Summary
Solid-støttet, protein-fri, doble phospholipid bilayer membraner (DLBM) kan forvandles til komplekse og dynamiske lipid nanotube nettverk og kan tjene som 2D opp modeller av det endoplasmatiske retikulum.
Abstract
Vi presenterer en praktisk metode for å danne en opp-strukturelle organelle modell for det endoplasmatiske retikulum (ER). Modellen består av svært tett lipidic nanorør som, morfologi og dynamikk, minner av Akutten. Nettverkene er avledet fra phospholipid dobbel bilayer membran patcher følge et gjennomsiktig Al2O3 substrat. Vedheft er formidlet av Ca2 + i ambient bufferen. Etterfølgende utarming av Ca2 + med BAPTA/EDTA forårsaker tilbakekalling av membranen, som resulterer i spontan lipid nanotube nettverk formasjon. Metoden bare fosfolipider og microfabricated flater for enkel dannelsen av en ER modell og krever ikke tillegg av proteiner eller kjemisk energi (f.eks GTP eller ATP). I motsetning til 3D morfologi av mobilnettet endoplasmatiske retikulum er modellen todimensjonale (riktignok nanotube dimensjoner, geometri, strukturen og dynamikken vedlikeholdes). Denne unike i vitro ER modellen består av bare noen komponenter, er lett å konstruere og kan observeres under lys mikroskop. Den resulterende strukturen kan være ytterligere dekorert for ytterligere funksjonalitet som tillegg av ER-assosiert proteiner eller partikler å studere transport fenomener blant rør. De kunstige beskrevet her er egnet strukturelle modeller for cellular ER, som unike karakteristisk morfologi har vist seg å være relatert til sin biologiske funksjon, mens detaljer om dannelsen av rørformede domenet og rearrangements innen er fortsatt ikke helt forstått. Vi oppmerksom på at denne metoden bruker Al2O3 tynn-film-belagt mikroskopi coverslips, som er kommersielt tilgjengelig men krever spesielle bestillinger. Derfor er det lurt å ha tilgang til en microfabrication for forberedelse.
Introduction
ER utfører viktige oppgaver i biologiske cellen inkludert proteinfolding, lipid syntese og kalsium forskrift1,2. ER morfologi er iboende til funksjonene utføres. Den kombinerer planar stabler og tett-dynamisk rørformede domener, som kontinuerlig kommuniserer med cytoskeleton og gjennomgå konstant bevegelse og omorganisering. Noen av remodeling at ER strukturer gjennomgå inkluderer kontinuerlig transformasjon mellom planar ark og rør, vesicle formasjon fra eller fusion ER lumen, forlengelse av eksisterende rør, rør retraksjon, fusion og brekkasje3. Merkelig struktur rørformede nettverkene er energisk ugunstige. Stier og mekanismer som ER genererer og opprettholder denne organisasjonen også hvordan dette gjelder dens funksjon ikke er ennå forstått fullt ut4,5.
Det er kjent at ER feil når det mister sin homøostatisk tilstand, som resulterer i ER stress, en tilstand som skyldes en økning i proteinsyntese, akkumulering av misfolded proteiner eller endringer i Ca2 + og oksidativt balanse. ER får stresset igjen deformasjon av naturlige morfologi av organeller, spesielt ved å forstyrre nettverk organisasjon6,7. Som et svar aktiverer cellen en reparasjon mekanisme for å homøostatisk igjen. I reparasjon kan føre til ER-indusert celle apoptose, som bidrar til flere metabolske og degenerative sykdommer som Alzheimers sykdom, type 2 diabetes, Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, og flere andre7, 8. Nåværende forskning mål organiseringen av rørformede ER nettverk, og flere studier fokuserer på gjenoppbygge ER i vitro2. Noen eksisterende modeller2,9,10 krever proteiner til å starte og vedlikeholde membran kurvatur3,11 og hjelpe organelle nå formen. Åpenbart er modellsystemer som speil noen av Hovedfunksjonene til strukturelle og organisatoriske er og gi tilgang til eksperimentelle studier etterspurt.
Vi presenterer her prosedyrer for utarbeidelse av en lettvinte, protein/kjemisk energi-fri, dynamisk i vitro modell for ER, gir en grunnleggende plattform for å studere ER morfologi og funksjonene4. I denne metoden er en ER modell laget med en nedenfra og opp tilnærming ved hjelp av bare noen elementer, som molekyler rundt kan integreres for å legge til kompleksiteten. Nettverket representerer ER strukturen og dynamikken. Videre reversibel transformasjon mellom planar membranen og rør, vesicle formasjon fra rør, rør fusion, skyve og retraksjon kan alle observeres. I tillegg til servering som opp-modell for fullstendig forstått mobilnettet ER, kan lipid ruten til nanotube nettverk beskrevet i denne protokollen være aktuelle for forskere studere selvstendig montering, nanofluidics, enkelt-molekylet og kolloid transport fenomener, Marangoni flyt, og andre relaterte felt. Bare molekylær byggeblokkene som brukes i vår metode er fosfolipider. Protokollen krever lite laboratoriearbeid og grunnleggende utstyr og er tilgjengelig for inkorporering av flere elementer.
Protocol
1. forberedelse av Phospholipid Vesicle suspensjon
Merk: For alle materialer referert til som "ren" i denne protokollen, grundig vask dem med isopropanol etterfulgt av deionisert vann og Føne dem med nitrogen. Merk at en behandling av glass underlag med sterkt oksiderende syreholdig stoffer (Piranha løsning), som vanligvis brukes i forberedelse protokoller for støttede lipid filmer på solid underlag, ikke bør utføres på Al2O3-belagt bærere.
- Sted i en ren 10 mL runde bunn eller invertert pære-formet glass kolbe: soya L-α phosphatidyl kolin (PC, 69% w/w), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (dop, 30% w/w) og en lipid-konjugerte fluorophore valgfrihet [f.eks Texas rød 1,2 - dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine triethylammonium salt (TR-DHPE, 1% w/w)] i kloroform; for en total 3000 µg av lipider i 300 µL av kloroform, noe som resulterer i en siste konsentrasjon av 10 mg/mL.
Merk: Bruk ren, glass, gass-tette sprøyter med polytetrafluoroethylene stempler ved håndtering av stoffer med kloroform.
FORSIKTIG: Kloroform er giftig og svært flyktige og alltid skal håndteres under avtrekksvifte med tilhørende personlig verneutstyr. - Koble kolbe til en roterende fordamperen, posisjon med en tilt på 45°, og rotere på 24 rpm i et vannbad på 23 ° C 6t med redusert lufttrykket å sakte og fjerne kloroform. Starte slankende Press rett etter oppstarten rotasjon trinn på 20 kPa hver 2 minutter før den når 20 kPa (150 Torr, 80% vakuum).
Merk: Dannelsen av en homogen lipid film av ensartet tykkelse i forberedelse fartøyet er det viktigste kravet fremgangsmåten for rotavap. Lipid forberedelser er følsomme for rotasjon hastighet, rask trykkendringer og siste trykkverdi; Derfor strengt følge punktene langsom reduksjon samt slutten press og rotasjon hastigheten. Plasser flasken en vinkel på 45° garantere at dehydrert lipid kaken er jevnt som en film dannet på veggen av flasken. For fort på en rotasjon fører fører til turbulens og lav av en rotasjon (på grunn av tyngdekraften) til opphopning av et tykt lag av væske på bunnen av flasken. Under påfølgende overnatting hevelse prosessen, en svært inhomogenous lipid masse produseres som ikke svarer godt til siste sonication trinn, og de resulterende fraksjonene er av forskjellige komposisjoner. Trykk og tid innenfor i metoden sikrer langsom desolvation. Med kloroform som løsemiddelet, for kjøles rask av et fall i press ned blandingen, som resulterer i økt viskositet og samlet og ujevn film formasjon. Den lange tidsperioden 6 h anbefales for å fjerne løsemiddel i størst grad mulig, organiske løsemidler partisjonene i lipid materialet på utvanning. - Etter 6 h og stoppe rotasjonen og øke lufttrykket igjen, etter hvert trinn på 20 kPa hver 2 min fram 100 kPa. Fjern flasken fra roterende fordamperen og legge 3 mL PBS og 30 µL glyserol. Forsiktig swirl kolbe å oppløse glyserol. Bruk en lufttett glass stopperen for å forsegle kolbe som inneholder lipider.
Merk: Glyserol brukes til å forhindre komplett dehydrering av lipid filmen og gjør bilayer separasjon12. Det bør være oppvarmet før bruk for å redusere sin viskositet, som forenkler håndteringen av dette sammensatte. Varmet glyserol omgås fortsatt ikke umiddelbart PBS bufferen. Mild virvlende kreves til glyserol er fullstendig oppløst. - Lagre flasken i kjøleskapet i 4 ° C over natten for rehydrering og hevelse av lipid filmer.
- På dagen sonicate lipider med en ultralyd vannbad ved romtemperatur (RT, ~ 21 ° C) og 35 kHz hyppigheten til å oppnå en jevn, litt grumset lipid suspensjon.
Merk: Sonication kan ta rundt 10-30 s. langvarig sonication (~ 1 min) produserer varme og er skadelig vesicle formasjonen. - Trinn 1.1-1.5 avkastning en suspensjon som inneholder to typer vesicula strukturer: multilamellar blemmer (MLV) og gigantiske unilamellar blemmer (GUV) (figur 1A-1F).
- For lagring, dele lipid suspensjon i 100 µL dele, med totalt 30 microcentrifuge rør, og lagre dem i en fryser på 20 ° C.
Merk: Flash fryser med flytende nitrogen er ikke nødvendig og ikke brukt før. Protokollen kan pauses her. Forlate lipid suspensjoner i 4 ° C kjøleskapet for langvarig ganger årsaker lipid lysis, som påvirker membranen sammensetningen.
2. forberedelse av underlag
Merk: Følgende protokollen utføres på et renrom klassifisert som ISO 8 i ISO 14644-1 standard-spesifikasjonen. Atomic lag avsetning (ALD) brukes til å dikte Al2O3 underlag. De angitte prosessen parameterne instrument-avhengige og kan variere mellom forskjellige modeller av utstyr. De kan brukes som første parameter for å utvikle prosessen.
- Still inn temperaturen av ALD reaktoren til 200 ° C.
- Legg glassflater (f.eks glass coverslips) i eksemplet kammeret sammen med en silicon wafer, som vil bli brukt senere som referanse plate for å finne tykkelsen på avsetning av ellipsometry.
Merk: Glass underlag ble brukt ut-av-esken og var ikke løsemiddel rengjort før deponering. De var bare rødmer med nitrogen gass å fjerne partikler. - Evakuere lasting kammeret til 400 Pa (3 torr) og overføre prøvene i viktigste reaksjon kammeret og evakuere det til 200 Pa.
Merk: Temperaturen i reaktoren må opprettholdes på 200 ° C til riktig deponering. Temperatursvingninger etter eksempel lasting må derfor være equilibrated før du iverksetter avsetning. Kammer trykk ligger høyere enn reaktoren Trykk for å unngå eventuelle forløpere til spre utenfor kammeret. - Begynne å sette Atom filmen. En syklus består av en 150 ms puls trimethyl aluminium eksponering, etterfulgt av en 1 s utrenskning, og deretter H2O eksponering av 200 ms varighet etterfulgt av en 1 s utrenskning.
Merk: Alle innstillingene inkludert kammer og reaktoren, lengden av sykluser og utrenskninger er automatisert for å oppnå et definert antall deponering. Disse parametrene kan variere blant de ulike modellene av utstyr. Forhåndskonfigurert oppskrifter er ofte utarbeidet av leverandør eller verktøyet ansvarlig på clean rommet og kommunisert til brukeren som avsatt filmen tykkelse per tidsenhet. - Nå 10 nm Al2O3 på underlaget, gjenta prosessen for 100 sykluser. Antall sykluser, avhenger av avsetning ofte, som kan variere blant forskjellige oppskrifter eller utstyr.
- For å fjerne prøvene fra reaktoren, første vent kammeret til trykket når lufttrykk, deretter fjerne prøvene.
- Lagre prøvene i luften containere RT før bruk.
Merk: Ingen ytterligere rengjøring er anbefalt før bruk. Protokollen kan pauses her.
Merk: Prøvene bør ideelt brukes umiddelbart etter deponering. Optimal lagring krever posisjonering overflater i polypropylen wafer bærere, etterfulgt av innhyllende operatører i rent-kompatibel plast poser, som skal nitrogen-spyles før vakuum tetting. Formålet er å unngå å utsette overflaten til luftbårne urenheter. Om nødvendig kan overflater holdes i luften containere RT på maksimalt 5 dager. Lengre lagring er ikke anbefalt. For brukere som ikke har lett tilgang til et rent rom i nærheten, og kjøpe eller få overflater fra utlandet, kan nytt oksiderende substrater med oksygen plasma- eller ozon behandling være en alternativ løsning13.
3. transformasjon av molekylære Phospholipid filmer til rørformet nettverk
- Tine lipid suspensjon og overføre en 4 µL dråpe suspensjon på en ren glass microscope skyve/dekkglassvæske.
- Utenå tørrlegge overflaten slippverktøyet for 20 min. Slippverktøyet vil kollapse flate, runde filmen av lipider etter uttørking, som er synlig for øyet.
- Rehydrate lipid filmen med 1 mL av HEPES buffer (se Tabell for materiale) i 3 minutter.
Merk: Volumet av rehydration buffer påvirker tettheten av vesicle suspensjon (antall blemmer per volum), som deretter overført til observasjon kammeret. Avhengig av observasjon kammeret og ønsket vesicle tetthet, rehydrering volumet kan være innstilt til 0,5-1 mL. Rene borosilicate lysbilder tendens til å støtte dråper av flere hundre microliters opptil 1,5 mL uten problemer. Siden dekkglassvæske ikke trenger å bli flyttet, fører dette ikke til et teknisk problem. Mer hydrofobe flater, som SU-8 polymer-belagt lysbilder, kan selv 1,5 mL være deponert12.
Merk: Lipider bør være nylagede som eksponering av utvannet lipid filmen for mer enn 20 min på RT fører til fordampning av bufferen og delvis dehydrering av tidligere utvannet blemmer, noe som fører til en dårlig definert komposisjon. - Forberede observasjon kammeret: slik at bufferen exchange ved hjelp av en automatisk pipette, som kreves for å starte ER transformasjon, en observasjon kammer med en åpen topp ble brukt. Denne kammer består av en polydimethylsiloxane (PDMS)-ramme med dimensjoner 1,5 x 1,5 x 0,5 cm, overholdt på Al2O3 avsatt dekkglassvæske. En ordning av montert observasjon kammeret er representert i figur 1G. Følgende ble utført for å dikte PDMS rammen og montere observasjon kammeret:
- Forberede en KOH løsning ved å blande 100 g KOH med 100 mL isopropanol i et beaker i en isbadet. Rør for 10 h eller lenger til KOH er fullstendig oppløst bruker magnetisk rørestang og magnetic røre plate.
FORSIKTIG: KOH løsningen er etsende og kan føre til hud brannsår, så alltid håndtere riktig personlig verneutstyr.
Merk: Løseligheten av KOH i isopropanol er ikke så høy som i vann. Oppløsningen er eksoterm. Knusing KOH pellets før oppløsning og kontinuerlig omrøring anbefales. - Senke et glass Petriskål (d = 6 cm) i KOH løsningen på RT og hold den over natten.
- Dagen fjerne glass rett fra løsningen, dyppe den i en container med deionisert vann i 5 minutter, skyll den flere ganger med vann og plassere den i en tørking ovn ved 80 ° C i 1 h. slag overflaten kort med en strøm av nitrogen slik at en del Icles fjernes.
- Passivate overflaten og forhindrer bånd til PDMS, overføre 200 µL av dimethyldichlorosilane med en plastsprøyte i en ren plastbeholder som vekting båt.
- Lagre glasset Petriskål sammen med silane 1t i en evakuert desiccator (lav vakuum, ~ 20 kPa).
FORSIKTIG: Dimethyldichlorosilane er giftig og bør alltid håndteres under avtrekksvifte med tilhørende personlig verneutstyr. - Vente 15 minutter før samle Petriskål for at de resterende dimethyldichlorosilane damp å forsvinne. Petriskål er nå silanized overflaten er hydrofobe.
Merk: En rask måte å teste suksessen av dette trinnet er å plassere en vann dråpe på silanized Petriskål. Kontakt vinkel slippverktøyet med overflaten må synlig økning sammenlignet med ubehandlet glass. - I en 250 mL plast container (gjennomsiktig plast kopp fersk fra pakken), bland 10 g av silikon-elastomer base med 1 g silikon elastomer herding agent (10:1). Rør med en plast rørestang/plast slikkepott for 5 min.
Merk: Luftbobler dannes ved røring, og PDMS vil se blek hvit. - Utenå tørrlegge overflaten blandingen å degas ved < 20 kPa inntil alle voksende luftbobler har kollapset (høyere vakuum akselererer prosessen). Hell degassed blandingen i silanized Petriskål.
- Kurere ved 65 ° C i 2t i en ovn.
Merk: Det er mulig å doble herding hastigheten ved å øke temperaturen å > 95 ° C. Herding temperaturen øker resulterer i en økning i stivhet av materialet. - Avkjøl Petriskål fylt med herdet PDMS til RT og fjerne PDMS skive med en slikkepott.
- Med en skalpell, klippe ut rammen i dimensjoner og geometri passer for tilgjengelig åpningen i mikroskopet scenen. Dimensjoner på 1,5 (lengde) x 1,5 (bredde) x 0,5 (høyde) cm er egnet for de fleste oppsett.
- Bringe den glatte siden (undersiden som var i kontakt med Petriskål) av PDMS ramme i kontakt med den aktive siden av overflaten der Al2O3 filmen ligger, og forsiktig bruk trykk å presse rammen og overflaten mot hverandre å få dem til å følge.
Merk: Vedheft mellom PDMS rammen og Al2O3 underlaget er svak. Tilstedeværelsen av luftbobler i kontakt grensesnittet kan forårsake de-vedlegg og følgelig lekkasje av bufferen og relatert innhold. PDMS rammen kan brukes flere ganger hvis umiddelbart etter og før hver bruk det skylles med isopropanol, fulgt av skylling med DI vann og håndflatene med nitrogen. Silanized Petriskål kan også brukes på nytt.
- Forberede en KOH løsning ved å blande 100 g KOH med 100 mL isopropanol i et beaker i en isbadet. Rør for 10 h eller lenger til KOH er fullstendig oppløst bruker magnetisk rørestang og magnetic røre plate.
- Fylle observasjon kammeret med Ca2 +- HEPES buffer (se Tabell for materiale).
Merk: Overflaten bør brukes umiddelbart etter unsealing pakken. Kontakt med luft fører til adsorpsjon av forurensning, som reduserer aktiviteten til overflaten gradvis. Kammeret skal fylles med buffer umiddelbart etter montering. Ikke fyll kammeret volumet å tillate tillegg av de utvannet lipider i senere trinn. - Plass kammeret på AC confocal mikroskop scenen. Overføre utvannet lipid materialet, nå en suspensjon som inneholder gigantiske blemmer, inn i kammeret med en plast Pasteur Pipetter (figur 11 AG).
- Vente 10-20 min la blemmer overholde på underlaget og spredt over overflaten (figur 1H-1J).
Merk: Spredning begynner umiddelbart etter deponering av lipider på overflaten. Frekvensen av spre kan litt varierer avhengig av lipid sammensetningen, Al2O3 avsetning teknikk (ADL RF-sputtering, kjemisk damp deponering, osv.), friskhet av underlaget og divalent kasjon konsentrasjon i den buffer. Sikre at bufferen exchange utføres før rupturing i spredningen flekker14. - Etter å observere fjerne flere lipid oppslag, sakte ambient bufferen via en automatisk pipette, slik at bare en tynn buffer film fortsatt på bunnen.
Merk: Rask fjerning av buffer perturbs lipid strukturer på overflaten. - Gå videre til ambient buffer exchange ved sakte fylle observasjon kammeret med chelator-HEPES buffer (se Tabell for materiale) bruker en automatisk pipette (figur 1K).
Merk: Brå tillegg bufferen perturbs lipid strukturer på overflaten. - Dette siste trinnet gir dynamisk nanotubular nettverk, dannet i chelator-indusert depinning og tilbakekalling av DLBM til MLV4 (figur 1L-1Y).
4. mikroskopi observasjon
- Kjøpe bildene med en invertert laserskanning AC confocal mikroskop med en 40 X (1,3 NA) nedsenkning oljeobjektiv med en skanning frekvens på 400 Hz. ansette noen hvitt lys laser opphisse Texas rød DHPE på 595 nm. Samler utslipp fra 605 til 700 nm ved hjelp av en hybrid Foton detektor.
Merk: Alternativt en epi-fluorescens mikroskop kan brukes til bildebehandling. Avhengig av lyskilder tilgjengelig, velger du en passende lipid-dye konjugert.
Representative Results
Lipid suspensjon innhentet i trinn 1 av protokollen og brukes i eksperimenter inneholder to typer blemmer: MLVs og GUVs. Figur 1 A-1F viser laserskanning AC confocal micrographs av blemmer i første eksemplet i 3D. Figur 1 A-1_C viser en MLV (lipid depositum) i xyz-, xz- og yz fly, henholdsvis. Figur 1 D-1F viser lignende utsikt over en gigantisk unilamellar vesicle (GUV). Den indre delen av GUVs, som mangler multilamellarity, er hul; Derfor er lipid materialet for å spre svært begrenset. Bare nyttig lipid reservoarene for denne metoden er derfor MLVs.
Når lipid suspensjon overføres til observasjon kammeret som inneholder Ca2 +- HEPES bufferen (figur 1G), begynner MLVs (figur 1A-1_C) å bosette seg på Al2O3 overflaten. Ved kontakt, blemmer overholder overflaten, og en sirkulær flatt dobbel lipid bilayer membran (DLBM) begynner å spre seg fra hver MLV på solid støtte (figur 1H-1J). MLV fungerer som et reservoar som gir lipider kontinuerlig voksende DLBM. Den distale (øverst) bilayer membranen, med hensyn til solid støtte, er koblet til den proksimale (lavere) bilayer membranen langs omkretsen av den sirkulære kanten, utføre en rullende bevegelse (figur 1jeg). De to bilayers er plassert flatt oppå hverandre, bare å ha en tynn flytende film innkapslet mellom dem. Under spredning overholder proksimale membranen kontinuerlig støtte overflaten under, mens den distale membranen trekkes sidelengs på kantene av voksende proksimale membran kanten. Spredningen av DLBM er formidlet av Ca2 +, som fungerer som en fusogenic agent mellom lipid hodet grupper fra den proksimale membranen og solid substrat4.
Hvis spredningen fortsetter i lengre perioder, membranen spenning øker, fører til brudd (figur 2A og 2B). Etter det punktet, kan re-membranen som er nødvendige for å opprette ER rørformede morfologi, ikke lenger bli indusert. Derfor er det viktig å erkjenne sprukket membraner. Siden lipider i vårt forsøk merkes fluorescently, kan den rupturing være direkte observert. En viktig indikator for rupturing er betydelig fall i fluorescens intensiteten i sprukket regionen (figur 2A og 2B)14. Den rupturing er et resultat av økt spenning og påfølgende pore formasjonen i distale membranen. Under fluorescerende mikroskop har regionene sprukket derfor halv utslippsintensitet (enkelt proksimale bilayer) unruptured regioner (dobbel bilayer)14 (figur 2B). Under pore formasjon overfører membran materialet, som ble opprinnelig plassert i regionene sprukket, til kantene av spre oppdateringen. Dette fører i sin tur til en vekst i samlet oppdatering området. Derfor kan en rask utbygging av konturene av sirkulære oppdateringen også observeres under rupturing.
For å unngå omfattende veksten fører til brudd på patcher, umiddelbart etter sirkulær oppdateringen området når 100-200 µm, er Ca2 +- HEPES bufferen forsiktig fjernet med en automatisk pipette til en tynn film av flytende på overflaten. Chelator-HEPES bufferen legges deretter forsiktig til kammeret starte retraksjonen (figur 1K). En komplett dehydrering av prøven (figur 2C) eller rask utveksling av buffere (figur 2D og 2E) forårsaker forstyrrelser, rupturing eller deformasjon av patcher. Tillegg av chelater fjerner gradvis Ca2 + fra avstanden mellom overflaten og membran. Chelator-HEPES bufferen åpner gradvis den inter-bilayer-underlag plassen, fra utkanten av lipid membran oppdateringen. Derfor fjerning av webområdene feste starter fra kantene av sirkulære oppdateringen og overfører innover (figur 1K-1U). Som følge av depinning begynner lipid membran å koble og trekke fra kantene innover, framover mot MLV på center. Retraksjon prosessen fører til et nytt grensesnitt for å utvikle dynamisk lipidic rørformede nettverk4 (figur 1L-1Y). Vedvarende regionene områdefesting, som ikke tillater membranen koble helt, forblir på overflaten og nucleate målingen, fører til lange forgrenet nettverk av nanorør. (Figur 1L-1Y). Kontinuerlig de låsing og ytterligere tilbakekalling av lipid nanorør er observert over tid et resultat gradvis chelation prosessen. Denne coarsening og omorganisering av nettverket grenene spiller en nøkkelrolle i den dynamiske oppførselen av rørformede nettverk, som ligner glatt ER.
Figur 1 L-1Y viser micrographs nanotube nettverk innhentet i protokollen. Figur 1 L er et nærbilde av regionen i figur 1M merket i hvite rammen. Kontinuerlig-rød regionene i figur 1L og 1 M er trekke brøkdel av DLBM (merket med en blå stiplet linje i figur 1M). Mikroskop-bilde av rørformede nettverk i figur 1N og 1O er invertert for å øke kontrasten. Figur 1 P og 1Q viser reduksjon av rørformede tettheten på en membran-regionen i løpet av 3 h og 20 min. Reduksjon av rørformede tetthet oppstår på grunn av den gradvise depinning fulgte ved tilbakekallelse av DLBM fra overflaten over eksperimentell tidsrommet. Over tid, antall poeng frigjort fra låsing øker, fører til rearrangements og en reduksjon av området som dekkes av rør (figur 1P og 1U). De rørformede rearrangements er motivert av overflaten fri energi minimering av en lipid nanotube suspendert mellom to faste punkter. Det er godt etablert at den mest effektive måten å minimere overflate energi av en nanotube er å redusere sin lengde15. Derfor når fusogenic regioner, som først holder nanorør på overflaten, er de låst, nanorør Skyv og ordne seg spontant, innta en minimal lengde. Disse rearrangements føre en gradvis redusert dekning av overflaten av nanorør (figur 1P og 1U).
Vi kan ikke se den Ca2 +-mediert feste poeng, men vi etablere plasseringene som poeng der rørene har terminal eller skarpe svinger. Skarpe svinger omtales som V-veikryss15 eller vendepunktene på grunn av plutselige skifte i retning av tuben justering (grønne pilene i figur 1R og 1 X). Sluttpunktet representerer endestasjonen til røret, som hindrer at røret trekke (oransje piler i figur 1X). Under reorganisering, energisk gunstige disponeringen av rør identifisert som "Y-veikryss" eller "3-veis veikryss", vises. Y-krysset forbinder tre rør med ca 120° vinkler mellom hver rør, hvor den korteste totale tube lengden kan sikres. Y-kryss, som ikke har en end-point og i stedet plasseres mellom flere nanorør, er ikke låst. Dette er den eneste Y-krysset som kan skyve (blå piler, figur 1R). Som vist i figur 1R og 1S, skyve av en Y-krysset langs en svært ustabil skjæringspunktet resulterer i dannelsen av to individuelle Y-veikryss (blå piler i figur 1S). Den stiplede hvite linjen superimposed på figur 1S representerer konturene av rørformede nettverket fragment i figur 1R. En brøkdel av Y-veikryss besitter slutten terminaler (gul pil i figur 1T) som over tid, til slutt trekke (figur 1U). Transformasjon av en V-krysset til en enkelt, rett rør ved depinning av krysningspunktet på to linjesegmentene og tilbakekalling av en av rør danner V-formen kan observeres i figur 1V og 1W og Figur 1X og 1Y, henholdsvis.
Figur 1 : Transformasjon av lipid innbetalinger til ER-lignende rørformede nettverk. (A-F) Laser skanning AC confocal micrographs av blemmer i første eksemplet, bygget i 3D. (A-C) Multilamellar lipid vesicle (MLV, lipid innskudd) i xyz-, xz- og yz fly, henholdsvis. (D-F) Lignende utsikt over en gigantisk unilamellar vesicle (GUV). Den indre delen av GUVs er hul, som gjør lipid materialet for å spre betydelig begrenset. Nyttig lipid reservoarene for denne metoden er derfor MLVs. (G) illustrasjon av observasjon chamber montert på en invertert mikroskop som buffer og lipider settes. Kammeret består av en PDMS ramme overholdt på et Al2O3 belagt dekkglassvæske, gir en åpen volum top. (H-J) Illustrasjon av spre fenomener av MLV i nærvær av Ca2 +. (H) ved kontakt med Al2O3, MLV spontant sprer seg i form av en sirkulær, dobbel lipid bilayer membran (DLBM). (I) skjematisk sideutsikt over DLBM i xz flyet, der erobringene utføre bølgende bevegelse. MLV (d = 5-15 µm) og DLBM (tykkelse = 10 nm) er ikke tegnet til skala. (J) en AC confocal mikroskop-bilde av en spredning DLBM fra oversiden. (K) beskriver de viktigste trinnet av denne protokollen, der bufferen er byttet til en som inneholder Ca2 + chelaterande agenter, hemmer spredning, forårsaker tilbakekalling av DLBM til MLV og fører til dannelsen av lipid nanorør. (L-Y) Micrographs nanotube nettverk innhentet med metoden beskrevet. (L) nærbilde av regionen i (M) merket i en ramme. Kontinuerlig-rød regionene i (L og M) representerer DLBM (også merket med en blå stiplet linje i M). Mikroskop-bilde av rørformede nettverk i (N og O) er invertert for å øke kontrasten. (P og Q) Fremstilling av reduksjon av rørformede tettheten på en membran regionen i løpet av 3 h og 20 min. (R-Y) representant rørformede re ordninger. (R og S) Skyve (T og U) overgang av en Y-krysset til V-kryss ved tilbakekallelse av en end-point, og (V og W) de låsing av et vendepunkt, som resulterer i utrydding av en V-kryss. (X og Y) Tilbakekalling av en end-point. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Potensielle negative resultater. (A og B) Rupturing i distale membranen grunnet en lang ventetid før utveksling av bufferne. Sprukket områdene, der den proksimale membranen blir synlig, vises som mørke områder i forhold til regionene unruptured distale membran. Senket panel B viser lysintensiteten langs den blå pilen i mikroskop-bilde. Intensiteten av sprukket regionene membranen (proksimale/single bilayer blir synlige) tilsvarer halvparten intensiteten av unruptured membranen (distale/dobbelt bilayer). (C) utseendet på en tørr lipid patch dannet som følge av fjerning av alle flytende fra observasjon kammeret. (D og E) Avbrudd av membranen av rask utveksling av buffere via automatisk pipette. I (D), har MLV delt i 2 MLVs, fører til en ikke-sirkulært, deformert lipid-oppdatering. I (E) gjenspeiles mønsteret av (piler), laget av sterk injeksjon av chelator-HEPES-bufferen på tubulated membran strukturen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
I følgende diskusjonen, er den avgjørende skritt, endres og begrensninger av protokollen beskrevet. Det første viktige steget er riktig montering av observasjon kammeret, gitt at vedheft av PDMS rammen til Al2O3 overflaten er egentlig svak. I tilfelle der rammen ikke overholder underlaget riktig innholdet vil lekke fra observasjon kammeret og eksperimentet kommer til å stoppe. De viktigste faktorene som hindrer riktig tetting av overflaten og rammen er 1) mangel på grundig rengjøring (gjenbrukes) PDMS rammen og 2) luftbobler som noen ganger blir fanget mellom rammen og underlaget. En nylig forberedt eller rengjøres grundig PDMS ramme bør brukes. Bør skylles rammen før og etter hver bruk med isopropanol, fulgt av skylling med DI vann og håndflatene med nitrogen. Al2O3 overflater krever ikke noen tidligere rengjøring, siden de er fabrikkert i et renrom miljø og oppbevares i lukkede beholdere til bruk. På grunn av amphoteric natur Al2O3, bør det ikke utsettes for sterkt syreholdig eller grunnleggende løsninger. Andre design for observasjon kammeret kan ansettes, avhengig av tilgjengelighet av det enkelte oppsettet. Viktige funksjoner på denne kammer er gratis tilgang til flytende prøven fra åpne toppen og inertness ramme materiale med hensyn til brukte løsninger og eksempler. Kammeret dimensjonene er også en viktig faktor, som de bør ta et volum fra 0,5 til 1 mL. Siden flater brukes vanligvis standardstørrelse coverslips (24 x 60 mm), avhengig volumet av kammeret av tykkelsen på rammen. Til vår kunnskap er avstandsstykker med størrelse og fargedybde som rommer eksempel volumene vanligvis håndteres i denne protokollen ikke kommersielt tilgjengelig. Vi har derfor dedikert en inndeling i protokollen til detaljer om fabrikasjon og montering av en prøve chamber ramme.
Det andre avgjørende skrittet i denne protokollen er buffer utveksling. En utfordring i dette trinnet er en nødvendig for å utføre denne utvekslingen. Spredning av MLV ved kontakt med Al2O3 underlaget er umiddelbar og kontinuerlig utvidelse av DLBM fører til sin rupturing, avslutter eksperimentet (figur 2A, B). Derfor spredning bør kontinuerlig overvåket og buffer utveksling må utføres i tide. Utveksling bør ikke utføres for raskt etter initialisering av spredning, slik at membran patcher å nå en optimal størrelse (100-200 µm i diameter). På den annen side, forårsaker kontinuerlig vedheft på overflaten høy membran spenning, som fører til rupturing. Dermed patcher alle membran til slutt brudd hvis spre ikke er avbrutt. Tidspunktet for den rupturing er forskjellig for hver oppdateringen, siden det kommer an på størrelsen og interne strukturen av MLV og tilgjengelighet av lipider deri. Derfor skal øyeblikk av utveksling ordnes til en timepoint som un sprukket flekker med optimal størrelser utgjør størstedelen av hele befolkningen. En annen utfordring i bufferen exchange trinn er frekvensen av fjerning og tillegg av bufferne. Utfører denne erstatningen for fort har en skadelig innflytelse på de endelige membran strukturene (figur 2C-E). Overdreven utvinning av Ca2 +- HEPES bufferen uten å forlate en tynn flytende film på underlaget, resulterer i tørket og irreversibelt deformert membran patcher (figur 2C). Selv om en riktig mengde væske opprettholdes på overflaten, forårsaker brå tillegg bufferen som Chelator-HEPES også forstyrrelsene av membran strukturer. Figur 2 D,E viser typisk utseendet på hydrodynamically forstyrret membran patcher. Samlet morfologiske avbrudd påvirker ikke nødvendigvis de dynamiske egenskapene til de siste strukturene (dvs. rørformet rearrangements i gjenværende områdene vil fortsatt skje). Imidlertid vil det bli vanskelig å observere materiale transformasjon på deformert strukturer. For eksempel i figur 2D, ville det være vanskelig å bestemme retningen mot MLV DLBM trekkes.
En mulig endring av protokollen er den lipid brukes. Hovedfokuset er på fosfolipider som dominerer ER sammensetningen i pattedyr og gjær16 (e. g., phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), og phosphatidylinositol (PI). Opprinnelige forsøkene ble utført med PC og PI blandinger4. I resultatene presentert ble en blanding av PC og dop og et derivat av PE brukt. Men har ikke alle vilkårlig lipid komposisjoner blitt funnet for å lage stålrør strukturer fra denne protokollen. Noen av de andre eksperimentelt undersøkte lipid blandinger involverer totale hjertet ekstrakt, soya bean ekstrakt polar, E. coli ekstrakt polar, blandinger av PC med stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoinositol (Lyso-PI) i varierende forhold og blandinger av PC-PE-PI-Posphatidyl serine (PS) i varierende forhold. Siden rørformede membran strukturer har høy curvatures og krever spesielle arrangement av personlige lipid molekyler, forventes det at observert fenomenet er lipid sammensetning-spesifikke.
En annen endring gjelder i denne protokollen er metoden overflaten fabrikasjon. Her, ble ALD brukt til å fabrikkere Al2O3 belagt coverslips. Dette er forskjellig fra metoden opprinnelig rapporterte deponering, reaktive sputtering4. Mens dette indikerer at en alternativ overflaten fabrikasjon metode kan fortsatt føre til ER som tubulation, synes en viktig begrensning å være spesifisitet av overflate materiale. Modus for å spre og styrke av vedheft er svært avhengig av egenskapene til overflate, som påvirker faktorer som elektrostatisk interaksjoner, wettability, hydrophobicity og råhet av overflaten. Al2O3 flater gir optimal vedheft styrke, og lipid filmer kan både knytte sterkt nok som en dobbel lipid bilayer membran og koble til skjemaet rørformede nettverk ved fjerning av Ca2 + ioner. Vi har tidligere testet samme eksperiment med SiO2, der multilamellar blemmer spredt som en dobbel lipid bilayer membran, men ingen rørformede nettverk formasjon ble observert på tillegg chelater17. De-vedlegg og rør formasjon er observert på Al2O3 eller plasma etset Al18. Våre undersøkelser avslørte at parameteren medvirkende fører til så fenomen zeta potensielle av overflater, som Al og Al2O3 ble nær null (mV) og SiO2 betydelig negativ. Zeta potensialet i borosilicate ligner SiO219; Derfor er vedheft av lipid filmer på borosilicate like sterk og irreversibel. Faktisk fører multilamellar lipid reservoaret kontakt med borosilicate flater vanligvis til umiddelbar brudd og dannelse av enkelt lipid bilayers20. Al2O3 overflater kreves for denne protokollen er ikke lett eller kommersielt tilgjengelig. De kan imidlertid være tilpasset bestilt fra spesialitet glass og underlaget produsenter. Tilgang til renrom fasiliteter med tynn-film fabrikasjon utstyr anbefales.
De andre eksisterende opp metodene å dikte ER som rørformede nettverk2,10 involverer proteiner som inndata av kjemisk energi (f.eks., GTP og ATP). Rapoport og kolleger2 rapportert dannelsen av ER-nettverk på glass coverslips i vitro ved å blande membran-bøying proteiner i ER, og fosfolipider GTP. Arbeidet Bachand et al. 10 viser hvordan slike dynamisk rørformede nettverk kan opprettes ved hjelp av molekylære motorer og ATP som energikilden. Denne protokollen presentert krever ikke membran proteiner eller hydrolyse av organiske forbindelser for energi. Kun nødvendige komponentene er solid underlaget og fosfolipider. Rensing og utvinning av proteiner er ikke nødvendig. Denne protokollen gir, i form av enkelhet av grunnleggende molekyler, den mest grunnleggende ER modellen.
Med denne grunnleggende, lipid-baserte ER modellen etablert, er bygge opp kompleksiteten ved å legge til ER-assosiert komponenter interessant, siden det gjør undersøkelse av individuelle virkninger på systemet. Ligner de faktiske ER nettverkene, rør i modellen er dynamiske. Bøyning til og overføring av merket membran proteiner eller fluorescerende partikler på rørformet nettverket, kan gi informasjon om membran bevegelsesretning. Innkapsling og overvåking av fluorescerende væske inne i DLBM og rør under transformasjon og en mulig kartlegging av intratubular innhold transport kan tjene som et annet fokus. Til slutt, en overgang fra 2D ER modellen som følge av denne protokollen mot en 3D glatt ER modell kan vedtas gjennom innkapsling av nettverk i hydrogel arkitekturer.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Prof Aldo Jesorka fra Chalmers University of Technology i Sverige for hans uvurderlig kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble gjort mulig gjennom økonomisk støtte fra Forskningsrådet (Forskningsrådet) prosjekt stipend 274433, UiO: biovitenskap konvergens miljø, svenske Research Council (Vetenskapsrådet) prosjekt Grant 2015-04561, i tillegg til oppstart finansiering tilbys av senter for molekylær medisin Norge & fakultet for matematikk og naturfag ved Universitetet i Oslo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pear-shape flask 10 mL | Lenz Laborglasinstrumente | 3.0314.13 | In which the lipid mixture is prepared |
| Hamilton 5 mL glass syringe (P/N) | Hamilton | P/N81520 | For transfer of the chloroform to beaker |
| Custom large hub needle Gauge 22 S | Hamilton | 7748-18 | Removable needle for syringe specified in row 3 |
| Hamilton 250 µL glass syringe | Hamilton | 7639-01 | Used for transfer of lipids in chloroform to the flask |
| Large hub Gauge 22 S | Hamilton | 7780-03 | Removable needle for syringe specified in row 5 |
| Hamilton 50 µL glass syringe | Hamilton | 7637-01 | Used for transfer of fluorophore-conjugated lipids to the flask |
| Small hub Gauge 22 S | Hamilton | 7770-01 | Removable needle for syringe specified in row 7 |
| Chloroform anhydrous (≥99%) | Sigma-Aldrich | 288306 | Used to complete the lipid mixture to a total of 300 µL |
| Soy L-α Phosphatidyl choline lipid (Soy PC) | Avanti Polar Lipids Inc | 441601 | phospholipid species contributing to 69% of the total composition/mixture |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids Inc | 850725 | phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture |
| L-α Phosphatidyl inositol lipid (Soy PI) | Avanti Polar Lipids Inc | 840044 | alterative phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture (from the original article Bilal and Gözen, Biomaterials Science, 2017) |
| Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | T1395MP | Fluorescent-lipid conjugate, 1% of the lipid composition/mixture |
| Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fischer | 88870006 | To warm glycerol in order to decrease its viscosity |
| Glycerol for molecular biology (≥99%) | Sigma Life Science | G5516 | For lipid preparation |
| PBS buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 17-21 | Used to prepare the lipid suspension | ||
| TRIZMA base, primary standard and buffer (≥99%) | Sigma Life Science | T1503 | Used to prepare PBS buffer |
| Potassium phosphate tribasic, reagent grade (≥98%) (K3PO4) | Sigma-Aldrich | P5629 | PBS buffer ingredient |
| Magnesium sulfate heptahydrate, BioUltra (≥99,5%) KT (MgSO47H2O) | Sigma Life Science | 63138 | PBS buffer ingredient |
| Potassium phosphate monobasic, anhydrous, free flowing, Redi-Dri, ACS (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 795488 | PBS buffer ingredient |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate ACS reagent, 99.0-101.0% (Na2EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | PBS and Chelator-HEPES buffer ingredient |
| Ultrasonic cleaner USC-TH | VWR | 142-0084 | Ultrasonication of rehydrated lipids |
| Rotary evaporator - Büchi rotary evaporator Model R-200 | Sigma | Z626797 | For evaporation of chloroform |
| Pressure meter - Vacuum regulator IRV-100 | SMC | IRV10/20 | For controlling the pressure value during lipid dehydration |
| HEPES-buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 26-27 | Used for rehydration of lipids. Content: 10 mM HEPES with 100 m NaCl diluted in ultrapure deionized water | ||
| HEPES ≥99.5% (titration) | Sigma Life Science | H3375 | HEPES-buffer ingredient |
| Sodium chloride for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥98% (titration) (NaCl) | Sigma Life Science | S3014 | HEPES-buffer ingredient |
| Calcium-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 29 | Used for spreading of lipids. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 4 mM CaCl2 diluted in ultrapure deionized water | ||
| Calcium chloride anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% (CaCl2) | Sigma Life Science | C5670 | To prepare Calcium-HEPES buffer |
| Chelator-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 31 | Used to promote the formation of tubular networks. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA and 7 mM BAPTA diluted in ultrapure deionized water | ||
| 1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt ≥95% (HPLC) (BAPTA-Na4) | Sigma Life Science | 14513 | Chelator-HEPES buffer ingredient |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| pH meter accumet™ AE150 pH | Fisher Scientific | 1544693 | Used to measure the pH of all buffers |
| Glass petri dish | VWR | HECH41042012 | 6 cm, used for making the PDMS sheet |
| Potassium hydroxide ACS reagent, ≥85%, pellets (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473 | To make the KOH solution for cleaning glass petri dish for the fabrication of the PDMS sheet |
| Isopropanol prima ren 99.5% | Antibac AS | 600079 | KOH solution ingredient |
| Heating and drying oven - venticell | MMM Medcenter Einrichtungen GmbH | MC000714 | For drying of the glass petri dish after silanization and to cure PDMS |
| Dichlorodimethylsilane ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 440272 | Used for silanization of glass petri dish in which PDMS sheet is prepared |
| Vacuum pump | Cole-Parmer | EW-79202-05 | Connected to desiccator |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow corning | 24236-10 | Kit to make PDMS solution |
| Sylgard 184 Silicone elastomer base | |||
| Disposable scalpel | Swann-Morton | 11798343 | Used to cut the PDMS |
| Cover slips | Menzel -Gläser | MEZ102460 | 24x60 mm. Used to deposit thin film of Al2O3 |
| Atomic layer deposition system | Beneq | TFS200 (model number) | Atomic Layer deposition system used to deposit thin film of Al2O3 in microscope cover glass |
| Ellipsometer | J.A. Woollan Co. | Alpha-SE (model name) | System used to charcaterize the thickness of the film deposited on glass surface |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | Microscope used for visualization of the experiment |
| Objective 40x, 1.3 NA | Leica Microsystems | 1550635 | Used for visualization of the experiment |
| White light laser source | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | For excitation of the membrane fluorophore |
References
- Chen, S., Novick, P., Ferro-Novick, S.
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543 (7644), 257-260 (2017).
- Pendin, D., McNew, J. A., Daga, A. Balancing ER dynamics: Shaping, bending, severing, and mending membranes. Current Opinion in Cell Biology. 23 (4), 435-442 (2011).
- Bilal, T., Gözen, I. Formation and dynamics of endoplasmic reticulum-like lipid nanotube networks. Biomaterials Science. 5 (7), 1256-1264 (2017).
- Shibata, Y., et al. Mechanisms determining the morphology of the peripheral ER. Cell. 143 (5), 774-788 (2010).
- Ozcan, L., Tabas, I. Role of endoplasmic reticulum stress in metabolic disease and other disorders. Annual Review of Medicine. 63, 317-328 (2012).
- Yamanaka, T., Nukina, N. ER dynamics and derangement in neurological diseases. Frontiers in Neuroscience. 12, (2018).
- Taalab, Y. M., et al. Mechanisms of disordered neurodegenerative function: Concepts and facts about the different roles of the protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase (PERK). Reviews in the Neurosciences. , (2018).
- Shemesh, T., et al. A model for the generation and interconversion of ER morphologies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 5243-5251 (2014).
- Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
- Sackmann, E. Endoplasmatic reticulum shaping by generic mechanisms and protein-induced spontaneous curvature. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 153-160 (2014).
- Jesorka, A., et al. Generation of phospholipid vesicle-nanotube networks and transport of molecules therein. Nature Protocols. 6, 791 (2011).
- Hook, D. A., Olhausen, J. A., Krim, J., Dugger, M. T. Evaluation of Oxygen Plasma and UV Ozone Methods for Cleaning of Occluded Areas in MEMS Devices. Journal of Microelectromechanical Systems. 19 (6), 1292-1298 (2010).
- Gözen, I., et al. Fractal avalanche ruptures in biological membranes. Nature Materials. 9 (11), 908-912 (2010).
- Lobovkina, T., Dommersnes, P., Joanny, J. -F., Hurtig, J., Orwar, O. Zipper Dynamics of Surfactant Nanotube Y Junctions. Phys Rev Lett. 97, (2006).
- van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (2), 112-124 (2008).
- Gözen, I., et al. Repair of large area pores in supported double bilayers. Soft Matter. 9 (10), 2787-2792 (2013).
- Gözen, I., et al. Thermal migration of molecular lipid films as a contactless fabrication strategy for lipid nanotube networks. Lab on a Chip. 13 (19), 3822-3826 (2013).
- Sides, P. J., Hoggard, J. D. Measurement of the Zeta Potential of Planar Solid Surfaces by Means of a Rotating Disk. Langmuir. 20 (26), 11493-11498 (2004).
- Nissen, J., Jacobs, K., Rädler, J. O. Interface Dynamics of Lipid Membrane Spreading on Solid Surfaces. Physical Review Letters. 86 (9), 1904-1907 (2001).
