Utilizzo di trapianto dell'isolotto intra-omentale di riempimento Matrix isolotto h-omentale (hOMING)

Terapia cellulare è un tema caldo, come ha lo scopo di curare malattie basate sulla medicina rigenerativa. Terapie cellulari assistita da materiale biologico sono stati sempre più studiate negli ultimi anni, soprattutto perché l'impianto delle cellule spesso richiede un vettore per il trasferimento delle cellule dalla piastra di coltura al destinatario. Biomateriale ponteggi sono vettori di cellule potenzialmente importante che soddisfano diversi ruoli¹. Un vettore competente dovrebbe proteggere le cellule da sollecitazioni meccaniche e fornire condizioni di crescita favorevoli, quali fattori di crescita essenziali, l'escrezione dei rifiuti metabolico, scambio di sostanze nutritive e ossigeno².

Tra i diversi tipi di biomateriali utilizzati nella terapia cellulare, idrogeli hanno molti vantaggi. Essi sono biocompatibili, biodegradabile, facile da maneggiare e facilitare la diffusione di ossigeno³. Inoltre, la tecnologia attuale permette l'utilizzo di idrogel per aiutare le cellule sopravvivono e interdigitate con, ad esempio, il completamento con fattori di crescita o di proteine di matrice extra-cellulare⁴.

Vettori di idrogel contenenti cellule staminali possono essere iniettati come trattamenti, ad esempio, dell'osso rigenerazione⁵ e sistema nervoso malattia⁶. L'impianto di cellule metabolicamente attive è necessario. Mentre è possibile convalidare in vitro dell'approccio, strumenti e tecniche per la convalida in vivo rimangono per essere raffinato.

Trapianto delle cellule e idrogel facilmente può essere effettuato mediante iniezione sottocutanea quando sono condotte prove di biocompatibilità. Tuttavia, quando le cellule innestate sono destinate a regolare i fattori sistemici di loro azione metabolica, questa localizzazione sottocutanea non è ottima, essenzialmente in termini di drenaggio venoso⁷. Di conseguenza, non sono disponibili strumenti attuali in modo rapido, sicuro ed efficiente valutare gli effetti benefici di un idrogel. Sulla base dell'esempio di trapianto dell'isolotto, che richiede che gli ormoni rilasciati nel flusso sanguigno dall'innesto in risposta a livelli di glucosio nel sangue, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per l'impianto delle cellule/idrogel in vivo.

Il primo passo era quello di identificare un sito accettore di trapianto, che può accettare un idrogel con cellule. L'omento offre un ampio spazio per l'impianto, è altamente plastico, e sua vascolarizzazione denso combinato con l'impostazione intraperitoneale è interessante per lo studio delle cellule che hanno alta attività metabolica⁸. Avanti abbiamo bisogno di stabilire una tecnica chirurgica che consente il trasferimento delle cellule e l'idrogel in omento. Ispirato il lipofilling utilizzato in chirurgia plastica⁹, abbiamo sviluppato l'isolotto di matrice h-omentale (hOMING) approccio di riempimento. Isolotti incorporati in idrogel vengono iniettati all'interno del tessuto omentale. La tecnica è anche finalizzato a fornire massimo attecchimento utilizzando più deposizioni di cella e idrogel della miscela nel tessuto omentale, dove il gran numero di vasi sanguigni inoltre migliora l'ossigenazione dell'innesto.

Nello studio presente, descriviamo una tecnica semplice ed innovativa per l'impianto dell'isolotto tra fogli omentale, all'interno del tessuto grasso più vicino ai vasi sanguigni. Si tratta di chirurgia micro-invasiva, che potrebbe essere completato in laparoscopia, con l'iniezione di isolotti contenute in un idrogel nel tessuto grasso. Questa tecnica è facilmente applicabile a tutte le combinazioni di idrogel e delle cellule che devono essere testati un in un ambiente metabolicamente funzionale.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le direttive del National Institutes of Health, con il numero di autorizzazione: AL/60/67/02/13.

1. preparazione destinatario

1. Chimicamente indurre il diabete in ratti destinatari.
   1. Iniettare 75 mg/kg dello streptozotocin (STZ, in sterile tampone citrato di 0,1 M, pH 4) intraperitonealmente ai ratti¹⁰.
      Nota: Per gli studi di trapianto, sono stati utilizzati ratti settimana-vecchio ceppo di Lewis 6, 150-190 g di peso.
   2. Controllare lo stato di diabete da misure della glicemia giornaliera durante i primi quattro giorni. Iniettare l'insulina ad azione prolungata 6 U/die per via sottocutanea quando ratti esibiscono glycemia più di 2 g/L per prevenire le complicanze del diabete e perdita di peso, fino a quando l'impianto di pellet di insulina.
   3. Sono ratti nella coorte quando due misure del glucosio nel sangue della vena della coda sono > 4-5 g/L per 2 giorni consecutivi e il livello di C-peptide è < 200 pM. Misurare la glicemia usando un glucometer e C-peptidemia da un'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA).
   4. Dell'impianto di pellet di insulina sotto la pelle (Vedi 1.2).
      Nota: Terapia insulinica cronica permette di legiferare meglio glycemia ed evita le complicazioni diabetiche (che esacerbano lo stress ossidativo presso il sito di trapianto)¹¹. Inoltre, la terapia conserva lo stato diabetico con una curva di crescita normale (senza perdita di peso usuale osservata in un animale diabetico). Questo può comportare un maggiore rilievo grasso omentale, che è l'ideale per lo svolgimento di trapianto.
2. Impianto di pellet di insulina
   1. Anestetizzare il ratto usando gas anestesia (3% isoflurane in 500 mL/min O₂) e posizionare il ratto in posizione prona.
   2. Verificare lo stato di anestesia controllando l'assenza del riflesso (zampa pizzicare). Pulire il collo con iodio povidone e radere la zona con una lama di rasoio. Applicare di nuovo lo iodio povidone e lasciar riposare per 3 minuti.
   3. 1.5 luogo insulina pellet (3 unità (U) / ratto 200 g) in una soluzione di iodio-povidone diluito 1:5 per sterilizzare i pellet. Bucare la pelle del collo con un trequarti 16g e inserire il pallino usando la guida arredato e mandrino. Recuperare la guida e il mandrino e unire un singolo punto. Utilizzare lo iodio povidone per pulire il punto.
      Nota: Nessuna gestione del dolore post-operatorio è stato necessaria in quanto l'intervento era paragonabile a una singola iniezione sottocutanea (SC).
   4. Lasciate che il ratto recuperare dall'anestesia e garantire che i ratti hanno accesso al cibo per evitare l'ipoglicemia.
   5. Misurare l'efficienza di pellet misurando la diminuzione di glicemia dopo l'impianto.
   6. Verificare l'efficienza di pellet monitorando il livello di glicemia ogni settimana per 1 mese.
   7. Sono ratti nella coorte quando una misura del livello di coda vena sangue C peptide è mantenuta sotto 200 pM 1 mese dopo l'impianto di pellet di insulina.
      Nota: Controllo dei livelli di C-peptide è obbligatorio per valutare gli animali alla linea di base prima di trapianto e per confermare il loro stato diabetico. Rigenerazione di C-peptide basso sempre si verifica durante il follow-up. Il più basso C-peptidemia è indicativo della rigenerazione minima.

2. hOMING: Intra-omentale Matrix isolotto riempimento

1. Preparazione della miscela dell'isolotto-matrice.
   1. Preparare il vettore viscoso dell'isolotto in cappa a flusso laminare. Sciogliere la polvere di alginato in PBS sterile ad una concentrazione di 1,5%. Sterilizzare la preparazione di passaggio attraverso un filtro da 0,22 µm. Preparare 400 µ l per ogni destinatario.
      Nota: Può essere utilizzato qualsiasi tipo di idrogel con una viscosità adatta per iniezione attraverso un ago 21G.
   2. Isolare isolotto da ratti Lewis sani (200-250 g) come descritto in precedenza¹².
   3. Conteggio dell'isolotto in equivalenti di isolotto (IEQ) (uno IEQ è considerato equivalente a un isolotto pancreatico con un diametro di 150 µm)¹³.
   4. In una cappa a flusso laminare, preparare aliquote di 7660-isolotto equivalente (IEQ) in una provetta da 1,5 mL.
   5. Lavare le aliquote di isolotti con 500 µ l di terreno CMRL (laboratori di ricerca medica di Connaught) gratuito di siero bovino fetale.
   6. A pellet isolotti mediante centrifugazione (2 min a 500 x g e a 4 ° C). Scartare il surnatante.
   7. Aggiungere 150 µ l di vettore di idrogel di alginato sopra gli isolotti, miscelare accuratamente pipettando su e giù e mettere la miscela sul ghiaccio.
   8. Preparare un ago 21G atraumatico e una siringa da 1 mL senza volume morto caricando 150 µ l di alginato vuota nella siringa.
   9. Riempire la siringa con la miscela di isolotti e di alginato (150 µ l, volume totale 300 µ l). Tenere la siringa sul ghiaccio.
2. Procedura chirurgica
   1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici mediante sterilizzazione a freddo (2% Steranios per 20 min).
   2. Anestetizzare il ratto usando l'anestesia di isoflurano e posizionare il ratto in posizione prona.
   3. Radere la zona del collo utilizzando una lama di rasoio e sterilizzare la zona con povidone iodio. Lasciate lo iodio riposare per 3 minuti.
   4. Fare un'incisione con un bisturi e rimuovere il pellet di 1,5 insulina con forcipe. Chiudere la pelle utilizzando uno o due punti di punto singolo. Non rimuovere il ratto dall'anestesia.
      Nota: Dopo 1 mese, il pellet può essere friabile come alcuni tessuto fibrotico può avvolgere come pellet; usare le forbici per disseccarla correttamente.
   5. Posto il ratto nella posizione supina. Rasatura e sterilizzare (con lo iodio povidone) la zona peritoneale. Lasciate lo iodio riposare per 3 minuti.
   6. Creare una laparotomia di 1,5 cm appena sotto lo sterno usando un bisturi. Posto bagnato-garza sterile intorno all'area incisa.
   7. Identificare l'omento è il cuscinetto di grasso localizzato accanto allo stomaco. Utilizzare pinze per attentamente prendere l'omento, estrarla delicatamente la cavità peritoneale e diffonderlo sulla garza.
      Nota: Il tessuto omentale si estende dalla milza al duodeno e si attacca al suo punto medio allo stomaco. L'omento normale dei ratti diabetici che ricevono la terapia dell'insulina è di circa 2 cm ² quando pubblicizza sulla garza.
   8. Idratare il tessuto omentale bene con 2 mL di soluzione salina sterile preriscaldata 37 ° C. Utilizzare piccolo forcipe curvo per manipolare il tessuto e penetrare il bordo omentale con l'ago tra gli strati omentali. Inserire l'ago completamente.
   9. Avviare l'iniezione della preparazione dell'isolotto lentamente e con attenzione spostare l'ago indietro per iniettare gli isolotti in diversi luoghi (come linee). Prima di ritirare l'ago, assicurarsi che l'idrogel ha smesso di uscire l'ago per evitare la perdita degli isolotti dispersi.
   10. Ripetere questa manipolazione per iniettare l'intero contenuto della siringa utilizzando punti di ingresso diversi per distribuire gli isolotti durante il tessuto omentale.
       Nota: Nei ratti, quattro o cinque iniezioni sono generalmente necessari.
   11. Verifica che gli isolotti non cluster nella siringa alla fine delle iniezioni.
       Nota: Se alcuni isolotti sono ancora visibili, è possibile ritirare l'ago dalla siringa, riempire la siringa direttamente con 100 µ l di idrogel vuota e riconnettere l'ago. Un secondo ciclo di iniezione può essere fatto per scovare gli isolotti rimanenti.
   12. Utilizzare una soluzione salina sterile nuovamente per idratare il tessuto omentale ed il muro della laparotomia. Utilizzare pinze per sostituire attentamente omento nella cavità addominale.
   13. Iniettare 2 mL di soluzione salina sterile pre-riscaldata nella cavità addominale per reidratare il ratto.
   14. Chiudere la parete muscolare utilizzando una sutura di filo continuo. Poi cucire lo strato cutaneo con punto singolo punto (punto per punto).
   15. Iniettare per via sottocutanea meloxicam (1,5 mg/kg) come un analgesico per 5 giorni una volta al giorno.
   16. Posto il ratto in una gabbia su un rilievo di riscaldamento fino al recupero dall'anestesia. Ripetere la procedura per tutti i ratti destinatari.
   17. Misurare il glucosio nel sangue dopo trapianto ogni giorno. Se la glicemia è > 2 g/L, iniettare 6 U di insulina ad azione prolungata per via sottocutanea una volta al giorno.
   18. Valutare la funzione dell'innesto di glicemia e c-peptidemia monitoraggio oltre 1 o 2 mesi.
       Nota: Nei casi di riuscito trapianto, glicemia dovrebbe stabilizzarsi entro 2-5 giorni dopo il trapianto, e ratti possono essere tolto l'insulina.

3. omentale innesto espianto

Nota: Questa procedura consentirà la conferma della funzione dell'innesto buona. Dopo il recupero di un innesto funzionale, ratti dovrebbero tornare a uno stato diabetico. Questo passaggio viene eseguito dopo 1 o 2 mesi di follow-up metabolico.

1. Anestetizzare il topo con anestesia di gas e collocarlo nella posizione supina.
2. Radere la zona peritoneale e sterilizzarlo con iodio povidone per 3 min.
3. Creare una laparotomia di 1,5 cm appena sotto sterno usando un bisturi. Posto garza sterile bagnato tutto intorno alla zona incisa.
4. Identificare l'omento, che si trova accanto allo stomaco. Utilizzare pinze per allargare con cautela sulla garza.
5. Usare le forbici per asportare l'omento. Iniziare dalla parte che aderisce sulla coda del pancreas (accanto alla milza). Se il sanguinamento si verifica, è possibile utilizzare garza sterile asciutta per fermarlo.
6. Continuare l'asportazione lungo la parte attaccata allo stomaco e recuperare l'omento.
   Nota: In questa posizione, arterie gastroepiploica (Figura 1) possono causare una grande quantità di sanguinamento se accidentalmente vengono tagliati. Incisioni dell'arteria sono inevitabili per recuperare l'innesto, ma sanguinamento possa essere gestita utilizzando forcipe e garza. In caso di un taglio accidentale, comprimere saldamente con garza asciutta e mantenere la compressione per almeno 1 min. Il sanguinamento dovrebbe smettere. In caso contrario, utilizzare clip oppure utilizzare un bisturi elettrico per cauterizzare i vasi.

Figura 1: distribuzione dell'arteria omentale. Per espianto di innesto di omento, l'area critica composto da arterie gastroepiploica è rappresentato in blu. Durante la resezione di questa parte del tessuto omentale, attenzione deve essere deve essere pagato alla sezione dell'arteria gastroepiploic di destra. Compressione, legatura o cauterizzazione può essere utilizzato per limitare il sanguinamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

7. Verificare se qualsiasi sanguinamento persiste. In caso contrario, iniettare 2 mL di soluzione fisiologica pre-riscaldato, chiudere il ratto e di processo come descritto in precedenza.
    Animali espiantati tornare a uno stato diabetico. Iniezione dell'insulina (6 U/SC/giorno) è quindi obbligatorio per garantire il benessere degli animali.
8. Eutanasia ratto 10-12 giorni dopo il explantation utilizzando un'overdose di pentobarbital (182,2 mg/kg).

4. istologici: Ematossilina ed eosina

1. Difficoltà il omenta estratto usando paraformaldeide al 4% (PFA) e incorporare in paraffina.
2. Tagliare sezioni 4 µm di spessore e macchia dell'eosina e per la valutazione morfologica del trapianto.

5. elaborazione statistica

1. Determinare la significatività statistica utilizzando software di analisi statistica e misure ripetute analisi della varianza (ANOVA) con test di Tukey significato onesta differenza come un test post-hoc. Rappresentano i valori di p come: *p < 0,05; p < 0.01; p < 0,001.

Il metodo di hOMING consente l'evitare l'impianto intravascolare ed il confinamento degli isolotti a un organo. Un tempo massimo di 8-10 min è necessario per la procedura di impianto intero isolotto, tra cui l'anestesia, che un diario paragonabile al classico trapianto del fegato.

Per studiare il modo di isolotti sono distribuiti all'interno del tessuto omentale, perle di destrano sono stati trapiantati utilizzando il metodo di hOMING (Figura 2). Un giorno dopo l'impianto, i ratti sono stati sacrificati, e tessuti omentale sono stati recuperati per l'analisi istologica. Ematossilina ed eosina ha rivelato una distribuzione uniforme delle perle in tutto il tessuto (Figura 2in basso a destra). Molto spesso, perline erano vicino ai vasi sanguigni ed erano ben impiantati nel tessuto grasso. Subito dopo l'impianto, una reazione infiammatoria si verifica intorno le perline, con conseguente riorganizzazione del tessuto per nidificare le isolette nel tessuto.

Figura 2: Descrizione di hOMING distribuzione tecnica e perlina attraverso il tessuto omentale un giorno dopo impianto. (A) illustrazione della tecnica hOMING. Dopo l'esposizione dell'organo (A, a sinistra), il mix di isolotto-idrogel (sostituito qui da perline di destrano di colore blu per una migliore visualizzazione) con attenzione è stato iniettato nel tessuto usando un ago atraumatico (un, al centro). Impiantati nel tessuto di perline sono visibile (A destra). (B) ematossilina ed eosina di omento espiantati 1 giorno dopo l'iniezione della perla. Perle si trovano nel tessuto con una distribuzione uniforme. Barra della scala = 100 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per convalidare questa tecnica, abbiamo svolto gli studi isogeni utilizzando ratti Lewis (n = 8). Ratti diabetici che ricevono trapianto dell'isolotto (equivalente dell'isolotto 7660, IEQ) per peso corporeo ratto utilizzando hOMING sono stati controllati per glicemia e C-peptidemia per due mesi. Glicemia è stata controllata tramite impianto di pellet di insulina (come attesta il primo calo di glicemia osservato in Figura 3A). La funzione dell'innesto è stata riflessa da glycemia di circa 2 g/L e C-peptidemia > 500 pM. Prima del trapianto, i ratti erano diabetici (glicemia > 5 g/L e C-peptidemia < 200 pM). Dopo il trapianto e il recupero di pellet di insulina, normalizzazione e manutenzione di glicemia è stata osservata solo 3 giorni di post-hOMING trapianto e fu mantenuto fino al recupero dell'innesto (p < 0,05 rispetto per livelli di pre-trapianto). Dopo espianto omentale, glicemia aumentato ancora al livello pre-trapianto, che attesta la funzionalità degli isolotti che sono stati trapiantati di hOMING (Figura 3A). Il modello C-peptidemia era esattamente l'opposto, con bassi a livelli non rilevabili prima dell'innesto, seguita da un aumento e manutenzione a questo livello aumentato nel corso dello studio (p < 0,05) e, dopo l'espianto omentale, un diminuire per pre-trapianto livelli (Figura 3B). Analisi dell'omento explanted dall'istologia ha rivelato altamente ri-vascularized isolotti, probabilmente a causa della loro vicinanza ai vasi sanguigni (Figura 3).

Figura 3: follow-up metabolico di due mesi di ratti che ricevono l'hOMING e innesto valutazione. Glicemia (A) misurazione e valutazione di C-peptide (B) dopo hOMING usando alginato come elemento portante dell'isolotto (Tx: trapianto e il recupero di pellet di insulina; Espianto: Espianto dell'omento). Gli innesti sono funzionali, come è illustrato dal mantenimento di normoglycemia dopo ricupero del pellet di insulina e aumentano della C-peptidemia dopo l'impianto dell'isolotto. Zone ombreggiate grigie rappresentano i valori minimi e massimi registrati in ogni momento. (C) ematossilina ed eosina di una sezione omentale dopo trapianto di insule pancreatiche utilizzando il metodo hOMING. Gli isolotti sono ben integrati nel tessuto due mesi dopo l'impianto senza alcun tessuto fibrotico circostante. Vasi sono cresciuti attorno e all'interno di isolotti, come indicato dalle frecce e quindi completamente il ripristino della funzione dell'isolotto. Morfologia degli isolotti sembra anche ben conservata. Scala bar = 50 µm. (n = 8) (*p < 0.05; * * p < 0.01; * * * p < 0,001 determinato utilizzando le misure ripetute analisi della varianza (ANOVA) con test di Tukey significato onesta differenza come un test post-hoc). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.