Utilizzo di trapianto dell'isolotto intra-omentale di riempimento Matrix isolotto h-omentale (hOMING)

Qui, presentiamo un protocollo per la convalida in vivo della terapia cellulare basata su idrogel, illustrata dall'esempio del trapianto di insule pancreatiche. h-omentale isolotto di Matrix (hOMING) l'impianto di riempimento permette l'impianto di una miscela di cella-idrogel tra gli strati omentale, vicino ai vasi sanguigni, per massimizzare l'attecchimento in un ambiente metabolico adeguato.

Questo metodo può aiutare a rispondere alla domanda chiave nel campo della terapia cellulare, ad esempio, il trapianto di isolotto può essere ottimizzato con la tecnica chirurgica hOMING? I principali vantaggi di questa tecnica sono che è semplice, veloce e tonnibile, e anche la convalida dei biomateriali è molto rapida. La dimostrazione visiva del posizionamento dell'ago è fondamentale per garantire una corretta iniezione di innesto all'interno dell'omento, poiché un ago posizionato in modo errato può causare perdite di isolotto.

Per indurre il diabete, iniettare 75 milligrammi per chilogrammo di streptozotocina intraperitonealmente in ogni ratto ricevente Lewis di sei settimane, da 150 a 190 grammi e controllare lo stato del diabete mediante misurazione giornaliera della glicemia per i primi quattro giorni dopo l'iniezione. Quando i ratti presentano una glicemia superiore a due grammi per litro, iniettare per via sottocutanea sei unità di insulina ad azione prolungata al giorno per prevenire complicazioni del diabete e perdita di peso. Includere i ratti nella coorte sperimentale quando due misure del livello di glucosio nel sangue della vena della coda sono superiori a quattro-cinque grammi per litro per due giorni consecutivi, con un livello di C-peptide inferiore a 200 picomolare.

Per l'impianto a pellet, confermare la mancanza di risposta al dito del piede nell'animale ricevente diabetico anestetizzato e pulire il collo con iodio povidone. Radere l'area di impianto e pulire la pelle esposta con ulteriore iodio povidone. Dopo tre minuti, sterilizzare un pellet di insulina da 1/2 in una soluzione di iodio povidone da uno a cinque e utilizzare un trocar calibro 16 per perforare la pelle del collo esposta.

Quindi, utilizzare la guida e lo stile per inserire i pellet e suturare l'apertura con un unico punto. Pulire il punto con più iodio di povidone e lasciare che il topo si riprenda in una gabbia con monitoraggio e cibo per evitare l'ipoglicemia. Per misurare l'efficienza dei pellet, misurare la diminuzione della glicemia ogni settimana per un mese dopo l'impianto, compresi i ratti nella coorte sperimentale quando una misura del livello c-peptidico del sangue della vena della coda viene mantenuta sotto i 200 picomolari a un mese dall'impianto di pellet di insulina.

Per il riempimento dell'isolotto della matrice intra-omentale, contare il numero di isolotti isolati dai ratti donatori sani in equivalenti di isolotto e preparare un equivalente di 7.660 isolotti per chilogrammo di ricevente in singoli tubi da 1,5 millilitri. Lavare ogni aliquota con 500 microlitri di mezzo CMRL senza siero bovino fetale e rimpignare il pellet di isolotto in 150 microlitri di trasportatore di idrogel alginato appena preparato per tubo con un'attenta miscelazione prima di posizionare i tubi sul ghiaccio. Successivamente, caricare siringhe da un millilitro dotate di un ago atraumatico calibro 21 con 150 microlitri di alginato vuoto senza volume morto, seguite da 150 microlitri di alginato più isolotti.

Posizionare le siringhe sul ghiaccio e preparare il collo del primo animale ricevente come appena dimostrato. Utilizzare un bisturi per fare un'incisione sulla vecchia ferita e utilizzare le forcep per rimuovere il pellet. Chiudere il punto con uno o due punti di punto singoli e posizionare il topo in posizione supina.

Sterilizzare l'area peritoneale e radersi. Usa un bisturi per creare una laparotomia di 1/2 centimetro appena sotto lo sterno. Posizionare la garza sterilizzata bagnata intorno all'incisione e identificare il cuscinetto di grasso omentale situato accanto allo stomaco.

Utilizzare le forcep per estrarre delicatamente il cuscinetto grasso dalla cavità peritoneale, diffondendolo sulla garza. Idratare bene il tessuto omentale con due millilitri di soluzione salina sterile pre-riscaldata a 37 gradi Celsius e, tenendo il tessuto con piccole pinza curve in una mano, penetrare il bordo omentale tra gli strati omentali con l'ago di una siringa carica di isolotto con l'altra. Quando si inserisce l'ago, assicurarsi che sia circondato da un sottile strato di tessuto omentale prima di iniziare l'iniezione.

Inserire l'ago interamente e lentamente iniziare a iniettare la preparazione dell'isolotto mentre si ritrae l'ago per consentire la diffusione degli isolotti iniettati in tutto il tessuto. Durante l'iniezione, ritrarre l'ago sul bordo dei tessuti, fermando l'iniezione quando l'ago è quasi fuori. Quindi, attendere cinque secondi prima di iniziare una nuova iniezione nella posizione successiva.

E iniettare altre tre o quattro aliquote come dimostrato. Quando tutto l'idrogel è stato erogato, ritirare attentamente l'ago per evitare la perdita degli isolotti iniettati, controllando che gli isolotti non siano raggruppati nella siringa alla fine dell'iniezione. Una volta consegnati tutti gli isolotti, idratare l'omento e la parete della laparotomia prima di restituire attentamente il tessuto omentale alla cavità addominale.

Iniettare due millilitri di soluzione salina sterile pre-riscaldata nella cavità addominale per reidratare il topo. Quindi chiudere la parete muscolare con una sutura continua del filo e cucire lo strato cutaneo con un singolo punto di punto. Dopo uno o due mesi di follow-up metabolico, aprire l'incisione chirurgica di ogni ricevente come dimostrato e utilizzare le forcep per diffondere con cura l'omenta su pezzi di garza imbevuti di salina disposti accanto alle incisioni.

Partendo dalla regione aderente alla coda pancreatica, utilizzare le forbici per asportare il tessuto omentale e iniettare due millilitri di soluzione salina prerifoderata prima di chiudere ogni animale come dimostrato. Correggere l'omenta recuperata in paraformaldeide al 4% prima di incorporarla in paraffina. Quindi, acquisire sezioni di quattro micrometri di spessore dei tessuti su un microtomo e applicare la macchia di ematossilina ed eosina per la valutazione morfologica dei trapianti.

Le perle di Dextran trapiantate con il metodo hOMING come dimostrato sono state frequentemente osservate vicino ai vasi sanguigni e sono state ben impiantate all'interno del tessuto adiposo. In questo studio isogenico rappresentativo, la glicemia è stata prima controllata dall'impianto di un pellet di insulina 1/2 come dimostrato e poi da isolotti impiantati come dimostrato da una glicemia di circa due grammi per litro e da una C-peptidimia superiore a 500 picomolare negli animali riceventi. Inoltre, l'analisi istologica dell'omenta esimpianto ha rivelato isolotti altamente rivascolarizzati, molto probabilmente a causa della loro vicinanza ai vasi sanguigni.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nei campi della terapia cellulare per esplorare il microambiente cellulare bioingegnerato in modelli preclinici.