Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

זיהוי סמני שטח תא של גזע עצבי ראשוני ובתאי מחולל מטבולית על ידי תיוג מטבולי של סילוגליקן

Published: September 7, 2019 doi: 10.3791/58945
Automatic Translation
*1, *2, 1
1Brain and Spinal Cord Innovative Research Center of Tongji Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University and Frontier Science Research Center for Stem Cells of Ministry of Education, 2College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Beijing National Laboratory for Molecular Sciences, Synthetic and Functional Biomolecules Center, and Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education, Peking University
* These authors contributed equally

Summary

מוצג כאן הוא פרוטוקול המשלב במערכת התרבותית העצבית-אנדותל ושיתוף תרבות מטבולית והתאגדות המטבולית של sialoglycan עם קבוצות פונקציונליות bioorthogonal כדי להרחיב את גזע הגוף העצבי ואת התאים מחולל מותג התווית שלהם סיליגליקורופנס להדמיה או ניתוח המסה-ספקטרומטריה של סמני שטח התא.

Abstract

תאי גזע ומחולל שדים עצביים הם הבסיס התאי למבנים ולתפקודים המורכבים של המוח. הם ממוקמים נישות מיוחדות ב vivo והוא יכול להיות מבודד ומורחב בתוך מבחנה, משמש כמשאב חשוב עבור השתלת תאים כדי לתקן את הנזק המוחי. עם זאת, NSPCs הם הטרוגנית ולא מוגדר באופן ברור ברמה המולקולרית או מטוהרים בשל חוסר סמנים משטח תא ספציפי. הפרוטוקול המוצג, אשר דווח בעבר, משלבת מערכת משותפת עצבית-שיתוף התרבות עם שיטת התיוג המטבולית, כדי לזהות את המשטח הפנימי של NSPCs הראשי. מערכת התרבות שיתוף הפעולה NSPC-אנדותל מאפשרת חידוש עצמי והתרחבות של NSPCs הראשי בתוך מבחנה, הפקת מספר מספיק של nspcs. סיאלוגליקנים בתרבית nspcs מסומנים באמצעות כתבת מטבולית בלתי טבעית של חומצה סילית עם קבוצות פונקציונליות ביואורתוגונאליות. על ידי השוואת שיתוף הפעולה העצמי מחדש NSPCs התרחב בתרבות האנדותל עם תרבות עצבית מבדילים, אנו מזהים רשימה של חלבונים ממברנה כי הם מועשרים NSPCs. בפירוט, הפרוטוקול כולל: 1) הגדרת תרבות שיתוף NSPC-אנדותל ו-NSPC תרבות הבחנה; 2) תיוג עם אזידוסוכר לפי-או-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4mannaz); ו-3) ביוטין ליצירת שינויים בסיקלוגליל לדימות לאחר קיבוע של תרבות עצבית או חילוץ חלבונים מהתרבות העצבית לניתוח הספקטרומטר ההמוני. לאחר מכן, מועמדים לסמן משטח NSPC מועשר נבחרו על ידי ניתוח השוואתי של נתונים ספקטרומטר המוני משני NSPC המורחבת ותרבויות עצביות הבדיל. פרוטוקול זה רגיש מאוד לזיהוי חלבונים ממברנות של שפע נמוך בחומרי ההתחלה, והוא יכול להיות מיושם על גילוי סמן במערכות אחרות עם שינויים מתאימים

Introduction

תאי גזע עצביים מוגדרים כאוכלוסיית תאים רב-עוצמה אשר ניתן לחדש את עצמו כדי לשמור על תא גזע הבריכה להבדיל לנוירונים ו glia. הם סוגי התא העיקריים במערכת העצבים ועשויים להציע פוטנציאל תרפויטי גדול ברפואת ההתחדשות באמצעות השתלת תאים לתוך המוח החולני והפצוע1,2. כמו התקדמות הפיתוח, האוכלוסיה הגזע העצבי הופך הטרודוגני3,4, ואת החלק של תאי גזע עצביים במוח בהדרגה יורדת5. באופן כללי, תאים גזע עובריים ותאים אחרים העצביים הנוירוני, המכונה בצורה קולקטיבית בתאי גזע ומחולל קדמון (NSPCs), ממוקמים באזורים נבטי, אזור חדרית, ואת אזור subventricular בעכברים6. במוח העובריים, תאי גזע עצביים ליצור נוירונים ישירות או בעקיפין באמצעות תאים ביניים מחולל (ipcs), ובמינים מסוימים דרך אזור subventricular החיצוני ושלתי (orgs)7,8. החתימה המולקולרית הספציפית, המבנה, המיקום בנישה תא הגזע, ופוטנציאל הבידול כולם קובעים את התפקיד של כל תת-סוג באורגנוגנזה ויישומים קליניים9. עם זאת, הסמנים הזמינים כרגע תא אינו יכול להפלות באופן חד-משמעי ולטהר סוגים שונים של NSPCs, הגבלת ההבנה והניצול של סוגי משנה אלה.

הזיהוי של סמני פני שטח NSPCs הראשי מוגבל על-ידי שלושה מכשולים עיקריים. הראשון הוא מספר התאים המוגבלים של NSPCs ברקמה, מה שמקשה על הכנת דגימות חלבון פני השטח של התא עבור ניתוח משותף של ספקטרומטר מסה. המגבלה השנייה היא הקושי בהפקת תת תאים טהורים ליצירת תת-סוג של נתוני חלבון ממברנה ספציפיים. לבסוף, האתגר השלישי הוא היחס הנמוך של חלבונים משטח התא בחלבונים תא שלם, אשר הסלים הרגישות שלהם לזיהוי על ידי ניתוח ספקטרומטר המסה.

כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו גישה chemoproteomic באופן סלקטיבי להעשיר ולזהות חלבונים פני השטח של התאים NSPCs הראשי על ידי metabolically תיוג sialoגליקורופנים10. כדי ליצור מספר מספיק של NSPCs, ניצלנו פרוטוקול מבוסס להרחיב ולתחזק NSPCs העיקרי במצבים מובחן ב מבחנה, על ידי co-culturing NSPCs עם המוח העכבר שורות התאים באמצעות תמיכה חדיר הוספת מטריצה (למשל, transwell) מערכת11. לעומת זאת, NPSCs תרבותי לבדו ללא תאים אנדותל ליצור הבדיל צאצאי11,12. כך, דגימות חלבונים משתי מערכות התרבות האלה ניתן לנתח באופן מקרי כדי לזהות חלבונים, כי הם מבוטא באופן מהותי NSPCs והבדיל נוירונים. כמו רוב חלבונים פני השטח משתנים על ידי חומצה סילית13, חומצה הסילית טבעי אנלוגי מקודמן N-azidoacetylmannosamine-tetraacylated (Ac4mannaz) שימש לחטוף את השביל הפנימי מטבולית כך אנדוגניים, לאחרונה מסונתז הם מתויגים עם קבוצות azido, יצירת ידית כימית14. באמצעות azido-אלאלקין-מתווך תגובות bioorthogonal, אשר המשלים ביוטין כדי sialoglycans, תא משטח חלבונים יכול להיות דמיינו ומועשר עבור זיהוי פרוטמית באמצעות מstreptavidin מצמידים fluorophore או מטריקס14.

כאן, אנו מבצעים צביעת של SDS-דף ניתוח ג'ל של פני השטח של sialoגליקורופאז מ NSPCs התרחב בתרבות שיתוף הפעולה של אנדותל ומבדילים תאים במערכת לא שיתוף תרבות. כמו כן אנו מטהר באופן סלקטיבי את המשטח בשתי מערכות התרבות של השוואה פרוטמית. הפרוטוקול שלנו, לעומת המסורתית צנטריפוגה מבוסס משטח תא פרוטוקולים טיהור15, מגביר את היעילות החילוץ על ידי הפחתת פני השטח החילוץ הליכי הפקת באמצעות תג מסוים בניינים ואהדה טיהור. בינתיים, זה מגביר את טוהר החילוץ של חלבונים משטח התא בהתבסס על ההנחה כי הסיללציה מתרחשת בעיקר על פני השטח של התאים חלבונים. למרות שגורמי האנדותל אינם יכולים לחסום לחלוטין את הבידול של nspcs מורחב, המחקר השוואתי בין תרבות שותפה ותרבות מובחנת מספק שיטה נוחה כדי לאתר את הזהות המועשרת של תאי גזע מועשר ללא צורך ל לנתח חלבונים מ NPCs מטוהרים על ידי FACS16. אנו מאמינים גישה זו ניתן להחיל על מחקרים של חלבונים פני השטח במערכות אחרות עם השינויים המתאימים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוטוקולים בעלי חיים המשמשים במחקר זה אושרו על ידי IACUC (הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים) של אוניברסיטת Tsinghua והופיע בהתאם להנחיות של IACUC. מתקן חיות המעבדה באוניברסיטת Tsinghua כבר מוכר על ידי AAALAC (האגודה להערכת והסמכה של מעבדה בעלי חיים הבינלאומי טיפול). עבור ההיערכות של עוברים, באמצע היום של התקע הנרתיק זוהה היה מחושב כיום עובריים 0.5 (E 0.5).

הערה: כל התאים הם מתורבתים בחממה תא בתנאים של 37 ° c ו 5% CO2.

1. הכנת תרבות אנדותל של העכבר בתוספות תמיכה

הערה: BEND3 תאים נשמרים על פי הוראות היצרן.

  1. הכנת BEND3 cell בינונית (BM) על ידי הוספת 50 mL של FBS ו 5 מ ל של פניצילין-סטרפטומיצין לתוך 500 mL של DMEM ומערבבים היטב.
  2. מBEND3 את המדיום מן הצלחת ולשטוף את התרבות התאים עם 1 מ ל של PBS פעם אחת. הוסף 1 מ ל של 0.25% טריפסין-EDTA לתוך התאים והופך את התאים במשך 4 דקות ב-37 ° c.
  3. הוסיפו 1 מ ל מוניטור לתוך התאים כדי לנטרל את טריפסין-EDTA ואת הפיפטה למעלה ולמטה בעדינות כדי לנתק לחלוטין את התאים. להעביר את ההשעיה התא לתוך חדש 15 מ"ל שפופרת חרוט ו-צנטריפוגה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 5 דקות ב 400 x g.
  4. מריף את supernatant מן הצינור ולהשעות מחדש את התאים עם 9 מ ל של מוניטור טרי, ולאחר מכן להוסיף 1 mL של השעיית התא לתוך להוסיף תמיכה חדיר אחד. הוסיפו עוד 2 מ ל של מוניטור טרי לכל טוב בחדר התחתון של המטריצה. המשיכו לתרבות התאים ליום אחד.

2. הכנת התרבות העיקרית של העכבר הקורטיקלית

  1. הכנת לוח התרבות, בינונית עיכול פפאין, ו התרבות הקורטיקלית בינונית (עם)
    1. מעיל 6-טוב צלחות עם פולי-L-ליזין (PLL) על ידי הוספת 1 mL של פתרון PLL לכל לוחיות 6-טוב. לאחר מכן, מודפה את הצלחות ב-RT למשך 30 דקות.
    2. העבר את פתרון ה-PLL לשפופרת חרוט של 15 מ ל. רוחצים את הצלחות 3 פעמים עם מים מזוקקים כפולים. האירי את הצלחות והניחי אותן בצד עד השימוש.
    3. להכין את מדיום העיכול פפאין על ידי הוספת 50 U של פפאין, 50 μl של l-גלוטמין, ו 50 μl של 100 mg/mL מרחקסיל-L-cysteine לתוך 5 מ ל של dmem. ערבב את המדיום בקצרה ולחמם אותו עד 37 ° c עבור 30 דקות עבור הפעלת אנזימים.
    4. הכן את התרבות הבין-לבנה בינונית (אם): להוסיף 500 μL של L-גלוטמין, 500 μL של נתרן פירובט, 500 μL של 100 mg/mL N-מרחקסיל-L-Cysteine, 500 μL של N2, 1 מ ל של B27, ו-5 μL של 100 μg/mL bFGF לתוך 50 mL של DMEM. ערבב היטב את המדיום וחמם אותו עד 37 ° צ' לפני השימוש.
  2. הכנת התאים הראשוניים מוחין הציפוי העוקב
    1. הקרבת מתוזמן 10.5 עכבר ההרה בזמן על ידי פריקה צוואר הרחם.
      הערה: ב-E 10.5, רוב התאים הם מתרבים NSPCs בקליפת המוח, המעניקה שיבוטים גדולים של צאצאי מבחנה.
    2. לחטא את הבטן על ידי 75% אתנול. השתמש במספריים משובחים ומלקחיים זעירים כדי לפתוח את הבטן על ידי חיתוך העור והשריר הבסיסי לאורך הצד הימני של הקו האמצעי. להסיר את הרחם מחלל הבטן בעדינות עם מלקחיים משונן ולחתוך אותו מתוך חלל הבטן עם מספריים עדינים.
    3. שטוף את הרחם עם 40 מ ל של HBSS לפני הקירור ב 10 ס מ צלחת פטרי. ואז, להעביר את הרחם לתוך צלחת חדשה 10 ס מ פטרי ולשטוף אותו שוב עם 40 mL של HBSS לפני הקירור.
    4. להעביר את הרחם לתוך צלחת חדשה 10 ס מ פטרי עם 40 mL של HBSS לפני הקירור. להסיר את העוברים מן הרחם קרום השפיר, ואז לחתוך את הראשים של העוברים מן הגזעים עם מיקרומלקחיים הצורפים.
    5. לשטוף את הראשים עם 40 mL של HBSS טרום מקורר ולהעביר את הראש לצלחת חדש 10 ס מ פטרי עם 40 mL של HBSS לפני הקירור. השימוש מיקרומלקחיים הצורפים כדי לקלף את העור ואת הסחוס המכסה את המוח, ואז לחתוך את המוח מכסה את ולאסוף אותם ב 15 מ ל שפופרת חרוטי עם הפרה מקורר HBSS.
    6. גלולה את הצנטריפוגה על ידי במשך 3 דקות ב 4 ° צ' ו 300 x g. לאחר מכן הוסיפו את סופרנטאנט מהצינור, ולאחר מכן להוסיף מופעל העיכול בינונית ו 15 μL של 4 מ"ג/mL DNase אני לתוך הגלולה הרקמה.
    7. השהה מחדש את הרקמה בקצרה על ידי הורטקנג עדין. מודטת הרקמה ב 37 ° c עבור 30 דקות. במהלך הזמן הזה, לשחרר את הרקמה על ידי וורטקנג קצר כל 10 דקות.
      הערה: בסוף העיכול, לא אמורות להיות. חתיכות רקמה גלויות בצינור
    8. צנפה את התאים הקורטיקלית על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 4 ° צ' ו 450 x g. ולשטוף את הגלולה הסלולרית. עם DMEM מקורר מראש . חזור על השלב הזה פעם אחת
      הערה: במהלך העיכול והכביסה, יש להיזהר לא לנקות את הרקמות ואת הגלולה התאים בערך כדי למנוע פגיעה בתאים עם כוח הגז חזק.
    9. לאחר מכן הוסיפו את הסופרנטאנט מהצינור ולאחר מכן תוסיפו 1.5 מ ל לתוך השפופרת. לתוך תאים בודדים עם ליטוף עדין. ספור את מספר הטלפון.
    10. הוסף 2 מ ל של AM ו-2 x 104 תאים קורטיקליים לכל טוב לתוך 6-טוב צלחות. מודקת את הצלחת ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 3 h כדי לאפשר לתאים לצרף את הצלחת.

3. הגדרת נוירותל-שיתוף-תרבות ומערכת תיוג

  1. יום אחד לאחר ציפוי תאים BEND3 בתוך מוסיף, בעדינות להפיח את המדיום בתא התחתון הראשון, ואז את התוספות. שטוף את הפנים של מוסיף 3 פעמים עם DMEM טרום מחומם. שטוף את המשטח החיצוני של התוספות על ידי שטיפה עם DMEM מחומם מראש.
  2. הוסף 1 מ ל של טרום מחומם לתוך הוספה אחת, לאחר מכן להעביר את התוספות לתוך הבארות עם תאי קליפת היסוד העיקרי. מודטה את התרבות המשותף ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 12 h.
  3. התמוססות Ac4mannaz ב dmso כדי להשיג ריכוז מניות של 200 מ"מ. 12 h לאחר הקמת התרבות העצבית-שיתוף האמנות, להוסיף 1 μL של Ac4מלאי mannaz למטה בחדר התחתון ו 0.5 μl של מניות להוספה לתוך התרבות המשותף. טלטל את הצלחות מיד ובעדינות כדי לערבב את הבאר הבינונית. עבור תאי הבקרה, הוסף נפח שווה של DMSO.
  4. תרבות התאים לעוד 5 ימים ב 37 ° צ' ו 5% CO2. הכן את AM עם bFGF 10x כאמצעי האכלה מחדש (RM). במהלך הזמן הזה, להוסיף 100 μL של RM לכל הוספה ו 200 μL של RM למטה כדי להזין מחדש את התאים האנדותל ואת העצבים בכל יום אחר. במהלך ההזנה, לא לספק Ac4mannaz או dmso לתוך התרבות.

4. מאימונולואווריזיייםצביעת של סילוגליקוטיינס ב מורחב NSPCs ראשוני הבדיל הנוירונים

  1. הכן BTTAA-CuSO4 קומפלקס מלאי 30x המכיל 1.5 Mm cuso4 ו 9 מ"מ bttaa במים כפולים מזוקקים. הכנת מאגר ביוטין טרי מעלה 1 המכיל 50 μM biotin-אלקין, 2.5 mM נתרן ascorbate, ו 1x BTTAA-CuSO4 קומפלקס ב PBS.
  2. הסר את התוספות מלוחות המשותף לתרבות. מרוב בינוני התרבות מבארות התחתון ולשטוף את התאים העצביים פעם עם מחומם מראש PBS.
  3. . ומכה את הערוץ מבארות להוסיף 1 מ ל של מקורר 4% הפתרון של הערוץ PBS לתוך התאים ולתקן את התאים ב-RT עבור 10 דקות. לאחר מכן, לשטוף את התאים 3 פעמים עם מקורר מראש PBS.
  4. מפחית את הPBS מבארות ומוסיפים 1 מ ל של מאגר ביוטין טרי מבושל 1 לכל טוב לתוך התאים. מודאת התאים בשעה RT עבור 10 דקות.
  5. . מרוב מאגרי התגובה מבארות רחץ את התאים 3 פעמים עם PBS. הכן את מאגר ההכתמים המכיל 1% FBS ו-1 μg/mL אלקסה Fluor 647-streptavidin. הוסף 1 מ ל של מאגר הצביעת לתוך התאים ומודאת התאים ב-RT עבור 30 דקות.
  6. מכתים את מאגר הצביעת מבארות ושוטפים את התאים 3 פעמים עם הערוץ הטרום מקורר. הכן את מאגר חסימת המכיל 5% BSA ו 0.3% לא יונית לניקוי-100 ב-PBS. הוסף 1 מ ל של חסימת מאגר לכל טוב לתוך התאים ו-דגירה ב-RT עבור 10 דקות.
  7. להכין פתרון נוגדן העיקרי על ידי לדלל את אנטי nestin anti-β-טובולין III נוגדנים יחד לתוך מאגר חסימת ביחס של 1:20 ו 1:1000, בהתאמה. הסר את מאגר חסימת מבארות ולהוסיף 1 מ ל פתרון הנוגדן העיקרי לתוך התאים. מודפה את התאים ב -4 ° c בלילה.
  8. הסר את פתרון הנוגדן העיקרי מבארות. לשטוף את התאים 3 פעמים עם מקורר מראש PBS. להכין פתרון נוגדן משני על ידי דילול אלקסה Fluor 488 עז נגד העכבר IgG1, אלקסה Fluor 546 עז אנטי עכבר IgG2b, ו DAPI יחד לתוך חסימת מאגר בדילול של 1:1000. משף את הPBS מן הבארות ולהוסיף 1 mL הפתרון נוגדן משני לכל לתוך תאים. דגירה את התאים בשעה RT עבור 2 h.
  9. מטפי את פתרון הנוגדן מן הבארות ולשטוף את התאים 3 פעמים עם ה-PBS מקורר. לאחר מכן, התאים מוכנים ללכידת תמונה.

5. טיהור של סיאלוגליקורופנים מורחבים מורחב NSPCs ו נוירונים הבדיל

  1. הכן BTTAA-CuSO4 מורכב 2 15x מלאי המכיל 1.5 Mm cuso4 ו 3 מ"מ bttaa במים כפולים מזוקקים. הכנת מאגר מחדש חלבון המכיל 4% SDS ו 10 מ"מ EDTA במים מזוקקים כפולים; חלבון מאגר resuspension B המכיל 150 מ"מ היום, 50 מ"מ triethanolamine, ו 1% polyoxyethylene האתר (למשל,) במים כפולים מזוקקים עם pH 7.4. לפני השימוש, לערבב מאגר A:buffer אגר B = 1:8 (vol/vol) כדי להכין את המאגר המלא חלבון מחדש. הכנת מאגר כביסה חלבון 1 המכיל 2% SDS ב PBS; מאגר כביסה של חלבון 2 המכיל 8 M אוריאה ב 250 מילימטר אמוניום ביקרבונט (ABC); ומאגר כביסה חלבון 3 המכיל 2.5 M הנאל ב-PBS.
  2. הסר את התוספות מלוחות המשותף לתרבות. מרוב בעלי התרבות מבארות התחתון ורוחצים את התאים העצביים פעם אחת עם העונה הראשונה מקורר.
  3. משף את הPBS מן הבארות ולהוסיף 200 μL של מאגר מקורר לפני המים של ריפה לתוך לוחיות. מודקון את לוחיות הקרח עבור 5 דקות. לאסוף את הליזה חלבון לתוך 1.5 מ"ל צינורות. גלולה פסולת תא על ידי צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 4 ° צ' ו 12,000 x g.
  4. העבר את הסופרנטנט לצינורות 1.5 mL חדשים. קבע ריכוז חלבונים עם ערכת BCA על פי הוראות היצרן. כוונן את ריכוז החלבון ל-1 מ"ג/mL.
  5. הוסף 100 μM אלבני-biotin, 2.5 mM נתרן ascorbate, ו-1x BTTAA-CuSO4 קומפלקס 2 ל 1 מ ל של לפירוק חלבון ולערבב את הפתרון היטב. מודאת המיקס ב-RT עבור 1 h.
  6. העבר את פתרון התגובה לתוך 20 מ ל של מתנול מקורר לפני הקירור בשפופרת חרוט 50 mL. מערבבים היטב ומשלבים ב-30 ° c בלילה כדי לזרז את החלבונים.
  7. גלולה החלבון מזרז על ידי צנטריפוגה עבור 15 דקות ב 4 ° צ' ו 4,500 x g. לשטוף את הגלולה החלבון פעמיים עם 20 מ ל של מתנול מקורר. . מנקז את הסופרנאנט מהצינור להשעות מחדש את הגלולה חלבון עם 4 מ ל של חלבון מאגר resuspend ולהעביר את החלבון resuspend לתוך צינור חדש 15 מ ל חרוט.
  8. קח 50 μL של חרוזים streptavidin ולשטוף אותם 3 פעמים עם PBS. מוסיפים את החרוזים הנשטפים. לתוך ההשעיה של החלבון דגירה הפתרון ב 4 ° צ' עבור 3 h על מסובבי אנכי במהירות סיבוב של 20 סל ד.
  9. לשטוף את החרוזים ברצף עם 6 סוגים של מאגרי: חלבון מאגר כביסה 1, חלבון מאגר כביסה 2, חלבון מאגר כביסה 3, 0.5 M ABC, 0.25 M ABC ו 0.05 M ABC.
  10. לאחר השטיפה, השהה מחדש את החרוזים עם 20 μL של PBS ולהעביר את החרוזים לתוך צינור חדש 1.5 mL. הוסף 20 μL של מאגר הטעינה של חלבון 2x לתוך החרוזים ולטפל ב 95 ° c עבור 10 דקות. דגימות חלבון צריך אז להיות נתון SDS-עמוד ומוכתם עם Coomassie מבריק כחול R-250 על פי הוראות היצרן. חותכים את החלבונים ב ג'ל כפי שצוין על ידי Coomassie כחול מבריק R-250 לניתוח הספקטרומטר המסה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההליך כולו להרחבת מבחנה ותיוג מטבולית של NSPCs העובריים הראשי לוקח 6 ימים (איור 1A). איכות של קו התא BEND3 ו NSPCs הראשי המבודד הטרי הם המפתח לניסוי מוצלח. תאים BEND3 הם המקור של גורמים מסיסים המעוררים חידוש עצמי והתפשטות NSPCs. יש להבטיח כי התאים BEND3 חופשיים של כל זיהום ולחלק באופן פעיל עם מוות תאים מינימלי לפני co-culturing עם תאים עצביים. NSPCs העיקרי חייב להיות מוכן בקפידה כדי למנוע נזק עודף במהלך הדיסוציאציה. NSPCs פגום עשוי עדיין לגדול ולהבדיל; עם זאת, הם אינם יכולים להגיב לגירויים אנדותל כדי לשמור על שורשים ולהתרחב. זהירות בנוסף יש לנקוט כדי להיות מזוהם במהלך הטלפון בזמן, כמו הפרוטוקול אינו מציע תוספת של אנטיביוטיקה למדיום התרבות העיקרית.

שיתוף תרבות מוצלח של האנדותל תוביל ל-NSPCs כדי ליצור שיבוטים גדולים כמו גיליונות. צורות כאלה שיבוט מובלט להיות ברור ביום 4 והם מאוד אופייני ביום 6. בתוך המשובטים, התאים שומרים. על קשר קרוב אחד עם השני חיסוני עם נוגדנים נגד סמן NSPC Nestin ואת הסמן העצבי β-טובולין III צריך לגלות כי שיבוט, רוב התאים הם Nestin+ nspcs ומעטים מאוד הם β-טובולין III+ תאים עצביים. לעומת זאת, אחוז התאים Nestin + ו-β-טובולין III+ תאים עצביים בשכפול נוצר במערכת שאינם שיתוף התרבות הם כמעט זהה (איור 1b, 1B, ו- 1b).

הכתב הכימי, Ac4mannaz הוא אנלוגי מטבולית ניתן לשלב לתוך המסלול הפנימי של חלבון החלבונים. מינונים גבוהים של Ac4מאנאז רעילים לתאים. עבור כל סוג מסוים של תא, את הריכוז תיוג של Ac4mannaz צריך להיבדק מראש כדי להשיג את היעילות הגבוהה ביותר תיוג ללא רעילות משמעותית. כאן, ריכוז מיטבי תיוג של Ac4mannaz עבור nspc הראשי הוא 100 μm. הערכה שינומה של מוות תאים המצוין על ידי מורפולוגיה תאית וגרעין מציע ריכוז זה תיוג אינו גורם השפעות ציטוטוקסיים ברורים והוא ניתן לתייג ביעילות את NSPCs (איור 1C ו -1c). מורפולוגיה של המשובטים, התחדשות עצמית ופוטנציאל הבידול של NSPCs הן במערכת התרבות האנדותל-שיתוף והתרבות שאינה מושפעת (איור 1C, 1Cו- 1c).

את התיוג המוצלח של nspcs על ידי Ac4מאנאז ניתן לבחון לאחר בדיקת ביוטין לתרבות בתיווך על ידי התגובה הביואורתוגונלית בין אזיד והאלקין. כל תא בתוך התרבות Ac4מאנזה-התווית מוכתם ומדמיין עם אלקסה fluor 647-streptavidin. אין תא חיובי עבור אלקסה Fluor 647-streptavidin מכתים בקבוצת הבקרה DMSO. בנוסף, דגימות חלבונים המוכנים מתוך התרבות Ac4מאנאז-התווית על ידי הקונביוטין וstreptavidin חרוזים טיהור להראות חזק coomassie כחול מבריק האות הכחול של sds-דף ג ' לים. בינתיים, היו רק מכתים רקע ואותות מחייב לא ספציפי בנתיבים שנטענו דגימות חלבונים מקבוצת הבקרה DMSO. זה גם מציין את התיוג היעיל של NSPCs על ידי Ac4mannaz (איור 1f).

Figure 1
איור 1 : זיהוי של סמנים משטח התא עבור NSPCs הראשי בסיוע מערכת שיתוף התרבות של אנתל ומטבולית sialoglycan לתיוג. (א) סכמטי של זרימת העבודה עבור הפרוטוקול. דמות זו שונתה מ-Bai et al. 10. התאים BEND3 הם שנזרע מוסיף מטריצה על D0. הכנת NSPCs הראשי והגדרת מערכת תרבות שיתוף מבוצעים על D1. תיוג מטבולית של התרבות נמשכת מ D2 ל D6. הזנה מחודשת של התרבות מתבצעת על D3 ו-D5. (ב) תמונות חיסולמיות עבור שיבוטים שנוצרו על ידי NSPCs הראשי לאחר תרבות של 5 ימים עם או בלי תאי אנדותל. סרגל קנה מידה מציין 20 μm. (ג) תמונות שדה בהיר עבור שיבוטים שנוצרו על ידי NSPCs הראשי לאחר תרבות של 5 ימים עם Ac4mannaz או dmso. הגרעין היה מוכתם על ידי DAPI. סרגל קנה המידה מציין 20 μm. שורת השגיאה מציינת את SEM (נ = אינו משמעותי). (ד) התמונות האימונולונטים של NSPC הקימו שיבוטים בתרבות שיתוף האנדותל עם Ac4mannaz או dmso. עיגול מקווקו מודד שיבוט עצבי יחיד. סרגל קנה המידה מציין 50 μm. (E) קוונפיקציה של NSPCs והבדיל נוירונים במשובטים נוצר על ידי NSPCs בשיתוף שיתוף התרבות ומערכת שאינו שיתוף תרבות עם Ac4מנדז התיוג או השליטה dmso. שורת השגיאה מציינת SEM (* * * p < 0.0005; נ = לא משמעותי). (ו) Coomassie כתמים כחולים מבריק של חלבונים מטוהרים על ידי חרוזים streptavidin מתאי העצבים המסומנים עם Ac4mannaz או dmso ב שיתוף תרבות אנדותל ושיתוף תרבות מערכת. להקת ה-kD 55 בקבוצות של תוויות שליטה מייצגת חלבונים בעלי כריכה לא ספציפית. (B, C, E ו-F) המתאימים לפרוטוקול זה הותאמו מ -Bai et al. 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

סמני פני השטח משמשים בדרך כלל לתוויות ולטיהור סוגי תאים ספציפיים במבחנה ובvivo17,18. גילוי של סמנים פני השטח תורם מאוד לרפואה משובי ומחקרים תא גזע על ידי מתן כלים מולקולריים באופן סלקטיבי להעשיר את האוכלוסייה תא גזע מרקמות נורמלי או פתולוגי מנות תרבות, מציע תא מטוהר משאב לשימוש קליני או למחקר של תכונות ביולוגיות. עם זאת, התקדמות בפיתוח סמנים פני השטח עבור מחקר תאי גזע עצביים כבר איטי בשל הקושי בבידוד תאי גזע מרקמות ראשיות. הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס. על פלטפורמת מבחנה פשוטה על ידי השוואת NSPCs העיקרי התרחב על ידי תרבות שיתוף הפעולה לתרבות עצבית מבדילים, חלבונים מבוטא באופן מורחב NSPCs מודגשים ומאפשרים זיהוי נוסף. הפרוטוקול שלנו גם מספק אסטרטגיה חלופית כדי לטהר חלבונים פני השטח של התא על ידי חטיפת מסלול חילוף החומרים הפנימי כדי sialoglycan תווית עם קבוצות bioorthogonal. בהשוואה לפרוטוקולים מסורתיים לטיהור פני השטח של התאים, היתרונות של פרוטוקול זה הם מוצמדים על-ידי שתי תכונות ספציפיות: 1) השכיחות של הסיאליציה על משטח התא חלבונים מבטיח כיסוי מקסימלי של משטח התא פרוטדום, ו 2) התגובה ספציפיות בין הקבוצה הביואורתוגונלית לבין ליגניות מעניקה טוהר של פני השטח הנרכש. כך, הפרוטוקול שלנו מביא לניתוח הפרוטאומית רגיש יותר במקרה של פחות חומרי התחלה. הדגמנו את הכדאיות של פרוטוקול זה בסמנים משטח NSPCs העיקרי. עם השינויים המתאימים על הרחבת תאי גזע בתוך מבחנה, גישה זו chemoproteomic יכול להיות תואם עם סמנים פני השטח של סוגים אחרים של תאי גזע. ראוי לציין כי כפי Ac4ManNAz הוא per-O-acetylated זה יכול להוביל S-הגליסיציה מלאכותית. השימוש בסוכרים בלתי טבעיים unacetylated יכול למנוע את היווצרות החפץ ולשפר את הספציפיות והתקפות של גלימטאני מטבולית התיוג בתאי החיים19.

ותאי האנדותל הם צעדים קריטיים. של הפרוטוקול ראשית, בעת עיכול רקמות הקורטיקלית עובריים, זמן העיכול, כמות האנזים, וכוח הטיפול חייב להיות נשלט בקפידה. עיכול מופרז וכוחות הגז המכני יפגע בשלמות של קרום הפלזמה וקולטני השטח של התאים המבגימים אותות עבור הישרדות תאים וצמיחה, והם גם יפריעו לתגובתיות של NSPCs לגירוי של תאי האנדותל. ויכולת ההתחדשות העצמית שלהם כדי להגיע לעיכול תקין, הניסויים חייבים להפעיל את הפאפאין במלואו ולעצור את העיכול ברגע שקוביות הרקמה ייעלמו. שנית, יש לשמור על תאים BEND3 במצב בריא כדי לתמוך בפרשה. מומלץ להשתמש BEND3 אצוות תאים עם פחות מעברים ומעבר את התאים לפני שהם מגיעים 100% המפגש. זה ימנע מעצר מחזור התא והזדקנות נגרמת על ידי נזק DNA שנצבר במהלך הפסייאייג או על ידי קשר צפוף בין תאים.

טכנולוגיית רצף התפוקה הגבוהה מגביר את הזיהוי של סמני פני השטח של התא באמצעות ניתוח ביטוי RNA, במיוחד עבור סוגי תאים כולל תאי גזע הרקמה, אשר לעתים קרובות נוכחים ב-vivo בכמויות קטנות מדי כדי לבצע ניתוח פרוטדום על ידי ספקטרומטר מסה. אף-על-פי ניתוח RNA-seq יכול לזהות גנים באופן ספציפי מבוטא NSPCs, זה לא יכול באמת לשקף רמות ביטוי חלבון, כי ביטוי RNA לא תמיד עקבי עם חלבון ביטוי20. בנוסף, biomolecules שאינם חלבונים שיכולים לעבוד כמו סמנים פני השטח אינם מסוגלים להתגלות על ידי המחקרים הטרנססקריפט. לדוגמה, oligosaccharide לואיס X הוא יצרנית משטח ידוע בשימוש נרחב לתווית תאים גזע עובריים האדם NSPCs, למרות שזה יכול להיות משויך עם חלבונים מרובים21. לכן, ניתוח ספקטרומטר המסה הישיר עדיין אינו מתמיר, ופיתוח שיטות שיכולות להפוך את ניתוח הספקטרומטר ההמוני לאפשרי ונוח יותר, הוא אינטרס רב ללימודים עתידיים.

בנוסף לסיליציה, סוגים אחרים של שינויי חלבון פוסט-טרנסלוניים ממלאים תפקיד חשוב בוויסות הפונקציות של חלבונים ששונו. שינויים אלה משפיעים על מאפייני החלבון כגון החיבור, מחצית החיים והלוקליזציה התת-תאית22,23. כמה שינויים חלבונים יש סוג תא ספציפיות24,25,26. עם תוכן הולך וגדל של ארגז הכלים הכימי, יותר סוגי שינויים הם קלה לתיוג מטבולית עם כתבים כימיים27. מכאן, הגישה הכימית המתוארת כאן יכולה לשמש לחקר הבדלים אחרים בשינוי חלבון בין תאי גזע לבין תאים הבדיל, הממחישות את המנגנונים המולקולריים מאחורי תחזוקת מאפייני תא גזע ובידול תקנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגילוי

Acknowledgments

איור 1B, 1B, 1B ו-1B משוחזרים מ-Bai ואח ' . מיכל עשור באישור מאגודת. הכימיה המלכותית אנו מודים לאיי האו במעבדה של אקס. סי. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (מס ' 91753206 ל-Q. S. ו-X. C, No. 31371093 ל-Q. S., ו-Nos. 21425204 ו21672013 ל-X. C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BEND3 ATCC CRL-229
DMEM Gibco 11960044
L-glutamine Gibco 25030081 1%
Sodium pyruvate Sigma P5280 1%
N2 supplement Gibco 17502048 1 to 100
N-acetyl-L-cysteine Sigma A7250 1 mM
Papain Worthington LS003726 10 U/mL
B27 supplement Gibco 17504044 1 to 50
Poly-L-lysine Sigma P4707
Basic Fibroblast growth factor Gibco PHG0261 10 ng/mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 1%
Fetal bovine serum Gibco 10099141 10%
HBSS Gibco 14175095
Tripsin-EDTA, 0.25% Gibco 25200056
DPBS Gibco 14190094
Transwell Corning 3450
Paraformaldehyde Sigma 158127 4%
Sucrose Sangon A100335
DAPI Gibco 62248
RIPA buffer Thermo Scientific 89900
SDS-PAGE loading buffer 2x Solarbio P1018
6-well plate Corning 3335
Tris-Glycine protein gel invitrogen xp00100box
Mouse monoclonal anti-Nestin Developmental Study Hybridoma Bank Rat-401 1 to 20
Mouse monoclonal anti-beta-tubulin III Sigma T8860 1 to 1,000
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 invitrogen A-21121 1 to 1,000
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b invitrogen A-21143 1 to 1,000
Albumin Bovine V Amresco 0332
Triton X-100 Amresco 0694
BCA assay kit Thermo Scientific 23225
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650
Brij97 Aladdin B129088
CuSO4 Sigma 209198
Alkyne-biotin Click Chemistry Tools TA105
BTTAA Click Chemistry Tools 1236
Ac4ManNAz Click Chemistry Tools 1084 100 µM
9AzSia synthesized in lab
Sodium ascorbate Sigma A4034
Methanol Sigma 34860
EDTA Sangon A100322
NaCl Sangon A100241
SDS Sangon A100227
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin invitrogen S21374 1 to 1,000
Triethanolamine Sigma V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin  invitrogen 60210
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Coomassie Brilliant Blue R-250 Thermo Scientific 20278
Isoflurane RWD Life Science Co. 970-00026-00
DNase I Sigma DN25 12 µg/mL
Urea Sigma U5378

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weissman, I. L. Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
  2. Gage, F. H., Temple, S. Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
  3. Gal, J. S. Molecular and Morphological Heterogeneity of Neural Precursors in the Mouse Neocortical Proliferative Zones. Journal of Neuroscience. 26, 1045-1056 (2006).
  4. Kawaguchi, A., et al. Single-cell gene profiling defines differential progenitor subclasses in mammalian neurogenesis. Development. 135, 3113-3124 (2008).
  5. Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
  6. Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139, 1535-1546 (2012).
  7. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The Glial Nature of Embryonic and Adult Neural Stem Cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  8. Wang, X., Tsai, J. W., LaMonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nature Neuroscience. 14, 555-561 (2011).
  9. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  10. Bai, Q. R., Dong, L., Hao, Y., Chen, X., Shen, Q. Metabolic glycan labeling-assisted discovery of cell-surface markers for primary neural stem and progenitor cells. Chemical Communications. 54, 5486-5489 (2018).
  11. Shen, Q., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
  12. Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28, 69-80 (2000).
  13. Varki, A. Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins. Nature. 446, 1023-1029 (2007).
  14. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  15. Lin, S. H., Guidotti, G. Purification of Membrane Proteins. Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).
  16. Schmidt, J. R., et al. Pilot Study on Mass Spectrometry-Based Analysis of the Proteome of CD34+CD123+ Progenitor Cells for the Identification of Potential Targets for Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia. Proteomes. 6, (2018).
  17. Crisan, M., Dzierzak, E. The many faces of hematopoietic stem cell heterogeneity Development. Development. 144, 4195-4195 (2017).
  18. Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 14720-14725 (2000).
  19. Qin, W., et al. Artificial Cysteine S-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides during Metabolic Glycan Labeling. Angewandte Chemie International Edition. , (2018).
  20. Gry, M., et al. Correlations between RNA and protein expression profiles in 23 human cell lines. BMC Genomics. 10, 365 (2009).
  21. Hennen, E., et al. A LewisX Glycoprotein Screen Identifies the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) as a Modulator of Oligodendrogenesis in Mice. Journal of Biological Chemistry. 288, 16538-16545 (2013).
  22. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 473-483 (2006).
  23. O’Brian, C. A., Chu, F. ReviewPost-translational disulfide modifications in cell signaling—role of inter-protein, intra-protein, S-glutathionyl, and S-cysteaminyl disulfide modifications in signal transmission. Free Radical Research. 39, 471-480 (2005).
  24. Williamson, A. J. K., Whetton, A. D. The requirement for proteomics to unravel stem cell regulatory mechanisms. Journal of Cellular Physiology. 226, 2478-2483 (2011).
  25. Christensen, B., et al. Cell Type-specific Post-translational Modifications of Mouse Osteopontin Are Associated with Different Adhesive Properties. Journal of Biological Chemistry. 282, 19463-19472 (2007).
  26. Yanagisawa, M., Yu, R. K. The expression and functions of glycoconjugates in neural stem cells. Glycobiology. 17, 57R-74R (2007).
  27. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).

Tags

מדעי המוח סוגיה 151 מטבולית גליקן תיוג חומצות הסיליות התגובה הביואורתוגונאליות תאי גזע עצביים בתאי מחולל סמני פני השטח תאי האנדותל פרוטדום תיוג כימי קליפת מוחין
זיהוי סמני שטח תא של גזע עצבי ראשוני ובתאי מחולל מטבולית על ידי תיוג מטבולי של סילוגליקן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Q. R., Dong, L., Shen, Q.… More

Bai, Q. R., Dong, L., Shen, Q. Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan. J. Vis. Exp. (151), e58945, doi:10.3791/58945 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter