Summary
여기, 우리는 히드로 기반 세포 치료, 섬 이식의 예에 의해 그림의 vivo에서 유효성 검사에 대 한 프로토콜을 제시. h Omental 매트릭스 섬 작성 (귀환) 이식 혈관, 적절 한 변화 환경에서 engraftment를 극대화 하기 위해 가까이 omental 레이어 사이 셀 하이드로 겔 혼합물의 주입 수 있습니다.
Abstract
세포 치료에 따라 재생 의학 질병 치료에 대 한 새로운 희망을 나타냅니다. 현재 장애물 적절 한 생체 내에서 유효성 검사는 치료의 효율성을 포함 한다. 받는 사람 몸에 전송, 셀 종종 생체 재료, 특히 hydrogels와 결합 될 필요가 있다. 그러나, 이러한 이식의 효능의 유효성 검사는 오른쪽, 오른쪽 히드로 환경과 바로 받는 사이트 필요합니다. omentum 같은 사이트 수 있습니다. 우리 섬 이식 및 생존 향상 omental 레이어 사이 조직 안에 이식의 주입으로 구성 된 귀환 (Omental h 행렬 섬 작성) 기술, 개발 섬 이식의 예에 따라. 이 위해 독도 atraumatic 바늘을 사용 하 여 그것의 주입을 가능 하 게 한 점도와 히드로에 포함 해야 합니다. 주사기는 히드로 독도의 조합으로 로드 됩니다. 여러 가지 주사는 다른 진입점에서 omental 조직 내부 수행 그리고 섬/히드로 혼합물의 증 착 라인을 따라 이루어집니다. 우리는 dextran 비즈를 사용 하 여이 혁신적인 접근의 타당성을 테스트. 구슬 잘 omental 조직, 혈관에 가까운 근접에서에 걸쳐 확산 되었다. 이식의 효능을 테스트 하려면 우리 독도 당뇨병 쥐에 이식 하 고 대사 후속 2 개월 동안 수행. 이식된 독도 주위와 독도, 안으로 다시 vascularization의 높은 비율을 전시 하 고 당뇨병을 반전. 유도 기술을 다른 유형의 세포 높은 신진 대사 활동에 대 한 하이드로 겔 또는 세포 치료에 대 한 적용할 수 있습니다.
Introduction
세포 치료 뜨거운 주제는 재생 의학에 따라 질병을 치료 하는 것을 목표로 합니다. 생물 재료를 이용한 세포 치료 최근 몇 년 동안, 특히 세포 이식 자주 받는 사람에 게 문화 접시에서 셀의 전송을 위한 운반대를 요구 하기 때문에 점점 공부 되었습니다 했다. 소재 건설 기계는 잠재적으로 귀중 한 셀 사업자 충족 여러 가지 역할1. 유능한 캐리어는 기계적인 긴장에서 세포를 보호 하 고 필수 성장 요인, 대사 폐기물 배설, 영양 물질과 산소2의 교환 호의 베푸는 성장 조건을 제공 해야 합니다.
세포 치료에 사용 되는 생체 재료의 종류 들 사이 hydrogels 많은 이점이 있다. 그들은 생체, 생 분해성, 쉽게 처리 하 고 용이 하 게 산소 보급3입니다. 또한, 현재 기술 세포 생존과 성장 인자 또는 세포 외 매트릭스 단백질4예, 보완과 engraft 수 있도록 hydrogels의 사용을 수 있습니다.
하이드로 겔 사업자 포함 하는 줄기 세포 치료로 주입 수 있습니다 예를 들면, 뼈 재생5 및 신 경계 질환6. Metabolically 활성 세포의 주입이 필요 합니다. 접근의 생체 외에서 확인이 가능, 도구와 기술을 vivo에서 유효성 검사에 대 한 세련 된 것을 남아 있다.
셀 및 히드로 이식 쉽게 수행할 수 있습니다 밖으로 피하 주입에 의해 생체 적합성 테스트를 실시 하는 경우. 그러나, 이식할된 세포는 그들의 신진 대사 활동에 의해 조직 요인 통제 의미,이 피하 지역화 최적의 정 맥 배수7점에서 본질적으로 않습니다. 따라서, 신속, 안전 하 게, 그리고 효율적으로 평가 하이드로 겔의 유익한 효과를 현재 도구가 있다. 호르몬 응답 혈액 포도 당 수준으로 이식에서 혈 류로 출시 될 필요, 섬 이식의 예에 따라 우리 vivo에서 세포/히드로 이식 위한 새로운 방법을 개발.
첫 번째 단계 셀 하이드로 겔을 받아들일 수 있는 수락자 이식 사이트를 식별 하는 것 이었다. 위한 큰 공간을 제공 하는 omentum 주입, 높은 플라스틱 이며 그것의 조밀한 vascularization 복 설정을 함께 공부 하는 데 높은 신진 대사 활동8셀에 대 한 흥미로운. 우리는 다음 수술 기법에는 omentum 전지와 히드로의 전송 허용 설정 필요 합니다. Lipofilling 성형 수술9에서 사용에 의해 영감, 우리 개발 (귀환) 접근을 채우는 h Omental 매트릭스 섬. 하이드로 겔에 포함 된 독도 omental 조직 안에 주입 됩니다. 기술은 또한 omental 조직, 혈관의 많은 수는 또한 이식 산소 향상으로 셀과 히드로 혼합물의 여러 증언을 활용 하 여 최대 engraftment를 제공 목적.
현재 연구에서 우리는 섬 이식 혈관에 가장 가까운 지방 조직 내부 omental 시트 사이 대 한 간단 하 고 혁신적인 기술을 설명합니다. 이 마이크로-수술, 복 강경 수술에서 완료 될 수 있는 지방 조직으로는 하이드로 겔에 포함 된 독도의 주입으로 이루어져 있다. 이 기술은에서 테스트 하는 데 필요한 모든 히드로 및 셀 조합에 쉽게 적용 가능 하다는 metabolically 기능 환경에서.
Protocol
모든 동물 실험 승인 번호와 국립 보건원의 지침에 따라 수행 했다: 알/60/67/02/13.
1. 받는 사람 준비
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받는 사람 쥐에 있는 당뇨병을 유도 하는 화학적으로.
- Intraperitoneally 쥐10에 streptozotocin (STZ, 살 균 0.1 M 구 연산 염 버퍼, pH 4)의 75 mg/kg을 주사.
참고: 이식 연구에 대 한 6 주 된 루이스 스트레인 쥐, 150-190 g 무게 사용 되었다. - 처음 4 일 동안 매일 혈액 포도 당 측정 하 여 당뇨병 상태를 확인 합니다. 긴-연기 인슐린 6 주사 U/일 쥐 당뇨병 합병증을 예방 하 고 체중 감소, 인슐린 펠 릿 이식까지 2 g/L 이상 glycemia를 전시 하는 때에 피하.
- 코 호트에서 쥐를 꼬리 정 맥 혈당의 2 측정은 포함 > 2 연속 일, 그리고 C-펩 티 드 수준에 대 한 4-5 g/L은 < 200 오후. Glycemia 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)에 의해 glucometer와 C peptidemia를 사용 하 여 측정 합니다.
- 인슐린 알 약을 피부 아래 임 플 란 트 (1.2 참조).
참고: 만성 인슐린 치료 더 나은 glycemia 레 귤 레이 션을 허용 하 고 (이식 사이트에서 산화 스트레스를 악화) 당뇨병 합병증을 피할 수11. 또한, 치료 (평소 체중 감소는 당뇨병 동물에서 관찰) 없이 정상적인 성장 곡선 함께 당뇨병 상태를 보존 합니다. 이 이식 실시는 더 큰 omental 지방 패드에 발생할 수 있습니다.
- Intraperitoneally 쥐10에 streptozotocin (STZ, 살 균 0.1 M 구 연산 염 버퍼, pH 4)의 75 mg/kg을 주사.
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인슐린 알 약의 주입
- 가스 마 취 (500 mL/min O2에서 3 %isoflurane)를 사용 하 여 쥐를 anesthetize 하 고 경향이 위치에 쥐를 놓습니다.
- 반사 (발 곤란)의 부재를 확인 하 여 마 취 상태를 확인 합니다. 목 povidone 요오드를 사용 하 여 청소 하 고 면도날을 사용 하 여 영역을 면도. Povidone 요오드를 다시 적용 하 고 그것은 3 분 서 보자.
- 장소 1.5 인슐린 펠 릿 (3 단위 (U) / 200 g 쥐) 산 탄 소독을 1:5 희석된 povidone 요오드 솔루션. 16 G trocar를 사용 하 여 목 피부를 관통 하 고 가구 가이드 stylet을 사용 하 여 펠 릿을 삽입 합니다. 가이드와 stylet을 검색 하 고 단일 포인트 스티치. Povidone 요오드를 사용 하 여 스티치를 청소.
참고: 아니 수술 후 통증 관리는 개입 했다 단일 피하 (SC) 주사에 비해 필요 했다. - 쥐 마 취에서 회복 하 고 쥐 저 혈당을 피하기 위해 음식에 대 한 액세스를 갖도록 하자.
- 이식 후 glycaemia 감소를 측정 하 여 펠 릿의 효율성을 측정 합니다.
- 1 달 동안 매주 glycemia 레벨을 모니터링 하 여 펠 릿 효율성을 확인 하십시오.
- 꼬리 정 맥 혈액 C 펩 티 드 수준 정도의 200 미만 유지 되는 일대에 쥐를 포함 오후 인슐린 펠 릿 이식 후 1 개월.
참고: C-펩 티 드 수준 확인 하는 것은 필수 이식 하기 전에 기준선에서 동물을 평가 하 고 그들의 당뇨병 상태를 확인 하입니다. 낮은 C-펩 티 드 재생 항상 후속 발생합니다. 낮은 C-peptidemia 낮은 중생의 나타내는 것입니다.
2. 유도: 내부 omental 매트릭스 섬 작성
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섬-매트릭스 혼합물 준비입니다.
- 층 류 두건에 점성 섬 캐리어를 준비 합니다. 1.5%의 농도에서 살 균 PBS에 alginate 분말을 디졸브. 0.22 μ m 필터를 통해 통행에 의해 준비를 소독. 받는 사람 당 400 µ L를 준비 합니다.
참고: 21g 바늘을 통해 주입에 적합 한 점도와 하이드로 겔의 어떤 종류를 사용할 수 있습니다. - 앞에서 설명한12건강 한 루이스 쥐 (200-250 g)에서 섬을 격리 합니다.
- 섬 등가물 (IEQ) (한 IEQ 150 µ m의 직경을 가진 췌 장 섬 간주 됩니다)에 섬 개수13.
- 층 류 흐름 후드, 1.5 mL 튜브에 7660 섬 상응 (IEQ)의 aliquots를 준비 합니다.
- 소 태아 혈 청의 무료 CMRL (Connaught 의료 연구 실험실) 매체의 500 µ L로 독도 aliquots 세척.
- 원심 (2 분 500 g x 4 ° C에서)에 의해 독도 작은. 폐기는 상쾌한.
- 독도 alginate 히드로 캐리어의 150 µ L을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 신중 하 게 믹스 얼음에 믹스를 놓습니다.
- Atraumatic 21 G 바늘과 죽은 볼륨 없이 1 mL 주사기 주사기에 빈 alginate의 150 µ L을 로드 하 여 준비 합니다.
- 독도 alginate (150 µ L, 총 볼륨 300 µ L)의 혼합물으로 주사기를 채우십시오. 얼음에 주사기를 유지.
- 층 류 두건에 점성 섬 캐리어를 준비 합니다. 1.5%의 농도에서 살 균 PBS에 alginate 분말을 디졸브. 0.22 μ m 필터를 통해 통행에 의해 준비를 소독. 받는 사람 당 400 µ L를 준비 합니다.
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외과 절차
- 감기 균을 사용 하 여 수술 기구를 소독 (2% Steranios 20 분).
- Isoflurane 마 취를 사용 하 여 쥐를 anesthetize 하 고 경향이 위치에 쥐를 놓습니다.
- 면도날을 사용 하 여 목 부분을 면도 하 고 소독 povidone 요오드 지역. 요오드 3 분 서 보자.
- 메스를 사용 하 여 절 개 하 고 1.5 인슐린 펠 릿 집게를 사용 하 여 제거 합니다. 하나 또는 두 개의 단일 스티치 포인트를 사용 하 여 피부를 닫습니다. 마 취에서 쥐를 제거 하지 마십시오.
참고: 1 개월 후, 펠 릿 수 어렵다면 어떤 거리 조직 펠 릿;으로 해결할 수 있는 가 위를 사용 하 여 제대로 그것을 해 부. - 부정사 위치에 쥐를 놓습니다. 면도 하 고 복 막 지역 (povidone 요오드)와 소독. 요오드 3 분 서 보자.
- 메스를 사용 하 여 흉 골 바로 아래 1.5 c m 개복 술을 만듭니다. 베인 주변 젖은 멸 균 거 즈를 놓습니다.
- 뚱뚱한 패드 위 옆 지역화 omentum을 식별 합니다. 집게를 사용 하 여 신중 하 게 catch 하는 omentum, 복 막 구멍, 부드럽게 꺼내 거 즈에 그것을 확산.
참고: Omental 조직 십이지 장 비장에서 확장 되 고 복 부에 그것의 중간 지점에. 인슐린 요법을 받는 당뇨 쥐의 정상적인 omentum 때 거 즈에 확산 2 ² 약 이다. - 37 ° C에 미리 데워 진된 멸 균 식 염 수의 2 개 mL를 사용 하 여 잘 omental 조직 하이드 레이트. 작은 곡선된 집게를 사용 하 여 조작 하는 조직 고 omental 계층 간의 바늘 omental 가장자리를 침투. 바늘을 완전히 삽입 합니다.
- 천천히 섬 준비의 주입을 시작 하 고 신중 하 게 바늘 주사 (선)으로 여러 장소에서 독도를 뒤로 이동 합니다. 바늘을 철수, 전에 히드로 분산 된 독도의 손실을 방지 하기 위해 바늘을 종료 중지 되었습니다 확인 하십시오.
- 반복이 조작 omental 조직에 걸쳐 독도 배포를 다른 진입점을 사용 하 여 주사기의 전체 내용을 삽입 하는 데 필요한.
참고: 쥐, 4 ~ 5 주사는 일반적으로 필요 합니다. - 독도 주사의 끝에 주사기에 클러스터 되지 않은 확인 하십시오.
참고: 일부 독도 여전히 표시 되는 경우 주사기에서 바늘을 철회, 직접 빈 하이드로 겔의 100 µ L 주사기 채우기 및 바늘을 다시 연결 가능 하다. 나머지 독도를 플러시 주입의 두 번째 라운드를 할 수 있습니다. - Omental 조직과 개복 술의 벽을 수 화를 다시 멸 균 식 염 수를 사용 합니다. 집게를 사용 하 여 신중 하 게 복 부 구멍에서 omentum 대체.
- 쥐를 rehydrate 하 복 부 구멍으로 미리 데워 진된 멸 균 식 염 수의 2 개 mL를 주사.
- 지속적인 스레드 봉합 사를 사용 하 여 근육 벽을 닫습니다. 그런 다음 단일 스티치 포인트 (포인트-) 피부 레이어를 바느질.
- 주사 meloxicam (1.5 mg/kg) 피하는 진통제로 5 일 하루에 한 번.
- 마 취에서 복구까지에 생리대에 쥐를 놓습니다. 모든 받는 사람 쥐에 대 한 절차를 반복 합니다.
- 이식 매일 후에 혈당을 측정 합니다. Glycemia 경우 > 2 g/L, 주사 6 U 긴-연기 인슐린의 피하는 하루에 한 번.
- Glycemia 및 c-peptidemia 1 또는 2 개월 이상 모니터링에 의해 이식 기능을 평가 합니다.
참고: 성공적인 이식의 경우, glycemia, 이식 후 2-5 일 이내 안정 해야 하 고 쥐 인슐린을 벗을 수 있다.
3. omental 이식 Explantation
참고: 이 절차는 좋은 이식 기능 확인을 허용 됩니다. 검색 기능 이식의, 후 쥐가 당뇨병 상태로 반환 해야 합니다. 이 단계는 대사 속 행의 1 또는 2 개월 후 수행 됩니다.
- Anesthetize 가스 마 취와 함께 쥐와 부정사 위치에 놓습니다.
- 복 막 영역을 면도 하 고 3 분 povidone 요오드를 사용 하 여 소독.
- 메스를 사용 하 여 흉 골 바로 아래 1.5 c m 개복 술을 만듭니다. 베인 주변 모든 젖은 멸 균 거 즈를 놓습니다.
- 위장은 omentum을 식별 합니다. 집게를 사용 하 여 거 즈에 신중 하 게 그것을 확산.
- 가 위를 사용 하 여는 omentum 소비 세. 췌 장 꼬리 (비장) 옆에 준수 하는 부분에서 시작 합니다. 출혈이 발생 하면, 건조 멸 균 거 즈를 사용 하 여 그것을 막으려고.
- 복 부에 연결 된 부분을 따라 절단을 계속 하 고는 omentum 검색 합니다.
참고: 이 위치에 gastroepiploic 동맥 (그림 1) 그들은 실수로 잘립니다 경우 출혈의 큰 금액을 일으킬 수 있습니다. 동맥 절 개 이식, 검색 불가피 하지만 집게와 거 즈를 사용 하 여으로 출혈 관리할 수 있습니다. 실수로 잘라 경우 마른 거 즈로 단단히 압축 하 고 적어도 1 분 동안 압축을 유지 합니다. 출혈이 중지 해야 합니다. 그렇지 않으면, 클립을 사용 하거나 전기 bistoury를 사용 하 여 혈관을 부식.
그림 1: Omental 동맥 분포. Omentum 이식 explantation에 대 한 gastroepiploic 동맥의 구성 하는 중요 한 영역 파란색으로 표시 됩니다. 이 부분의 omental 조직 절제, 동안 관심 오른쪽 gastroepiploic 동맥 섹션에 지불 하 여야 합니다. 압축, 합자, 또는 열화 출혈 제한 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 출혈이 지속 되는지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 미리 데워 진된 염의 2 개 mL를 주입, 쥐, 닫고 이전 설명으로 처리.
Explanted 동물 당뇨병 상태를 반환합니다. 인슐린 주입 (6 U/SC/day)은 동물의 복지를 보장에 필수. - 안락사는 쥐 explantation pentobarbital (182.2 mg/kg)의 과다를 사용 하 여 10 ~ 12 일.
4. 조직학 분석: Hematoxylin 및 오신 얼룩
- 4 %paraformaldehyde (PFA)를 사용 하 여 검색 된 omenta를 해결 하 고 파라핀에 포함.
- 섹션 4 µ m 두께에서 고 이식의 형태 평가 되며 고 오신 얼룩을 적용.
5. 통계 분석
- 사용 하 여 통계 분석 소프트웨어와 반복된 측정 분산 분석 (ANOVA) Tukey의 정직한 의미 차이 테스트 포스트 hoc 시험으로 통계적 의미를 확인 합니다. P 값으로 나타내는: *p < 0.05; p < 0.01; p < 0.001입니다.
Representative Results
추적 메서드는 기관에 있는 혈관 내 주입의 회피와 독도의 감 금 허용합니다. 8-10 분 최대 시간이 마 취를 포함 하 여 전체 섬 이식 절차에 대 한 필요는 타임 라인 클래식 간 이식에 비해.
공부 하 고 독도 omental 조직 내부에 배포 되는 방법, dextran 구슬 유도 방법 (그림 2)를 사용 하 여 이식 했다. 주입, 후에 1 일 쥐 희생 했다, 그리고 omental 조직 조직학 분석에 대 한 검색. 되며 고 오신 얼룩 (그림 2오른쪽 아래) 조직에 걸쳐 구슬의 균일 한 분포를 밝혔다. 매우 자주, 구슬 혈관 가까이 되었고 지방 조직에 잘 설치 되지 않았습니다. 이식, 직후 염증 반응 결과 조직에 독도 중첩 하려면 조직 재편에 구슬 주위 발생 합니다.
그림 2: 유도 기술과 비드 배포 omental 조직을 통해 이식 후에 1 일의 설명. 유도 기술의 (A) 그림. 장기 노출 (A, 왼쪽), 섬-히드로 믹스 (대체 여기 더 나은 시각화를 위한 블루 색 dextran 구슬) 신중 하 게 atraumatic 바늘 (A, 중간)을 사용 하 여 조직에 주입 했다. 조직에 이식 하는 구슬 (A, 오른쪽) 볼 수 있습니다. (B) 되며 고 오신 omentum의 얼룩 explanted 비드 주입 후 1 일. 구슬 균일 한 분포와 조직에서 발견 된다. 눈금 막대 = 100 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
이 방법의 유효성을 검사 하기 위해 루이스 쥐를 사용 하 여 isogenic 연구를 수행 했습니다 (n = 8). 당뇨병 쥐 유도 사용 하 여 쥐 몸 무게 kg 당 섬 이식 (7660 섬 해당, IEQ)를 받고 두 달 동안 glycemia와 C-peptidemia에 대 한 감시 되었다. Glycemia ( 그림 3A에서 관찰 하는 glycemia에서 첫 번째 드롭 다운을 증명)으로 펠 릿 인슐린의 주입에 의해 통제 되었다. 이식 기능 약 2 g/L 및 C-peptidemia의 glycemia에 의해 반영 되었다 > 500 오후. 이식 전에 쥐 했다 당뇨병 (glycaemia > 5 g/L 및 C-peptidemia < 200 오후). 이식 후 인슐린 펠 릿 검색, glycemia 유지 보수 및 정규화 불과 3 일 후 이식 귀환 관찰 했다 하 고 이식 검색 (p < 0.05 미리 이식 수준에 비해)까지 유지 되었다. Omental explantation 후 glycemia 다시 귀환에 의해 이식 된 시리즈의 기능을 증명 사전 이식 수준으로 상승 (그림 3A). C-peptidemia 패턴은 정확히 반대, 이식, 증가 및 연구 과정을 통해이 증가 수준 유지 보수 하기 전에 발견할 수 없는 수준 낮은 (p < 0.05), 그리고, omental explantation, 후 한 감소 전 이식 수준 (그림 3B). 조직학으로 explanted omentum의 분석 혈관 (그림 3C)에 그들의 근접 결과로 가장 가능성이 매우 vascularized 다시 독도를 밝혔다.
그림 3: 추적 및 이식 평가 받은 쥐의 2 개월 대사 후속. (A) Glycemia 측정 및 섬 캐리어로 alginate를 사용 하 여 유도 후 (B) C-펩 티 드 평가 (Tx: 이식 및 인슐린 펠 릿 검색; Explantation:는 omentum의 Explantation). 이식 기능, 같이 normoglycemia의 유지 보수에 의해 인슐린 펠 릿 검색 후 고 섬 이식 후 C-peptidemia에서 증가. 회색 음영된 지역 각 시간 지점에서 최소 및 최대 기록 된 값을 나타냅니다. (C) 되며 고 오신 유도 방법을 사용 하 여 작은 섬 이식 후 omental 섹션의 얼룩. 독도 어떤 주변 거리 조직 없이 주입 후 2 개월 조직으로 통합 된. 혈관 고, 화살표로 표시 된 것 처럼 주위와 독도, 안으로 성장 했다 따라서 섬 기능을 완전히 복원. 독도의 형태 또한 잘 보존 된 것 같다. 스케일 바 = 50 µ m. (n = 8) (*p < 0.05; * * p < 0.01; * * * p < 0.001 Tukey의 정직한 의미 차이 테스트 반복된 측정 분산 분석 (ANOVA)을 사용 하 여 포스트 hoc 테스트로 결정). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계를 강조 수 있습니다. 첫째, 그것은 깨지기 쉬운 사람이 수술을 수행 하 고 조직 조작 지방 조직으로 섬세 한 수 있어야 합니다. 분쇄 또는 손상 된 omentum 피할 필요가 있다. 방어 조직으로 omentum, 대 식 세포 및 다른 백혈구에 농축입니다. 이러한 면역 세포 과도 한 조작에 의해 활성화 될 수 있다 고는 이식에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 둘째, 이식 (섬-히드로 혼합물) 로드은 또한 중요 합니다. 절차를 수행 하는 사람 죽은 볼륨을 피해 야 한다 그리고 모든 히드로 섬 혼합물의 주입 장치 로드 해야 합니다. 이 단계 후에 즉시 또 다른 중요 한 포인트는 주입 자체 이다. 주사 치료, 그리고 섬세 하 게 천천히, 수행 되어야 합니다. 주사기는 모든 나머지 독도 검색을 처음 로드 하는 빈 히드로에서 플러시됩니다 해야 합니다. 셋째, 봉합 이루어져야 합니다 신중 하 고 2 단계에서. 근육 계획 해야 될 봉합 먼저, 근육, omentum 봉합 하지 않도록 주의 복용 하 고 피부를 별도로 봉합 한다. Omental 이식에 대 한 explantation 절차에 대하여 특별 한 주의 때 위 (gastroepiploic 동맥)에 가까운 동맥 베는 순간에 취해야 한다. 그것은 몇 일 내의 동물 죽음에 어떤 지속적인 출혈 리드로 동물을 봉합 하기 전에 그들을 중지 발생 하는 모든 출혈에 주의 해야 합니다.
문제 해결 필요할 수 있습니다 매체에 관한 운반 독도; 하이드로 겔의 선택은 히드로 주 사용으로 실험, 최대입니다. 다른 재료를 사용 하 여 변수에서 발생할 수 있습니다 (또는 보충, 예 제외) 기능을 접목. 여기 설명 하는 방법을 7660 IEQ/kg의 섬 비율로 불활성 공동 이식 재료의 효율을 입증 했다.
현재 메서드 omental 크기와 히드로 속성에 의해 제한 될 수 있습니다. 당뇨병 쥐 모델을 사용 하려면 인슐린 치료는 충분 한 접목 영역을 제공 하기 위해 섬 이식 전에 필수입니다. 당뇨병 설치류 무게와 STZ 유도 당뇨병으로 인해 체 지방 량을 많이 잃게됩니다. 이 연구에 등록 하는 동물의 작은 무게, 고려도 작은 영역에 접목 수는 없습니다.
(전에 이식 펠 릿을 사용 하 여 그리고 그 후 오랫동안 행동 인슐린을 사용 하 여) 적절 한 glycemia 관리의 절약은 필수입니다. 여기, 우리가 여러 가지 이유로 이식의 날까지 인슐린 펠 릿을 보존 하기로 결정 했다. 첫째, 적절 한 glycemic 통제의 유지 보수 상당히 섬 이식11 해로운 수 있는 연속의 집중적인 인슐린 치료 및 받는 사람 수 받는 사람 기관에서 당뇨병에 의해 유도 된 산화 스트레스를 감소 클리닉12에서 관찰 하는 준비. 둘째, 우리는 쥐에 대 한 마 취 절차의 최대 수를 제한 하 고 싶었다. 긴-연기 인슐린을 사용 하 여 신진 대사 후속 동안 인슐린 치료의 구현에 관한 사용 되는 체계 피해 대규모 합병증 "진짜" glycemia 값을 절약 하 고 glucotoxicity (이식 파괴할 수 있다)이 때문.
이식 효율을 모니터링 하려면 glycemia 되지 않습니다 관련 매개 변수는 처음 몇 일에 쥐 펠 릿을 사용 하 여 인슐린 치료를 받고 있다. 이 때문에 C-펩 티 드 여러 번 이전 이식 하는 필수 검사입니다. 이 시대는 STZ 주입 후 동물을 선택 하는 연구의 시작과 다음 그냥 이식, 쥐 당뇨병 유지 하 고 재생은 최소한의 앞에 포함 됩니다.
하이드로 겔 속성은 또한 중요 하다. 액체 히드로 omental 조직에서 누출 됩니다 하 고 높은 점성 하이드로 겔 주 사용 되지 않습니다. 하이드로 겔 점도 injectability는 사용 하기 전에 테스트를 하지만 또한 섬 또는 생체 외에서 다른 세포 생존의 평가 의해 직접 재료를 테스트 필수 나타납니다. 여기, 독도 hypoxia과 높은 점성 캐리어의 사용에 매우 민감한 산소 보급을 발생할 수 있습니다.
기존의 방법에 대해 설명 하는 방법의 중요성의 측면에서이 내부-조직 이식 기술 재현성의 기간에서 장점이 있습니다. 또한 조직에 대 한 atraumatic 이며, 외 혈관 위치, 출혈 및 혈전 증 위험을 피 한다. 또한, 섬 이식 때, 인스턴트 혈액 중재 염증 반응은 피할된14이다. 또한, 유도 간 기능15점에서 위험 포즈 간으로 이식 달리 비 중요 한 장기로 독도 이식 수 있습니다.
최적의 성능, 생산 하는 하이드로 겔 수행 한다 하는 셀에 적용할 수 있다. 성장 인자 또는 특정 단백질의 사용은 이식된 세포16,17에 긍정적인 영향을 가질 수 있습니다.
결론,이 기술을 사용할 수 있습니다 다른 세포 유형에 하이드로 겔의 vivo에서 유효성 검사를 위해 독도 관해서는 활성 대사 환경 필요 하는 경우에 특히. 또한,이 수술 기술은 여러 응용 프로그램에 적용 됩니다 그리고 급속 하 게 인 간에 게 양도 그것 실행 될 수 있다 쉽게 강경을 사용 하 여 미래에 있을 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 지구의 알자스, CQDM-BioArtMAtrix-Pôle 알자스 Biovalley;에 의해 투자 되었다 53/14/C1입니다. 저자는이 혁신적인 기술 개발을 돕는 Hôpitaux Universitaires de 스트라스부르에서 팀의 홍보 Bruant-Rodier 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginate (PRONOVA UP LMV) | Novamatrix | 4200206 | Hydrogel carrier |
| Atraumatic needle (Blunt) | B.Braun | 9180109 | |
| CMRL without FBS | Gibco | 11500576 | |
| C-peptide ELISA kit | Mercodia | 10-1172-01 | |
| Eosin | Leica Microsystems | 3801592E | |
| Ethilon 4/0 | Ethicon | F2414 | Surgical suture |
| Hematoxylin | Leica Microsystems | 3801562E | |
| Insulin pellets | Linshin | INS-B14 | |
| Isofluorane | Centravet | ISO007 | |
| Lantus (Insulin-Glargin) | Sanofi Adventis | Lantus SoloStar | Long acting insulin |
| Metacam | Boehringer Ingelheim | MET019 | Anti-inflammatory drug |
| NaCl (for saline 0.9%) | Sigma | 10112640 | |
| Needle 26 G | TERUMO | 050101B | |
| Oxygen | Linde | 2010152 | For isoflurane use |
| Sodium pentobarbital | Vetoquinol | Dolethal | For euthanasia |
| Steranios 2% | Anios | 11764046 | |
| Streptozotocin | Santa-Cruz | SC-200719A | |
| Syringe – Injekt-F | B.Braun | 9166017V | |
| Trocar & stylet (linshin) | Linshin | G12-SS | For pellet insertion |
References
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