 分間インキュベーションで 3 回ブロック バッファーで洗浄します。Alexa 594 共役ヤギ抗うさぎ二次抗体 (ブロック バッファーで希釈 1: 400) を追加し、スライドに 1 時間室温で孵化させなさい。10 分間隔でスライド ブロック バッファーで 3 回洗います。
- 残留 BSA と馬の血清を削除する PBS で一度スライドを最後に洗います。
- 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) スライドをマウントし、透明なマニキュアを使用して coverslip のシールでメディアを antifade マウントの 1 滴を追加します。
4. 共焦点レーザー顕微鏡
- 共焦点顕微鏡を用いた DAPI の Alexa 594 と 410-520 nm の 590-650 nm の範囲で波長を設定します。1024 x 1024 の画像形式と高解像度の画像を取得する 8 行平均を選択します。
- 共焦点顕微鏡の下で 4 もスライドの各ウェルを分析します。図 1および図 2に示すように 100 X 目的として代表的な細胞像を取得します。
- 多数のセルをカウントするため、40 X 目的の下の連続したフィールドの画像を取る。
注: 各感染症の各時点から 200 以上の感染した細胞を蓄積する 5-10 の画像が必要です。 - 各実験で比較するすべてのサンプルの必要性のための定数の共焦点パラメーターで写真を撮る。
5. 核と細胞質分布を解析
- 共焦点アプリケーション ソフトウェアでプロジェクトを開く。細胞が ICP0 の核と細胞質分布を集計する必要がありますイメージを選択します。
- トップ メニューから「量」をクリックし、、ツール メニューから「ソート ・ ロワ」を選択します。
- トップ メニューから「線を描画」を選択分析するの縦線を描画します。
注: ICP0、DAPI の線に沿って蛍光強度を示すヒストグラムが表示されます。ヒストグラムに青い線が DAPI ピクセルを表し、赤い線が ICP0 ピクセルを表すに対し、核の境界をマークします。 -
背景の汚損を基に、各実験における ICP0 の細胞内分布を解析する ICP0 強度定数のしきい値を設定します。
- において例示するとおり図 2、赤い信号の平均場合は核領域のしきい値を下回るが、青の境界を越えてしきい値を超えている、主に細胞質内に位置する、赤い信号を分類します。
- 赤い信号が核の内外青い信号の境界のしきい値を超える場合、核と細胞質局在赤信号をグループ化します。
- 赤い信号が核のしきい値を超えている、平均で青い信号の境界の外側の下にある場合、核局在化として赤い信号をグループ化します。
- 別の感染時と時間 (図 3) によると ICP0 の動きを説明するために棒グラフでプロットで各サンプルから 200 以上の感染した細胞を集計します。
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Representative Results
分子基盤と ICP0 は、HSV-1 感染時に人身売買の生物学的機能を理解するには、蛍光顕微鏡観察メソッドを使用して別の感染段階で ICP0 の細胞内分布を解析します。図 1は、感染症が進行するにつれて特徴的な ICP0 ローカリゼーションと代表的な細胞を示しています。ICP0 の核-細胞質の転流を定量化する感染細胞を 3 つのグループに分類することによって核の相対的な ICP0 分布を分析: 核局在化、細胞質局在化、核と細胞質局在 (図 2)。ICP0 は伝染の間に人身売買に必要な要素を理解するには、私たちは別の感染段階で野生型の HSV-1 突然変異体 ICP0 の動きを追跡します。ICP0 の細胞内分布感染の異なる時点での集計結果の例を図 3に示します。
図 1: HSV 1 伝染の間に ICP0 の動的な人身売買します。4 よくスライドに育つ HEL セルが 10 pfu/セルでプロトタイプ HSV-1 (F 系) に感染していた。1、5、9 h の記事感染 (hpi) で細胞固定、グリセリン、ウサギ抗 ICP0 とマウス抗 PML 一次抗体に反応して、Alexa 594 共役抗家兎とアレクサ 488 24ptc-4 電界抗マウス二次抗体の反応未満 100 X 目標をイメージングします。前骨髄球性白血病 (PML) 蛋白質は感染の PML 劣化のための 5 と 9 の hpi で消えて ND10 核体のマーカー蛋白質として機能します。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ICP0 の細胞内分布の解析。左側のパネル: 共焦点顕微鏡を用いた代表的な細胞が利益 (率 ROI) の領域を定義するセルに描画される縦の線を表示する拡大されました。右側のパネル: ROI の蛍光輝度が ICP0 と個々 の細胞における DAPI の定量化し、共焦点アプリケーション ソフトウェアによってヒストグラムとして示されています。任意のしきい値 (グリーン ライン) は、染色の背景を反映するように設定されました。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 野生型の細胞内分布の割合と C 末端 ICP0 を切り捨てられます。ヘル セルは野生型 ICP0 を含む組換えウイルスに感染した (ICP0 WT) または C 末端切り捨て ICP0 (ICP0 C 切り捨て) 4 pfu/携帯で。指定された時点で細胞染色, 上記のように分析.ICP0 場所の表セルは 200 個以上。スプレッドシート計算ソフトウェアを含む核、細胞質、細胞または細胞質核 + ICP0 の割合をプロットしました。これは、このメソッドを使用して、我々 として識別されている C 末端 ICP0 ICP0 核-細胞質移行に必要なドメインを表示する模範的な実験です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、HSV-1 ICP0 の核-細胞質の転流を研究に使用されています。ICP0 は、HSV-1 感染 (図 1) の細胞内輸送を受けます。おそらく、ICP0 は別の場所で異なる機能を実行する各種の細胞経路と対話します。これにより、人間のホスト13と綱引きの複数機能を微調整する ICP0。しかし、ICP0 が時空の方法で複数の機能を調整する方法はよく研究されていません。上記蛍光顕微鏡のプロトコルと ICP0 核・細胞質移行の分子基盤の解析を始めました。今では、我々 は ICP0 の C 末端を識別したこの転置のために重要な必須の要素として 35 アミノ酸。C 末端がない場合は、ICP0 は感染症 (図 3) 核内で拘束されました。また、発見した、ICP0 E3 リガーゼ依存核保持力遅延、核-に-細胞質移行 U2OS セル12。さらに、我々 は ICP0 C 末端と後半のウイルス蛋白質の表現を核の保持を克服し、細胞質移行12を容易にするために協力していくことを発見しました。現在、ICP0 核-細胞質転流に関与する後半のウイルス蛋白質のための画面にこのプロトコルを用いています。
プロトコルは、HSV-1 感染症の ICP0 の動的な人身売買を研究に当初開発されました。HSV-1 感染の初期に図 1に示すように、ICP0 は ND10、携帯電話の制限要因のいくつかのキー部品、ND10 PML と Sp1008などが分解されると結果です。ND10 キー成分を分解後、ICP0 拡散、核全体および後期の感染症、ICP0 は細胞質へ移行します。ICP0 を受ける感染時のde novo合成、ので最初の蛋白質 abundancy は非常に低いと堅牢なウイルス合成が困難使用して単一分子を追跡する任意の個々 の分子の運動があいまいされますすぐに、ライブ イメージング技術。したがって、我々 は意図的にライブ イメージングを使うことにしました。代わりに、我々 は別の感染ポイントは、HSV-1 感染細胞の人口の ICP0 の時間的な動きを追跡でよく役立った定常 ICP0 ローカリゼーションを調査する上記議定書を採択しました。
共焦点における高信号-バック グラウンド比の 2 つの重要な手順がこのプロトコルのウェット ベンチ部分で注目に値する。まず、4 も千鳥スライド 1 つ 1 つのスライドで処理に複数のサンプルを許可します。それは大きくウイルスと抗体のような貴重な試薬の使用量を節約できます。ただし、各ウェルで開催されたボリュームが小さすぎて、ため後続の試薬に残留バッファー バッファーの変更時にオフにすると完全には干渉することができます。したがって、バッファーの各スイッチには、新しいバッファーを追加する前に徹底的な吸引が必要です。第二に、我々 の経験に基づいて、セル架橋と膜の透磁率の範囲は、蛍光信号の明瞭さのため重要です。我々 は、パラホルムアルデヒドのノニオン界面活性剤トリートメント 10 分の実証番号を設定しています。当時大いにより長いまたは短い 10 分は背景に信号の比率を減らすことができるよりもを発見しました。以前研究12図 1と図 2で示すように、我々 の実験で得られた画像はクリスタル クリア。核の境界を明確に示す顕著な青の信号は、ICP0 の細胞内分布を決定する鍵です。このプロトコルの計算の部分で 1 つの重要なステップはバック グラウンドを除去するために一定のしきい値を設定します。高のシグナル/バック グラウンド比の成功した染色は低いしきい値を表す線とコントラスト、信号にキーです。ICP0 の定量的なマニュアルのための基盤は、同じ実験では、ただし、すべてのサンプルの一定のしきい値を維持する (図 2および図 3)。
プロトコルは、適したライブ イメージング法が欠けているとき、他のウイルスや細胞の蛋白質の細胞内輸送を研究する一般的なツールとしても使用できます。ライブ イメージング技術、細胞に細胞代謝状態14,15を維持するために最適な生理学的環境で保持されます。生きているセルイメージ投射のための基本的な要件は蛍光タグ16ターゲット蛋白質の融合によって達成することができます、ターゲット蛋白質の蛍光ラベル、または、fluorophore を提供する共役分子標的タンパク質17 の特定.いずれにしても、蛍光タグ融合ターゲット蛋白質プロパティの変更や、fluorophore 共役分子は細胞膜を交差させる難しさの問題が上がるかもしれません。フォトブリーチング プロセスの細胞損傷を引き起こす、ライブ イメージング18追加問題です。したがって、ライブ イメージングの制限を克服する新たな戦略は、技術開発のフロンティアであり続けます。我々 はここで説明されたプロトコルは適切なライブ イメージング法が使用できない場合に代替ツールとして役立つことができる定常共焦点画像の時系列解析を提供します。方法は、簡単で信頼性の高いです。それは、最小の背景を持つタンパク質細胞内局在の明確な検出を提供します。定量的セル人口のターゲット蛋白質の異なる分布を持つ細胞の割合を分析し、別の細胞の段階でターゲット蛋白質の動きを文書化することができる共焦点ソフトウェアを使用しております。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
海東区受賞 NIH グラント (RO1AI118992) からの財政支援に感謝いたします。テクニカル サポートのウェイン州立大学で顕微鏡、イメージング ・ フローサイトメトリー リソース (MICR) コア施設に感謝いたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells and viruses | |||
| Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) | Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) | HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS | |
| HSV-1 viral Stock (Strain F) | Dr. Bernard Roizman Lab | ||
| Medium | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
| Medium-199 (10x) | Gibco | 11825-015 | |
| Reagents | |||
| 4- well 11 mm staggered slide | Cel-Line/Thermofisher Scientific | 30-149H-BLACK | |
| 16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Fisher reagents | BP151-1C0 | |
| Bovine Serum Abumin (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| NaCl | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagent | BP362-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
| Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| Rabiit Anti-ICP0 antibody | Dr. Haidong Gu lab | ||
| PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG | santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
| Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG | invitrogen | A11012 | |
| Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG | invitrogen | A11001 | |
| Vectashield Mouting medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Pasteur pipette | Fisher Brand | 13-678-20D | |
| Nail Polish | Sally Hansen | ||
| Equipment | |||
| Confocal Microscope | Leica SP8 | ||
| Confocal Software | Leica LAS X Application suite | ||
| Excel software | Microsoft Excel | ||
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | Order code 51026282 |
References
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