Summary

Valutazione dell'interazione tra la proteina di complemento C1q e l'acido chialuronico nella promozione dell'adesione cellulare

Published: June 15, 2019
doi:

Summary

Il componente complementare C1q è una molecola pro-infiammatoria altamente espressa nel microambiente tissutale che può interagire con la matrice extracellulare. Qui, descriviamo un metodo per testare come C1q legato all’acido ialuronico influisce sull’adesione cellulare.

Abstract

È stato sempre più dimostrato che il microambiente tumorale svolge un ruolo attivo nella crescita della neoplasia e nella metastasi. Attraverso diversi percorsi, le cellule tumorali possono reclutare in modo efficiente le cellule stromali, immunitarie ed endoteliali secernendo fattori stimolatori, chemiochine e citochine. A loro volta, queste cellule possono alterare le proprietà di segnalazione del microambiente rilasciando segnali di promozione della crescita, metaboliti e componenti di matrice extracellulare per sostenere l’elevata proliferazione e la competenza metastatica. In questo contesto, identifichiamo che il componente complementare C1q, altamente espresso localmente da una serie di tumori maligni umani, interagendo con l’acido ialuronico della matrice extracellulare, influenza fortemente il comportamento delle cellule primarie isolate dal tumore umano Esemplari. Qui, descriviamo un metodo per testare come C1q legato all’acido ialuronico (HA) influisce sull’adesione delle cellule tumorali, il cui fatto è il fatto che le proprietà biologiche dei componenti chiave della matrice extracellulare (in questo caso ha) possono essere modellate da segnali bioattivi verso il tumore progresso.

Introduction

Il microambiente tumorale (TME) influenza lo sviluppo e la progressione del cancro poiché può fornire una nicchia permissiva per la sopravvivenza cellulare, la crescita e l’invasione. L’identificazione di nuovi attori chiave nel TME può essere utile per la scoperta di nuovi strumenti molecolari per la terapia mirata. Il TME comprende una rete complessa e dinamica di cellule non maligne, come cellule endoteliali, fibroblaste e cellule del sistema immunitario, incorporate nei componenti della matrice extracellulare circostante (ECM), tra cui collageni, laminoin, fibronectine, proteoglicani e ialuronani. Sia le cellule tumorali che non tumorali sintetizzano e secernonno componenti ECM insieme a citochine, chemiochine, fattori di crescita ed enzimi di rimodellamento infiammatorio e a matrice che nel complesso alterano le proprietà fisiche, chimiche e di segnalazione di TME. Tra questi costituenti, l’acido ialuronico (HA) è emerso per esercitare un ruolo cruciale nella biologia del tumore. Nonostante la sua semplice composizione chimica, HA, insieme alle sue molecole leganti HA (ialadherine), può modulare l’angiogenesi, la reattività del sistema immunitario e il rimodellamento ECM in modo di dimensioni e concentrazionedipendente 1.

Il sistema di complemento a complemento (C) fa anche parte del TME locale, che ha recentemente ricevuto una crescente attenzione. Il sistema C comprende una serie di proteine solubili e legate alla membrana coinvolte nella prima linea di difesa contro non autocellule, elementi ospiti indesiderati e agenti patogeni. Funzionalmente, la C collega i bracci a due etsuori dei sistemi innati e adattativi per promuovere l’uccisione diretta delle cellule o il montaggio di una risposta infiammatoria2. L’attivazione del tumore può sopprimere la crescita del tumore, distruggendo le cellule tumorali o inibendo la loro escrescenza, ma è diventato sempre più chiaro che può possedere un’attività di promozione del tumore sostenendo l’infiammazione cronica, promuovendo l’istituzione di un milieu immunosoppressivo, inducendo l’angiogenesi e attivando le vie di segnalazione legate al cancro3. In questo contesto, C1q, la prima molecola di riconoscimento del percorso classico del sistema C è emersa per esercitare importanti funzioni nel microambiente tumorale indipendentemente dall’attivazione C4. C1q è stato dimostrato di essere espresso localmente da una serie di tumori maligni umani, dove può favorire l’adesione delle cellule tumorali, la migrazione e la proliferazione oltre all’angiogenesi e metastasi5. È interessante notare che C1q interagisce con un importante costituente dell’ECM come l’HA.

Abbiamo sviluppato una tecnica per isolare le cellule tumorali primarie dalla massa tumorale. Inoltre, abbiamo creato la matrice, che può stimolare il microambiente tumorale, in particolare l’interazione tra C1q e acido ialuronico ad alto peso molecolare. C1q legato all’HA è stato in grado di indurre l’adesione delle cellule tumorali.

Protocol

Campioni di tessuti da pazienti sono stati raccolti dopo il consenso informato dopo l’approvazione delle considerazioni etiche da parte del Consiglio Istituzionale dell’Ospedale Universitario di Trieste, Italia. 1. Isolamento e coltura delle cellule tumorali (giorno 1) Isolare le cellule del mesotelioma umano da campioni solidi MPM. Tritare finemente il tessuto con una fresa per ottenere frammenti di circa 2-3 mm2 di dimensioni e incubare in 5 mL di soluzione di digestione…

Representative Results

L’HA è un polisaccago ad alto peso molecolare caricato negativamente, costituito da unità ripetute (1-4)-D-glucuronic acid-((1-3)-N-acetyl-D-glucosamine disaccharide units (1B)7. Il verificarsi del legame di HA sulla piastra 96-well così come l’efficienza della sua immobilizzazione sono stati testati sfruttando ha biotinylated (bio-HA). Diverse concentrazioni di Bio-HA, che vanno da 10 g/mL a 1 mg/mL, sono state ri-sospese in 100 mM…

Discussion

Descriviamo un metodo semplice per studiare come il componente complementare C1q, interagendo con l’acido ialuronico, è in grado di modulare il comportamento delle cellule primarie isolate dai tessuti tumorali umani. Sia l’HA che il C1q sono abbondantemente presenti nel microambiente tissutale sia in condizioni fisiologiche che patologiche, partecipando a diversi processi biologici cellulari. Per esempio, C1q ha dimostrato di essere presente nel microambiente della placenta dove favorisce l’invasione extravillous tropob…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Ivan Donati per aver fornito ha, Leonardo Amadio, Gabriella ‘ito (Dipartimento di Ginecologia di IRCCS “Burlo Garofolo”, Trieste, Italia) e Andrea Romano (Unità Operativa Clinica di Anatomia e Istologia Patologica, Ospedale Cattinara, Trieste, Italia ) per la raccolta dei campioni di tessuto. Ringraziamo anche Nicolò Morosini per l’aiuto nella preparazione video e Alex Coppola, la voce. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni dell’Istituto per la salute materna e infantile, IRCCS “Burlo Garofolo”, Trieste, Italia (RC20/16) e della Fondazione Cassa di Risparmio Trieste a R.Bulla.

Materials

100 µm pore filter BD Falcon 352360
Amphotericin B solution (fungizone) Sigma-Aldrich  1397-89-3
basic FGF Immunological Sciences GRF-15595
Calcium Chloride Sigma-Aldrich  C-4901
Collagenase type I Worthington Biochemical Corporation, DBA MX1D12644
D-Glucose Sigma-Aldrich  50-99-7
DNase I  Roche 10 104 159 001
EDTA Sigma-Aldrich  60-00-4
EGF Immunological Sciences GRF-10544
FAST DiI Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific D7756
Fetal bovine serum Gibco,  Thermo Fisher Scientific 10270-106
Fibronectin Roche 11051407001
Flask for cell culture Corning 430639 Sterile, vented
Gentamicin solution Sigma-Aldrich  G1397-10ML
Hank’s Balanced Salt Solution (HBBS)  Sigma-Aldrich  H6648 Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone
High molecular weight hyaluronic acid Kind gift by Prof. Ivan Donati
Human endothelial serum free medium  Gibco,  Thermo Fisher Scientific 11111-044 Supplemented with EGF (5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), and  1% penicillin–streptomycin (Sigma-Aldrich)
Magnesium Chloride Carlo Erba 13446-18-9
Medium 199 with Hank’s salt Sigma-Aldrich  M7653
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich  P0781
Time-lapse microscopy  Nikon  Imaging System BioStation IM-Q
Titertek Multiskan ELISA Reader Flow Labs
Trypsin Sigma-Aldrich  T4674

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Vidergar, R., Agostinis, C., Zacchi, P., Mangogna, A., Bossi, F., Zanconati, F., Confalonieri, M., Ricci, G., Bulla, R. Evaluation of the Interplay Between the Complement Protein C1q and Hyaluronic Acid in Promoting Cell Adhesion. J. Vis. Exp. (148), e58688, doi:10.3791/58688 (2019).

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