Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Flash NanoPrecipitation för inkapsling av hydrofoba och hydrofil föreningar i polymera nanopartiklar

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58757
Automatic Translation
, , , ,
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University

Summary

Flash NanoPrecipitation (FNP) är en skalbar metod att producera polymera core-shell nanopartiklar. Lab-skala formuleringar för inkapsling av hydrofoba eller hydrofila therapeutics beskrivs.

Abstract

Utformningen av en terapeutisk förening till nanopartiklar (NPs) kan ge unika egenskaper. För dåligt vattenlösligt läkemedel, kan NP formuleringar förbättra biotillgänglighet och ändra narkotika distribution i kroppen. För hydrofil droger som peptider eller proteiner, kan inkapsling inom NPs också ge skydd från naturliga clearance mekanismer. Det finns några tekniker för produktion av Polymera NPs som är skalbar. Flash NanoPrecipitation (FNP) är en process som använder konstruerad blandande geometrier för att producera NPs med smala storlek distributioner och avstämbara storlekar mellan 30 och 400 nm. Detta protokoll ger instruktioner på laboratorieskala produktionen av core-shell polymera nanopartiklar av en Målstorlek som använder FNP. Protokollet kan genomföras för att kapsla in antingen hydrofil eller hydrofoba föreningar med endast smärre ändringar. Tekniken kan användas lätt i laboratorium vid milligram skala till skärmen formuleringar. Bly träffar kan direkt skalas upp till gram och kilo-skala. Som en kontinuerlig process innebär skala upp längre blandning processen körs tid snarare än översättning till nya Processkärl. NPs produceras av FNP är mycket laddade med terapeutiska, har en tät stabiliserande polymeren borste, och en storlek reproducerbarhet ± 6%.

Introduction

Sedan slutet av 1990, har det varit en stadig ökning av antalet kliniska prövningar som sysselsätter nanomaterial1,2. Det stigande intresset återspeglar löftet om nanomaterial att förbättra biotillgängligheten av hydrofoba droger och möjliggöra förmånsbehandling inriktning inom kropp3. Polymera nanopartiklar (kallas nanopartiklar eller NPs här) utgör en växande andel av denna klass av material2. NPs har rönt intresse eftersom de har mycket avstämbara egenskaper som storlek, sammansättning och ytan funktionalisering4. När tillämpas på förvaltningen av svårlösliga läkemedel, har NPs ofta en kärna-shell struktur där de terapeutiska är inkapslade i hydrofoba kärnan och skalet består av en hydrofil polymer borste. Ett enkelt sätt att generera denna struktur sysselsätter en amfifila diblock sampolymer (BCP) bestående av nedbrytbar hydrofobisk block, som utgör del av partikel kärnan, och en hydrofil poly(ethylene glycol) (PEG) blockera, som bildar den polymer borsten och förmedlar sterisk stabilisering4,5.

Nanoprecipitation är en vanlig fabrication teknik för polymera nanopartiklar eftersom det är enkelt och inte energi intensiv6. I sin enklaste form innebär nanoprecipitation tillägg med pipett NP komponenter i ett organiskt lösningsmedel som aceton till en överskottet rörs vatten. Spädningsvätska till en utspädd vattenlösning förändringen resulterar i utfällning av olösliga huvudkomponenten. Stabilisatorn monterar på denna växande partikel yta, regisserad av adsorption av kollapsade hydrofoba block7,8,9,10. En enhetlig partikelstorleksfördelning erhålls när den lösningsmedel och vatten snabbt blanda för att bilda en homogen lösning. Blandning som är långsammare än kärnbildning och montering av komponenter resulterar i en större, mer polydisperse partikel befolkningen. Men lätt åtkomliga för ett enkelt test, metoden rörs batch resulterar i bred variation på grund av blandning inkonsekvens och är inte mottagliga för skala upp6,11. Mikrofluidik har dykt upp som en annan avenue till NP produktion som kan köras kontinuerligt. Detta produktionsmedel har nyligen granskats av Ding o.a. 11 . En gemensam strategi använder laminärt flöde med fokus för att minska skalan lösningsmedel längd till sub micron värden. Blandning av antisolvent sker genom diffusion, så litet flöde dimensioner är avgörande för att säkerställa enhetliga partiklar11,12. Parallelization av flera mikroflödessystem kammare för skala upp är problematiskt för stora tillverkningsvolymer.

De snabba blandning villkor som gynnar enhetliga nanoprecipitation i mikrofluidik kan växelvis produceras i trånga, turbulenta flöden. Flash NanoPrecipitation (FNP) sysselsätter speciella blandning geometrier att uppnå dessa villkor högre volymetrisk flöden än möjligt med mikrofluidik. Inlopp strömmar ange en blandningskammare under turbulenta förhållanden som leder till generation av virvlar, så att vätska/anti-solvent lamellerna bildar på längd skala av diffusion11,13. Således, enhetlig blandning på en tidsskala som är kortare än kärnbildning och tillväxt av den terapeutiska uppnås. Mixern trånga geometri tillåter inte strömma förbi i regionen där turbulenta energiupptagning uppstår och hela systemet upplever samma process historia13. Kärnbildning uppstår enhetligt i blandningskammare och partikel tillväxt fortsätter tills stoppades av montering av BCP-reglerna på den ytan9,14. Den blandad ström som innehåller stabila partiklar kan sedan spädas med ytterligare antisolvent att undertrycka Ostwald mognad av partiklar15,16,17.

En mixer med trånga impinging i jet (CIJ) är den enklaste mixer designen för FNP och tillåter blandning av två strömmar i en skalbar och kontinuerlig mode, som visas i figur 1A13. En multi inlopp vortex mixer (MIVM) utvecklades för att aktivera upp till fyra olika stream ingångar samtidigt fortfarande uppnå den snabba micromixing som krävs för enhetlig partikelbildning, som visas i figur 1B18. FNP möjliggör enkel formulering screening som lätt kan översättas till kommersiell skala produktion. Kontinuerlig pågrund av processen kräver större batchstorlekar inte nya fartyg men snarare längre körtider, möjliggör enkel översättning till kilogram produktion i samma utrustning tåget.

Hydrofil föreningar såsom peptider och proteiner ('biologics') kan också vara inkapslade i en process kallas inversen Flash NanoPrecipitation (iFNP). Tekniken kräver en amfifila BCP där ett kvarter är hydrofoba och den andra är en polyacid19. Det första steget innebär snabb blandning av en dimetyl sulfoxid (DMSO) dataström med den biologiska och BCP mot lipofilt lösningsmedel såsom diklormetan eller kloroform. Detta resulterar i bildandet av partiklar stabiliserad med hydrofoba block borsten. Här, benämns sådan arkitektur en 'omvända' NP. Kärnan innehåller den polyacid, som sedan ionically tvärbunden med en multivalenta cation. Detta stabiliserar partiklarna för bearbetning till en vattenlösning miljö i form av mikropartiklar eller PEG-belagd nanopartiklar av tekniker som har rapporterats i litteraturen19,20,21.

Detta protokoll kan användas för lab-skala produktion av Polymera core-shell nanopartiklar encapsulating antingen hydrofoba eller hydrofila föreningar. Underavsnitten i protokollet ge instruktioner om användningen av båda mixer klasser - den (CIJ) och MIVM. Läsaren bör kunna anpassa protokollet för romanen kärnkomponenter och reproducibly generera nanopartiklar av önskad storlek med hjälp av lämpliga mixern för stream ingångar. Tre exempel formuleringar använder FNP och iFNP presenteras nedan. Två sysselsätter CIJ mixern och en kräver MIVM15,22. Den första formuleringen visar inkapsling av en modell hydrofoba sammansatta av FNP. Den andra formuleringen visar inkapsling av en modell hydrofil förening av iFNP i en CIJ mixer. Den slutliga formuleringen ger ett exempel på protein inkapsling av iFNP med en MIVM. Protokollet för denna tredje formulering beskriver användningen av en småskalig, handhållna MIVM kallas den 'μMIVM'. Mixer design är mindre att möjliggöra förenklade formulering screening, men beteendet skalning är väl förstådda och mixern är inte en mikroflödessystem enhet22. Den sista delen av protokollet innehåller några anteckningar om uppskalning av bly formuleringar identifieras i screening. Dessa formuleringar är avsedda att ge åtkomstpunkter för lärande processen och följaktligen använda icke-nedbrytbara poly (styren)-baserade polymerer. Alternativa stabilisatorer har beskrivits i litteraturen, med ett antal biokompatibla kommersiella alternativen tillgängliga14,23,24.

Protocol

1. inkapsling av hydrofoba föreningar i polymera NPs använder en CIJ Mixer

  1. Förbered och rengör utrustning.
    1. Upphandla och validera en CIJ mixer.
      Obs: Se Tilläggsinformation avsnitt 1 för konstruktion vägledning. CAD-filer finns också som Kompletterande Information .
    2. Före varje användning, säkerställa att alla beslag på CIJ mixern är ombonad och utlopp slangen inte är böjd eller klämd.
    3. I ett dragskåp, bifoga en 5 mL luer lås spruta innehållande 2-3 mL spädningsvätska till varje inlopp adapter. Välj ett lösningsmedel (t.ex., aceton) som kommer att rensa alla föreningar nyligen i mixern.
      Obs: Typiska val är aceton eller tetrahydrofuran (THF). Endast användning av polypropen sprutor att undvika lösningsmedel kompatibilitetsproblem såsom urlakning. Använd inte sprutor med gummi O-ring tätning kolvar.
    4. Ange sammansättningen (CIJ) över en avfallsbehållare.
      Obs: En kolv med en öppning som är mindre än CIJ kroppen fungerar bra som detta stöder mixern och tillåter enkel användning av sprutor.
    5. Stadigt tryck spruta kolvarna för att tömma innehållet genom blandningskammaren över några sekunder. Ta bort sprutor.
      Obs: Sprutor kan behållas och återanvändas i flera omgångar av rengöring mellan FNP körningar.
    6. Torr (CIJ) mixer interna använder en N2 ström. En manlig luer-adapter på slutet av en N2 line är effektiv.
      Obs: Om rengöring lösningsmedlet inte är flyktiga (t.ex. DMSO), upprepa steg 1.1.3-1.1.5 med aceton eller THF innan du fortsätter till steg 1.1.6. Det är viktigt att ta bort kvarvarande vätska för kör-och-kör konsekvens.
  2. Förbereda lösningsmedel och antisolvent strömmar på target kompositioner.
    1. Lös den hydrofoba föreningen (dvs., E-vitamin) i ostabiliserad THF på 10 mg/mL i tillräcklig mängd att slutföra önskat antal FNP körningar. Förbereda något mer än behövs per körning.
      Obs: Andra lösningsmedel kan användas i stegen, förbehåll för begränsningarna i diskussionsavsnittet. Om de anställer THF, rekommenderas stabilisator-fri vätska eftersom butylhydroxitoluen har låg vattenlöslighet. Använd försiktighet att undvika peroxid uppbyggnad (inklusive peroxid testing) och vara medveten om att låga nivåer av peroxider kan störa vissa NP applikationer (t.ex. blekning av färgämnen).
    2. Blanda vitamin E lösningen på en vortex mixer tills upplöst.
      Obs: För vissa föreningar, bad ultraljudsbehandling för 1-2 min får bistå genererar en upplöst lösning. Det är viktigt att alla NP komponenter löses molekylärt.
    3. Lös upp block sampolymer stabilisatorn (dvs.poly(styrene) -b- poly(ethylene glycol), PS1.6 k-b-PEG5 k) i THF på 10 mg/mL vid ungefär samma volym som i steg 1.2.1 bildar den polymer lösningen.
      Obs: Andra lösningsmedel kan användas, med de begränsningar som beskrivs i avsnittet diskussion.
    4. Blanda polymer lösningen med en vortex mixer tills upplöst. Vid behov, placera lösningen i ett ultraljudsbehandling bad för 1-2 min till stöd i fasta upplösning.
      Obs: Polymeren kan inte vara i en micellar form. Dynamiska ljusspridning (DLS) kan vara ett användbart verktyg för att avgöra om en ny ström sammansättning uppfyller detta kriterium.
    5. Skapa lösningsmedel indataströmmen innehållande 5 mg/mL av både E-vitamin och stabilisatorn (50% E-vitamin lastning) första pipettering 0,25 mL vitamin E-lösning i en 1,5 mL centrifugrör. Sedan Pipettera 0,25 mL av polymer lösningen i samma rör.
      Obs: Volymer större än 0,5 mL per körning är genomförbara med olika spruta storlekar. Ovanför 10 mL volym är det praktiskt att använda en sprutpump.
    6. Blanda väl på en vortex mixer för 5-10 s. Alternativt, Centrifugera röret vid 1000 x g i 5-10 s återställa någon vätska som fastnat på den gemensamma jordbrukspolitiken, vilket förbättrar reproducerbarhet mellan CIJ körningar.
    7. Pipettera 0,525 mL avjoniserat vatten i ett andra 1,5 mL centrifugrör som den antisolvent strömmen.
      Obs: Det är bättre att ha överskott antisolvent, vilket säkerställer att lösningsmedel strömmen aldrig träder blandningskammaren utan antisolvent närvarande. I vissa fall där salt löslighet i lösningsmedel/antisolvent blandningen inte är begränsande, kan buffrat vattenlösning system användas.
    8. Pipettera 4 mL avjoniserat vatten i ett 20 mL injektionsflaska av scintillation eller annan lämplig behållare som en spärr bad. Placera en liten magnetiska rör bar i injektionsflaskan.
      Obs: Quench badet minskar den Ostwald mognad genom att sänka den slutliga halten lösningsmedel till 10% av volymen15,17. Denna volym kan justeras till adress processen begränsningar och kan skalas direkt med indataström volym.
  3. Producera NPs av FNP använder CIJ mixern.
    1. Placera injektionsflaskan öppen quench bad nedanför rengjorda CIJ mixern på en uppståndelse tallrik i dragskåp. En praktisk konfiguration använder ett 50 mL provrör rack block för att stödja CIJ mixern med injektionsflaskan nedan och utlopp slangen riktad in i injektionsflaskan. Se figur 1A för orientering.
    2. Börja omrörning den quench bad via magnetiska rör baren på omkring 75% max hastighet.
    3. Med en 1 mL polypropylen spruta försedd med en trubbig spets nål, dra på full volym från antisolvent röret.
      Obs: Använd inte sprutor som innehåller en gummi O-ring tätning för att undvika kompatibilitet bekymmer. För större inlopp volymer, Använd en lämplig storlek luer lås spruta. Sprutan utlopp måste vara centrerad på sprutan axeln eller det blir instabil under depressionen.
    4. Försiktigt bort alla luftbubblor från sprutan och nålen trubbig spets, bortskaffande i en behållare.
    5. Prime kolven så att strömmen kommer bara att spruta öppningen. Fäst sprutan på en CIJ inlopp tillbehören.
    6. Upprepa steg 1.3.3-1.3.5 för lösningsmedel lösningen.
    7. Snabbt, smidigt och jämnt tryck sprutor samtidigt genom att placera bollen i handen, i handflatan eller en tumme varje på topparna av kolvarna beroende på personliga preferenser. Samla avloppsvattnet i dämpningen bad injektionsflaskan.
      Obs: En 0,5 mL ingång bör vara deprimerad i mindre än 0,5 s.
    8. Avsätta den CIJ mixer med sprutorna fortfarande ansluten. Ta bort fältet uppståndelse och locket injektionsflaskan, som nu innehåller NP spridning med core-shell partikel struktur (figur 1 c).
    9. Håll mixern över en avfall lösning behållare och ta sprutorna. Håll upp volymen (ca 0,25 mL) kommer sedan rinna ut. Kassera de använda sprutorna och upprepa rengöring steg 1.1 innan den nästa FNP rättegång.
      Obs: Låt inte håll upp volymen till tom i injektionsflaskan med NPs som detta kommer att negativt påverka prov enhetlighet.
  4. Utför analys och efterbearbetning av NP dispersion.
    1. Att karakterisera NP storleken med DLS, tillsätt 100 μL av NP spridning i en plast kyvetten och tillsätt 900 μl quench bad lösningsmedel (t.ex. vatten).
      Obs: Mindre volymer kan användas för låg volym kyvetter. En 10-faldig utspädning är normalt tillräckligt.
    2. Blanda väl genom pipettering upp och ned eller genom mild omskakning. Följ instruktionerna instrumentspecifika att analysera provet.
      Obs: Alternativa karakterisering tekniker såsom zeta potential analys eller elektronmikroskopi får utföras som krävs. NP spridningen kan behandlas som dikteras av ansökan och granskas i diskussionsavsnittet.

2. inkapsling av hydrofil föreningar i inverterad NPs använder en CIJ Mixer

  1. Förbereda lösningsmedel, antisolvent, och släcka lösningar i dragskåp.
    1. Komplett rengöring och preparering procedurerna som beskrivs i steg 1.1, använda DMSO som rengöring vätska och att anteckningen i steg 1.1.6 för att slutföra en andra sköljning med THF.
    2. Upplösa den hydrofila föreningen (dvs, maltodextrin (MD) med dextros motsvarande (DE) med 4-7, genomsnittlig molekylvikt = 3 275 g/mol, ”3 k MD”) i DMSO på 10 mg/mL i tillräcklig volym för att slutföra önskat antal FNP körs.
      Obs: Andra lösningsmedel kan användas, med de begränsningar som beskrivs i avsnittet diskussion.
    3. Blanda maltodextrin lösningen med en vortex mixer tills upplöst. Vid behov, placera lösningen i ett ultraljudsbehandling bad för 1-2 min till stöd i fasta upplösning.
    4. Skapa block sampolymer stabilisator (dvs., poly(styrene) -b- poly (akryl syra), PS5 k-b- PAA4.8 k) stamlösning i THF på 11,1 mg/mL vid ungefär samma volym som i steg 2.1.2 bildar den polymer lösningen .
      Obs: Andra lösningsmedel och stabilisator koncentrationer kan användas. DMSO kan lätt användas som lösningsmedel i stället för THF.
    5. Blanda polymer lösningen med en vortex mixer tills upplöst. Vid behov, placera lösningen i ett ultraljudsbehandling bad för 1-2 min till stöd i fasta upplösning.
      Obs: Ingången polymer kan inte vara i en micellar form. DLS kan användas för att avgöra om en ny ström sammansättning uppfyller detta kriterium.
    6. Förbereda lösningsmedel stream input (0,5 mL) genom att kombinera följande, i ordning, i en 1,5 mL centrifugrör: 0.250 mL 3 k MD lösning, 0,225 mL polymer lösning och 0,025 mL avjoniserat vatten.
      Obs: Vattenhalten i denna ström har en stark inverkan på NP storlek och polydispertion. Generellt är det bäst att fungera i 2.5-10 vol % intervallet20. Värden på den höga änden av skalan kan hjälpa inkapsling av större molekylvikt föreningar.
    7. Blanda väl på en vortex mixer för 5-10 s.
    8. Alternativt kan du Centrifugera röret vid 1000 x g i 5-10 s återställa någon vätska som fastnat på den gemensamma jordbrukspolitiken, vilket förbättrar reproducerbarhet mellan CIJ körningar.
    9. Bered en crosslinker av kalciumkloriddihydrat (CaCl2) i metanol 25,0 mg/ml.
      Obs: Crosslinker kommer att läggas i förhållandet 1:1 kostnad till sura grupper i blocket PAA. Justera koncentrationen om en olika crosslinker används eller om en annan PAA block storlek eller polymer koncentrationen är begagnade20,21.
    10. Förbered antisolvent strömmen genom pipettering 0,5 mL kloroform och 0,05 mL crosslinker lösningen (0,55 mL totalt) i en mikrocentrifug rör.
      Obs: Andra godtagbara antisolvents dikteras av block sampolymer valet och vanligtvis innehåller diklormetan eller aceton. Crosslinker kan i stället läggas till dämpningen bad, med ytterligare åldrande av NP dispersionen för crosslink bildandet20.
    11. Blanda väl på en vortex mixer för 5-10 s.
    12. Alternativt kan du Centrifugera röret vid 1000 x g i 5-10 s återställa någon vätska som fastnat på den gemensamma jordbrukspolitiken, vilket förbättrar reproducerbarhet mellan CIJ körningar.
    13. Lägga till 4 mL av antisolvent (dvs, kloroform) till en injektionsflaska med 20 mL scintillation att bilda quench badet. Placera en liten magnetiska rör bar i injektionsflaskan.
      Obs: Denna volym kan justeras till adress processen begränsningar.
  2. Slutföra protokollet för NP bildandet enligt steg 1.3.
  3. Utför analys och efterbearbetning av NP dispersion.
    1. Att karakterisera NP storleken med DLS, tillsätt 100 μL av NP spridning i ett glas kyvetten och tillsätt 900 μl av lösningsmedel används för dämpningen bad.
    2. Blanda väl genom pipettering upp och ner eller ljus agitation av kyvetten. Följ instruktionerna programvara att analysera provet.
      Obs: Crosslinking av NPs kan bedömas kvalitativt genom DLS med ett bra lösningsmedel som DMSO eller dimetylformamid (DMF) som DLS spädningsvätska20. Partiklar som är stabilt tvärbundna ställer ut en autokorrelation funktion i spädningsvätskan med minimal förändring i partikelstorlek. Dåligt tvärbundna partiklarna svälla och uppvisar en svag autokorrelation funktion och spridning styrka21.
    3. Du kan också lägga en bas, såsom ammoniak, att köra Joniska komplexering och stärka crosslinking i partikel kärnan.
      1. Du kan också förbereda en 3,48 mg/mL lösning av ammoniak i metanol gravimetriskt använder ammoniumhydroxidlösning (normalt 30 wt % ammoniak). Tillsätt 50 μL (dvs, 0.6 medel med avseende på syra grupperna på polymeren) droppvis under omrörning.
        Obs: Motsvarigheterna kan justeras om så önskas av varierande antingen koncentrationen eller volymen lagt25.
      2. Eventuellt ålder inte mindre än 30 min med mild omrörning för crosslinking inträffa.
    4. Processen för NP spridning att producera antingen mikropartiklar eller bestruket NPs som beskrivs i litteraturen19,20,21.

3. inkapsling av Ovalbumin i inverterad NPs använder en μMIVM

  1. Förbereda lösningsmedel och antisolvent lösningar.
    1. Förbereda en 50 mg/mL lösning av ovalbumin i avjoniserat vatten (”ägg”).
    2. Förbereda 0,75 mL av lösning A i ett 1,5 mL centrifugrör genom att späda 75 μl av OVA lösningen med 0.675 mL DMSO att generera en 5 mg/mL lösning av ägg i DMSO innehållande 10% vatten volymen. Blanda väl och centrifugera kort som tidigare beskrivits.
      Obs: Se steg 2.1.6 angående vatteneffekter. Liksom i tidigare avsnitt, kan lösning volymerna skalas upp eller ned fit materiella behov.
    3. Förbereda lösning B genom upplösning av block sampolymer stabilisator (dvs., poly(styrene) -b- poly (akryl syra), PS5 k-b- PAA4.8 k) i DMSO vid 6 mg/mL. Blanda väl och Sonikera för att lösa upp om det behövs. Pipettera 0,75 mL i ett 1,5 mL centrifugrör.
    4. Överför med pipett 0,75 mL THF (lösning C) i ett 1,5 mL centrifugrör.
    5. Pipettera 1,85 mL kloroform (lösning D) i en injektionsflaska av glas scintillation.
    6. Bered en 60,0 mg/mL kalciumklorid dihydrat crosslinker i metanol. Blanda med en vortex mixer.
    7. Förbereda en 4,17 mg/mL ammoniaklösning i metanol som beskrivs i steg 2.3.4.
    8. Lägg till 5,25 mL kloroform till en 15 mL centrifugrör som quench badet.
  2. Förbereda mixer montering och stativ.
    1. Samla den nedre mottagare, blanda geometri disk, övre disken, skiftnyckel skiftnyckel och en O-ring. Se figur 2 för Schematisk av komponenter och mixer stativ terminologi.
      Obs: På MIVM konstruktion återfinns i Tilläggsinformation (avsnitt 1) och i litteratur22. CAD-filer finns också som Kompletterande Information .
    2. Placera o-ringen i spåret, säkerställa att den passar väl och att det inte finns några tecken på slitage eller skada.
      Obs: Normal drift kommer att leda till slitna eller lösningsmedel-svullna O-ringar. Om o-ringen verkar sträckt eller deformerade, låt den torka över natten innan användning. Om formen inte återhämta inte över natten, avyttra o-ringen. Hålla ett stort lager, eftersom detta är en förbrukningsvara delen.
    3. Försiktigt justera blandande disk hålen med pinnarna på översta skivan och skjuta ihop. Se till att o-ringen inte bli fördrivna genom att kontrollera de två bitarna sitta spola.
    4. Invertera två stycken och manuellt montera dem med den nedre mottagaren. Säkerställa att utlopp slang tillbehöret har varit lossas så att den inte stör komplett skärpning av disken.
      Obs: Om trädande fångsterna under monteringen, försiktigt isär och tillämpa en mat - eller läkemedels-grade anti-gripa till gängning för att förhindra kallsvetsning.
    5. Efter manuell skärpa, passar skiftnyckel skiftnyckel till översta disk pinnarna och dra ordentligt åt församlingen. Dra sedan åt de utlopp slang passande så att den sitter stadigt mot nedre ansiktet av blandande geometri. Se till att spruta beslag på översta disken ligger tätt.
    6. Placera monterade mixern på mixer stativet så att utlopp slangen sträcker sig under stödplattan. Stöd för mobila plattan så att det är tillfälligt ur vägen arbetsutrymme.
    7. Du kan också sprutor kontrollera mekaniskt stopp justering genom att först koppla det tomma glaset till mixer öppningarna.
      Obs: Volymetrisk flöden är varierade med sprutor med olika fat diametrar, eftersom sprutorna är deprimerade samtidigt på samma linjära hastighet. Inledande och avslutande vertikala höjder måste vara samma för alla sprutor och kan justeras med ställskruvar knackade in kolven axel22. Den mekaniska stannar säkerställa att alltför stora skador på glas sprutorna inte sker.
      1. Eventuellt kommer lägre mobila plattan så det är att vila på de mekaniska stopp. Se till att dessa är justerade så att plattan kommer också att vila omedelbart innan du kontaktar de tomma sprutorna (som kan ses i figur 2).
      2. Du kan också lossa mekaniska stopp och flytta, om det behövs. Ta bort glas sprutorna och återställa mobila plattan ur vägen.
        Obs: För användning med plast sprutor, de mekaniska stopp krävs inte.
    8. Placera öppna quench badet nedanför outlet slangen att samla utflödet.
    9. Rita lösning A i en 1 mL gastät spruta med en nål med trubbig spets. Ta bort alla luftbubblor och släng kanylen. Prime lösningen till slutet av sprutans luer tillbehöret. Upprepa denna process för lösningar B och C.
    10. Rita lösning D i en 2,5 mL gastät spruta med en nål med trubbig spets. Ta bort alla luftbubblor och släng kanylen. Prime lösningen till slutet av sprutans luer tillbehöret.
      Obs: Dessa volymer har valts så att första sprutkolven höjderna är desamma. Om volymer ändras, måste de fortfarande uppfylla detta krav.
    11. Montera de fyra sprutorna på mixern i en medsols i alfabetisk ordning. Se figur 1B för slutliga utseende och spruta orientering Schematisk.
      Obs: Kontrollera att ingen spruta höjd skiljer sig väsentligt från de andra och Felsök som behövs.
  3. Utföra mixer drift och rengöring.
    1. Grepp i lagerhuset på båda sidor av mobila plattan. Placera inte fingrarna i botten ansiktet av bostäder, eftersom detta är en nypa fara mot den mekaniska stannar. Långsamt Sänk mobila plattan så att det vilar jämnt men knappt röra sprutorna.
    2. Stadigt och smidigt trycka ned plattan, som syftar till att slutföra åtgärden i ca 0,5-1 s för dessa strömma volymer22.
      1. Ta bort och locket quench badröret som nu innehåller NP spridning.
    3. Ta mixern med sprutorna fortfarande sitter och håller över en avfallsbehållare. Ta bort sprutor, så att volymen hold-up rinna in i behållaren. Håll mixer församlingen upp och isär blandaren med skiftnyckel skiftnyckel.
    4. Använda en sprayflaska, skölj utlopp slangen med flera milliliter vätska (t.ex. aceton) och torka med luft eller kväve.
    5. Skölj den blandande geometrin med ett bra lösningsmedel (t.ex. avjoniserat vatten eller DMSO) och skölj sedan med aceton med flera milliliter från en sprayflaska. Torka med en luft eller kväve ström.
    6. Skölj o-ringen i en ström av avjoniserat vatten och torka.
    7. Skölj den översta disken grundligt med flera milliliter av aceton som använder en vätska flaska tills visuellt ren. Torka med en luft eller kvävgas strömma både ytan och spruta beslag.
    8. Skölj varje spruta med flera milliliter av ett bra lösningsmedel (t.ex. avjoniserat vatten eller aceton) från en vätska flaska. Applicera en slutsköljning av flera milliliter av aceton och lufttorka innan nästa användning.
  4. Utföra efterbehandling och analys.
    1. Tillsätt 50 μL av kalciumklorid dihydrat crosslinker lösningen droppvis under omrörning till ca 75% maximal hastighet.
    2. Tillsätt 50 μL av ammoniaklösningen droppvis under omrörning med 75% maximal hastighet. Ålder för minst 30 min.
    3. Karakterisera NP storlek enligt beskrivningen i steg 2.3.1 och 2.3.2.
    4. Processen för NP spridning att producera antingen mikropartiklar eller bestruket NPs som beskrivs i litteraturen19,20,21.

4. ändringar för formulering skala upp

  1. Förbereda de lösningsmedel och antisolvent lösningarna som beskrivs i steg 1, 2 eller 3 på önskad sammansättning och tillräcklig volym för krävs formulering storlek.
  2. Alternativt, om det behövs, rengöra och sterilisera blandaren på plats med hjälp av en lämplig protokoll före NP bildandet.
    Obs: Sekventiell sköljningar av CIP 100, vatten (till neutralt pH), CIP 200, vatten (till neutralt pH) och lämpligt lösningsmedel har använts tidigare. Sterila filter kan dessutom kopplas till öppningarna av mixern i fall där slutlig partikelstorlek utesluter sterilisering genom filtrering.
  3. Läsa in lösningarna i gastäta sprutor av lämplig volym och bifoga polytetrafluoreten (PTFE) slangar med en luer adapter monteras på slutet. Manuellt prime lösningarna till slutet av slangen.
    1. Fyll sprutorna i en sprutpumpen och fäst sprutorna mixer öppningarna på antingen CIJ eller MIVM, som krävs.
      Obs: Alternativt Flödesregleringsventiler kan användas på lab eller pilotskala för att ge större volym kapacitet än en sprutpump. Lyckad operation kräver kontinuerligt flöde och tillräcklig tryckfall, vilket innebär att trycksatt fartyg med flöde mätning på uttaget är det lämpligaste valet för storskalig produktion.
  4. Placera en samling behållare innehållande badkar dämpningen av tillräcklig volym, om så krävs, under outlet slangen.
  5. Ange de volymflödet att matcha dem som uppnås manuellt (t.ex. ca 30-60 mL/min per stream).
    Obs: Om du använder CIJ, pump flödesvärden måste vara identiska. Om du använder MIVM, kan olika vikar ha olika flöden.
  6. Samtidigt börja pumparna. Samla in ca 5-10 mL utflöde som avfall i en liten flaska (detta är en ”start-up volym”) och sedan börja samla i dämpningen badet.
  7. Karakterisera och processen som beskrivs i motsvarande formulering avsnittet ovan.

Representative Results

Screening av NP formuleringar med FNP är snabb och kräver små kvantiteter av material (storleksordningen 1-10 mg). FNP protokollet att kapsla in hydrofoba föreningar såsom E-vitamin (steg 1) resulterar i en stabil, klar eller lätt opalescent NP dispersion. Dynamiska ljusspridning (DLS) tillhandahåller en robust sätt att karakterisera partikelstorlek. I figur 3visas processen ger NPs med en låg polydispertion på ett reproducerbart sätt. Den typiska polydispertion indexet (PDI) är mindre än 0,20, som indikerar en relativt monodisperse befolkningen. PDI erhålls från funktionen autokorrelation och genomförs ofta i instrumentet programvara. Det är ett förhållande av andra till första stund, där värden av 0,1 erhålls vanligtvis för monodisperse partiklar26. För fyra vitamin E/PS-b-PEG formulering replikat rapporterade, värdet var 0,12 ± 0,02 och den genomsnittliga diametern 107 ± 7 nm. En typisk ”feltändning” på grund av antingen ojämna depression av sprutor eller långsammare depression rapporteras också i figur 3. Polydispertion var opåverkad, men storleken var något större (135 nm). Inklusive detta prov är nya mätvärden för partikelstorlek 113 ± 14 nm. En misständning resulterar i perioder där kammaren innehåller bara en enda Strömtyp. Det är viktigt att hela strömmen upplever samma process historik och relativa mängder organiska och vattenaktig strömmar inom mixern. Utan en stabilisator produceras en ogenomskinlig lösning med synliga aggregat. DLS autokorrelation funktion för detta prov är icke-monoton och förfalla inte smidigt, som sett i den figur 3 infällt.

Partikel storlekskontroll av FNP demonstreras i figur 4, där varierar de relativa mängder core material – poly(styrene)1.8 k i detta fall – och PS -b-PEG stabilisator resulterade i partiklar storlekar som varierade från 49-152 nm. Dessa partikelstorlek genererades med THF strömmar som innehåller en totala masskoncentrationen av kärna och stabilisator av 20 mg/mL, 25%, 50% eller 75% av massan var poly(styrene) core materialet. Polydispertion av nanopartiklar var alltid mindre än 0,15. Omfattande diskussion om parametern effekter på partikelstorlek som produceras av FNP kan hittas i litteratur10. Lastning kan ställas in genom att hålla konstanten lösningsmedel volym och varierande relativa volymerna av core och stabilisator lager lösningar. Likaså kan den totala masskoncentrationen varieras genom att förbereda stamlösningar på andra värden än 10 mg/mL. Under vissa villkor är det möjligt att observera en tom micelle befolkning av DLS27. Detta har inte någon skadlig effekt än bredda den uppmätta partikelstorleksfördelning. När storlekarna är liknande, kan detta manifesteras som en enda bred topp snarare än två separata toppar.

Samma CIJ mixern kan också användas att kapsla in hydrofil föreningar av iFNP, som exemplifieras i steg 2 i protokollet. De partiklar som produceras i rapporterade formuleringen är omkring 65 nm med en låg polydispertion av 0,08. Storleksfördelning kan ses i figur 5A (streckade linjer). Effekten av crosslinking PAA karboxylsyra rester på partikel stabilitet framgår av DLS analys i ett starka lösningsmedel som DMSO, som visas i figur 5B. Autokorrelation funktion för brunn-tvärbunden partiklar bör börja nära värdet 1 och släpp kraftigt till 0 samtidigt karakteristiska som är relaterade till partikelstorlek (heldragen linje). Partiklar som sväller i stor utsträckning eller upplösa är inte tvärbundna och Visa minimal autokorrelation signal (streckad linje). För iFNP manifestera misslyckade försök på liknande sätt som beskrivs för FNP ovan. Synliga aggregat kan ses eller dålig DLS autokorrelation funktion form kan observeras. MIVM kan användas för FNP eller iFNP när mer än två inlopp strömmar krävs på grund av systemet begränsningar såsom löslighet eller kemisk inkompatibilitet. En småskalig version av MIVM (μMIVM) med dess mixer stativ visas i figur 2. Som med CIJ, kan denna mixer användas att kapsla in hydrofoba eller hydrofila föreningar22. I steg 3 beskrevs ett protokoll för inkapsling av en hydrofil protein, ägg, av iFNP. Fördelningen av partiklarnas storlek visas i figur 5A (heldragen linje). Storleken är ca 125 nm med en PDI av 0,16. Ett allmänt protokoll för spruta pump drift vid större skalor finns i steg 4.

Figure 1
Figur 1: Mixer montering och inre flöde mönster scheman. (A) den trånga inkräkta jets (CIJ) mixer med bifogade sprutor är placerad ovanför quench badet. Inte på bilden är en uppståndelse bar i injektionsflaskan quench bad och en uppståndelse tallrik. Blandande geometri avbildas i den utökade vyn visar de två stream inlopp som inkräktar i mitten av salen. (B) en multi inlopp vortex mixer (μMIVM) visas med glas sprutor och är placerad i stativet ovanför badkar dämpningen. Den mobila plattan och den mekaniska stannar har beskurits från bilden. Den utökade vyn visar vortex kammaren och inlopp kanalerna schematiskt. (C), en schematisk representation av core-shell NPs produceras av FNP. Red sfärer representerar den terapeutiska som i kombination med blå kollapsade polymer blocket, omfatta NP kärnan. Blocket gul polymer bildar borste lagret förmedla sterisk stabilisering till den NPs. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: μMIVM terminologi och komponenter för montering. ΜMIVM kräver en mixer stå att aktivera enhetlig depression av fyra sprutor. I det här fallet måste sprutkolven höjder vara enhetliga för att säkerställa konsekvent mixning. Det kan alternativt styras med sprutpumpar. Mixer stativet med märkta komponenter visas till vänster i figuren. Till höger är nedmonterat mixern med o-ringen på plats på skivan med blandande geometri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Partikel storlek distribution av Polymera nanopartiklar som innehåller en kärna av vitamin E och stabiliseras med PS -b-PEG. Dynamiska ljusspridning (DLS) ger intensitet-viktade storlek distributioner som anger NP diameter fördelningen. Kurvor är genomsnittet av tre exemplar analyser för varje rättegång och har varit skalas för att producera identiska högsta toppar. De fyra replikat (heldragna linjer) indikerar hög reproducerbarhet av metoden (standardavvikelse = 7 nm). Dessutom ingår en representant misständning (streckad linje), såsom långsammare spruta eller ojämn depression av två sprutor, vilket resulterar i större partikeldiameter. Standardavvikelsen för NP storlek inklusive misständning var 14 nm. (Infälld) Utan på PS -b-PEG stabilisator, stora micron-skala aggregat (eller droppar, i fråga om en olja som vitamin E) bildas. DLS autokorrelation funktionen av en körning utan stabilisator (streckad linje) visas tillsammans med en representativ autokorrelation från en nanopartikel replikera (heldragen linje). Autokorrelation funktion visar ett antal karaktäristiska tidsskalor för det stickprov, som anger en polydisperse befolkning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: partikel storlekskontroll av FNP genom varierande relativ nyckeltal för core material till stabilisator. De intensitet-viktade storlek distributionerna av tre formuleringar med en poly(styrene) kärna stabiliseras av PS -b-PEG är avbildade. Den totala masskoncentrationen i THF var 20 mg/mL och antisolvent vatten. Formuleringarna var beredda i en CIJ mixer. Fraktionen av massan består av materiellt kärna ur visas i förklaringen. Till exempel 25% core provet innehöll 5 mg/mL poly(styrene) och 15 mg/mL PS -b-PEG. De genomsnittliga storlekarna för 25% (heldragen linje), 50% (streckad linje) och 75% (blandade streckad linje) core belastningar var 49 nm, 96 nm och 152 nm, respektive. Alla PDI värden var mindre än 0,15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: karakterisering av inverterad NPs gjort under en CIJ mixer eller μMIVM. (A), DLS kurvor är genomsnittet av tre exemplar analyser för varje formulering. Den streckade linjen visar fördelningen av storlek 3 k MD partiklar gjort i CIJ mixer medan den heldragna linjen är storlek distribution av OVA partiklar i μMIVM. (B), styrkan av crosslinking kan bedömas av DLS använda DMSO som spädningsvätska. DLS autokorrelation funktion anger styrkan av crosslinking genom inledande autokorrelation värdet och observation av en ren övergång till ett värde av noll. Den streckade linjen föreställer autokorrelation funktion för en partikel med ingen crosslinker visar en svag första signal och en bred förfalla time. Den heldragna linjen skildrar autokorrelation efter tillägg av en stark crosslinker (i detta fall, tetraethylenepentamine), som visar en stark initial signal och en definierad decay tidsskalan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: övermättnaden, S, som en funktion av de relativa blandning nyckeltal av organiskt lösningsmedel till vatten. (A) jämförelse av högsta uppnåeliga övermättnaden för (○) boscalid, bekämpningsmedel och (■) peptid B, en sju-rester modell peptid. Den organiska strömmen innehåller boscalid vid en koncentration på 230 mg/mL och peptid B 200 mg/ml, mättnad koncentrationer. Det finns en maximal övermättnaden som beror på varje aktiv farmaceutisk ingrediens (API) / lösningsmedel system. (B) När koncentrationen av boscalid i organiska flödet minskas 20-faldigt, de villkor som där övermättnaden och nanoprecipitation är nått bli begränsad. Denna siffra återges med tillstånd från Elsevier9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Inkapsling av hydrofoba föreningar såsom E-vitamin, som i steg 1 i protokollet, har varit utförligt beskrivna9,14,28. Monodisperse partiklar produceras relativt eftersom tidsskalan för blandning är kortare än tidsskalan för sammanläggning och tillväxt av partiklarna. Specifikt, blandad vätska/antisolvent lösningen blir snabbt homogen, vilket möjliggör kärnbildning inträffa jämnt. Montering av segmentsampolymerer till partikeln ytbehandlar sedan ger sterisk stabilisering som stoppar partikel tillväxt5. Eftersom blandning tid i kammaren (turbulens) är en funktion av flödesvärden inlopp till den (CIJ) eller MIVM, finns det en inlopp takt, som inträffar efter övergången till turbulenta blandning, där partikelstorleken är väsentligen konstant13. Detta ger extra tålighet mot processen som vissa sats till sats variation i inlopp flöde (dvs, spruta depression hastighet) kan tolereras utan betydande inverkan på den slutliga NP-storleken som framgår av figur 3. Långsammare eller ojämn inlopp hastigheter kan leda till större partiklar eller mer polydisperse distributioner, som sett för misständning exempel. FNP har också utvidgats för att kapsla in hydrofil föreningar i nanopartiklar av inversen Flash NanoPrecipitation. Dessa inverterad nanopartiklar kan sedan användas för att skapa mikropartiklar eller vara belagd med PEG att skapa vatten-spridbar nanopartiklar25. De underliggande montering principerna desamma, även om det finns extra komplexiteten av crosslinking partikel kärnan. Detta är nödvändigt för stabilisering av partikeln i en vattenlösning miljö. I allmänhet räcker förhållandet 1:1 kostnad jämfört med polyacid blocket, även om de joniska interaktionerna kan främjas genom pH-justering genom tillägg av en bas19. I detta protokoll, har endast första processteget till formuläret inverterad NPs beskrivits.

Förutom snabb blandning är lyckad formulering av FNP eller iFNP begränsad till fall där flera villkor kan vara mötta9,14. Först, alla strömma ingångar måste vara blandbar. Medan emulsioner har använts för att producera NPs, kräver FNP en enhetlig lösning fas i mixern. Andra måste huvudkomponenten vara nästan olösliga på lösningsmedel villkoren i mixern (för CIJ, en 50/50 blandning av volym) att köra snabb kärnbildning. Annars en betydande del förblir oinkapslat eller kommer fällningen efter ytterligare spädning med antisolvent. MIVM kan aktivera högre antisolvent innehåll i blandningskammaren adress core material löslighet begränsningar. Det är ofta användbart att generera övermättnaden kurvor från löslighet data som en funktion av lösningsmedel sammansättning att vägleda process design9. Figur 6 visar representativa kurvor för två föreningar. Låg övermättnaden vid blandande kammare villkor förtjänster på olika kompositioner, vanligtvis med hjälp av MIVM. Högre övermättnaden gynnar kärnbildning av huvudkomponenten över partikel tillväxt men ett matchningsfel för monteringstid av materiellt kärna ur och stabilisatorn kan resultera i stora aggregat av den terapeutiska. D'Addio och Prud'homme har granskat tillämpningen av sådana övermättnaden kurvor i detalj9. Slutligen BKP molekylärt måste upplösas i lösningsmedel strömmen och den antisolvent strömmen måste vara selektiv för ett kvarter. BCP-reglerna måste vara tillräckligt amfifila att ge både en solvophobic drivkraft från blocket kollapsade att förankra stabilisatorn på partikeln ytbehandlar och för solvatiserade blocket att förmedla sterisk stabilitet till partikeln. Lösningsmedel än de som beskrivs i protokollet kan användas så länge de uppfyller dessa begränsningar.

Öva med manuell spruta drift kan förbättra framgång under screening. Som nämnts ovan, innebär ovan övergången till homogena, turbulent blandande villkor att små variationer i flödet tolereras i processen28. Skala upp till pump-driven, dator-kontrollerade flöden resulterar i ännu större vinster i konsistensen på grund av reproducerbara inlopp flödesvärden. Vid något tillfälle under efterbearbetning av partiklarna, kan okulärbesiktning eller DLS analys tyda på närvaro av stora aggregat vilket kan bero på tillfällig damm eller partikel instabilitet. Vid behov kan strömmen filtreras med ett lämpligt filter porstorlek. I avsaknad av aggregat, har vi funnit att mindre än 5% massa förloras vanligtvis när filtrering PEG-belagd nanopartiklar om nominella filtret storlek är större än fördelningen av partiklarnas storlek. När filtrering aggregat, Experimentell bestämning av massa förlorade under processen är nödvändigt. Kvantifiering av massa förlusten kan utföras på ett av två sätt. Totala fasta massan i en given volym kan bestämmas genom termogravimetrisk analys före och efter filtrering för att identifiera omfattningen av förändringen (se Tilläggsinformation avsnitt 2). Alternativt, partiklarna kan vara återvunna (t.ex., genom att frystorka den) och upplöst i ett bra lösningsmedel. Koncentrationen av materiellt kärna ur kan sedan direkt mätas med en lämplig teknik såsom ultraviolett-synligt spektrofotometri eller kromatografi.

För FNP, måste de återstående 10 vol % organiskt lösningsmedlet (t.ex., THF) tas bort från vattendispersion. Detta kan göras genom evaporativ destillation14,29, dialys30eller tangentiell flow filtrering31,32. Praktiska överväganden för varje bearbetningssteg beskrivs i beaktandeleden som tillhandahålls. För dialys är typiska membran 3,5 kDa eller 6-8 kDa cutoffs, även om större alternativ finns. Detta molekylvikt cutoff räcker för lösningsmedel borttagning när dialyseras för 24 h använder flera bad förändringar. Användning av tangentiella flow filtrering medför vissa processutveckling som var noga med att undvika inducerande aggregation på grund av koncentrationen polarisering membran yta. Vi har funnit att minska organiska lösningsmedel sammansättning under ett system-beroende värde, vanligtvis 2-10 vol.%, eliminerar aggregering membran yta. Efter bearbetning, bestäms lätt koncentrationen av nanopartiklar genom termogravimetrisk analys (se Tilläggsinformation avsnitt 2). Det är ofta önskvärt att transportera eller förvara partiklar i en mycket stabil form. Aqueous dispersioner kan enkelt frysas snabbt använda en torr-is/aceton blandning och sedan förvaras vid-80 ° C. Alternativt, torrt pulver kan erhållas genom att frystorka den33,34 eller spraya torkning24. Ofta måste en frysskyddmedel läggas till minska nanopartiklar aggregation under frysning eller torkning. Socker (sackaros, trehalos, etc.), poly(ethylene glycol) eller cyklodextrin kan undersökas för effektivitet över en serie koncentrationer av kontroll storleken av DLS35,36,37, 38. Vanliga NP stabilitetsproblem under behandling är ofta relaterade till löslighet eller fas separation i kärnan resulterar i rearrangering mot ett lägre energitillstånd under förhållanden där rörlighet ökas. Användning av samtidig kärnan material, alternativa stabilisatorer eller modifierad extern lösning sammansättning kan bidra till att förbättra stabilitet14,16,17,39,40, 41.

Som nämnts ovan, gör MIVM högre antisolvent innehåll i blandningskammaren när krävs för att uppnå hög övermättnaden. Det kan också möjliggöra fysisk åtskillnad av arter i mer än två strömmar när reaktivitet eller löslighet begränsningar kräver det. Ett exempel är bildandet av zein protein-stabiliserad nanopartiklar av den antibiotiska klofazimin24. Den hydrofoba klofazimin introduceras i en aceton ström; Zein introduceras i en 60% enprocentig vattenlösning ström; kasein, som komplex med zein, förs in med en vattenlösning buffert ström, och den fjärde stream är extra buffert att öka förhållandet mellan vatten till aceton och etanol. Två vätska strömmar krävs eftersom klofazimin och zein inte är lösligt i ett vanligt lösningsmedel. Denna process skulle inte kunna åstadkommas inom en två-jet CIJ mixer. Detta protein-stabiliserad formulering visar också att FNP inte är begränsat till BCP stabilisatorer. Janus partiklar har producerats utan stabilisator42 och en rad billiga stabilisatorer har påvisats för muntliga ansökningar24. Särskilt, kan sampolymerer såsom hydroxipropylmetylcellulosa användas i stället för block sampolymerer24. Kärnan material kan göras mer hydrofoba genom ett antal olika tekniker. Hydrofoba ion ihopparning har tillämpats för att kapsla in ett brett utbud av föreningar som har mellanliggande löslighet43,44,45. Extremt hydrofoba prodrugs har varit genereras och sedan inkapslade46. Nukleinsyror har införlivats genom komplexbildning med katjoniska lipider47. Ännu viktigare, har dessa studier visat att FNP kan producera en rad partikel ytan kemiska sammansättningar. Ytterligare, blandad stabilisatorer som innehåller en bråkdel av BCP som har modifierats med en inriktning ligand på kedjan slutet har använts. Detta möjliggör exakt kontroll över ligand innehåll på ytan eftersom partikeln sammansättning speglar indataström sammansättning23,48. Likaså är det möjligt att införliva flera huvudkomponenter samt, inklusive färgämnen och oorganiska nanopartiklar3,8.

Flash NanoPrecipitation är en skalbar metod för polymera nanopartiklar består av antingen en hydrofob och en hydrofil kärna. Om de kriterier som räknas upp ovan är uppfyllda, vanligen kapslas över 95% av materiellt kärna ur på hög massfraktionen i partikeln. De tre exemplen som presenteras här genomfördes på bänk skala, som kräver några milligram av material och cirka 0,5 mL i varje inlopp ström. Detta möjliggör snabb screening av partikel villkor för formulering optimering. Uppskalning av bly formuleringar till större batchstorlekar handlar om kör processen längre, som lätt kan uppnås genom användning av sprutpumpar eller Flödesregleringsventiler. Däremot ansikten att skala upp bulk tillägg nanoprecipitation väldokumenterade utmaningar att upprätthålla tillräcklig micromixing vid tidpunkten för tillägg och redovisning av effekten av att ändra fartygets geometri49. Detta är ett stort hinder, eftersom det är avgörande att tillverka partiklar på ett konsekvent sätt att möta FDA krav50. Mikrofluidik tekniker kan också producera uniform, reproducerbara nanopartiklar, men endast möjliggöra produktion i intervallet milligram. Till exempel rapporterade Karnik et al. produktionstakt 0,25 mg/min för en läkemedelsfrisättning studera51. Ytterligare skala upp innebär vanligtvis parallelization på hög kapitalkostnad12. Med FNP är det enkelt att producera 1 gram av nanopartiklar på 600 mg/min med en sprutpump och några beslag att ansluta till mixer öppningarna. FNP representerar följaktligen en tillgänglig lab-skala screeningmetod för såväl som en skalbar metod för NP produktion för translationell arbete.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av medel från Optimeos Life Sciences, National Science Foundation (Fortsättningssatsningen 1605816), av Bill och Melinda Gates Foundation (BMGF, OPP1150755) och National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1656466) tilldelas K.D.R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confined Impinging Jets Mixer NA NA See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation
Luer fitting Idex Health & Science P-604 Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads
Plug fitting Idex Health & Science P-309 Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)
Outlet fitting - CIJ Idex Health & Science P-205 Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet
Outlet ferrule - CIJ Idex Health & Science P-200 Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)
Outlet tubing - CIJ Idex Health & Science 1517 Use tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn't protrodue into mixing chamber
Tetrahydrofuran (THF) Fisher Scientific T425-4 Use stabilizer-free THF to avoid solubility limits of BHT. Peroxides may interfere in some applications.
Norm-ject syringe (3 ml) VWR 53548-017
Vitamin E (α-tocopherol) Sigma-Aldrich 90669-50G-F Store cold
poly(styrene-b-ethylene glycol), PS1.6k-b-PEG5k Polymer Source P13141-SEO Other block sizes acceptable depending on application
poly(styrene)1.8k Polymer Source P2275-S Example hydrophobic core material
Scintillation vial DWK Lifesciences 74504-20
Luer-slip plastic syringes, 1ml (100 pk) National S7510-1
Maltodextrin DE 4-7 Sigma-Aldrich 419672-100G
poly(styrene-b-acrylic acid), PS5k-b-PAA4.8k Polymer Source P5917-SAA Other block sizes acceptable depending on application
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D159-4
Calcium chloride dihdyrate Sigma-Aldrich 223506-25G Hygroscopic.
Methanol Fisher Scientific A452-4
Ammonium Hydroxide Fisher Scientific AC423300250
Albumin from chicken egg white (Ovalbumin, OVA) Sigma-Aldrich A5503-1G
Multi-Inlet Vortex Mixer NA NA See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation
Outlet fitting - MIVM Idex Health & Science P-942 Combination with ferrule
Outlet tubing - MIVM NA NA Fit to ferrule ID.
O-ring (MIVM) C.E. Conover MM1.5 35.50 V75 Order bulk - consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.
Mixer stand NA NA See Markwalter & Prud'homme for design.17

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bobo, D., Robinson, K. J., Islam, J., Thurecht, K. J., Corrie, S. R. Nanoparticle-Based Medicines: A Review of FDA-Approved Materials and Clinical Trials to Date. Pharmaceutical Research. 33 (10), 2373-2387 (2016).
  2. D'Mello, S. R., et al. The evolving landscape of drug products containing nanomaterials in the United States. Nature Nanotechnology. 12 (6), 523-529 (2017).
  3. Gindy, M. E., Prud'homme, R. K. Multifunctional nanoparticles for imaging, delivery and targeting in cancer therapy. Expert Opinion on Drug Delivery. 6 (8), 865-878 (2009).
  4. Chen, G., Roy, I., Yang, C., Prasad, P. N. Nanochemistry and Nanomedicine for Nanoparticle-based Diagnostics and Therapy. Chemical Reviews. 116 (5), 2826-2885 (2016).
  5. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Mechanism for Rapid Self-Assembly of Block Copolymer Nanoparticles. Physical Review Letters. 91 (11), 118302-118302 (2003).
  6. Schubert, S., Delaney, J. J. T., Schubert, U. S. Nanoprecipitation and nanoformulation of polymers: from history to powerful possibilities beyond poly(lactic acid). Soft Matter. 7 (5), 1581-1588 (2011).
  7. Lebouille, J. G. J. L., Stepanyan, R., Slot, J. J. M., Cohen Stuart, M. A., Tuinier, R. Nanoprecipitation of polymers in a bad solvent. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. , 225-235 (2013).
  8. Akbulut, M., et al. Generic method of preparing multifunctional fluorescent nanoparticles using flash nanoPrecipitation. Advanced Functional Materials. 19 (5), 718-725 (2009).
  9. D'Addio, S. M., Prud'homme, R. K. Controlling drug nanoparticle formation by rapid precipitation. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (6), 417-426 (2011).
  10. Pagels, R. F., Edelstein, J., Tang, C., Prud'homme, R. K. Controlling and Predicting Nanoparticle Formation by Block Copolymer Directed Rapid Precipitations. Nano Letters. 18 (2), 1139-1144 (2018).
  11. Ding, S., Anton, N., Vandamme, T. F., Serra, C. A. Microfluidic nanoprecipitation systems for preparing pure drug or polymeric drug loaded nanoparticles: an overview. Expert Opinion on Drug Delivery. 13 (10), 1447-1460 (2016).
  12. Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles. Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).
  13. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Chemical processing and micromixing in confined impinging jets. AIChE Journal. 49 (9), 2264-2282 (2003).
  14. Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
  15. Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
  16. Kumar, V., Wang, L., Riebe, M., Tung, H. H., Prud'homme, R. K. Formulation and stability of itraconazole and odanacatib nanoparticles: Governing physical parameters. Molecular Pharmaceutics. 6 (4), 1118-1124 (2009).
  17. Liu, Y., Kathan, K., Saad, W., Prud'homme, R. K. Ostwald Ripening of β -Carotene Nanoparticles. Physical Review Letters. 98 (3), 036102-036102 (2007).
  18. Liu, Y., Cheng, C., Liu, Y., Prud'homme, R. K., Fox, R. O. Mixing in a multi-inlet vortex mixer (MIVM) for flash nano-precipitation. Chemical Engineering Science. 63, 2829-2842 (2008).
  19. Pagels, R. F., Prud'homme, R. K. Polymeric nanoparticles and microparticles for the delivery of peptides, biologics, and soluble therapeutics. Journal of Controlled Release. 219, 519-535 (2015).
  20. Pagels, R. F., Prud'homme, R. K. Ch. 11. Control of Amphiphile Self-Assembling at the Molecular Level: Supra-Molecular Assemblies with Tuned Physicochemical Properties for Delivery Applications Vol. 1271 ACS Symposium Series. , American Chemical Society. 249-274 (2017).
  21. Markwalter, C. E., Prud'homme, R. K. Ch. 12. Control of Amphiphile Self-Assembling at the Molecular Level: Supra-Molecular Assemblies with Tuned Physicochemical Properties for Delivery Applications Vol. 1271 ACS Symposium Series. , American Chemical Society. 275-296 (2017).
  22. Markwalter, C. E., Prud'homme, R. K. Design of a Small-Scale Multi-Inlet Vortex Mixer for Scalable Nanoparticle Production and Application to the Encapsulation of Biologics by Inverse Flash NanoPrecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 107 (9), 2465-2471 (2018).
  23. Gindy, M. E., Ji, S., Hoye, T. R., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'Homme, R. K. Preparation of poly(ethylene glycol) protected nanoparticles with variable bioconjugate ligand density. Biomacromolecules. 9 (10), 2705-2711 (2008).
  24. Zhang, Y., et al. Design and Solidification of Fast-Releasing Clofazimine Nanoparticles for Treatment of Cryptosporidiosis. Molecular Pharmaceutics. 14 (10), 3480-3488 (2017).
  25. Pagels, R. F. Polymeric Nanoparticles and Microparticles for the Delivery of Hydrophobic and Hydrophilic Therapeutics. , Princeton University. Doctor of Philosophy thesis (2018).
  26. Frisken, B. J. Revisiting the method of cumulants for the analysis of dynamic light-scattering data. Applied Optics. 40 (24), 4087-4091 (2001).
  27. Budijono, S. J., Russ, B., Saad, W., Adamson, D. H., Prud'homme, R. K. Block copolymer surface coverage on nanoparticles. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 360 (1-3), 105-110 (2010).
  28. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Flash NanoPrecipitation of Organic Actives and Block Copolymers using a Confined Impinging Jets Mixer. Australia Journal of Chemistry. 56, 1021-1024 (2003).
  29. Kumar, V., Prud'homme, R. K. Nanoparticle stability: Processing pathways for solvent removal. Chemical Engineering Science. 64 (6), 1358-1361 (2009).
  30. Shi, L., Shan, J., Ju, Y., Aikens, P., Prud'homme, R. K. Nanoparticles as delivery vehicles for sunscreen agents. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. , 122-129 (2012).
  31. Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. Comparison of Diafiltration and Tangential Flow Filtration for Purification of Nanoparticle Suspensions. Pharmaceutical Research. 22 (12), 2152-2162 (2005).
  32. Pansare, V. J., Tien, D., Thoniyot, P., Prud'homme, R. K. Ultrafiltration of nanoparticle colloids. Journal of Membrane Science. 538, 41-49 (2017).
  33. D'Addio, S. M., et al. Novel Method for Concentrating and Drying Polymeric Nanoparticles: Hydrogen Bonding Coacervate Precipitation. Molecular Pharmaceutics. 7 (2), 557-564 (2010).
  34. Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., Fessi, H. Freeze-drying of nanoparticles: Formulation, process and storage considerations. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1688-1713 (2006).
  35. Correa, S., et al. Highly Scalable, Closed-Loop Synthesis of Drug-Loaded, Layer-by-Layer Nanoparticles. Advanced Functional Materials. 26 (7), 991-1003 (2016).
  36. Figueroa, C. Engineering Nanoparticles for Pharmaceutical Applications: Formulation and Freeze-drying Techniques. , Princeton University. Doctor of Philosophy thesis (2014).
  37. Harada, A., Li, J., Kamachi, M. Preparation and properties of inclusion complexes of polyethylene glycol with alpha-cyclodextrin. Macromolecules. 26 (21), 5698-5703 (1993).
  38. Troiano, G., Song, Y. -H., Zale, S., Wright, J., Van Geen Hoven, C. Stable Formulations for Lyophilizing Therapeutic Particles. United States patent. , (2013).
  39. Kumar, V., Adamson, D. H., Prud'homme, R. K. Fluorescent polymeric nanoparticles: Aggregation and phase behavior of pyrene and amphotericin B molecules in nanoparticle cores. Small. 6 (24), 2907-2914 (2010).
  40. Budijono, S. J., et al. Synthesis of stable block-copolymer-protected NaYF4:Yb3+, Er3+up-converting phosphor nanoparticles. Chemistry of Materials. 22 (2), 311-318 (2010).
  41. Chen, T., et al. Protected peptide nanoparticles: Experiments and brownian dynamics simulations of the energetics of assembly. Nano Letters. 9 (6), 2218-2222 (2009).
  42. Sosa, C., et al. Soft Multifaced and Patchy Colloids by Constrained Volume Self-Assembly. Macromolecules. 49 (9), 3580-3585 (2016).
  43. Pinkerton, N. M., et al. Formation of stable nanocarriers by in situ ion pairing during block-copolymer-directed rapid precipitation. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 319-328 (2013).
  44. Lu, H. D., Rummaneethorn, P., Ristroph, K. D., Prud'homme, R. K. Hydrophobic Ion Pairing of Peptide Antibiotics for Processing into Controlled Release Nanocarrier Formulations. Molecular Pharmaceutics. 15 (1), 216-225 (2018).
  45. Lu, H. D., et al. Encapsulation of OZ439 into Nanoparticles for Supersaturated Drug Release in Oral Malaria Therapy. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 970-979 (2018).
  46. Ansell, S. M., et al. Modulating the Therapeutic Activity of Nanoparticle Delivered Paclitaxel by Manipulating the Hydrophobicity of Prodrug Conjugates. Journal of Medicinal Chemistry. 51 (11), 3288-3296 (2008).
  47. Gindy, M. E., et al. Mechanism of macromolecular structure evolution in self-assembled lipid nanoparticles for siRNA delivery. Langmuir. 30 (16), 4613-4622 (2014).
  48. D'Addio, S. M., et al. Optimization of cell receptor-specific targeting through multivalent surface decoration of polymeric nanocarriers. Journal of Controlled Release. 168 (1), 41-49 (2013).
  49. Perry's Chemical Engineers' Handbook. , McGraw-Hill. 19-20 (2007).
  50. Torrice, M. Does nanomedicine have a delivery problem? ACS Central Science. 2 (7), 434-437 (2016).
  51. Karnik, R., et al. Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles. Nano Letters. 8 (9), 2906-2912 (2008).

Tags

Bioteknik fråga 143 nanopartiklar micromixing block sampolymer drug delivery peptid protein processen skala upp
Flash NanoPrecipitation för inkapsling av hydrofoba och hydrofil föreningar i polymera nanopartiklar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Markwalter, C. E., Pagels, R. F.,… More

Markwalter, C. E., Pagels, R. F., Wilson, B. K., Ristroph, K. D., Prud'homme, R. K. Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles. J. Vis. Exp. (143), e58757, doi:10.3791/58757 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter