Summary
Solid-stöds, protein-fri, dubbel fosfolipid lipidens membran (DLBM) kan omvandlas till komplexa och dynamiska lipid nanotube nätverk och kan fungera som 2D underifrån modeller av endoplasmatiska retiklet.
Abstract
Vi presenterar en bekväm metod för att bilda en botten-upp strukturella organell modell för det endoplasmatiska retiklet (ER). Modellen består av mycket tät lipidic nanorör som, vad gäller morfologi och dynamik, som påminner om ER. Nätverken härleds från fosfolipid dubbel lipidens membran patchar följa ett transparent Al2O3 substrat. Vidhäftningen medieras av Ca2 + i omgivande bufferten. Efterföljande utarmning av Ca2 + med hjälp av BAPTA/EDTA medför indragning av membranet, vilket resulterar i spontana lipid nanotube nätverk bildas. Metoden endast består av fosfolipider och biochips ytor för enkel bildandet av en ER-modell och kräver inte tillsats av proteiner eller kemisk energi (t.ex. GTP eller ATP). I motsats till 3D morfologi av cellulära endoplasmatiska retiklet är modellen tvådimensionella (om än nanotube dimensionerna, geometri, struktur och dynamics bibehålls). Denna unika in vitro- ER modell består av endast ett fåtal komponenter, är lätt att konstruera och kan observeras under ett ljusmikroskop. Den resulterande strukturen kan dekoreras vidare för ytterligare funktioner, till exempel tillägg av ER-associerade proteiner eller partiklar att studera Transportfenomen bland rören. De artificiella nätverk som beskrivs här är lämpliga strukturella modeller för cellulära ER, vars unika karakteristisk morfologi har visat sig vara relaterade till biologiska funktion, medan detaljer angående bildandet av tubulär domänen och omflyttningar inom är fortfarande inte helt förstått. Vi noterar att denna metod använder Al2O3 tunna-filmdragerade mikroskopi coverslips, som är kommersiellt tillgängliga men som kräver särskild order. Därför är det tillrådligt att ha tillgång till en mikrofabrikation anläggning för beredning.
Introduction
Akuten utför avgörande uppgifter i cellen biologisk inklusive proteinveckning, lipid syntes och kalcium förordning1,2. ER morfologi är inneboende till de funktioner som den utför. Den kombinerar planar stackar och tät-dynamiska tubulär domäner, som kontinuerligt samverkar med cytoskelettet och genomgå ständig rörelse och ombildning. Några av ombyggnaden att ER strukturer genomgå inkluderar den kontinuerlig omvandlingen mellan plana ark och rör, vesikler bildning från eller fusion till ER lumen, förlängning av redan existerande rören, tube dementi, fusion och brott3. Egendomlig struktur av tubulär nätverken är energetically unfavorable. De vägar och mekanismer som ER genererar och upprätthåller denna organisation samt hur detta hänger samman med dess funktion inte är ännu förstått det4,5.
Det är känt att ER krånglar när det förlorar sitt homeostatiska tillstånd, vilket resulterar i ER stress, ett tillstånd som orsakas av en ökning av proteinsyntesen, ansamling av felveckning proteiner, eller förändringar i Ca2 + och oxidativ balans. ER orsakar stress i sin tur deformation av naturliga morfologi av organell, speciellt genom att störa nätverk organisation6,7. Som svar aktiverar cellen en reparation mekanism att återgå till en homeostatiska tillstånd. Reparation kan leda till att ER-inducerad cell apoptos, vilket bidrar till flera metabola och degenerativa sjukdomar såsom Alzheimers sjukdom, typ 2-diabetes, Parkinsons sjukdom, amyotrofisk lateral skleros och flera andra7, 8. Aktuell forskning mål organisationen av tubulär ER nätverken, och flera studier fokuserar på beredning av det ER in vitro-2. Några befintliga modeller2,9,10 behöver proteiner för att initiera och upprätthålla membran krökning3,11 och hjälpa organell nå sin form. Klart, modellsystem som speglar några av de viktigaste strukturella och organisatoriska funktionerna av ER och ge tillgång till avancerade experimentella studier är mycket efterfrågade.
Vi presenterar här förfaranden för utarbetandet av en lättköpt, protein eller kemisk energi-fri, dynamiska in vitro- modell för ER, som ger en grundläggande plattform för att studera ER morfologi och tillhörande funktioner4. Den här metoden är en ER-modell tillverkad med en bottom-up strategi använder endast några delar, där molekylerna av intresse kan integreras för att lägga till komplexiteten. I nätverket representerar ER struktur och dynamik. Dessutom reversibla omvandlingen mellan planar membranet och rören, vesikler bildning från rör, tube fusion, glidande och indragning kan alla observeras. Förutom som tjänar som en bottom-up-modell för ofullständigt förstådda cellulära ER, kan lipid rutten till nanotube nätverk beskrivs i detta protokoll vara tillämpliga för forskare som studerar självmontering, nanofluidik, single-molekyl och kolloid Transportfenomen, Marangoni flöde och andra relaterade områden. De bara molekylära byggstenarna som används i vår metod är fosfolipider. Protokollet kräver lite laborativt arbete och grundläggande utrustning och är tillgänglig för inkorporeringen av ytterligare element.
Protocol
1. beredning av fosfolipid vesikler fjädring
Obs: För alla material avses som ”ren” i detta protokoll, tvätta dem med isopropanol följt av avjoniserat vatten och föna dem med kväve. Observera att en behandling av glas substrat med starkt oxiderande sura ämnen (Piranha lösning), som normalt tillämpas i förberedelse protokoll för stöds lipid filmer på fasta substrat, inte bör utföras på Al2O3-belagd bärare.
- Plats i en ren 10 mL runda-botten eller inverterad päronformad glas: soja L-α fosfatidylkolin (PC, 69% w/w), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (knark, 30% w/w) och en lipid-konjugerad fluorophore val [t.ex. Texas röd 1,2 - dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine triethylammonium salt (TR-DHPE, 1% w/w)] i kloroform; till ett totalt belopp på 3000 µg av lipider i 300 µL kloroform, vilket resulterar i en slutlig koncentration på 10 mg/mL.
Obs: Använd rena, glas, gastäta sprutor med polytetrafluoreten kolvar vid hantering av föreningar som innehåller kloroform.
FÖRSIKTIGHET: Kloroform är giftiga och mycket volatil och ska alltid hanteras under ett dragskåp med tillhörande personlig skyddsutrustning. - Anslut kolven till en rotationsindunstare, position med en lutning av 45°, och rotera vid 24 rpm släpper ett vattenbad vid 23 ° C i 6 h med reducerat lufttryck till långsamt och helt ta bort kloroform. Börja minska trycket rätt efter inleda rotation av steg på 20 kPa varje 2 min tills den når 20 kPa (150 Torr, 80% vakuum).
Obs: Bildandet av en homogen lipid film av enhetlig tjocklek i förberedelse fartyget är det viktigaste kravet för förfarandet för rotavap. Lipidsänkande preparat är känsliga för rotationshastighet, snabba tryckförändringar och slutliga trycket värde; därför strikt följa stegen långsam minskning samt slutet trycket och rotation hastighet. Placera kolven med en lutning av 45° att garantera att uttorkad lipid kakan bildas jämnt som en film på väggen i kolven. Alltför snabbt av en rotation leder leder till turbulenser och för långsamt av en rotation (på grund av tyngdkraften) till ansamling av ett tjockt lager av vätska på botten av kolven. Under den efterföljande övernattning svullnad process, en mycket inhomogenous lipid massa produceras som inte svarar väl till slutliga ultraljudsbehandling steg, och de resulterande fraktionerna är av olika sammansättningar. Tryck och tiden inom intervallet som angetts i metoden säkerställer långsam desolvering. Med kloroform som lösningsmedel, alltför kyler snabba av blodtrycksfall blandningen, vilket resulterar i ökad viskositet och aggregera och ojämn film formation. Under lång period 6 h rekommenderas för att avlägsna lösningsmedel i största utsträckning som är möjligt, så de organiska lösningsmedel partitionerna i lipid materialet vid rehydrering. - Efter 6 h, stoppa rotationen och öka lufttrycket igen, gradvis, med 20 kPa varje 2 min tills de når 100 kPa. Ta ut kolven ur rotationsindunstaren och tillsätt 3 mL PBS och 30 µL av glycerol. Snurra försiktigt kolven för att upplösa glycerol. Använd en lufttät glaspropp för att täta kolven som innehåller lipider.
Obs: Glycerol används för att förhindra den fullständig uttorkningen av lipid filmen och gör lipidens separation12. Det ska värmas före användning för att minska dess viskositet, vilket underlättar hanteringen av denna förening. Värmde glycerol blandas inte fortfarande inte omedelbart med PBS-bufferten. Försiktig omskakning krävs tills glycerol är helt upplöst. - Förvara kolven i kylskåp vid 4 ° C över natten för rehydrering och svullnad av lipid filmerna.
- Följande dag, Sonikera i lipider med en Ultraljuds vattenbad vid rumstemperatur (RT, ~ 21 ° C) och vid 35 kHz frekvens tills att uppnå en enhetlig, lätt grumlig lipid suspension.
Obs: Ultraljudsbehandling kan ta runt 10-30 s. långvarig ultraljudsbehandling (~ 1 min) producerar värme och skadar vesikler bildning. - Steg 1,1-1,5 avkastning en suspension som innehåller två typer av vesikulär strukturer: multilamellar blåsor (MLV) och jätte unilamellar blåsor (GUV) (figur 1A-1F).
- Förvaring, dela lipid suspensionen i 100 µL portioner, med hjälp av en totalt 30 mikrocentrifugrör, och lagra dem i en frys vid-20 ° C.
Obs: Flash frysning med flytande kväve är inte nödvändig och inte används före lagring. Protokollet kan pausas här. Lämnar lipid suspensioner i kylskåpet 4 ° C under längre tider orsaker lipid lysis, vilket påverkar membranet sammansättning.
2. beredning av substrat
Obs: Följande protokoll utförs på ett renrum klassificerade som ISO 8 i ISO 14644-1 standarden specifikationen. Atomlager nedfall (ALD) används för att tillverka Al2O3 substrat. Specificerade processparametrar är instrument-beroende och kan variera mellan olika modeller av utrustning. De kan användas som initial parametrar för att utveckla processen.
- Ställa in temperaturen av ALD reaktorn till 200 ° C.
- Ladda glasytor (t.ex. glas coverslips) in i provkammaren tillsammans med en silicon wafer, som kommer att användas senare som en referensyta för att bestämma tjocklek av nedfall av ellipsometri.
Obs: Glas substrat var använda out-of-the-box och var inte lösningsmedel-rengöras innan nedfall. De var bara spolas med kvävgas att ta bort partiklar. - Evakuera lastning kammare till 400 Pa (3 torr) överför proverna till huvudsakliga reaktionskammaren och evakuera det till 200 Pa.
Obs: Temperaturen i reaktorn skall hållas vid 200 ° C för korrekt nedfall. Temperaturvariationer efter provet lastning måste därför vara utjämnad innan nedfall. Kammare trycket ligger högre än reaktorn tryck för att undvika eventuella prekursorer att sprida utanför kammaren. - Börja sätta in Atom filmen. En cykel består av en 150 ms puls trimetyl aluminium exponering, följt av en 1 s utrensning och därefter en H2O exponering av 200 ms längd följt av en 1 s utrensning.
Obs: Alla inställningar inklusive kammare och reaktorn pressar, längd av cykler och utrensningar som är automatiserade för att uppnå en definierad nedfall. Dessa parametrar kan variera mellan olika modeller av utrustning. De förkonfigurerade recept ofta bereds av leverantören eller verktyget ansvarig i renrum och kommuniceras till användaren som deponerade filmtjocklek per tidsenhet. - Att nå 10 nm Al2O3 på underlaget, upprepa processen för 100 cykler. Antalet cykler beror på den insvetstal, som kan variera mellan olika recept eller utrustning.
- Ta bort proverna från reaktorn, första vent i kammaren tills dess trycket når atmosfärstryck, sedan ta bort proverna.
- Lagra proverna i lufttäta behållare på RT fram till användning.
Anmärkning: Inga ytterligare rengöring rekommenderas före användning. Protokollet kan pausas här.
Obs: Proverna bör helst användas omedelbart efter nedfall. Optimal lagring kräver positionering ytorna inuti polypropylen wafer bärare, följt av kuvertering bärarna i renrum-kompatibel plastpåsar, som skall vara kväve-spolas innan vakuum försegling. Syftet är att undvika att utsätta ytan till luftburna föroreningar. Om det behövs kan ytorna förvaras i lufttät behållare vid RT högst i 5 dagar. Längre lagring rekommenderas inte. För användare som inte har enkel tillgång till ett renrum i närheten, och köpa eller få ytorna från utlandet, kan åter oxiderande substratesna med hjälp av syre plasma eller ozon behandling vara en alternativ lösning13.
3. omvandling av molekylär fosfolipid filmer till tubulär nätverk
- Tina lipid fjädringen och överföra en 4 µL droplet suspension på en ren Mikroskop bild/täckglas.
- Ut droplet-programmet i 20 min. Droplet-programmet kommer att kollapsa i en platta cirkulära film av lipider efter torkning, som är synlig för ögat.
- Rehydrera lipid filmen med 1 mL HEPES buffert (se Tabell för material) för 3 min.
Obs: Volymen av rehydrering buffert påverkar tätheten av vesikler fjädring (antalet blåsor per volymenhet), som överförs därefter till observation kammaren. Beroende på volymen av observation kammaren och önskad vesikler tätheten, volymen rehydrering kan stämmas till 0,5-1 mL. Ren Borsilikat bilder tenderar att stödja droppar av flera hundra mikroliter upp till 1,5 mL utan problem. Eftersom täckglaset inte behöver flyttas, leder detta inte till ett tekniskt problem. På mer hydrofoba ytor, såsom SU-8 polymerbelagda diabilder, kan även 1,5 mL vara insatta12.
Obs: Lipider bör vara nyberedd, eftersom exponering av återfuktad lipid filmen för mer än 20 min på RT leder till avdunstning av bufferten och partiell dehydratisering av de tidigare återfuktad vesicles, vilket leder till en dåligt definierad sammansättning. - Förbereda observation kammaren: för att möjliggöra buffert exchange med hjälp av en automatisk pipett som krävs för att initiera den ER förvandlingen, en observation kammare med en öppen topp användes. Kammaren består av ett Polydimetylsiloxan (PDMS) ram med måtten 1,5 x 1,5 x 0,5 cm, anslutit sig till Al2O3 deponeras täckglas. En ordning med monterade observation kammaren är representerade i figur 1G. Följande steg utfördes för att tillverka ramen PDMS och montera observation kammaren:
- Förbered en KOH-lösning genom att blanda 100 g KOH med 100 mL isopropanol i en bägare i ett isbad. Rör om i 10 h eller längre tills KOH är helt upplöst med en magnetisk omrörare och magnetiska rör plattan.
FÖRSIKTIGHET: KOH lösning är frätande och kan leda till brännskador på huden, så alltid hantera med lämplig personlig skyddsutrustning.
Obs: KOH löslighet i isopropanol är inte lika hög som i vatten. Upplösningen är exoterm. Det är tillrådligt att krossning KOH pellets innan upplösning och kontinuerlig omrörning. - Sänk ett glas petriskål (d = 6 cm) i KOH lösningen på RT och hålla det över natten.
- Följande dag, ta glas skålen ur lösningen, fördjupa det i en behållare med avjoniserat vatten i 5 min, skölj flera gånger med vatten och placera den inuti en torkugn vid 80 ° C i 1 h. Blow ytan kort med en ström av kväve för att säkerställa att en del larna tas bort.
- Passiverande ytan och förebygga bindning till PDMS, över 200 µL av dimetyldiklorosilan med en Plastspruta i en ren plast behållare såsom en viktning båt.
- Förvara glaset petriskål tillsammans med silan för 1 h i en evakuerade exsickatorn (lågt vakuum, ~ 20 kPa).
FÖRSIKTIGHET: Dimetyldiklorosilan är giftigt och bör alltid behandlas under ett dragskåp med tillhörande personlig skyddsutrustning. - Vänta 15 min innan samla petriskål för återstående dimetyldiklorosilan ånga att försvinna. Petriskål är nu silaniserad, och ytan är hydrofoba.
Obs: Ett snabbt sätt att testa framgång för detta steg är att placera en vatten droplet på silaniserad petriskål. Droplet-programmet med ytan kontakt vinkel måste synbart öka jämfört med obehandlat glas. - I 250 mL plastflaska (transparent plast kopp färskt från paketet), blanda 10 g av silikonelastomer bas med 1 g av silikon elastomer härdare (10:1). Rör om med en plast omrörare/plast spatel för 5 min.
Obs: Luftbubblor bildas vid omrörning, och PDMS ser blek-vit. - Ut blandningen till degas < 20 kPa tills alla expanderande luftbubblor har kollapsat (högre vakuum accelererar processen). Häll avgasade blandningen i silaniserad petriskål.
- Bota vid 65 ° C under 2 timmar i ugn.
Obs: Det är möjligt att fördubbla bota hastigheten genom att öka temperaturen till > 95 ° C. Den ökande bota temperaturen resulterar i en ökning i styvheten i materialet. - Kyla ner petriskål fylld med de härdade PDMS RT och avlägsna PDMS plattan med en spatel.
- Med en skalpell skär ramen i mått och geometri passar tillgängliga öppningen i Mikroskop scenen. Dimensioner (längd) 1,5 x 1,5 (bredd) x 0,5 (höjd) cm är lämplig för de flesta konfigurationer.
- Ta med den släta sidan (undersidan som var i kontakt med petriskål) av PDMS Rama i kontakt med den aktiva sidan av ytan där Al2O3 filmen finns, och Applicera försiktigt tryck push ramen och yta mot varandra att få dem att följa.
Obs: Vidhäftningen mellan PDMS ram och Al2O3 substrat är svag. Förekomsten av luftbubblor i gränssnittet kontakt kan orsaka avinstallation fastsättning och därmed läckaget av buffert och relaterat innehåll. PDMS ramen kan användas flera gånger om omedelbart efter och före varje användning det sköljs med isopropanol, följt av sköljning med DI vatten och föning med kväve. Silaniserad petriskål kan också återanvändas.
- Förbered en KOH-lösning genom att blanda 100 g KOH med 100 mL isopropanol i en bägare i ett isbad. Rör om i 10 h eller längre tills KOH är helt upplöst med en magnetisk omrörare och magnetiska rör plattan.
- Fyll observation kammaren med Ca2 +- HEPES buffert (se Tabell för material).
Obs: Ytan bör användas omedelbart efter öppna paketet. Kontakt med luft leder till adsorption av föroreningar, vilket minskar aktiviteten av ytan gradvis. Kammaren bör fyllas med buffert omedelbart efter monteringen. Fyll inte volymen hela kammaren för tillägg av de återfuktad lipider i efterföljande steg. - Plats i kammaren på confocal Mikroskop scenen. Överföra återfuktad lipid materialet, nu en suspension som innehåller gigantiska blåsor, in i kammaren med en plast Pasteur-pipett (figur 1A-1 G).
- Vänta 10-20 min att låta de blåsor följer på substratet och spridda över ytan (figur 1H-1J).
Obs: Att sprida startar omedelbart efter nedfallet av lipider på ytan. Graden av spridning varierar något beroende på lipid sammansättning, Al2O3 nedfall teknik (ADL, RF-sputtring, kemisk förångningsdeposition, etc.), friskhet av substrat och tvåvärda ering koncentration i den buffert. Säkerställa att buffert exchange utförs innan spricker spridning patchar14. - Efter att ha konstaterat flera lipid spreads, långsamt ta bort omgivande bufferten via en automatisk pipett, så att endast en tunn buffert film är på botten.
Obs: Snabb borttagning av buffert perturbs lipid strukturer på ytan. - Vidare till omgivande buffert utbyte genom att långsamt fyller observation kammaren med kelator-HEPES buffert (se Tabell för material) med hjälp av en automatisk pipett (figur 1K).
Obs: Abrupt tillägg av buffert perturbs lipid strukturer på ytan. - Detta steg ger dynamiska nanotubular nätverk, bildas till följd av den kelator-inducerad depinning och indragning av DLBM till MLV4 (figur 1L-1Y).
4. mikroskopi Observation
- Förvärva bilderna med en inverterad laser skanning confocal Mikroskop med 40 X oljeimmersionsobjektivet (1.3 NA) med en avsökningsfrekvens på 400 Hz. anställa en vitt ljus laserkälla för att excitera det Texas röd DHPE på 595 nm. Samla in utsläpp från 605 till 700 nm med hjälp av en hybrid photon detektor.
Obs: Alternativt ett epi-fluorescens Mikroskop kan användas för avbildning. Beroende på de tillgängliga ljuskällorna, Välj en lämplig lipid-dye konjugat.
Representative Results
Lipid suspensionen erhölls i steg 1 i protokollet och användas under hela experimenten innehåller två huvudtyper av blåsor: MLVs och GUVs. Figur 1 A-1F visar laserscanning confocal micrographs av blåsor i första provet konstruerad i 3D. Figur 1 A-1_C visar en MLV (lipid insättning) i xyz, xz och yz plan, respektive. Figur 1 D-1F visar liknande utsikt över en jätte unilamellar vesikler (chef). Den inre delen av de GUVs, som saknar multilamellarity, är ihålig; lipid materialet för att sprida är därför avsevärt begränsad. De enda användbara lipid reservoarerna för denna metod är därför MLVs.
När lipid suspensionen överförs till observation kammaren som innehåller Ca2 +- HEPES bufferten (figur 1G), starta MLVs (figur 1A-1_C) sedimentera på Al2O3 yta. Blåsor följa ytan vid kontakt, och en cirkulär platta dubbla lipid lipidens membran (DLBM) börjar spridas från varje MLV på fasta stödet (figur 1H-1J). MLV fungerar som en reservoar som ger lipider för den ständigt växande DLBM. Distala (övre) lipidens membranet, med avseende på fasta stöd, är ansluten till proximal (nedre) lipidens membranet längs omkretsen av cirkulär kanten, utför ett rullande vinkar (figur 1jag). De två lipidmonolager är placerade blankt ovanpå varandra, att bara ha en tunn vätskefilm inkapslade mellan dem. Under spridning följer proximala membranet kontinuerligt till support ytan under, medan distala membranet är sido drog vid kanterna av den expanderande proximala membran-kanten. Fördelningen av DLBM medieras av Ca2 +, som fungerar som en fusogenic agent mellan lipid huvud grupper från den proximala membranen och fasta substrat4.
Om spridningen fortsätter under längre perioder, membranet spänning ökar, vilket leder till bristningar (figur 2A och 2B). Efter den punkten, kan membran dementi, som är nödvändiga för att skapa ER tubulär morfologi, inte längre induceras. Det är därför viktigt att erkänna de brusten membran. Eftersom lipider i våra experiment märks fluorescently, kan den spricker observeras direkt. En viktig indikator spricker är den betydande nedgången i fluorescensintensiteten brusten regionen (figur 2A och 2B)14. Den spricker är ett resultat av den ökade spänningen och efterföljande pore formation i distala membranet. I fluorescerande Mikroskop, brusten regionerna därför ställer ut halva utsläpp intensiteten (enda proximala lipidens) av unruptured regioner (dubbel lipidens)14 (figur 2B). Under pore bildandet migrerar det membran material, som var ursprungligen placerad på Regionkommittén brusten, till kanterna på fördelande plåstret. Detta medför i sin tur en tillväxt av övergripande patch området. Därför kan en snabb expansion av konturen av cirkulär lappen också observeras under spricker.
För att undvika omfattande tillväxt leder till bristning av patchar, omedelbart efter området cirkulär patch når 100-200 µm, avlägsnas Ca2 +- HEPES bufferten försiktigt med en automatisk pipett till en tunn film av flytande kvar på ytan. Kelator-HEPES bufferten läggs sedan försiktigt till kammaren för att initiera den returgående fas (figur 1K). En fullständig uttorkning av provet (figur 2C) eller snabbt utbyte av buffertar (figur 2D och 2E) orsakar störningar, spricker eller deformation av patchar. Tillägg av kelater successivt tar bort Ca2 + från utrymmet mellan ytan och membran. Kelator-HEPES bufferten åtkomster gradvis inter-bilayer-substrat utrymmet, start från peripheryen av lipid membranet plåstret. Därför avlägsnande av fastnålnings webbplatser börjar från kanterna av cirkulär lappen och propagerar inåt (figur 1K-1Q). Till följd av depinning börjar lipid membranet lossa och dra in från de kanter inåt, framåt mot MLV på center. Dementi leder till ett nytt gränssnitt för att dynamiskt utveckla lipidic tubulär nätverk4 (figur 1L-1Y). De ihållande regioner av fastlåsning, som inte tillåter membranet lossna helt, kvar på den ytan och nucleate tabulering, vilket leder till långa förgrenade nätverk av nanorör. (Figur 1L-1Y). Kontinuerlig de fästa och ytterligare indragning av lipid nanorör observeras över tid som följd av den gradvisa kelering processen. Denna förgrovning och omflyttning av nätverket grenarna spelar en nyckelroll i de tubulära nätverken, som liknar smidig ER dynamiska beteende.
Figur 1 L-1Y visar micrographs av nanotube nätverken erhålls i protokollet. Figur 1 L är en närbild av regionen i figur 1M markerade i den vita ramen. Kontinuerlig klarröda regionerna i figur 1L och 1 M är den Upprullningskraften fraktionen av den DLBM (markerad med en blå streckad linje i diagram 1M). Mikrograf av en tubulär nätverk i figur 1N och 1O är inverterad för att öka kontrasten. Figur 1 P och 1Q skildrar minskning av tubulär tätheten på en membran-region under loppet av 3 h och 20 min. Minskningen av tubulär densitet uppstår på grund av den gradvisa depinning följt av indragning av DLBM från ytan under experimentell period. Över tid, antalet poäng som befriade från fästa ökar, vilket leder till omstruktureringar och en minskning av det område som omfattas av rör (figur 1P och 1Q). De tubulära rearrangements är motiverade av ytan fri energi minimering av en lipid nanotube upphängd mellan två fasta punkter. Det är väletablerat att det mest effektiva sättet att minimera ytan energi av en nanotube är att minska dess längd15. Därför, när de fusogenic regionerna, som inledningsvis håller nanorör på ytan, är de fästa, nanorör Skjut och ordnar sig spontant, att anta en minimal längd. Dessa rearrangements orsaka en gradvis minskad täckning av ytan av nanorör (figur 1P och 1Q).
Vi kan inte visualisera den Ca2 +-medierad fastnålnings punkter, men vi etablera sina platser som de punkter där rören har terminal eller skarpa svängar. Skarpa svängar kallas V-korsningar15 eller vändpunkter på grund av plötslig förändring i riktning mot rörets justering (gröna pilar i figur 1R och 1 X). Slutpunkten representerar slutstationen för röret, vilket förhindrar att röret Upprullningskraften (orange pilar i figur 1X). Under ren-organization, energetically gynnsamma disposition av rören som identifieras som ”Y-korsningar” eller ”3-vägs korsningar”, visas. Y-korsningen förbinder tre rör med cirka 120° vinklar mellan varje tub, där den kortaste total rörlängd kan säkras. Y-korsningar, som äger inte en slutpunkt och istället placeras mellan flera nanorör, är inte fästa. Detta är den enda Y-korsning-typ som kan utföra glidande (blå pilar, figur 1R). Som visas i figur 1R och 1S, glidning av en Y-korsning längs en mycket instabila korsningen resulterar i bildandet av två enskilda Y-korsningar (blå pilar i figur 1S). Den streckade vita linjen överlagrade på figur 1S representerar konturen av tubulär nätverk fragmentet i figur 1R. En bråkdel av Y-korsningar äger ändhylsor (gula pilen i figur 1T) som, över tiden, så småningom tillbaka (figur 1U). Omformningen av en V-korsning för att en enda, raka röret genom depinning av skärningspunkten för de två linjesegment och indragning av en av de rör som utgör V-formen kan observeras i figur 1V och 1W och Figur 1X och 1Y, respektive.
Figur 1 : Omvandling av lipid insättningar till ER-liknande tubulär nätverk. (A-F) Laser scanning confocal micrographs av blåsor i första urvalet, konstruerat i 3D. (A-C) Multilamellar lipid vesikler (MLV, lipid insättning) i xyz, xz och yz flygplan, respektive. (D-F) Liknande åsikter av en jätte unilamellar vesikler (chef). Den inre delen av GUVs är ihåliga, vilket gör lipid materialet för att sprida avsevärt begränsad. Användbar lipid behållarna för denna metod är alltså MLVs. (G) Illustration av observation kammaren monterad på ett inverterat Mikroskop som den buffert och lipider deponeras. Avdelningen består av en PDMS ram följs på ett Al2O3 belagda täckglas, som tillhandahåller en öppen volym topp. (H-J) Illustration av MLV i närvaro av Ca2 +fördelande företeelser. (H) vid kontakt med Al2O3sprider MLV spontant i form av ett cirkulär, dubbla lipid lipidens membran (DLBM). (I) Schematisk sidovy av DLBM i i xz-planet, där periferier utföra rullande rörelse. MLV (d = 5-15 µm) och DLBM (tjocklek = 10 nm) är inte ritade i skala. J en confocal Mikrograf av en fördelande DLBM från top-view. (K) beskriver det viktigaste steget i detta protokoll, där bufferten är utbytt till en som innehåller Ca2 + kelatmedel, hämma spridning, orsakar indragning av DLBM att MLV och leder till bildandet av lipid nanorör. (L-Y) Micrographs av nanotube nätverken erhålls med den beskrivna metoden. (L) Närbild av regionen i (M) markerade i en ram. Kontinuerlig klarröda regionerna i (L och M) representerar de DLBM (också märkt med en blå streckad linje i M). Mikrograf tubulär nätverk (N och O) är inverterad för att öka kontrasten. (P och Q) Skildring av minskningen av tubulär tätheten på en membran region under loppet av 3 h och 20 min. (R-Y) representativa tubulär re-arrangemang. (R och S) Glidande, (T och U) övergår i en Y-korsning för att V-korsningen genom indragning av en slutpunkt, och (V och W) de fästa en vändpunkt, som leder till utrotning av en V-korsning. (X och Y) Indragning av en slutpunkt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Potentiella negativa resultat. (A och B) Spricker av distala membranet på grund av en lång väntetid innan utbyte av buffertar. Brusten områdena, där proximala membranet blir synlig, visas som mörka regioner jämfört med Regionkommittén unruptured distala membran. Infällt till panel B visar ljusintensiteten längs den blå pilen på Mikrograf. Intensiteten av brusten regionerna av membranet (proximala Enkelrum lipidens blir synliga) motsvarar halva intensiteten av unruptured membran (distala dubbelsäng lipidens). (C) utseende av en torr lipid lapp bildas till följd av borttagande av alla flytande från observation kammaren. (D och E) Störningar av membranet av snabbt utbyte av buffertar via automatisk pipett. I (D), har MLV delas upp i 2 MLVs, leder till en icke-cirkulära, deformerade lipid patch. (E), i mönstret av flödet (pilar), skapad av stark injektion av kelator-HEPES bufferten, reflekteras på tubulated membran strukturen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
I den följande diskussionen beskrivs de kritiska steg, eventuella ändringar och begränsningar i protokollet. Ett första viktigt steg är korrekt montering av observation kammaren, eftersom vidhäftningen av PDMS ramen till Al2O3 ytan är egensäkra svag. I fall där ramen inte följer underlaget ordentligt, innehållet kommer att läcka från observation kammaren och experimentet kommer att avstanna. De viktigaste faktorerna som hindrar korrekt försegling av ytan och ram är 1) brist på noggrann rengöring av ramen PDMS (återanvändas) och 2) luftbubblor som ibland få anhållna mellan ram och substrat. En nyligen beredd eller grundligt rengjorda PDMS ram bör användas. Ramen bör sköljas före och efter varje användning med isopropanol, följt av sköljning med DI vatten och föning med kväve. Al2O3 ytor kräver inte någon föregående rengöring, eftersom de är tillverkade i renrum och förvaras i tillslutna behållare fram till användning. Amfotära pågrund av Al2O3, bör den inte utsättas för starkt sur eller basisk lösningar. Andra konstruktioner för observation kammaren kan användas, beroende på tillgänglighet av den enskilda inställningen. Viktiga funktioner i denna kammare är fri tillgång till flytande prov från den öppen toppen och hur inert ram material med avseende på begagnade lösningar och prover. Kammaren mått är också en viktig faktor, eftersom de bör rymma en volym från 0,5 till 1 mL. Eftersom de ytor som används är vanligtvis standardstorlek coverslips (24 x 60 mm), bestäms volymen av kammaren främst tjockleken av ramen. Till vår kunskap är distanser med storlek och djup som rymmer de provmängder som vanligtvis hanteras i detta protokoll inte kommersiellt tillgängliga. Vi har därför ägnat ett avsnitt i protokollet till Detaljer för tillverkning och montering av en prov kammare ram.
Det andra avgörande steget i detta protokoll är buffert utbyte. En utmaning i det här steget är timingen behövs för att utföra detta utbyte. Fördelningen av MLV vid kontakt med Al2O3 substratet är omedelbar, och en kontinuerlig utbyggnad av DLBM leder till dess spricker, avsluta experimentet (figur 2A, B). Därför fördelningen bör övervakas ständigt och buffert utbyte måste utföras i god tid. Utbyte bör inte utföras för snabbt efter initiering av spridning, för att möjliggöra membran patchar att nå en optimal storlek (100-200 µm i diameter). Däremot, orsakar kontinuerlig vidhäftning på ytan hög membran spänning, vilket leder till spricker. Således lappen alla membran så småningom brista om sprider inte avbryts. Tidpunkten för den spricker skiljer sig för varje plåster, eftersom det beror på storlek och inre strukturen av MLV och tillgängligheten av lipider däri. Tidpunkten för utbyte bör därför ordnas till en tidpunkt där un-brusten patchar med optimal storlekar representera en majoritet av hela befolkningen. En annan utmaning i buffert utbyte steg är den borttagning och tillägg av buffertar. Utför denna substitution för snabbt har en skadlig inverkan på de slutliga membranstrukturer (figur 2C-E). Överdriven utvinning av Ca2 +- HEPES bufferten utan att lämna en tunn vätskefilm på underlaget, resulterar i torkade och oåterkalleligt deformerade membran patchar (figur 2C). Även om en ordentlig mängd vätska bibehålls på ytan, orsakar abrupt tillägg av kelator-HEPES bufferten också störning av membranstrukturer. Figur 2 D,E visar det typiska utseendemässigt av hydrodynamiskt störd membran patchar. De övergripande morfologiska störningar påverkar inte nödvändigtvis de dynamiska egenskaperna hos de slutliga strukturerna (dvs, de rörformiga omflyttningar i återstående områden sker fortfarande). Det blir dock svårt att observera materiella omformningen på deformerade strukturer. Till exempel i figur 2D, skulle det vara svårt att bestämma riktningen mot som MLV DLBM dras in.
En möjlig ändring av protokollet är lipid sammansättning används. Tyngdpunkten har legat på fosfolipider som dominera ER sammansättningen hos däggdjur och jäst16 (e. g., fosfatidylkolin (PC), fosfatidyletanolamin (PE), och fosfatidylinositol (PI). De ursprungliga experimenten utfördes med hjälp av PC och PI blandningar4. I de resultat som presenteras, användes en blandning av PC och knark och ett derivat av PE. Dock har inte alla godtyckliga lipid kompositioner hittats för att skapa de tubulära strukturer som erhållits genom detta protokoll. Några av andra försöksvis undersökta lipid blandningar innebär totala hjärtat extrakt, soy bean extrakt polar, E. coli extrakt polar, blandningar av PC med stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoinositol (Lyso-PI) i varierande proportioner och blandningar av PC-PE-PI-Posphatidyl serine (PS) i varierande proportioner. Eftersom tubulär membranstrukturer besitter hög krökningar och kräver särskilda arrangemang av enskilda lipid molekyler, förväntas det att det observerade fenomenet är lipid sammansättning-specifika.
En annan ändring tillämpas i detta protokoll är metoden för surface fabrication. Här användes ALD att fabricera den Al2O3 belagda coverslips. Detta skiljer sig från metoden ursprungligen rapporterade nedfall, reaktiv sputtring4. Medan detta indikerar att en alternativ yta fabrication metod fortfarande kan leda till ER-liknande tubulation, verkar en viktig begränsning vara specificiteten av ytmaterialet. Funktionsläget av spridning och styrka vidhäftning är starkt beroende av ytmaterialet, egenskaper som påverkar faktorer såsom elektrostatiska interaktioner, Vätbarheten, vattenavvisande egenskaper och ojämnheter på ytan. Al2O3 ytor ger optimal vidhäftning styrka och lipid filmer kan både koppla starkt nog att sprida som en dubbel lipid lipidens membran och lossa tubulär nätverk efter borttagning av Ca2 + joner. Vi testade tidigare samma experiment med SiO2, där de multilamellar blåsor sprida som en dubbel lipid lipidens membran, men ingen tubulär nätverk bildning observerades vid tillägg av kelater17. Avinstallation fastsättning och tube bildandet observeras endast på Al2O3 eller plasma etsade Al18. Våra undersökningar visade att parametern bidragande leder till sådant fenomen var zeta potential av ytor, för vilka Al och Al2O3 var nära noll (mV) och SiO2 avsevärd negativ. Zeta potential av borosilikatglas är liknande till SiO219; vidhäftning av lipid filmer på borosilikatglas är därför lika stark och oåterkalleliga. I själva verket leder multilamellar lipid reservoar kontakt med Borsilikat ytor vanligtvis till omedelbar bristning och bildandet av enda lipid lipidmonolager20. Al2O3 ytor krävs för detta protokoll är inte lätt eller kommersiellt tillgängliga. De kan dock vara anpassad beställas från specialitet glas och substrat tillverkare. Tillgång till renrum med tunnfilms-tillverkning utrustning rekommenderas.
De andra befintliga underifrån metoderna att tillverka ER-liknande tubulär nätverk2,10 involverar proteiner samt input av kemisk energi (t.ex., GTP och ATP). Rapoport och kollegor2 rapporterade bildandet av ER-nätverk på glas coverslips in vitro- genom att blanda de membran-bockning proteinerna som finns kvar i ER, med fosfolipider och GTP. Arbetet av Bachand o.a. 10 visar hur sådana dynamiska tubulär nät kan skapas med hjälp av molekylära motorer och ATP som energikälla. Detta protokoll presenteras kräver inte membranproteiner eller hydrolys av organiska föreningar för energi. Endast nödvändiga komponenter är fasta substrat och fosfolipider. Rening och utvinning av proteiner krävs inte. Detta protokoll ger, när det gäller enkelhet av konstituerande molekylerna, den mest grundläggande ER-modellen.
Med denna grundläggande, lipid-baserade ER modell etablerade, är bygga upp komplexiteten genom att lägga till ER-associerade komponenter av intresse, eftersom det gör det möjligt för utredning av enskilda effekter på systemet. Liknar de faktiska ER nätverk, rör i modellen är dynamiska. De konjugation till och migration av märkt membranproteiner eller fluorescerande partiklar i hela tubulär nätverket, kan ge information om membran rörelseriktning. Inkapsling och övervakning av fluorescerande vätskor inne i DLBM och rör under omformningen och ett möjligt kartläggning av intratubular innehåll transport kan tjäna som en annan inriktning. Slutligen kan en övergång från den 2D ER-modell som följd av detta protokoll mot en 3D slät modell antas genom inkapsling av näten i hydrogel arkitekturer.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Prof. Aldo Jesorka från Chalmers University of Technology i Sverige för hans ovärderliga synpunkter på manuskriptet. Detta arbete har gjorts möjlig genom ekonomiskt stöd från forskning rådet av Norge (norska) projektet bidraget 274433, UiO: biovetenskap konvergens miljö, Vetenskapsrådet (Vetenskapsrådet) projektet Grant 2015-04561, samt den startfinansiering som tillhandahålls av centrum för molekylärmedicin Norge & fakulteten för matematik och naturvetenskap vid universitetet i Oslo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pear-shape flask 10 mL | Lenz Laborglasinstrumente | 3.0314.13 | In which the lipid mixture is prepared |
| Hamilton 5 mL glass syringe (P/N) | Hamilton | P/N81520 | For transfer of the chloroform to beaker |
| Custom large hub needle Gauge 22 S | Hamilton | 7748-18 | Removable needle for syringe specified in row 3 |
| Hamilton 250 µL glass syringe | Hamilton | 7639-01 | Used for transfer of lipids in chloroform to the flask |
| Large hub Gauge 22 S | Hamilton | 7780-03 | Removable needle for syringe specified in row 5 |
| Hamilton 50 µL glass syringe | Hamilton | 7637-01 | Used for transfer of fluorophore-conjugated lipids to the flask |
| Small hub Gauge 22 S | Hamilton | 7770-01 | Removable needle for syringe specified in row 7 |
| Chloroform anhydrous (≥99%) | Sigma-Aldrich | 288306 | Used to complete the lipid mixture to a total of 300 µL |
| Soy L-α Phosphatidyl choline lipid (Soy PC) | Avanti Polar Lipids Inc | 441601 | phospholipid species contributing to 69% of the total composition/mixture |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids Inc | 850725 | phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture |
| L-α Phosphatidyl inositol lipid (Soy PI) | Avanti Polar Lipids Inc | 840044 | alterative phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture (from the original article Bilal and Gözen, Biomaterials Science, 2017) |
| Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | T1395MP | Fluorescent-lipid conjugate, 1% of the lipid composition/mixture |
| Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fischer | 88870006 | To warm glycerol in order to decrease its viscosity |
| Glycerol for molecular biology (≥99%) | Sigma Life Science | G5516 | For lipid preparation |
| PBS buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 17-21 | Used to prepare the lipid suspension | ||
| TRIZMA base, primary standard and buffer (≥99%) | Sigma Life Science | T1503 | Used to prepare PBS buffer |
| Potassium phosphate tribasic, reagent grade (≥98%) (K3PO4) | Sigma-Aldrich | P5629 | PBS buffer ingredient |
| Magnesium sulfate heptahydrate, BioUltra (≥99,5%) KT (MgSO47H2O) | Sigma Life Science | 63138 | PBS buffer ingredient |
| Potassium phosphate monobasic, anhydrous, free flowing, Redi-Dri, ACS (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 795488 | PBS buffer ingredient |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate ACS reagent, 99.0-101.0% (Na2EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | PBS and Chelator-HEPES buffer ingredient |
| Ultrasonic cleaner USC-TH | VWR | 142-0084 | Ultrasonication of rehydrated lipids |
| Rotary evaporator - Büchi rotary evaporator Model R-200 | Sigma | Z626797 | For evaporation of chloroform |
| Pressure meter - Vacuum regulator IRV-100 | SMC | IRV10/20 | For controlling the pressure value during lipid dehydration |
| HEPES-buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 26-27 | Used for rehydration of lipids. Content: 10 mM HEPES with 100 m NaCl diluted in ultrapure deionized water | ||
| HEPES ≥99.5% (titration) | Sigma Life Science | H3375 | HEPES-buffer ingredient |
| Sodium chloride for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥98% (titration) (NaCl) | Sigma Life Science | S3014 | HEPES-buffer ingredient |
| Calcium-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 29 | Used for spreading of lipids. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 4 mM CaCl2 diluted in ultrapure deionized water | ||
| Calcium chloride anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% (CaCl2) | Sigma Life Science | C5670 | To prepare Calcium-HEPES buffer |
| Chelator-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 31 | Used to promote the formation of tubular networks. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA and 7 mM BAPTA diluted in ultrapure deionized water | ||
| 1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt ≥95% (HPLC) (BAPTA-Na4) | Sigma Life Science | 14513 | Chelator-HEPES buffer ingredient |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| pH meter accumet™ AE150 pH | Fisher Scientific | 1544693 | Used to measure the pH of all buffers |
| Glass petri dish | VWR | HECH41042012 | 6 cm, used for making the PDMS sheet |
| Potassium hydroxide ACS reagent, ≥85%, pellets (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473 | To make the KOH solution for cleaning glass petri dish for the fabrication of the PDMS sheet |
| Isopropanol prima ren 99.5% | Antibac AS | 600079 | KOH solution ingredient |
| Heating and drying oven - venticell | MMM Medcenter Einrichtungen GmbH | MC000714 | For drying of the glass petri dish after silanization and to cure PDMS |
| Dichlorodimethylsilane ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 440272 | Used for silanization of glass petri dish in which PDMS sheet is prepared |
| Vacuum pump | Cole-Parmer | EW-79202-05 | Connected to desiccator |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow corning | 24236-10 | Kit to make PDMS solution |
| Sylgard 184 Silicone elastomer base | |||
| Disposable scalpel | Swann-Morton | 11798343 | Used to cut the PDMS |
| Cover slips | Menzel -Gläser | MEZ102460 | 24x60 mm. Used to deposit thin film of Al2O3 |
| Atomic layer deposition system | Beneq | TFS200 (model number) | Atomic Layer deposition system used to deposit thin film of Al2O3 in microscope cover glass |
| Ellipsometer | J.A. Woollan Co. | Alpha-SE (model name) | System used to charcaterize the thickness of the film deposited on glass surface |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | Microscope used for visualization of the experiment |
| Objective 40x, 1.3 NA | Leica Microsystems | 1550635 | Used for visualization of the experiment |
| White light laser source | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | For excitation of the membrane fluorophore |
References
- Chen, S., Novick, P., Ferro-Novick, S.
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543 (7644), 257-260 (2017).
- Pendin, D., McNew, J. A., Daga, A. Balancing ER dynamics: Shaping, bending, severing, and mending membranes. Current Opinion in Cell Biology. 23 (4), 435-442 (2011).
- Bilal, T., Gözen, I. Formation and dynamics of endoplasmic reticulum-like lipid nanotube networks. Biomaterials Science. 5 (7), 1256-1264 (2017).
- Shibata, Y., et al. Mechanisms determining the morphology of the peripheral ER. Cell. 143 (5), 774-788 (2010).
- Ozcan, L., Tabas, I. Role of endoplasmic reticulum stress in metabolic disease and other disorders. Annual Review of Medicine. 63, 317-328 (2012).
- Yamanaka, T., Nukina, N. ER dynamics and derangement in neurological diseases. Frontiers in Neuroscience. 12, (2018).
- Taalab, Y. M., et al. Mechanisms of disordered neurodegenerative function: Concepts and facts about the different roles of the protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase (PERK). Reviews in the Neurosciences. , (2018).
- Shemesh, T., et al. A model for the generation and interconversion of ER morphologies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 5243-5251 (2014).
- Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
- Sackmann, E. Endoplasmatic reticulum shaping by generic mechanisms and protein-induced spontaneous curvature. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 153-160 (2014).
- Jesorka, A., et al. Generation of phospholipid vesicle-nanotube networks and transport of molecules therein. Nature Protocols. 6, 791 (2011).
- Hook, D. A., Olhausen, J. A., Krim, J., Dugger, M. T. Evaluation of Oxygen Plasma and UV Ozone Methods for Cleaning of Occluded Areas in MEMS Devices. Journal of Microelectromechanical Systems. 19 (6), 1292-1298 (2010).
- Gözen, I., et al. Fractal avalanche ruptures in biological membranes. Nature Materials. 9 (11), 908-912 (2010).
- Lobovkina, T., Dommersnes, P., Joanny, J. -F., Hurtig, J., Orwar, O. Zipper Dynamics of Surfactant Nanotube Y Junctions. Phys Rev Lett. 97, (2006).
- van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (2), 112-124 (2008).
- Gözen, I., et al. Repair of large area pores in supported double bilayers. Soft Matter. 9 (10), 2787-2792 (2013).
- Gözen, I., et al. Thermal migration of molecular lipid films as a contactless fabrication strategy for lipid nanotube networks. Lab on a Chip. 13 (19), 3822-3826 (2013).
- Sides, P. J., Hoggard, J. D. Measurement of the Zeta Potential of Planar Solid Surfaces by Means of a Rotating Disk. Langmuir. 20 (26), 11493-11498 (2004).
- Nissen, J., Jacobs, K., Rädler, J. O. Interface Dynamics of Lipid Membrane Spreading on Solid Surfaces. Physical Review Letters. 86 (9), 1904-1907 (2001).
