Name: Utilizzo di trapianto dellisolotto intra-omentale di riempimento Matrix isolotto h-omentale (hOMING) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Impara la tecnica hOMING per il trapianto di isole pancreatiche nel tessuto omentale usando idrogeli di alginato. Questo metodo semplice e veloce migliora l'innesto cellulare e la rivascolarizzazione nei modelli preclinici di diabete.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla Région Alsace, CQDM-BioArtMAtrix-Pôle Alsazia Biovalley; 53/14/C1. Gli autori sono grati al team di Pr. Bruant-Rodier dal Hôpitaux Universitaires de Strasburgo per aiutare a sviluppare questa tecnica innovativa.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le direttive del National Institutes of Health, con il numero di autorizzazione: AL/60/67/02/13.
1. preparazione destinatario
<ol><li>
Chimicamente indurre il diabete in ratti destinatari.
	<ol>
<li>Iniettare 75 mg/kg dello streptozotocin (STZ, in sterile tampone citrato di 0,1 M, pH 4) intraperitonealmente ai ratti10. Nota: Per gli studi di trapianto, sono stati utilizzati ratti settimana-vecchio ceppo di Lewis 6, 150-190 g di peso.</li>
		<li>Controllare lo stato di diabete da misure della glicemia giornaliera durante i primi quattro giorni. Iniettare l'insulina ad azione prolungata 6 U/die per via sottocutanea quando ratti esibiscono glycemia più di 2 g/L per prevenire le complicanze del diabete e perdita di peso, fino a quando l'impianto di pellet di insulina.</li>
		<li>Sono ratti nella coorte quando due misure del glucosio nel sangue della vena della coda sono &gt; 4-5 g/L per 2 giorni consecutivi e il livello di C-peptide è &lt; 200 pM. Misurare la glicemia usando un glucometer e C-peptidemia da un'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA).</li>
		<li>Dell'impianto di pellet di insulina sotto la pelle (Vedi 1.2). Nota: Terapia insulinica cronica permette di legiferare meglio glycemia ed evita le complicazioni diabetiche (che esacerbano lo stress ossidativo presso il sito di trapianto)11. Inoltre, la terapia conserva lo stato diabetico con una curva di crescita normale (senza perdita di peso usuale osservata in un animale diabetico). Questo può comportare un maggiore rilievo grasso omentale, che è l'ideale per lo svolgimento di trapianto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Impianto di pellet di insulina
	<ol>
<li>Anestetizzare il ratto usando gas anestesia (3% isoflurane in 500 mL/min O2) e posizionare il ratto in posizione prona.</li>
		<li>Verificare lo stato di anestesia controllando l'assenza del riflesso (zampa pizzicare). Pulire il collo con iodio povidone e radere la zona con una lama di rasoio. Applicare di nuovo lo iodio povidone e lasciar riposare per 3 minuti.</li>
		<li>1.5 luogo insulina pellet (3 unità (U) / ratto 200 g) in una soluzione di iodio-povidone diluito 1:5 per sterilizzare i pellet. Bucare la pelle del collo con un trequarti 16g e inserire il pallino usando la guida arredato e mandrino. Recuperare la guida e il mandrino e unire un singolo punto. Utilizzare lo iodio povidone per pulire il punto. Nota: Nessuna gestione del dolore post-operatorio è stato necessaria in quanto l'intervento era paragonabile a una singola iniezione sottocutanea (SC).</li>
		<li>Lasciate che il ratto recuperare dall'anestesia e garantire che i ratti hanno accesso al cibo per evitare l'ipoglicemia.</li>
		<li>Misurare l'efficienza di pellet misurando la diminuzione di glicemia dopo l'impianto.</li>
		<li>Verificare l'efficienza di pellet monitorando il livello di glicemia ogni settimana per 1 mese.</li>
		<li>Sono ratti nella coorte quando una misura del livello di coda vena sangue C peptide è mantenuta sotto 200 pM 1 mese dopo l'impianto di pellet di insulina. Nota: Controllo dei livelli di C-peptide è obbligatorio per valutare gli animali alla linea di base prima di trapianto e per confermare il loro stato diabetico. Rigenerazione di C-peptide basso sempre si verifica durante il follow-up. Il più basso C-peptidemia è indicativo della rigenerazione minima.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hOMING: Intra-omentale Matrix isolotto riempimento
<ol><li>
Preparazione della miscela dell'isolotto-matrice.
	<ol>
<li>Preparare il vettore viscoso dell'isolotto in cappa a flusso laminare. Sciogliere la polvere di alginato in PBS sterile ad una concentrazione di 1,5%. Sterilizzare la preparazione di passaggio attraverso un filtro da 0,22 µm. Preparare 400 µ l per ogni destinatario. Nota: Può essere utilizzato qualsiasi tipo di idrogel con una viscosità adatta per iniezione attraverso un ago 21G.</li>
		<li>Isolare isolotto da ratti Lewis sani (200-250 g) come descritto in precedenza12.</li>
		<li>Conteggio dell'isolotto in equivalenti di isolotto (IEQ) (uno IEQ è considerato equivalente a un isolotto pancreatico con un diametro di 150 µm)13.</li>
		<li>In una cappa a flusso laminare, preparare aliquote di 7660-isolotto equivalente (IEQ) in una provetta da 1,5 mL.</li>
		<li>Lavare le aliquote di isolotti con 500 µ l di terreno CMRL (laboratori di ricerca medica di Connaught) gratuito di siero bovino fetale.</li>
		<li>A pellet isolotti mediante centrifugazione (2 min a 500 x g e a 4 ° C). Scartare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 150 µ l di vettore di idrogel di alginato sopra gli isolotti, miscelare accuratamente pipettando su e giù e mettere la miscela sul ghiaccio.</li>
		<li>Preparare un ago 21G atraumatico e una siringa da 1 mL senza volume morto caricando 150 µ l di alginato vuota nella siringa.</li>
		<li>Riempire la siringa con la miscela di isolotti e di alginato (150 µ l, volume totale 300 µ l). Tenere la siringa sul ghiaccio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedura chirurgica
	<ol>
<li>Sterilizzare gli strumenti chirurgici mediante sterilizzazione a freddo (2% Steranios per 20 min).</li>
		<li>Anestetizzare il ratto usando l'anestesia di isoflurano e posizionare il ratto in posizione prona.</li>
		<li>Radere la zona del collo utilizzando una lama di rasoio e sterilizzare la zona con povidone iodio. Lasciate lo iodio riposare per 3 minuti.</li>
		<li>Fare un'incisione con un bisturi e rimuovere il pellet di 1,5 insulina con forcipe. Chiudere la pelle utilizzando uno o due punti di punto singolo. Non rimuovere il ratto dall'anestesia. Nota: Dopo 1 mese, il pellet può essere friabile come alcuni tessuto fibrotico può avvolgere come pellet; usare le forbici per disseccarla correttamente.</li>
		<li>Posto il ratto nella posizione supina. Rasatura e sterilizzare (con lo iodio povidone) la zona peritoneale. Lasciate lo iodio riposare per 3 minuti.</li>
		<li>Creare una laparotomia di 1,5 cm appena sotto lo sterno usando un bisturi. Posto bagnato-garza sterile intorno all'area incisa.</li>
		<li>Identificare l'omento è il cuscinetto di grasso localizzato accanto allo stomaco. Utilizzare pinze per attentamente prendere l'omento, estrarla delicatamente la cavità peritoneale e diffonderlo sulla garza. Nota: Il tessuto omentale si estende dalla milza al duodeno e si attacca al suo punto medio allo stomaco. L'omento normale dei ratti diabetici che ricevono la terapia dell'insulina è di circa 2 cm ² quando pubblicizza sulla garza.</li>
		<li>Idratare il tessuto omentale bene con 2 mL di soluzione salina sterile preriscaldata 37 ° C. Utilizzare piccolo forcipe curvo per manipolare il tessuto e penetrare il bordo omentale con l'ago tra gli strati omentali. Inserire l'ago completamente.</li>
		<li>Avviare l'iniezione della preparazione dell'isolotto lentamente e con attenzione spostare l'ago indietro per iniettare gli isolotti in diversi luoghi (come linee). Prima di ritirare l'ago, assicurarsi che l'idrogel ha smesso di uscire l'ago per evitare la perdita degli isolotti dispersi.</li>
		<li>Ripetere questa manipolazione per iniettare l'intero contenuto della siringa utilizzando punti di ingresso diversi per distribuire gli isolotti durante il tessuto omentale. Nota: Nei ratti, quattro o cinque iniezioni sono generalmente necessari.</li>
		<li>Verifica che gli isolotti non cluster nella siringa alla fine delle iniezioni. Nota: Se alcuni isolotti sono ancora visibili, è possibile ritirare l'ago dalla siringa, riempire la siringa direttamente con 100 µ l di idrogel vuota e riconnettere l'ago. Un secondo ciclo di iniezione può essere fatto per scovare gli isolotti rimanenti.</li>
		<li>Utilizzare una soluzione salina sterile nuovamente per idratare il tessuto omentale ed il muro della laparotomia. Utilizzare pinze per sostituire attentamente omento nella cavità addominale.</li>
		<li>Iniettare 2 mL di soluzione salina sterile pre-riscaldata nella cavità addominale per reidratare il ratto.</li>
		<li>Chiudere la parete muscolare utilizzando una sutura di filo continuo. Poi cucire lo strato cutaneo con punto singolo punto (punto per punto).</li>
		<li>Iniettare per via sottocutanea meloxicam (1,5 mg/kg) come un analgesico per 5 giorni una volta al giorno.</li>
		<li>Posto il ratto in una gabbia su un rilievo di riscaldamento fino al recupero dall'anestesia. Ripetere la procedura per tutti i ratti destinatari.</li>
		<li>Misurare il glucosio nel sangue dopo trapianto ogni giorno. Se la glicemia è &gt; 2 g/L, iniettare 6 U di insulina ad azione prolungata per via sottocutanea una volta al giorno.</li>
		<li>Valutare la funzione dell'innesto di glicemia e c-peptidemia monitoraggio oltre 1 o 2 mesi. Nota: Nei casi di riuscito trapianto, glicemia dovrebbe stabilizzarsi entro 2-5 giorni dopo il trapianto, e ratti possono essere tolto l'insulina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. omentale innesto espianto
Nota: Questa procedura consentirà la conferma della funzione dell'innesto buona. Dopo il recupero di un innesto funzionale, ratti dovrebbero tornare a uno stato diabetico. Questo passaggio viene eseguito dopo 1 o 2 mesi di follow-up metabolico.
<ol><li>Anestetizzare il topo con anestesia di gas e collocarlo nella posizione supina.</li>
	<li>Radere la zona peritoneale e sterilizzarlo con iodio povidone per 3 min.</li>
	<li>Creare una laparotomia di 1,5 cm appena sotto sterno usando un bisturi. Posto garza sterile bagnato tutto intorno alla zona incisa.</li>
	<li>Identificare l'omento, che si trova accanto allo stomaco. Utilizzare pinze per allargare con cautela sulla garza.</li>
	<li>Usare le forbici per asportare l'omento. Iniziare dalla parte che aderisce sulla coda del pancreas (accanto alla milza). Se il sanguinamento si verifica, è possibile utilizzare garza sterile asciutta per fermarlo.</li>
	<li>Continuare l'asportazione lungo la parte attaccata allo stomaco e recuperare l'omento. Nota: In questa posizione, arterie gastroepiploica (Figura 1) possono causare una grande quantità di sanguinamento se accidentalmente vengono tagliati. Incisioni dell'arteria sono inevitabili per recuperare l'innesto, ma sanguinamento possa essere gestita utilizzando forcipe e garza. In caso di un taglio accidentale, comprimere saldamente con garza asciutta e mantenere la compressione per almeno 1 min. Il sanguinamento dovrebbe smettere. In caso contrario, utilizzare clip oppure utilizzare un bisturi elettrico per cauterizzare i vasi.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58898/58898fig1.jpg"> Figura 1: distribuzione dell'arteria omentale. Per espianto di innesto di omento, l'area critica composto da arterie gastroepiploica è rappresentato in blu. Durante la resezione di questa parte del tessuto omentale, attenzione deve essere deve essere pagato alla sezione dell'arteria gastroepiploic di destra. Compressione, legatura o cauterizzazione può essere utilizzato per limitare il sanguinamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58898/58898fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="7"><li>Verificare se qualsiasi sanguinamento persiste. In caso contrario, iniettare 2 mL di soluzione fisiologica pre-riscaldato, chiudere il ratto e di processo come descritto in precedenza.  Animali espiantati tornare a uno stato diabetico. Iniezione dell'insulina (6 U/SC/giorno) è quindi obbligatorio per garantire il benessere degli animali.</li>
	<li>Eutanasia ratto 10-12 giorni dopo il explantation utilizzando un'overdose di pentobarbital (182,2 mg/kg).</li>
</ol>4. istologici: Ematossilina ed eosina
<ol><li>Difficoltà il omenta estratto usando paraformaldeide al 4% (PFA) e incorporare in paraffina.</li>
	<li>Tagliare sezioni 4 µm di spessore e macchia dell'eosina e per la valutazione morfologica del trapianto.</li>
</ol>5. elaborazione statistica
<ol><li>Determinare la significatività statistica utilizzando software di analisi statistica e misure ripetute analisi della varianza (ANOVA) con test di Tukey significato onesta differenza come un test post-hoc. Rappresentano i valori di p come: *p &lt; 0,05; p &lt; 0.01; p &lt; 0,001.</li>
</ol>

<ol><li>Bakhshandeh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3B+strategies%2C+tissues%2C+and+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+genetic+engineering+reviews%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering; strategies, tissues, and biomaterials.</a> Biotechnology & genetic engineering reviews. 33, 144-172 (2017).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Alcuni passaggi critici possono essere evidenziate nel presente protocollo. In primo luogo, la persona che esegue l'intervento chirurgico e manipolare i tessuti deve essere delicata con il tessuto grasso, come è fragile. Schiacciare o danneggiare l'omento deve essere evitato. Omento, come un tessuto difensivo, si arricchisce in macrofagi ed altri leucociti. Queste cellule immuni possono essere attivate tramite manipolazione eccessiva e potrebbero influenzare negativamente l'innesto. In secondo luogo, innesto (isolotto-idrogel miscela) caricamento è anche critico. La persona che esegue la procedura deve evitare i volumi morti e tutta la miscela di idrogel-isolotto deve caricare il dispositivo di iniezione. Subito dopo questo passaggio, un altro punto critico è l'iniezione stessa. Iniezione deve essere effettuata lentamente, con cura e delicatamente. La siringa deve essere lavata dall'idrogel vuoto caricato inizialmente per recuperare qualsiasi isolotti rimanenti. In terzo luogo, la sutura deve essere fatto con attenzione e in due passaggi. Il piano muscolare deve essere suturato in primo luogo, avendo cura di non per suturare l'omento con il muscolo, e la pelle deve essere suturata separatamente. Per quanto riguarda la procedura di espianto per l'innesto omentale, particolare attenzione dovrebbe essere presa al momento quando sono incise le arterie vicino allo stomaco (arterie gastroepiploica). È importante prestare attenzione alle eventuali emorragie che si verificano e fermarli prima sutura l'animale, come qualsiasi porta sanguinamento persistente alla morte animale entro alcuni giorni.
Risoluzione dei problemi può essere necessario per quanto riguarda il mezzo per il trasporto di isolotti; la scelta di idrogel spetta allo sperimentatore, fintanto che l'idrogel è iniettabile. L'uso di materiali diversi può provocare la variabile dell'innesto di funzione (con o senza il completamento, per esempio). Il metodo qui descritto ha dimostrato la sua efficienza per materiale inerte Co-trapianto con un rapporto dell'isolotto di 7660 IEQ/kg.
Il presente metodo può essere limitato dalle dimensioni omentale e proprietà di idrogel. Per utilizzare un modello di roditore diabetico, la terapia insulinica è obbligatoria prima dell'impianto dell'isolotto per fornire sufficiente area di innesto. Roditori diabetici perdono un sacco di peso e massa grassa a causa di diabete indotto STZ. Considerando il piccolo peso degli animali iscritti a questo studio, non è possibile l'innesto in un'area ancora più piccola.
Conservazione della glicemia corretta gestione (prima del trapianto usando le palline e da allora in poi usando l'insulina ad azione prolungata) è obbligatorio. Qui, abbiamo scelto di conservare il pellet di insulina fino al giorno del trapianto per diversi motivi. In primo luogo, il mantenimento di un controllo glicemico adeguato riduce notevolmente lo sforzo ossidativo indotto da diabete negli organi destinatari, che possono essere deleteri per isolotto innesto11 e permette la continuazione della terapia insulinica intensiva e destinatario preparazione osservata nella clinica12. In secondo luogo, abbiamo voluto limitare il numero massimo delle procedure di anestesia per i ratti. Per quanto riguarda l'attuazione della terapia dell'insulina durante il follow-up metabolico usando l'insulina ad azione prolungata, lo schema utilizzato evitato enormi complicazioni dovuto glucotossicità (che è in grado di distruggere gli innesti) e di conservare un valore di glicemia "reale".
Per monitorare l'efficienza dell'innesto, glicemia non è un parametro rilevante nei primi giorni se ratti stanno ricevendo la terapia di insulina usando le palline. Ecco perché controllare il livello di C-peptide diverse volte prima di trapiantare è obbligatorio. Questi tempi sono all'inizio dello studio, per selezionare gli animali dopo l'iniezione di STZ e poi appena prima del trapianto, per garantire che i ratti rimangano diabetiche e che la rigenerazione è minima.
Proprietà di idrogel sono anche importanti. Idrogel liquido colerà fuori tessuto omentale e altamente viscosi idrogel non sarà iniettabili. Iniettabilità e idrogel viscosità deve essere testato prima dell'uso, ma sembra indispensabile per testare anche il materiale direttamente dalla valutazione dell'isolotto o un'altra sopravvivenza di cellule in vitro. Qui, come isolotti sono molto sensibili ad ipossia e l'uso di un vettore altamente viscoso può influenzare la diffusione dell'ossigeno.
In termini di entità del metodo descritto qui per quanto riguarda i metodi esistenti, questa tecnica di trapianto intra-tessuto ha benefici in termini di riproducibilità. È anche atraumatica per il tessuto e, grazie alla sua posizione extra-vascolare, evita i rischi di emorragie e trombosi. Inoltre, quando si considera il trapianto dell'isolotto, immediata reazione infiammatoria mediata dal sangue è evitato14. HOMING consente inoltre di trapianto isolotti in un organo non-vitale, a differenza di trapianto nel fegato, che costituisce un rischio in termini di funzionalità epatica15.
Per ottenere prestazioni ottimali, deve essere adattata alle cellule che porterà un idrogel. Uso di fattori di crescita o proteine specifiche possa avere un effetto positivo su cellule trapiantate16,17.
Per concludere, questa tecnica può essere utilizzata per la convalida in vivo di un idrogel su tipi cellulari differenti, soprattutto quando è necessario un ambiente metabolico attivo, per quanto riguarda gli isolotti. Inoltre, questa tecnica chirurgica è applicabile a più applicazioni e potrebbe essere, in futuro, rapidamente trasferibile agli esseri umani, come può essere facilmente eseguita mediante laparoscopia.

Terapia cellulare è un tema caldo, come ha lo scopo di curare malattie basate sulla medicina rigenerativa. Terapie cellulari assistita da materiale biologico sono stati sempre più studiate negli ultimi anni, soprattutto perché l'impianto delle cellule spesso richiede un vettore per il trasferimento delle cellule dalla piastra di coltura al destinatario. Biomateriale ponteggi sono vettori di cellule potenzialmente importante che soddisfano diversi ruoli1. Un vettore competente dovrebbe proteggere le cellule da sollecitazioni meccaniche e fornire condizioni di crescita favorevoli, quali fattori di crescita essenziali, l'escrezione dei rifiuti metabolico, scambio di sostanze nutritive e ossigeno2.
Tra i diversi tipi di biomateriali utilizzati nella terapia cellulare, idrogeli hanno molti vantaggi. Essi sono biocompatibili, biodegradabile, facile da maneggiare e facilitare la diffusione di ossigeno3. Inoltre, la tecnologia attuale permette l'utilizzo di idrogel per aiutare le cellule sopravvivono e interdigitate con, ad esempio, il completamento con fattori di crescita o di proteine di matrice extra-cellulare4.
Vettori di idrogel contenenti cellule staminali possono essere iniettati come trattamenti, ad esempio, dell'osso rigenerazione5 e sistema nervoso malattia6. L'impianto di cellule metabolicamente attive è necessario. Mentre è possibile convalidare in vitro dell'approccio, strumenti e tecniche per la convalida in vivo rimangono per essere raffinato.
Trapianto delle cellule e idrogel facilmente può essere effettuato mediante iniezione sottocutanea quando sono condotte prove di biocompatibilità. Tuttavia, quando le cellule innestate sono destinate a regolare i fattori sistemici di loro azione metabolica, questa localizzazione sottocutanea non è ottima, essenzialmente in termini di drenaggio venoso7. Di conseguenza, non sono disponibili strumenti attuali in modo rapido, sicuro ed efficiente valutare gli effetti benefici di un idrogel. Sulla base dell'esempio di trapianto dell'isolotto, che richiede che gli ormoni rilasciati nel flusso sanguigno dall'innesto in risposta a livelli di glucosio nel sangue, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per l'impianto delle cellule/idrogel in vivo.
Il primo passo era quello di identificare un sito accettore di trapianto, che può accettare un idrogel con cellule. L'omento offre un ampio spazio per l'impianto, è altamente plastico, e sua vascolarizzazione denso combinato con l'impostazione intraperitoneale è interessante per lo studio delle cellule che hanno alta attività metabolica8. Avanti abbiamo bisogno di stabilire una tecnica chirurgica che consente il trasferimento delle cellule e l'idrogel in omento. Ispirato il lipofilling utilizzato in chirurgia plastica9, abbiamo sviluppato l'isolotto di matrice h-omentale (hOMING) approccio di riempimento. Isolotti incorporati in idrogel vengono iniettati all'interno del tessuto omentale. La tecnica è anche finalizzato a fornire massimo attecchimento utilizzando più deposizioni di cella e idrogel della miscela nel tessuto omentale, dove il gran numero di vasi sanguigni inoltre migliora l'ossigenazione dell'innesto.
Nello studio presente, descriviamo una tecnica semplice ed innovativa per l'impianto dell'isolotto tra fogli omentale, all'interno del tessuto grasso più vicino ai vasi sanguigni. Si tratta di chirurgia micro-invasiva, che potrebbe essere completato in laparoscopia, con l'iniezione di isolotti contenute in un idrogel nel tessuto grasso. Questa tecnica è facilmente applicabile a tutte le combinazioni di idrogel e delle cellule che devono essere testati un in un ambiente metabolicamente funzionale.

<table><tbody><tr><td>Alginato (PRONOVA UP LMV)Novamatrix</td><td></td> <td>4200206</td><td>Hydrogel carrier</td></tr><tr><td>Ago atraumatico (Blunt)</td><td>B.Braun</td><td>9180109</td><td></td></tr><tr><td>CMRL senza FBS</td><td>Gibco</td><td>11500576</td><td></td></tr><tr><td>kit ELISA per peptidi C</td><td>Mercodia</td><td>10-1172-01</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Leica Microsystems</td><td>3801592E</td><td></td></tr><tr><td>Ethilon 4/0</td><td>Ethicon</td><td>F2414</td><td>Sutura chirurgica</td></tr><tr><td>Ematossilina</td><td>Leica Microsystems</td><td>3801562E</td><td></td></tr><tr><td>Pellet di insulina</td><td>Linshin</td><td>INS-B14</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane</td><td>Centravet</td><td>ISO007</td><td></td></tr><tr><td>Lantus (Insulin-Glargin)</td><td>Sanofi Adventis</td><td>Lantus SoloStar</td><td>Insulina a lunga durata d'azione</td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>MET019</td><td>Farmaco antinfiammatorio</td></tr><tr><td>NaCl (per soluzione salina 0,9%)</td><td>Sigma</td><td>10112640</td><td></td></tr><tr><td>Ago 26 G</td><td>TERUMO</td><td>050101B</td><td></td></tr><tr><td>Ossigeno</td><td>Linde</td><td>2010152</td><td>Per uso di isoflurano</td></tr><tr><td>Pentobarbital di sodio</td><td>Vetoquinol</td><td>Dolethal</td><td>Per eutanasia</td></tr><tr><td>Steranios 2%</td><td>Anios</td><td>11764046</td><td></td></tr><tr><td>Streptozotocina</td><td>Santa-Cruz</td><td>SC-200719A</td><td></td></tr><tr><td>Siringa &ndash; Injekt-F</td><td>B.Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>Trocar & stiletto (linshin)</td><td>Linshin</td><td>G12-SS</td><td>Per l'inserimento di pellet</td></tr></tbody></table>

utilizzo di trapianto dell'isolotto intra-omentale di riempimento matrix isolotto h-omentale (homing)

Intra-Omental Islet Transplantation Using h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING)

Medicina rigenerativa basata sulla terapia cellulare rappresenta una nuova speranza per curare la malattia. Gli attuali ostacoli includono convalida corretta in vivo dell'efficienza della terapia. Per il trasferimento al corpo del destinatario, le cellule hanno bisogno spesso di essere combinati con biomateriali, soprattutto idrogeli. Tuttavia, la convalida dell'efficacia di tali un innesto richiede l'ambiente giusto, la giusta idrogel e il sito proprio destinatario. L'omento potrebbe essere un tale sito. Sulla base dell'esempio di trapianto dell'isolotto, abbiamo sviluppato la tecnica hOMING (h-omentale riempimento dell'isolotto di Matrix), che consiste dell'iniezione dell'innesto all'interno dei tessuti, tra gli strati omentali, per migliorare la sopravvivenza e l'impianto dell'isolotto. Per raggiungere questo obiettivo, è necessario essere incorporato in un idrogel con una viscosità che consente la sua iniezione utilizzando un ago atraumatico isolotti. Siringhe sono caricati con una combinazione di idrogel e isolotti. Diverse iniezioni vengono eseguite all'interno del tessuto omentale presso punti di ingresso diversi, e la deposizione della miscela dell'isolotto/idrogel avviene lungo una linea. Abbiamo testato la fattibilità di questo approccio innovativo usando le perle di destrano. Le perle erano ben distribuite in tutto il tessuto omentale, in prossimità di vasi sanguigni. Per testare l'efficacia dell'innesto, abbiamo trapiantato isolotti in ratti diabetici ed eseguire un follow-up metabolico più di due mesi. Isole trapiantate hanno esibito un alto tasso di ri-vascolarizzazione attorno e all'interno di isolotti e invertito il diabete. La tecnica di hOMING potrebbe essere applicabile per altri tipi di terapia idrogel o delle cellule, cellule con alta attività metabolica.

Il metodo di hOMING consente l'evitare l'impianto intravascolare ed il confinamento degli isolotti a un organo. Un tempo massimo di 8-10 min è necessario per la procedura di impianto intero isolotto, tra cui l'anestesia, che un diario paragonabile al classico trapianto del fegato.
Per studiare il modo di isolotti sono distribuiti all'interno del tessuto omentale, perle di destrano sono stati trapiantati utilizzando il metodo di hOMING (Figura 2). Un giorno dopo l'impianto, i ratti sono stati sacrificati, e tessuti omentale sono stati recuperati per l'analisi istologica. Ematossilina ed eosina ha rivelato una distribuzione uniforme delle perle in tutto il tessuto (Figura 2in basso a destra). Molto spesso, perline erano vicino ai vasi sanguigni ed erano ben impiantati nel tessuto grasso. Subito dopo l'impianto, una reazione infiammatoria si verifica intorno le perline, con conseguente riorganizzazione del tessuto per nidificare le isolette nel tessuto.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58898/58898fig2.jpg"> Figura 2: Descrizione di hOMING distribuzione tecnica e perlina attraverso il tessuto omentale un giorno dopo impianto. (A) illustrazione della tecnica hOMING. Dopo l'esposizione dell'organo (A, a sinistra), il mix di isolotto-idrogel (sostituito qui da perline di destrano di colore blu per una migliore visualizzazione) con attenzione è stato iniettato nel tessuto usando un ago atraumatico (un, al centro). Impiantati nel tessuto di perline sono visibile (A destra). (B) ematossilina ed eosina di omento espiantati 1 giorno dopo l'iniezione della perla. Perle si trovano nel tessuto con una distribuzione uniforme. Barra della scala = 100 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58898/58898fig2large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per convalidare questa tecnica, abbiamo svolto gli studi isogeni utilizzando ratti Lewis (n = 8). Ratti diabetici che ricevono trapianto dell'isolotto (equivalente dell'isolotto 7660, IEQ) per peso corporeo ratto utilizzando hOMING sono stati controllati per glicemia e C-peptidemia per due mesi. Glicemia è stata controllata tramite impianto di pellet di insulina (come attesta il primo calo di glicemia osservato in Figura 3A). La funzione dell'innesto è stata riflessa da glycemia di circa 2 g/L e C-peptidemia &gt; 500 pM. Prima del trapianto, i ratti erano diabetici (glicemia &gt; 5 g/L e C-peptidemia &lt; 200 pM). Dopo il trapianto e il recupero di pellet di insulina, normalizzazione e manutenzione di glicemia è stata osservata solo 3 giorni di post-hOMING trapianto e fu mantenuto fino al recupero dell'innesto (p &lt; 0,05 rispetto per livelli di pre-trapianto). Dopo espianto omentale, glicemia aumentato ancora al livello pre-trapianto, che attesta la funzionalità degli isolotti che sono stati trapiantati di hOMING (Figura 3A). Il modello C-peptidemia era esattamente l'opposto, con bassi a livelli non rilevabili prima dell'innesto, seguita da un aumento e manutenzione a questo livello aumentato nel corso dello studio (p &lt; 0,05) e, dopo l'espianto omentale, un diminuire per pre-trapianto livelli (Figura 3B). Analisi dell'omento explanted dall'istologia ha rivelato altamente ri-vascularized isolotti, probabilmente a causa della loro vicinanza ai vasi sanguigni (Figura 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58898/58898fig3.jpg"> Figura 3: follow-up metabolico di due mesi di ratti che ricevono l'hOMING e innesto valutazione. Glicemia (A) misurazione e valutazione di C-peptide (B) dopo hOMING usando alginato come elemento portante dell'isolotto (Tx: trapianto e il recupero di pellet di insulina; Espianto: Espianto dell'omento). Gli innesti sono funzionali, come è illustrato dal mantenimento di normoglycemia dopo ricupero del pellet di insulina e aumentano della C-peptidemia dopo l'impianto dell'isolotto. Zone ombreggiate grigie rappresentano i valori minimi e massimi registrati in ogni momento. (C) ematossilina ed eosina di una sezione omentale dopo trapianto di insule pancreatiche utilizzando il metodo hOMING. Gli isolotti sono ben integrati nel tessuto due mesi dopo l'impianto senza alcun tessuto fibrotico circostante. Vasi sono cresciuti attorno e all'interno di isolotti, come indicato dalle frecce e quindi completamente il ripristino della funzione dell'isolotto. Morfologia degli isolotti sembra anche ben conservata. Scala bar = 50 µm. (n = 8) (*p &lt; 0.05; * * p &lt; 0.01; * * * p &lt; 0,001 determinato utilizzando le misure ripetute analisi della varianza (ANOVA) con test di Tukey significato onesta differenza come un test post-hoc). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58898/58898fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui, presentiamo un protocollo per la convalida in vivo della terapia cellulare basata su idrogel, illustrata dall'esempio del trapianto di insule pancreatiche. h-omentale isolotto di Matrix (hOMING) l'impianto di riempimento permette l'impianto di una miscela di cella-idrogel tra gli strati omentale, vicino ai vasi sanguigni, per massimizzare l'attecchimento in un ambiente metabolico adeguato.

Utilizzo di trapianto dell'isolotto intra-omentale di riempimento Matrix isolotto h-omentale (hOMING)

Regenerative medicine based on cell therapy represents a new hope for curing disease. Current obstacles include proper in vivo validation of the ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alla domanda chiave nel campo della terapia cellulare, ad esempio, il trapianto di isolotto può essere ottimizzato con la tecnica chirurgica hOMING? I principali vantaggi di questa tecnica sono che è semplice, veloce e tonnibile, e anche la convalida dei biomateriali è molto rapida. La dimostrazione visiva del posizionamento dell'ago è fondamentale per garantire una corretta iniezione di innesto all'interno dell'omento, poiché un ago posizionato in modo errato può causare perdite di isolotto.Per indurre il diabete, iniettare 75 milligrammi per chilogrammo di streptozotocina intraperitonealmente in ogni ratto ricevente Lewis di sei settimane, da 150 a 190 grammi e controllare lo stato del diabete mediante misurazione giornaliera della glicemia per i primi quattro giorni dopo l'iniezione. Quando i ratti presentano una glicemia superiore a due grammi per litro, iniettare per via sottocutanea sei unità di insulina ad azione prolungata al giorno per prevenire complicazioni del diabete e perdita di peso. Includere i ratti nella coorte sperimentale quando due misure del livello di glucosio nel sangue della vena della coda sono superiori a quattro-cinque grammi per litro per due giorni consecutivi, con un livello di C-peptide inferiore a 200 picomolare.Per l'impianto a pellet, confermare la mancanza di risposta al dito del piede nell'animale ricevente diabetico anestetizzato e pulire il collo con iodio povidone. Radere l'area di impianto e pulire la pelle esposta con ulteriore iodio povidone. Dopo tre minuti, sterilizzare un pellet di insulina da 1/2 in una soluzione di iodio povidone da uno a cinque e utilizzare un trocar calibro 16 per perforare la pelle del collo esposta.Quindi, utilizzare la guida e lo stile per inserire i pellet e suturare l'apertura con un unico punto. Pulire il punto con più iodio di povidone e lasciare che il topo si riprenda in una gabbia con monitoraggio e cibo per evitare l'ipoglicemia. Per misurare l'efficienza dei pellet, misurare la diminuzione della glicemia ogni settimana per un mese dopo l'impianto, compresi i ratti nella coorte sperimentale quando una misura del livello c-peptidico del sangue della vena della coda viene mantenuta sotto i 200 picomolari a un mese dall'impianto di pellet di insulina.Per il riempimento dell'isolotto della matrice intra-omentale, contare il numero di isolotti isolati dai ratti donatori sani in equivalenti di isolotto e preparare un equivalente di 7.660 isolotti per chilogrammo di ricevente in singoli tubi da 1,5 millilitri. Lavare ogni aliquota con 500 microlitri di mezzo CMRL senza siero bovino fetale e rimpignare il pellet di isolotto in 150 microlitri di trasportatore di idrogel alginato appena preparato per tubo con un'attenta miscelazione prima di posizionare i tubi sul ghiaccio. Successivamente, caricare siringhe da un millilitro dotate di un ago atraumatico calibro 21 con 150 microlitri di alginato vuoto senza volume morto, seguite da 150 microlitri di alginato più isolotti.Posizionare le siringhe sul ghiaccio e preparare il collo del primo animale ricevente come appena dimostrato. Utilizzare un bisturi per fare un'incisione sulla vecchia ferita e utilizzare le forcep per rimuovere il pellet. Chiudere il punto con uno o due punti di punto singoli e posizionare il topo in posizione supina.Sterilizzare l'area peritoneale e radersi. Usa un bisturi per creare una laparotomia di 1/2 centimetro appena sotto lo sterno. Posizionare la garza sterilizzata bagnata intorno all'incisione e identificare il cuscinetto di grasso omentale situato accanto allo stomaco.Utilizzare le forcep per estrarre delicatamente il cuscinetto grasso dalla cavità peritoneale, diffondendolo sulla garza. Idratare bene il tessuto omentale con due millilitri di soluzione salina sterile pre-riscaldata a 37 gradi Celsius e, tenendo il tessuto con piccole pinza curve in una mano, penetrare il bordo omentale tra gli strati omentali con l'ago di una siringa carica di isolotto con l'altra. Quando si inserisce l'ago, assicurarsi che sia circondato da un sottile strato di tessuto omentale prima di iniziare l'iniezione.Inserire l'ago interamente e lentamente iniziare a iniettare la preparazione dell'isolotto mentre si ritrae l'ago per consentire la diffusione degli isolotti iniettati in tutto il tessuto. Durante l'iniezione, ritrarre l'ago sul bordo dei tessuti, fermando l'iniezione quando l'ago è quasi fuori. Quindi, attendere cinque secondi prima di iniziare una nuova iniezione nella posizione successiva.E iniettare altre tre o quattro aliquote come dimostrato. Quando tutto l'idrogel è stato erogato, ritirare attentamente l'ago per evitare la perdita degli isolotti iniettati, controllando che gli isolotti non siano raggruppati nella siringa alla fine dell'iniezione. Una volta consegnati tutti gli isolotti, idratare l'omento e la parete della laparotomia prima di restituire attentamente il tessuto omentale alla cavità addominale.Iniettare due millilitri di soluzione salina sterile pre-riscaldata nella cavità addominale per reidratare il topo. Quindi chiudere la parete muscolare con una sutura continua del filo e cucire lo strato cutaneo con un singolo punto di punto. Dopo uno o due mesi di follow-up metabolico, aprire l'incisione chirurgica di ogni ricevente come dimostrato e utilizzare le forcep per diffondere con cura l'omenta su pezzi di garza imbevuti di salina disposti accanto alle incisioni.Partendo dalla regione aderente alla coda pancreatica, utilizzare le forbici per asportare il tessuto omentale e iniettare due millilitri di soluzione salina prerifoderata prima di chiudere ogni animale come dimostrato. Correggere l'omenta recuperata in paraformaldeide al 4% prima di incorporarla in paraffina. Quindi, acquisire sezioni di quattro micrometri di spessore dei tessuti su un microtomo e applicare la macchia di ematossilina ed eosina per la valutazione morfologica dei trapianti.Le perle di Dextran trapiantate con il metodo hOMING come dimostrato sono state frequentemente osservate vicino ai vasi sanguigni e sono state ben impiantate all'interno del tessuto adiposo. In questo studio isogenico rappresentativo, la glicemia è stata prima controllata dall'impianto di un pellet di insulina 1/2 come dimostrato e poi da isolotti impiantati come dimostrato da una glicemia di circa due grammi per litro e da una C-peptidimia superiore a 500 picomolare negli animali riceventi. Inoltre, l'analisi istologica dell'omenta esimpianto ha rivelato isolotti altamente rivascolarizzati, molto probabilmente a causa della loro vicinanza ai vasi sanguigni.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nei campi della terapia cellulare per esplorare il microambiente cellulare bioingegnerato in modelli preclinici.

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