Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Identifikation af celleoverflade markører for primær neurale stamme og stamceller ved metabolisk mærkning af Sialoglycan

Published: September 7, 2019 doi: 10.3791/58945
Automatic Translation
*1, *2, 1
1Brain and Spinal Cord Innovative Research Center of Tongji Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University and Frontier Science Research Center for Stem Cells of Ministry of Education, 2College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Beijing National Laboratory for Molecular Sciences, Synthetic and Functional Biomolecules Center, and Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education, Peking University
* These authors contributed equally

Summary

Præsenteret her er en protokol, der kombinerer en in vitro neurale-Endothelial Co-kultur system og metabolisk inkorporering af sialoglycan med bioorthogonal funktionelle grupper til at udvide primære neurale stamme og stamcelle celler og mærke deres overflade sialoglycoproteiner til billeddannelse eller massespektrometri analyse af celleoverflade markører.

Abstract

Neurale stamme-og stamceller (Nspc'er) er det cellulære grundlag for de komplekse strukturer og funktioner i hjernen. De er placeret i specialiserede nicher in vivo og kan isoleres og udvides in vitro, tjener som en vigtig ressource for celletransplantation til at reparere hjerneskade. Nspc'erne er imidlertid heterogene og ikke klart defineret på molekyleniveau eller renset på grund af manglende specifikke celleoverflade markører. Den forelagte protokol, som tidligere er blevet rapporteret, kombinerer et Neural-Endothelial Co-Culture system med en metabolisk Les mærkningsmetode til at identificere overfladen sialoglycoproteome af primære nspc'er. Det NSPC-endotheliale Co-kultur system giver mulighed for selvfornyelse og udvidelse af primære Nspc'er in vitro, genererer et tilstrækkeligt antal nspc'er. Sialoglycans i dyrkede nspc'er er mærket ved hjælp af en unaturlig sialisyre metabolisk reporter med bioorthogonal funktionelle grupper. Ved at sammenligne sialoglycoproteomet fra selvfornyende Nspc'er ekspanderet i en endotelco-kultur med differentierende neurale kultur, identificerer vi en liste over membran proteiner, der er beriget i Nspc'er. I detaljer omfatter protokollen: 1) oprettelse af en NSPC-Endothelial Co-kultur og NSPC differentierende kultur; 2) mærkning med azidosugar per-O-acetyleret N-azidoacetylmannosamin (AC4Mannaz); og 3) biotin konjugering til modificeret sialoglycan til billeddannelse efter fiksering af neurale kultur eller protein udvinding fra neurale kultur for massespektrometri analyse. Derefter udvælges de NSPC-berigede overflade markør kandidater ved komparativ analyse af massespektrometri data fra både det udvidede NSPC og differentierede neurale kulturer. Denne protokol er meget følsom for at identificere membran proteiner af lav overflod i udgangsmaterialerne, og det kan anvendes til markør opdagelse i andre systemer med passende ændringer

Introduction

Neurale stamceller er defineret som en multi potent cellepopulation, der kan selv forny for at opretholde en stamcelle pulje og differentiere sig til neuroner og glia. De er de vigtigste celletyper i nervesystemet og kan tilbyde stort terapeutisk potentiale i regenerativ medicin gennem celletransplantation til syge og sårede hjerner1,2. Efterhånden som udviklingen skrider frem, bliver den neurale stamcelle population heterogene3,4, og andelen af neurale stamceller i hjernen aftager gradvist5. Generelt er embryonale neurale stamceller og andre neurale stamceller, kollektivt kaldet neurale stamme-og progenitorceller (Nspc'er), placeret i avlsmateriale zonerne, ventrikel zonen og den subventrikulære zone i mus6. I den embryonale hjerne genererer neurale stamceller neuroner direkte eller indirekte gennem mellemliggende progenitorceller (IPCS) og i nogle arter gennem den ydre subventrikulære zone forfædre (orgs)7,8. Den specifikke molekylære signatur, morfologi, placering i stamcelle niche, og differentiering potentiale alle bestemme rollen for hver under type i hjernen organogenesen og kliniske anvendelser9. De aktuelt tilgængelige celleoverflade markører kan dog ikke utvetydigt diskriminere og rense forskellige undertyper af Nspc'er, hvilket begrænser forståelsen og udnyttelsen af disse undertyper.

Identifikationen af primære Nspc'er overflade markører er begrænset af tre store forhindringer. Den første er det begrænsede celleantal af Nspc'er i vævet, hvilket gør det vanskeligt at forberede celleoverflade protein prøver til almindelig massespektrometri analyse. Den anden begrænsning er vanskeligheden ved at producere rene celle undertyper til generering af subtype-specifikke membran protein data. Endelig er den tredje udfordring det lave forhold mellem celleoverflade proteiner i hele celle proteiner, som hæmmer deres detekteringsfølsomhed ved massespektrometri analyse.

For at overvinde disse problemer, vi udviklet en chemoproteomic tilgang til selektivt berige og identificere celleoverflade proteiner i primære Nspc'er ved metabolisk mærkning af sialoglycoproteiner10. For at generere et tilstrækkeligt antal Nspc'er benyttede vi en etableret protokol til at udvide og vedligeholde primære embryonale Nspc'er i udifferentierede stater in vitro, ved at co-culturing Nspc'er med musehjerne endotheliale cellelinjer ved hjælp af en permeabel støtte matrix indsats (f. eks. transwell) system11. I modsætning hertil genererer npscs, som dyrkes alene uden endotelceller, differentieret afkom11,12. Således kan protein prøver fra disse to kultur systemer relativt analyseres for at identificere proteiner, der differentielt udtrykkes i Nspc'er og differentierede neuroner. Da de fleste celleoverflade proteiner modificeres af sialsyre13, blev unaturlig sialsyre forløber analogt N-azidoacetylmannosamin-tetraacyleret (AC4Mannaz) anvendt til at kapre den iboende metaboliske pathway, således at endogene, nyligt syntetiseret sialoglycans er mærket med azido grupper, genererer en kemisk håndtag14. Gennem azido-alkyne-medierede bioortogonale reaktioner, som konjugat biotin til sialoglycans, kan celleoverflade proteiner visualiseres og beriges til proteomisk identifikation gennem en streptavidin-koblet fluoroforet eller matrix14.

Her udfører vi farvning af SDS-side gel analyse af overfladen sialoglycoproteome fra nspc'er ekspanderet i en endotel Co-kultur og differentiere celler i et ikke-Co-kultur system. Vi renser også selektivt overflade sialoglycoproteome i de to kultur systemer til proteomisk sammenligning. Vores protokol, sammenlignet med de traditionelle Centrifugerings baserede celleoverflade rensning protokoller15, øger ekstraktions effekten ved at reducere overfladen protein udvinding procedurer gennem specifik tag konjugation og affinitet Rensning. I mellemtiden, det øger udvinding renhed af celleoverflade proteiner baseret på den forudsætning, at sialylering sker mest på celleoverfladen proteiner. Selv om endotelfaktorer ikke helt kan blokere differentieringen af ekspanderede Nspc'er, giver den komparative undersøgelse mellem en co-kultur og differentieret kultur en bekvem metode til at lokalisere stamcelle berigede overflade proteiner, uden at det er nødvendigt at Analysér proteiner fra NPC'er renset af FACS16. Vi mener, at denne fremgangsmåde kan anvendes til undersøgelser af overflade proteiner i andre systemer med passende modifikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle de dyre protokoller, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev godkendt af IACUC (Udvalget for institutionel dyreomsorg og-anvendelse) på Tsinghua Universitet og udført i overensstemmelse med IACUC'S retningslinjer. Laboratoriet dyre facilitet på Tsinghua Universitet er blevet akkrediteret af AAALAC (Association for vurdering og akkreditering af laboratorium Animal Care International). Til iscenesættelse af embryoner blev midt dagen for det identificerede vaginal stik beregnet som embryon dag 0,5 (E 0,5).

Bemærk: Alle celler dyrkes i celle inkubator under forhold på 37 °C og 5% CO2.

1. forberedelse af muse Endotelkulturen i permeable støtte skær

Bemærk: BEND3 celler vedligeholdes i henhold til producentens anvisninger.

  1. Forbered BEND3 celle medium (BM) ved at tilsætte 50 mL FBS og 5 mL penicillin-streptomycin i 500 mL DMEM og bland godt.
  2. Aspirer mediet fra skålen og vask BEND3-cellernes kultur med 1 mL PBS én gang. 1 mL 0,25% trypsin-EDTA tilsættes til cellerne, og cellerne inkubates i 4 minutter ved 37 °C.
  3. Tilsæt 1 mL BM i cellerne for at neutralisere trypsin-EDTA og pipetten forsigtigt op og ned for at adskille cellerne fuldstændigt. Cellesuspensionen overføres til en ny 15 mL konisk slange og pellet ved centrifugering ved stuetemperatur (RT) i 5 minutter ved 400 x g.
  4. Opsug supernatanten fra røret og resuspension cellerne med 9 mL frisk BM, og tilsæt derefter 1 mL cellesuspension til en gennemtrængelig støtteindsats. Tilsæt yderligere 2 mL frisk BM pr. brønd i det nederste kammer i matrixen. Fortsæt med at kultur cellerne for en dag.

2. forberedelse af mus primære kortikale NSPCs kultur

  1. Fremstilling af kultur plade, papain fordøjelses medium, og kortikale vedet kulturmedium (AM)
    1. Coat 6-brønd plader med poly-L-lysin (PLL) ved at tilføje 1 mL PLL opløsning pr brønd i 6-brønd plader. Derefter inkubatér pladerne ved RT i 30 min.
    2. PLL-opløsningen overføres til et 15 mL konisk rør. Vask pladerne 3 gange med dobbeltdestilleret vand. Airdry pladerne og læg dem til side indtil brug.
    3. Forbered papain fordøjelses mediet ved at tilføje 50 U papain, 50 μL L-glutamin og 50 μL af 100 mg/mL Acetyl-L-Cystein i 5 mL DMEM. Bland mediet kortvarigt og opvarmer det til 37 °C i 30 minutter for Enzymaktivering.
    4. Forbered den kortikale celle vedet kulturmedium (AM): Tilsæt 500 μL L-glutamin, 500 μL natriumpyruvat, 500 μL af 100 mg/mL N-acetyl-L-Cystein, 500 μL N2, 1 mL B27 og 5 μL 100 μg/mL bFGF til 50 mL DMEM. Bland mediet godt og varm det til 37 °C før brug.
  2. Forberedelse af primære cerebral kortikale celler og efterfølgende plating
    1. Offer en E 10.5 timet gravid mus ved livmoderhals dislokation.
      Bemærk: Ved E 10.5 er størstedelen af cellerne prolifererende Nspc'er i hjernebarken, hvilket giver anledning til store kloner af afkom in vitro.
    2. Steriliser maven med 75% ethanol. Brug fine sakse og mikro-serrated tang til at åbne maven ved at skære huden og underliggende muskler langs højre side af den midterste linje. Fjern livmoderen fra bughulen forsigtigt med savtakket æg tang og skær den ud fra bughulen med fin saks.
    3. Livmoderen vaskes med 40 mL forkølet HBSS i 10 cm Petri skål. Derefter overføres livmoderen til en ny 10 cm Petri skål og vaskes igen med 40 mL forkølet HBSS.
    4. Livmoderen overføres til en ny 10 cm Petri skål med 40 mL forkølet HBSS. Fjern embryonerne fra livmoderen og Foster membranen, og skær derefter hovedet af embryonerne ud fra stamperne med Jewelers micropincet.
    5. Hovederne vaskes med 40 mL forkølet HBSS, og hovederne overføres til en ny 10 cm Petri skål med 40 mL forkølet HBSS. Brug Jewelers mikropincet til at skrælle hud og brusk, der dækker hjernen, og skær derefter de cerebrale corticer af og saml dem i et 15 ml konisk rør med forkølet hbss.
    6. Pellet corticer ved centrifugering i 3 min ved 4 °c og 300 x g. Aspirer supernatanten fra røret, og tilsæt derefter aktiveret papain-fordøjelses medium og 15 μL 4 mg/mL DNase i i vævs pellet.
    7. Resuspendere vævs pellet kortvarigt ved blid vortexing. Inkuber vævet ved 37 °C i 30 minutter. I løbet af denne tid, løsne vævet ved kort vortexning hver 10 min.
      Bemærk: Ved afslutningen af fordøjelsen, bør der ikke være synlige væv stykker i røret.
    8. Pellet de kortikale celler ved centrifugering i 10 min ved 4 °C og 450 x g. Du aspirerer supernatanten fra røret og vasker celle pellet med præ-kølet DMEM. Gentag dette trin én gang.
      Bemærk: Under fordøjelsen og vask, Vær forsigtig med ikke at pipettere væv og celle pellet groft for at undgå at beskadige cellerne med en stærk klippe kraft.
    9. Aspirer supernatanten fra røret og tilsæt derefter 1,5 mL forkølet HBSS ind i røret. Dissociere den kortikale celle pellet i enkeltceller med blid pipettering. Tæl celle nummeret med et hemocytometer.
    10. Tilsæt 2 mL AM og 2 x 104 kortikale celler pr brønd til 6-brønde plader. Pladen inkubates ved 37 °C og 5% CO2 i 3 timer for at lade cellerne binde sig til pladen.

3. opsætning af Neural-Endothelial Co-kultur og AC4Mannaz mærknings system

  1. En dag efter plating BEND3 celler i skær, forsigtigt aspirere mediet i nederste kammer først, så skær. Vask den enface af skær 3 gange med præ-varmet DMEM. Vask den udvendige overflade af skær ved skylning med præ-varmet DMEM.
  2. Tilsæt 1 mL pre-varmet AM i en indsats, og overfør derefter skær i brøndene med primære kortikale celler. Medkulturen ved 37 °C og 5% CO2 i 12 timer.
  3. AC4Mannaz OPLØSES i DMSO for at opnå en lager koncentration på 200 mm. 12 h efter opsætning af Neural-Endothelial Co-kultur tilsættes 1 μL AC4Mannaz-bestand pr. bund kammer og 0,5 μl bestand pr. indsats i co-kulturen. Ryst pladerne straks og forsigtigt for at blande mediet godt. For kontrol cellerne tilsættes samme mængde DMSO.
  4. Kultur cellerne i yderligere 5 dage ved 37 °C og 5% CO2. Forbered AM med 10x bFGF som refeeding medium (RM). I denne periode tilsættes 100 μL RM pr. indsats og 200 μL RM pr. bund kammer for at genfodre endotel og neurale celler hver anden dag. Under genfodring, ikke levere AC4Mannaz eller DMSO ind i kulturen.

4. Immunofluorescent farvning af Sialoglycoproteiner i ekspanderede primære Nspc'er og differentierede neuroner

  1. Forbered BTTAA-CuSO4 Complex 1 30x Stock, der indeholder 1,5 mm CuSO4 og 9 mm bttaa i dobbeltdestilleret vand. Forbered frisk biotin-konjugeret buffer 1 indeholdende 50 μM biotin-alkyne, 2,5 mM natriumascorbat og 1x BTTAA-CuSO4 -kompleks i PBS.
  2. Fjern skær fra Co-kultur pladerne. Aspirer kulturmediet fra bunden brønde og vask neurale celler en gang med præ-varmet PBS.
  3. Aspirere PBS fra brøndene. Tilsæt 1 mL forkølet 4% paraformaldehydopløsning pr. brønd ind i cellerne, og fastgør cellerne ved RT i 10 minutter. Derefter vaskes cellerne 3 gange med præ-kølet PBS.
  4. Aspirer PBS fra brøndene og tilsæt 1 mL frisklavet biotin-konjugeret buffer 1 pr. brønd ind i cellerne. Inkuber cellerne ved RT i 10 min.
  5. Aspirer reaktions bufferen fra brøndene. Vask cellerne 3 gange med PBS. Forbered farvnings bufferen indeholdende 1% FBS og 1 μg/mL Alexa fluor 647-streptavidin. Tilsæt 1 mL farvnings buffer pr. brønd ind i cellerne, og Inkuber cellerne ved RT i 30 minutter.
  6. Udsug farvnings bufferen fra brøndene og de vaskede celler 3 gange med præ-kølet PBS. Den blokerende buffer, der indeholder 5% BSA og 0,3% ikke-ionisk rengøringsmiddel-100 i PBS, forberedes. Tilsæt 1 mL blokerende buffer pr. brønd ind i cellerne og Inkuber ved RT i 10 min.
  7. Der fremstilles en primær antistof opløsning ved at fortynde anti-nestin-og anti-β-Tubulin III-antistoffer sammen i blokerende buffer i forhold til henholdsvis 1:20 og 1:1000. Fjern blokerings bufferen fra brøndene og tilsæt 1 mL primær antistof opløsning pr. brønd ind i cellerne. Cellerne inkubates ved 4 °C natten over.
  8. Fjern den primære antistof opløsning fra brøndene. Vask cellerne 3 gange med præ-kølet PBS. Forbered en sekundær antistof opløsning ved at fortynde Alexa fluor 488 Goat anti-Mouse IgG1, Alexa fluor 546 Goat anti-Mouse IgG2b og DAPI sammen til blokerende buffer ved en fortynding på 1:1000. Du aspirerer PBS fra brøndene og tilfører 1 mL sekundær antistof opløsning pr. brønd til cellerne. Inkuber cellerne ved RT i 2 timer.
  9. Aspirer antistof opløsningen fra brøndene og vask cellerne 3 gange med præ-kølet PBS. Bagefter er cellerne klar til billedoptagelse.

5. rensning af Sialoglycoproteiner fra ekspanderede primære Nspc'er og differentierede neuroner

  1. Forbered BTTAA-CuSO4 kompleks 2 15x lager, der indeholder 1,5 mm CuSO4 og 3 mm bttaa i dobbeltdestilleret vand. Forbered protein opblanding buffer A indeholdende 4% SDS og 10 mm EDTA i dobbeltdestilleret vand; protein opblanding buffer B indeholdende 150 mm NaCl, 50 mm triethanolamin og 1% polyoxyethylen oleyl ether (f. eks. Brij97) i dobbeltdestilleret vand med pH 7,4. Før brug blandes buffer a:buffer B = 1:8 (Vol/Vol) for at tilberede den fulde protein opblanding buffer. Forbered protein vaskebuffer 1 indeholdende 2% SDS i PBS; protein vaskebuffer 2 indeholdende 8 M urinstof i 250 mM ammoniumbicarbonat (ABC); og protein vaskebuffer 3 indeholdende 2,5 M NaCl i PBS.
  2. Fjern skær fra Co-kultur pladerne. Aspirer kulturmediet fra bund brøndene og vask de neurale celler én gang med præ-kølet PBS.
  3. Aspirer PBS fra brøndene og tilsæt 200 μL præ-kølet RIPA buffer per brønd ind i pladerne. Inkubér pladerne på is i 5 min. Saml protein lysis i 1,5 mL rør. Pellet celle resterne ved centrifugering i 10 min ved 4 °C og 12.000 x g.
  4. Supernatanten overføres til nye 1,5 mL rør. Bestem proteinkoncentrationen med BCA-kittet i henhold til producentens anvisninger. Juster proteinkoncentrationen til 1 mg/mL.
  5. Tilsæt 100 μM alkyne-biotin, 2,5 mM natriumascorbat, og 1x BTTAA-CuSO4 kompleks 2 til 1 ml protein lyse og bland opløsningen godt. Bland blandingen ved RT i 1 time.
  6. Reaktions opløsningen overføres til 20 mL forkølet methanol i et 50 mL konisk rør. Bland godt og Inkuber ved-30 °C natten over for at fremskynde proteinerne.
  7. Pellet protein udfældet ved centrifugering i 15 min ved 4 °C og 4.500 x g. Protein pellet vaskes to gange med 20 mL forkølet methanol. Aspirer supernatanten fra røret. Opblanding af protein pellet med 4 ml protein opblanding buffer og overføre protein opslæmning til et nyt 15 ml konisk rør.
  8. Tag 50 μL streptavidin perler og vask dem 3 gange med PBS. Tilsæt de vaskede perler i proteinet resuspension. Opløsningen inkubates ved 4 °C i 3 timer på en lodret rotator ved en rotationshastighed på 20 rpm.
  9. Vask perlerne sekventielt med 6 typer af buffere: protein vaskebuffer 1, protein vaskebuffer 2, protein vaskebuffer 3, 0,5 M ABC, 0,25 M ABC og 0,05 M ABC.
  10. Efter vask, resuspension perlerne med 20 μL PBS og overføre perlerne til en ny 1,5 mL rør. Tilsæt 20 μL 2x protein loading buffer i perlerne og Behandl ved 95 °C i 10 min. Protein prøverne skal derefter underkastes SDS-side og farves med Coomassie Brilliant Blue R-250 i henhold til producentens anvisninger. Skær proteinerne i gel som indikeret af Coomassie Brilliant Blue R-250 for massespektrometri analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hele proceduren for in vitro-ekspansion og metabolisk mærkning af primære embryonale Nspc'er tager 6 dage (figur 1a). Kvaliteten af BEND3 cellelinje og nyisolerede primære Nspc'er er nøglen til et vellykket eksperiment. BEND3 celler er kilden til opløselige faktorer, der stimulerer selvfornyelse og spredning af Nspc'er. Det bør sikres, at de BEND3 celler er fri for enhver kontaminering og opdele aktivt med minimal celledød før Co-culturing med neurale celler. De primære Nspc'er skal forberedes omhyggeligt for at undgå overskydende skader under dissociationen. Beskadigede Nspc'er kan stadig vokse og differentiere; Men, de er ikke i stand til at reagere på endotelstimuli godt at opretholde stemthed og udvide. Ekstra forsigtighed bør tages for at være aseptisk under celledyrkning, da protokollen ikke foreslår tilsætning af antibiotika til det primære dyrkningsmedium.

Vellykket endotel Co-kultur vil føre nspc'er til at danne store, ark-lignende kloner. Sådanne Fremhævede klon figurer bliver tydelige på dag 4 og er meget typiske på dag 6. I klonerne bevarer cellerne tæt kontakt med hinanden. Immun farvning med antistoffer mod NSPC markør Nestin og neuronal markør β-Tubulin III bør afsløre, at i klon, de fleste af cellerne er Nestin+ nspc'er og meget få er β-Tubulin III+ neuronal celler. I modsætning hertil er procentdelen af Nestin + celler og β-Tubulin III+ neuronal celler i klon dannet i ikke-Co-kultur system næsten det samme (figur 1b, 1dog 1E).

Den kemiske reporter, AC4Mannaz, er en metabolisk analog og kan inkorporeres i den iboende protein sialylationsvej. Høje doser af AC4Mannaz er giftige for celler. For hver specifik type celle skal mærknings koncentrationen af AC4Mannaz testes på forhånd for at opnå den højeste mærknings effektivitet uden signifikant cytotoksicitet. Her, den optimerede mærkning koncentration af AC4Mannaz for primære nspc er 100 ΜM. kombinatorisk evaluering af celledød indikeret af cellulære og kerner morfologi tyder på, at denne mærkning koncentration ikke forårsager indlysende cytotoksiske virkninger og er effektivt at kunne mærke Nspc'er (figur 1c og 1d). Den klonale morfologi, selvfornyelse og differentierings potentiale for Nspc'er i både det endoteliale samkultur-og ikke-Co-kultur-system påvirkes ikke (figur 1c, 1dog 1E).

Den vellykkede mærkning af Nspc'er ved AC4Mannaz kan undersøges efter konjugering af biotin til en kultur, der er medieret af en bioorthogonal reaktion mellem Azid og alkyne. Hver celle i AC4Mannaz-mærket kultur er plettet og visualiseret med Alexa fluor 647-streptavidin. Ingen celle er positiv for Alexa fluor 647-streptavidin farvning i DMSO kontrolgruppen. Desuden protein prøver fremstillet af AC4Mannaz-mærket kultur ved biotin konjugering og streptavidin perler rensning viser stærk Coomassie strålende blå farvnings signal i SDS-side gels. I mellemtiden var der kun farvnings baggrund og uspecifikke bindings signaler i banerne lastet med protein prøver fra DMSO-kontrolgruppen. Dette indikerer også en effektiv mærkning af Nspc'er ved AC4Mannaz (figur 1f).

Figure 1
Figur 1 : Identifikation af celleoverflade markører for primære Nspc'er bistået af endotel Co-Culture system og metabolisk sialoglycan-mærkning. (A) skematisk af arbejdsprocessen for protokollen. Dette tal er blevet modificeret fra Bai et al. 10. de BEND3 celler er seedet i matrix skær på d0. Udarbejdelsen af primære kortikale Nspc'er og etablering af co-kultur system udføres på D1. Metabolisk mærkning af kultur varer fra D2 til D6. Kultur genfodring udføres på D3 og D5. B) immunfluorescent billeder for kloner dannet af primære nspc'er efter 5-dages kultur med eller uden endotelceller. Skala bjælke angiver 20 μm. C) lyse feltbilleder for kloner dannet af primære Nspc'er efter en 5-dages kultur med AC4Mannaz eller DMSO. Kerner blev modfaret af DAPI. Skala bjælken angiver 20 μm. Fejl bjælken indikerer SEM (n.s. = ikke signifikant). D) immunfluorescent billeder for nspc dannede kloner i endotelco-kulturen med AC4Mannaz eller DMSO. Stiplede cirkel afgrænses beskyttelses en enkelt neurale klon. Skala bjælken angiver 50 μm. E) kvantificering af Nspc'er og differentierede neuroner i kloner dannet af Nspc'er i endotel-Co-kultur og ikke-Co-kultur system med AC4Mannaz-mærkning eller DMSO-kontrol. Fejl bjælken indikerer SEM (* * * p < 0,0005; n.s. = ikke signifikant). F) coomassie Brilliant blå farvning af proteiner renset af streptavidin perler fra neurale celler mærket med AC4Mannaz eller DMSO i endotel Co-kultur og nonco-kultur system. 55 kD-båndet i kontrol mærknings grupperne repræsenterer uspecifikke binde proteiner. (B, C, E og F), som svarer til denne protokol, er blevet tilpasset fra Bai et al. 10. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Overflade markører bruges almindeligvis til at mærke og rense specifikke celletyper in vitro og in vivo17,18. Opdagelsen af overflade markører bidrager i høj grad til regenerativ medicin og stamcelleforskning ved at give molekylære værktøjer til selektivt at berige en stamcelle population fra normale eller patologiske væv og kultur retter, der tilbyder en renset celle ressource til klinisk brug eller undersøgelse af biologiske egenskaber. Men fremskridtene med at udvikle overflade markører for neurale stamcelleforskning har været langsom på grund af vanskeligheden ved at isolere stamceller fra primære væv. Den her beskrevne protokol er baseret på en forenklet in vitro-platform. Ved at sammenligne primære Nspc'er, der er udvidet af en endotelco-kultur til en differentierende neurale kultur, fremhæves proteiner, som differentielt udtrykkes i ekspanderede Nspc'er, og giver mulighed for yderligere identifikation. Vores protokol giver også en alternativ strategi til at rense celleoverflade proteiner ved at kapring den iboende metaboliske vej til at mærke sialoglycan med bioorthogonal grupper. Sammenlignet med traditionelle protokoller for rensning af celleoverflade proteiner er fordelene ved denne protokol understøttet af to specifikke træk: 1) forekomsten af sialylering på celleoverflade proteiner sikrer maksimal dækning af cellens overflade proteome, og 2) reaktions specificiteten mellem den bioortogonale gruppe og dens ligander giver renhed af den erhvervede overflade proteome. Således resulterer vores protokol i en mere følsom proteomisk analyse i tilfælde af mindre råvarer. Vi har demonstreret gennemførligheden af denne protokol i primære NSPCs overflade markører. Med de relevante modifikationer på ekspanderende stamceller in vitro, denne chemoproteomic tilgang kan være kompatibel med at identificere overflade markører af andre stamcelle typer. Det er bemærkelsesværdigt, at som Ac4ManNAz er per-O-acetylated det kunne føre til kunstig S-glykosylering. Brugen af uacetylerede unaturlige sukker kan undgå artefakt dannelse og forbedre specificiteten og gyldigheden af metabolisk Les mærkning i levende celler19.

Forberedelse af primære kortikale neurale stamceller og endotelceller er kritiske trin i protokollen. Først, når fordøje embryonale kortikale væv, fordøjelsestid, mængden af enzym, og styrken af håndteringen skal være omhyggeligt kontrolleret. Overdreven fordøjelse og mekaniske klippe kræfter vil skade integriteten af plasma membran-og celleoverflade receptorer, der formidler signaltransduktion for cellernes overlevelse og vækst, og de vil også forstyrre Nspc'er for at stimulere endotelceller og deres evne til selvfornyelse. For at opnå korrekt fordøjelse, skal eksperimenta aktivere papain fuldt ud og stoppe fordøjelsen, så snart vævs blokkene forsvinder. For det andet, BEND3 celler skal opretholdes i en sund tilstand for at støtte sekretionen. Det anbefales at bruge BEND3 celle batches med færre passager og passage cellerne, før de når 100% sammenløbet. Dette vil forhindre celle cyklus anholdelse og senescens forårsaget af DNA-skader akkumuleret under passaging eller ved overfyldte kontakt mellem celler.

High gennemløb sekventering Technology øger identifikationen af celleoverflade markører gennem analyse af RNA-udtryk, især for celletyper, herunder vævs stamceller, som ofte er til stede in vivo i mængder for små til at udføre proteom analyse ved Massespektrometri. Selv om RNA-SEQ-analysen kan identificere gener, der specifikt udtrykkes i Nspc'er, afspejler det måske ikke i virkeligheden protein ekspression, fordi RNA-udtryk ikke altid er i overensstemmelse med protein ekspression20. Desuden kan ikke-protein-biomolekyler, der fungerer som overflade markører, ikke påvises ved transkriptomic-undersøgelser. For eksempel, oligosaccharid Lewis X er en velkendt overflade Maker meget brugt til at mærke humane embryonale stamceller og nspc'er, selv om det kan være forbundet med flere proteiner21. Derfor er direkte massespektrometri analyse endnu ikke substituerbare, og udviklingen af metoder, der kan gøre massespektrometri analyse mere gennemførlig og bekvem, er af stor interesse for fremtidige undersøgelser.

Ud over sialylering spiller andre typer post-translationelle protein modifikationer en vigtig rolle i reguleringen af funktioner af modificerede proteiner. Disse modifikationer påvirker protein egenskaber såsom kropsbygning, Half-Life, og subcellulære lokalisering22,23. Flere protein modifikationer har celletype specificitet24,25,26. Med det stigende indhold af den kemiske værktøjskasse, mere modifikation typer er modtagelig for metaboliske mærkning med kemiske journalister27. Derfor kan den kemiske fremgangsmåde, der er beskrevet her, anvendes til at studere andre forskelle i protein modifikation mellem stamceller og differentierede celler, hvilket illustrerer de molekylære mekanismer bag vedligeholdelse af stamcelle egenskaber og differentiering Forordning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at offentliggøre.

Acknowledgments

Figur 1b, 1C, 1E og 1f gengives fra Bai et al . 10 med tilladelse fra Royal Society of Chemistry. Vi takker Yi Hao i X. C. 's Lab for figur redigering. Dette arbejde støttes af Kinas National Natural Science Foundation (nr. 91753206 til Q. S. og X. C., nr. 31371093 til Q. S., og NOS. 21425204 og 21672013 til X. C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BEND3 ATCC CRL-229
DMEM Gibco 11960044
L-glutamine Gibco 25030081 1%
Sodium pyruvate Sigma P5280 1%
N2 supplement Gibco 17502048 1 to 100
N-acetyl-L-cysteine Sigma A7250 1 mM
Papain Worthington LS003726 10 U/mL
B27 supplement Gibco 17504044 1 to 50
Poly-L-lysine Sigma P4707
Basic Fibroblast growth factor Gibco PHG0261 10 ng/mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 1%
Fetal bovine serum Gibco 10099141 10%
HBSS Gibco 14175095
Tripsin-EDTA, 0.25% Gibco 25200056
DPBS Gibco 14190094
Transwell Corning 3450
Paraformaldehyde Sigma 158127 4%
Sucrose Sangon A100335
DAPI Gibco 62248
RIPA buffer Thermo Scientific 89900
SDS-PAGE loading buffer 2x Solarbio P1018
6-well plate Corning 3335
Tris-Glycine protein gel invitrogen xp00100box
Mouse monoclonal anti-Nestin Developmental Study Hybridoma Bank Rat-401 1 to 20
Mouse monoclonal anti-beta-tubulin III Sigma T8860 1 to 1,000
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 invitrogen A-21121 1 to 1,000
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b invitrogen A-21143 1 to 1,000
Albumin Bovine V Amresco 0332
Triton X-100 Amresco 0694
BCA assay kit Thermo Scientific 23225
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650
Brij97 Aladdin B129088
CuSO4 Sigma 209198
Alkyne-biotin Click Chemistry Tools TA105
BTTAA Click Chemistry Tools 1236
Ac4ManNAz Click Chemistry Tools 1084 100 µM
9AzSia synthesized in lab
Sodium ascorbate Sigma A4034
Methanol Sigma 34860
EDTA Sangon A100322
NaCl Sangon A100241
SDS Sangon A100227
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin invitrogen S21374 1 to 1,000
Triethanolamine Sigma V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin  invitrogen 60210
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Coomassie Brilliant Blue R-250 Thermo Scientific 20278
Isoflurane RWD Life Science Co. 970-00026-00
DNase I Sigma DN25 12 µg/mL
Urea Sigma U5378

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weissman, I. L. Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
  2. Gage, F. H., Temple, S. Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
  3. Gal, J. S. Molecular and Morphological Heterogeneity of Neural Precursors in the Mouse Neocortical Proliferative Zones. Journal of Neuroscience. 26, 1045-1056 (2006).
  4. Kawaguchi, A., et al. Single-cell gene profiling defines differential progenitor subclasses in mammalian neurogenesis. Development. 135, 3113-3124 (2008).
  5. Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
  6. Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139, 1535-1546 (2012).
  7. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The Glial Nature of Embryonic and Adult Neural Stem Cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  8. Wang, X., Tsai, J. W., LaMonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nature Neuroscience. 14, 555-561 (2011).
  9. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  10. Bai, Q. R., Dong, L., Hao, Y., Chen, X., Shen, Q. Metabolic glycan labeling-assisted discovery of cell-surface markers for primary neural stem and progenitor cells. Chemical Communications. 54, 5486-5489 (2018).
  11. Shen, Q., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
  12. Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28, 69-80 (2000).
  13. Varki, A. Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins. Nature. 446, 1023-1029 (2007).
  14. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  15. Lin, S. H., Guidotti, G. Purification of Membrane Proteins. Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).
  16. Schmidt, J. R., et al. Pilot Study on Mass Spectrometry-Based Analysis of the Proteome of CD34+CD123+ Progenitor Cells for the Identification of Potential Targets for Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia. Proteomes. 6, (2018).
  17. Crisan, M., Dzierzak, E. The many faces of hematopoietic stem cell heterogeneity Development. Development. 144, 4195-4195 (2017).
  18. Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 14720-14725 (2000).
  19. Qin, W., et al. Artificial Cysteine S-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides during Metabolic Glycan Labeling. Angewandte Chemie International Edition. , (2018).
  20. Gry, M., et al. Correlations between RNA and protein expression profiles in 23 human cell lines. BMC Genomics. 10, 365 (2009).
  21. Hennen, E., et al. A LewisX Glycoprotein Screen Identifies the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) as a Modulator of Oligodendrogenesis in Mice. Journal of Biological Chemistry. 288, 16538-16545 (2013).
  22. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 473-483 (2006).
  23. O’Brian, C. A., Chu, F. ReviewPost-translational disulfide modifications in cell signaling—role of inter-protein, intra-protein, S-glutathionyl, and S-cysteaminyl disulfide modifications in signal transmission. Free Radical Research. 39, 471-480 (2005).
  24. Williamson, A. J. K., Whetton, A. D. The requirement for proteomics to unravel stem cell regulatory mechanisms. Journal of Cellular Physiology. 226, 2478-2483 (2011).
  25. Christensen, B., et al. Cell Type-specific Post-translational Modifications of Mouse Osteopontin Are Associated with Different Adhesive Properties. Journal of Biological Chemistry. 282, 19463-19472 (2007).
  26. Yanagisawa, M., Yu, R. K. The expression and functions of glycoconjugates in neural stem cells. Glycobiology. 17, 57R-74R (2007).
  27. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).

Tags

Neurovidenskab metabolisk Les mærkning sialsyrer bioorthogonal reaktion neurale stamceller progenitorceller overflade markører endotelceller proteome kemisk mærkning hjernebarken
Identifikation af celleoverflade markører for primær neurale stamme og stamceller ved metabolisk mærkning af Sialoglycan
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Q. R., Dong, L., Shen, Q.… More

Bai, Q. R., Dong, L., Shen, Q. Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan. J. Vis. Exp. (151), e58945, doi:10.3791/58945 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter