Summary
Сайт Направленный мутагенез — это метод, используемый для внедрения специфических мутаций в дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Этот протокол описывает, как сделать сайт направленного мутагенеза с шага 2 и 3-х ступенчатая полимеразной цепной реакции (ПЦР) на основе подхода, который применяется к любой фрагмент ДНК интерес.
Abstract
Сайт Направленный мутагенез — это метод, используемый для внедрения конкретных мутации в ДНК для изучения взаимодействия между малых молекул некодирующих рибонуклеиновой кислоты (Срна) и целевой messenger РНК (мРНК). Кроме того сайт Направленный мутагенез используется для сопоставления определенных белков сайтов связывания РНК. Описан шаг 2 и шаг 3 ПЦР на основе внедрения мутаций. Этот подход имеет отношение к всех белков РНК и исследования взаимодействия РНК-РНК. Короче говоря метод полагается на проектирование грунты с желаемой mutation(s) и через 2 или 3 шаги PCR, синтезирующий продукт PCR с мутацией. Затем продукт PCR используется для клонирования. Здесь мы опишем, как выполнять сайт направленного мутагенеза с 2 - х и 3-х ступенчатый подход к внедрению мутации Срна, McaS и мРНК, csgD, расследовать РНК-РНК, РНК белковых взаимодействий. Мы применяем этот метод для изучения взаимодействия РНК; Однако методика применима ко всем исследованиям мутагенез (например, ДНК белковых взаимодействий, амино кислоты замещения/удаления/добавления). Это можно представить какой-либо мутация, за исключением ненатуральных баз, но техника применяется, только если продукт PCR может быть использован для вниз по течению приложения (например, клонирование и шаблон для дальнейшего ПЦР).
Introduction
ДНК часто называют чертеж живой клетки, так как все структуры ячейки кодируются в последовательности ДНК. Точная репликация и ДНК ремонт механизмов гарантируют, что происходят только очень низкие темпы мутаций, которая необходима для поддержания правильной функции закодированных генов. Изменения последовательности ДНК может повлиять на последующие функции на различных уровнях, начиная с ДНК (признание факторов транскрипции и энзимов ограничения), затем РНК (base пара взаимодополняемости и вторичной структуры изменения) и/или белки (аминокислоты кислоты замены, удаления, дополнений или смены кадра). Хотя многие мутации не существенно влияет на функции гена, некоторые мутации в ДНК может иметь огромные последствия. Таким образом сайт Направленный мутагенез является ценным инструментом для изучения важность определенных участков ДНК на всех уровнях.
Этот протокол описывает подход целевой мутагенеза, используется для введения специфических мутаций. Протокол опирается на две разные стратегии ПЦР: шаг 2- или 3-шаг ПЦР. 2-шаг ПЦР является применимым, если желаемый мутации недалеко от ' конец 5 или 3' концу ДНК интерес (< 200 пар оснований (ВР) от конца) и ПЦР 3-шаг применяется во всех случаях.
В 2-х ступенчатый подход ПЦР 3 грунты разрабатываются, в которой один набор праймеров предназначен для того чтобы усилить дна интереса (грунтовки 1 и 3, вперед и назад, соответственно), и один учебник предназначен для включения мутации. Мутация, представляя грунтовка (праймер 2) должен иметь обратный ориентации, если мутации недалеко от ' конец 5 и вперед ориентации если мутация близок к 3' конца. На первом шаге PCR праймер 1 + 2 или 2 + 3 усиливает небольшой фрагмент недалеко от ' конец 5 или 3' конца, соответственно. Полученный продукт PCR затем используется как грунт на втором шаге грунтом 1 или 3, в результате чего в продукт PCR с мутации в ДНК интерес (рис. 1A).
В 3-х ступенчатая PCR 4 грунтовки предназначены, в которых один набор праймеров предназначен для того чтобы усилить дна интереса (грунтовки 1 и 4, вперед и назад, соответственно) и один набор праймеров предназначен для учета специфических мутаций с перекрывающимися взаимодополняемости (грунты, 2 и 3, обратить вспять и вперед, соответственно). В шаге один и два, грунтовки 1 + 2 и 3 + 4 усиливают 5' и 3' конца. На шаге 3 результирующий продукты PCR от шаг 1 и 2 используются как шаблоны и усиливается с праймерами 1 + 4. Таким образом полученный продукт PCR является ДНК интерес с желаемой мутация (рис. 1B).
В то время как мутировал ДНК может использоваться для любого приложения, ниже по течению, этот протокол описывает вновь объединить вектор клонирования ДНК. Использование клонирования векторов имеет ряд преимуществ, таких как простота клонирования и конкретных экспериментальных приложений в зависимости от особенностей вектора. Эта возможность часто используется для исследования взаимодействия РНК. Другой метод для исследования взаимодействия РНК является структурной зондирующего РНК в комплексе с другой РНК1,белка или2 3,4. Однако структурные зондирование выполняется только в пробирке в то время как сайт направленного мутагенеза и последующего клонирования позволяют для исследования взаимодействия в естественных условиях.
Сайт Направленный мутагенез широко применяется для исследования взаимодействия РНК, представленные здесь. Однако ключевым методом относительно 2 - или 3-шаг ПЦР применима к любой фрагмент ДНК и таким образом не ограничивается только исследования РНК взаимодействия.
Чтобы проиллюстрировать, техника и его возможного использования, используется характеристика регионов важно для post-transcriptional регулирование мРНК, csgD, Escherichia coli (E. coli). В E. coli, csgD является мишенью малые РНК-кодирования, McaS, в сотрудничестве с белками, Hfq, для подавления выражения протеина CsgD2,4,5. Метод используется для внедрения мутаций в регионе база сопряжения между csgD и McaS и Hfq привязки сайта csgD. Затем полученные ДНК клонируется в вектор подходит для последующих экспериментов. Нисходящие приложения методики включают в vivo и in vitro экспериментов. Для иллюстрации пример 1 характеризуется в естественных условиях, используя западную помарку пробирного и пример 2 характеризуется в пробирке, используя assay переноса электрофоретической подвижности (EMSA). В обоих случаях это иллюстрированный как сайт Направленный мутагенез может использоваться в сочетании с другими методами биологического выводы о ген интереса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. вектора выбора
- Выберите вектор для выполнения течению эксперименты с. Для этого метода ПЦР 2 - и 3-шаг применим любой вектор.
- На основе выбора вектора, выберите надлежащие энзимы ограничения для клонирования.
2. грунтовка дизайн для сайта направленного мутагенеза
- Выбор между ПЦР стратегия 2-шаг или 3-ступенчатая (2-шаг предназначен только для перегласовок < 200 bp из любого конца ДНК интерес). Для 2-ступенчатой PCR перейдите к шагу 2.2 и для 3-х ступенчатая PCR, перейдите к шагу 2.3.
- Праймеры дизайн для 2-ступенчатой ПЦР.
- Конструкция праймера 1 и 3, чтобы усилить дна интереса и с 5' навес, содержит 4 нуклеотидов (например, ATAT или СЛКП) следуют соответствующие ограничения распознавания сайта необходимо клонировать в выбранный вектор.
- Дизайн праймера 2 ввести mutation(s) на нужный сайт и фланка мутации с 10-15 дополнительных нуклеотидов с обеих сторон. Сделать обратный если мутация вводится в конце 5' грунтовка или если мутация вводится в конце 3'.
- Дизайн праймеров PCR 3-шаг.
- Конструкция праймера 1 и 4, чтобы усилить дна интереса и с 5' навес, содержит 4 нуклеотидов (например, ATAT или СЛКП) следуют соответствующие ограничения распознавания сайта необходимо клонировать в выбранный вектор.
- Дизайн праймера 2 и 3 для внедрения mutation(s) на нужный сайт и фланка мутации на 10-15 дополнительных нуклеотидов с обеих сторон. Грунтовка, 2 и 3 являются обратный взаимодополняющими.
3. ПЦР-амплификации дикого типа ДНК для клонирования
Примечание: Данные по PCR, см.6.
- Выполните ПЦР6 с помощью грунтовки 1 + 2 (2-шаг ПЦР) или 1 + 4 (3-шаг ПЦР) и дикого типа ДНК как шаблон для получения продукта PCR I. Использование программы ПЦР в таблице 1.
- Проверка ПЦР электрофорезом геля агарозы.
- Сделайте агарозы геля раствор (2%), добавив 2 g агарозы на 100 мл 1 x трис ацетат Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (ТЭ) буфера. Растворите агарозы путем кипячения в микроволновой печи. Добавьте бромид ethidium краситель ДНК окрашивание (до конечной концентрации ~ 0,5 мкг/мл) для агарозы гель решение для визуализации.
- Литой геля агарозы, поместите ее в устройство электрофореза и загрузить образцы ПЦР (смешанные с ДНК загрузки красителя) и ДНК лестница известного размера. Запуск образцов на 75 W 45 мин, или до полосы отделены адекватно и визуализировать полос столом ультрафиолетового (УФ) или с гель системы.
- Очистить продукт PCR с комплектом извлечения геля (Таблица материалов) и измерять концентрацию очищенная ДНК с спектрофотометр (Таблица материалов).
- Храните очищенная ДНК при-20 ° C (в буфер Tris-ЭДТА (TE) – длительный срок хранения) или 4 ° C (в dH2O – короткий срок хранения) до используется в шаге 5.
4. ПЦР представить сайт направлен мутации в ДНК
- ПЦР для 2-ступенчатой ПЦР (см. шаг 4.2 для PCR 3-шаг)
- Выполнять ПЦР6 с помощью грунтовки 1 + 2, если мутации в ' конец 5 или 2 + 3 Если мутации в 3' конца и использовать дикого типа ДНК в качестве шаблона для получения продукта PCR II (см. таблицу 1 для ПЦР программы).
- Проверка ПЦР электрофорезом геля агарозы как шаг 3.2.1 и 3.2.2.
- Очистить продукт PCR с комплектом извлечения геля (Таблица материалов) и измерять концентрацию очищенная ДНК с спектрофотометр (Таблица материалов).
- Магазин очищенная ДНК при-20 ° C (в буфере TE) или 4 ° C (в dH2O) до используется в шаге 5.
- Выполнять ПЦР6 с помощью ПЦР продукта II как грунт вместе с грунт 3 Если мутации в 5' конца или праймер 1 Если мутации в конце 3' и использовать дикого типа ДНК как шаблон для получения продукта PCR III (см. в таблице 1 для ПЦР программы).
- Проверка ПЦР электрофорезом геля агарозы как шаг 3.2.1 и 3.2.2.
- Очистить продукт PCR с комплектом извлечения геля (Таблица материалов) и измерять концентрацию очищенная ДНК с спектрофотометр (Таблица материалов).
- Магазин очищенная ДНК при-20 ° C (в буфере TE) или 4 ° C (в dH2O) до шаг 5.
- ПЦР для 3-шаг PCR
- Выполнять ПЦР6 с помощью грунтовки 1 + 2 и 3 + 4 в отдельный реакциях и использования дикого типа ДНК в качестве шаблона для получения продукта PCR II и III (см. таблицу 1 для ПЦР программы).
- Проверка ГКДЗ электрофорезом геля агарозы как шаг 3.2.1 и 3.2.2.
- Очистить продуктов ПЦР с комплектом извлечения геля (Таблица материалов) и измерять концентрацию очищенная ДНК с спектрофотометр (Таблица материалов).
- Магазин очищенная ДНК при-20 ° C (в буфере TE) или 4 ° C (в dH2O).
- Выполнять ПЦР6 с помощью грунтовки 1 + 4 и использовать 2-5 нг обоих продуктов ПЦР II и III как шаблоны (в тот же реакция) для получения ПЦР продукта IV (см. таблицу 1 для ПЦР программы).
- Проверка ПЦР электрофорезом геля агарозы как шаг 3.2.1 и 3.2.2.
Примечание: Это не редкость получить несколько неправильные полосы (может иногда быть уменьшена с помощью менее шаблона). Однако неправильные продукты PCR может игнорироваться, если правильно размера группы является подакцизным и гель извлекается. - Если все правильно, очистить продукт PCR с комплектом извлечения геля (Таблица материалов) и измерять концентрацию очищенная ДНК с спектрофотометр (Таблица материалов).
- Магазин очищенная ДНК при-20 ° C (в буфере TE) или 4 ° C (в dH2O) до шаг 5.
5. рекомбинации дикого типа и мутантов версию(и) ДНК в выбранный вектор
Примечание: Подробные сведения на следующие шаги, см7.
- Дайджест очищенные продукты PCR I и III (от 2-х ступенчатый ПЦР) и IV (от 3-х ступенчатая ПЦР) с помощью соответствующих энзимов ограничения.
- В 20 мкл 1 x пищеварение буфер с 1 мкл каждого энзима ограничения, дайджест 200 ng ПЦР продукта при 37 ° C за 30-60 мин.
- Очистить переваривается ПЦР продукта экстракцией гель, используя набор извлечения геля (Таблица материалов), измерения концентрации ДНК очищенная ДНК с спектрофотометр (Таблица материалов) и хранить при температуре-20 ° C (в буфере TE) или 4 ° C (в dH2 O) до тех пор, пока используется для шага 5.6.
- Дайджест очищенный вектор с соответствующими энзимов ограничения и лечения с щелочной фосфатазы уменьшить события повторного перешнуровка вектора. Не относитесь продуктов ПЦР с щелочной фосфатазы.
- В 30 мкл 1 x пищеварение буфер с 1 мкл каждого энзима ограничения и 1 мкл щелочной фосфатазы, дайджест 1000 ng вектора при 37 ° C за 30-60 мин.
- Отдельные переваривается вектор из отходов ДНК (например, режиссерский вектор и вырежьте из ДНК) с использованием геля агарозы как шаг 3.2.1 и 3.2.2.
- Очистить переваривается вектор экстракцией гель, используя набор извлечения геля (Таблица материалов), измерения концентрации ДНК очищенная ДНК с спектрофотометр (Таблица материалов) и хранить при температуре-20 ° C (в буфере TE) или 4 ° C (в dH2O) до тех пор, пока используется для шага 5.6.
- Перевязать переваривается продуктов ПЦР в переваривается вектор с реакции, указанных в таблице 2.
- Инкубации при комнатной температуре на 2 ч или ночлег на 16 ° C.
- Трансформировать получателей деформации (например, E. coli K12) с перевязкой реакций.
- Расти штамм ОД600= 0,3-0,5 и передачи 1 мл культуры столько 1.5 мл пробирок как лигаза реакций.
- Спина на 3500 x g 5 минут и удалить супернатант.
- Ресуспензируйте клетки в 200 мкл буфера трансформации (10 мл бульона (LB) lysogeny с 0,1 г/мл полиэтиленгликоля 3350, 5% диметил сульфат и 20 мм MgCl2).
- Добавить реакции перешнуровки и место трубы на льду за 30 мин.
- Тепло шок для 2 мин при 42 ° C.
- Добавьте 1 mL фунта для 1.5 мл пробирок и позволяют фенотипические выражения к антибиотикам для по крайней мере 45 минут при 37 ° C.
- Спина клетки на 3500 x g 5 мин, отменить 1 мл супернатант и Ресуспензируйте ячейки в остальные супернатант.
- Пластина клетки на пластинах с соответствующие антибиотики и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
- Определите трансформантов, укрывательство векторов с успешной интеграции Вставка ДНК (например, с использованием вектора - и вставка специфические праймеры PCR).
- Проверить последовательность ДНК Сэнгером последовательности.
Предостережение: Не используйте же Праймеры для последовательности, используемое для шага 5.9.
6. использование сконструированного векторов для эксперименты в лабораторных условиях или в естественных условиях
- В естественных условиях эксперимента
Примечание: Это пример использования вектор выразить дикого типа/мутировал РНК характеризовать post-transcriptional регулирования. Для получения более подробной информации о Западный blotting смотрите8.- Растут штаммов E. coli K12 с построены векторные в соответствующей среде и побудить выражение, если требуется. Урожай образцы центрифугированием.
- Подготовка образцов для натрия Додециловый сульфат – полиакриламидный гель-электрофорез (SDS-PAGE) путем растворения гранул клеток в 1 x буфер образца SDS (62,5 мм трис-HCl pH 6.8, 2,5% SDS, 0,002% бромфеноловый синий, β-меркаптоэтанол 5%, 10% глицерина) и варить при 95 ° C за 5 мин.
Примечание: Это можно бросить гель или использовать коммерчески доступных сборного гель. Последний был использован в результаты, представленные на рисунке 3 (Таблица материалов). - Загрузить 107 клеток каждого образца в отдельных скважинах (включая трапом протеина) и Побегите гель на 200 V до тех пор, пока белки разделяются (примерно 45 минут).
- Блот белков на целлюлозы мембрану полусухим переводом на 80 мА на 1 ч.
- Блокировать мембраны смесью белков (например, 5% молока порошок растворяют в 1 x Tween 20-трис буфер солевой (TTBS) буфера).
- Добавление основного антитела (растворяют в 1 x TTBS буфера) протеина интереса (например, GFP-, флаг- или его меткой белка) и инкубировать 1 час с нежным агитации.
- Вымойте мембраны в 1 x TTBS удалить несвязанные антитела для 10 мин. Повторите дважды больше.
- Добавление вторичного антитела (растворяют в 1 x TTBS буфера), предназначенный для первичного антитела и позволяют для обнаружения (например, пероксидаза (ПХ)-конъюгированных вторичные антитела. Инкубируйте 1 час с нежным агитации.
- Вымойте мембраны в 1 x TTBS удалить несвязанные антитела для 10 мин. Повторите дважды больше.
- Визуализируйте мембраны с техникой, совместимый с вторичные антитела (например, путем обработки изображений после инкубации с люминол производные хемилюминесценции, если используется вторичное антитело проспряганное ПХ).
- В пробирке эксперимент
Примечание: Это пример использования вектора как шаблон для в vitro транскрипция РНК характеризовать РНК белковых взаимодействий. Для получения более подробной информации о EMSA см9.- Сделайте в пробирке стенограммы, используя T7 в vitro транскрипция kit (Таблица материалов) и векторы из шага 5 в качестве шаблонов.
- Отдельные РНК стенограммы на страницу на 4,5% мочевина 7 М, Денатурирующий гель и извлечь РНК непосредственно из геля, электро элюирование с диализа трубы (Таблица материалов).
- Ярлык РНК (например, radiolabeling с γ -32P-ATP используя T4-полинуклеотид киназы (Таблица материалов) и очистить снова с колоннами (Таблица материалов).
Предупреждение: Перед началом работы с радиоактивными материалами, консультироваться с сотрудником местной радиационной безопасности. - Смешайте помечены РНК с увеличением концентрации белка в отдельные реакции в 1 x привязки буфера (20 мм трис, рН 8, 100 мм KCl, 1 мм MgCl2, 1 мм Дитиотреитол (DTT)).
Примечание: В представленные результаты (рис. 4), 2 Нм radiolabeled csgD мРНК смешивали с градиентом от 0 до 2 мкм Hfq белка (концентрации мономера). - Разрешить белка и РНК гибридизируйте перед загрузкой гибридизации микс на-Денатурирующий гель полиакриламида и запустить гель для 1,5 h 200 V.
- Визуализируйте гель с техникой, совместимый с маркировки от шага 6.1.3. (например, путем phosphoimaging, если radiolabeling был применен).
- Количественную оценку относительной интенсивности полос перешли с работой с образами, программа обработки и подходят кривой (сигмоид) к данным с помощью графа и программное обеспечение для анализа данных (Таблица материалов). Основываясь на гладкой кривой, диссоциация констант (dK) может определяться автоматически с программным обеспечением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для изучения взаимодействия РНК относительно post-transcriptional регулирование csgD, двойной Векторный установки был выбран: выразить csgD мРНК и другой выразить малые РНК-кодирования, McaS. csgD был клонирован в pBAD33, который является арабинозы индуцибельной средне копировать плазмиду с хлорамфеникол сопротивления и McaS был клонирован в мини-pNDM220 R1, который является изопропиловый β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) индуцибельной низкой копировать плазмиду с Ампициллин сопротивление. Дикого типа csgD был PCR, усиливаются с помощью грунтовки 1A и 4A (4A включает флаг последовательности) приносить ПЦР продукта IA, хотя дикого типа McaS PCR, усиливаются с помощью грунтовки 1B и 4B приносить ПЦР продукта IB. Стратегия 3-шаг PCR был использован ввести замен в регионе предсказал спаривания базы csgD и McaS. В двух первых шагов продукты PCR IIA и IIIA синтезировано с помощью грунтовки 1A, 2A и 3A + 4A, соответственно. На третьем шаге был синтезирован продукт PCR IVA, используя продукты PCR IIA и IIIA как шаблон и 1A 4A в качестве грунтовки (рисунок 2A). Аналогичным образом дополнительные сайт направленных мутаций были введены в McaS, с помощью грунтовки 1B, 2В, 3В и 4B приносить продукты PCR IIB, IIIB в первые два шага и IVB на третьем этапе (рис. 2A). pBAD33 и продукты PCR IA и IVA были переваривается с BamHI и PstI и перевариваются IA и IVA были лигируют в усваивается pBAD33. Результате конструкции были названы pBAD-csgDфлаг и pBAD-csgD63-66FLAG (мутировал в позиции 63-66 относительно transcriptional стартовый сайт). pNDM220 и продукты PCR IB и IVB были переваривается с AatII и BamHI и перевариваются IB и IVB были лигируют в усваивается pNDM220. Результате конструкции были названы pNDM-mcaS и pNDM-mcaS42-45 (мутировал в позиции 42-45 относительно transcriptional стартовый сайт).
Для анализа эффект мутаций, штаммы кишечной палочки , укрывательство pBAD-csgDфлаг или pBAD-csgD63-66FLAG и pNDM220, pNDM-mcaS или pNDM-McaS42-45 были выращены в M9 минимальный средний с 0,2% глицерина ОД 450 0,4. 10 мин выражение из pNDM векторов затем индуцированных добавлением 1 мм ИПТГ, следуют 5 мин индукции pBAD-векторов добавлением арабинозы 1 мм. На данный момент были собраны образцы и Западный анализ помаркой была исполнена с собранных образцов. Хотя выражение дикого типа McaS предотвращает перевод дикого типа CsgD, введение мутаций в CsgD или McaS снимает наблюдаемых репрессий. Однако, когда мутации дополняются в CsgD и McaS трансляционная репрессии CsgD восстанавливается (рис. 3; изменение от2). Таким образом сайт направлен мутационного подход поддерживает гипотезу что McaS и csgD -пар в этом регионе.
PBAD33 вектор был выбран для эксперимента, в естественных условиях и также использовался для введения сайта направленных мутаций расследовать Hfq привязки к csgD мРНК в пробирке. Сайт направленных мутаций были введены с 2-ступенчатой ПЦР стратегии для создания csgD мутант РНК с измененных первичных или вторичных структур при трансляции. Грунты 1 + 2 C, 2D, 2E, 2F или 2G были использованы для усиления и внедрения мутаций к 5' концу csgD. Результате продукты PCR (IIC, IID, IIE, IIF и IIG) использовались как шаблоны с грунт 3 усилить и внедрить мутации для всей csgD ДНК (рис. 2B). Результате продукты PCR (IIIC, IIID, IIIE, IIIF и IIIG) были клонированы в pBAD33, как описано выше. В пробирке стенограммы были расшифрованы с РНК полимеразы T7: во-первых, продукты PCR были синтезированы с грунтовки 5А, 5C, 5D, 5E, 5F или 5 g + 6 с использованием сконструированного векторов как шаблон. Результате продукты PCR были использованы в качестве шаблонов для T7 РНК полимеразы. В пробирке расшифрованный csgD дикого типа и мутантов RNAs были чистые, radiolabeled и смешанные с увеличение концентрации очищенный Hfq. Реакций гибридизации были работать на не денатурации гели и визуализированы. Увеличение Kd-значения мутантных аллелей доказывает, что Hfq менее эффективно связывает мутантов. Кроме того Hfq имеет несколько сайтов связывания на csgD , который показан в 3 смены, наблюдается для дикого типа РНК. Однако, наблюдаются только 2 сайтов связывания для различных мутант РНК (рис. 4; изменение от4). Таким образом, сайт направленных мутационного подход определяет первичной или вторичной структуры csgD мРНК, которые важны для полного связывания Hfq.
Взятые вместе, это возможно для выполнения сайт направленного мутагенеза с 2 - х или 3-х ступенчатый подход ПЦР в сочетании с течению анализы сделать биологических выводы о регулировании гена на post-transcriptional уровне, а также взаимодействий протеин РНК .
| Шаг | Температура | Время |
| Первоначальный денатурации | 98° C | 2 мин |
| Денатурация | 98° C | 10 s |
| Отжиг | 55° C | 10 s |
| Расширение | 72° C | 15 s |
| (30 циклов) | ||
| Окончательное расширение | 72° C | 5 мин |
| Удерживайте | 4 ° C |
Таблица 1: ПЦР программа
| Реагент | Реакция управления | 20 фмоль реакция | 100 фмоль реакция |
| 10 x буфер лигаза | 2 МКЛ | 2 МКЛ | 2 МКЛ |
| Переваривается дна вектора | 10 фмоль | 10 фмоль | 10 фмоль |
| Усваивается продукт PCR | 0 фмоль | 20 фмоль | 100 фмоль |
| H2O | До 19 мкл | До 19 мкл | До 19 мкл |
| Лигаза | 1 МКЛ | 1 МКЛ | 1 МКЛ |
Таблица 2: Перевязка реакции
| Грунтовка имя | Последовательность | Используется для - мутации | ||
| 2-1A или 3-1A | GCGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATCAGA TGTAATCCATTAGT |
2 - и 3-раунд ПЦР на csgD | ||
| 2-3A или 3-4A | CCGCCTGCAGAAAAAAACCCCGCAGCAGCGGGGTTTTTCTACCAGACGAGAAC | 2 - и 3-раунд ПЦР на csgD | ||
| 3-2A | CAGAAGTACTGACAGATGTTGGTGAGCTGTGTGTAGTAATAAATC | 3-раунд ПЦР на csgD – заменяет 4 nt | ||
| 3-3А | GATTTATTACTACACACAGCТСАСCAACATCTGTCAGTACTTCTG | 3-раунд ПЦР на csgD – заменяет 4 nt | ||
| 3-1B | CGCCTGACGTCGGCAAAAAGAGTGTTGACTTGTGAGCGGATAACAATGATACTTA GATTCACCGGCGCAGAGGAGACAATGCC |
3-раунд ПЦР на McaS | ||
| 3-4B | AATTGGATCCAAAAAAATAGAGTCTGTCGACATC | 3-раунд ПЦР на McaS | ||
| 3-2B | CTCTACAGTACACACAGCТСАСCATCCGCGTCTTAAATC | 3-раунд ПЦР на McaS-заменяет 4 nt | ||
| 3-3B | GATTTAAGACGCGGATGGTGAGCTGTGTGTACTGTAGAG | 3-раунд ПЦР на McaS-заменяет 4 nt | ||
| 2-2C | CAGCCCTAAATGGGTCTAATGGATTACATCTG | 2-раунд ПЦР на csgD – удаляет 11 nt | ||
| 2-2D | CAGCCCTAAATGGGTAAAACCCCAAACTAATGGATTACATCTG | 2-раунд ПЦР на csgD – заменяет 4 nt | ||
| 2-2E | CTGTGTGTAGTAATAAATCAGTAAAATATAAAACTAATGGATTACATCTG | 2-раунд ПЦР на csgD – удаляет 11 nt | ||
| 2-2F | GTAATAAATCAGCCCTACTACTAGAACTAATGGATTACATCTG | 2-раунд ПЦР на csgD – удаляет 9 nt и заменителей 7 nt | ||
| 2-2G | CCCTGCTGTGTGTAGTAAT ATCAGCCCTATGACTAAAACTAATGGATTACATCTG | 2-раунд ПЦР на csgD – удаляет 9 nt и заменителей 7 nt | ||
| 5А | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACCC | T7 PCR | ||
| 5C | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGACCCATTTAGG | T7 PCR | ||
| 5D | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTGGGGTTTTAC | T7 PCR | ||
| 5E | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACTGATTTATTAC | T7 PCR | ||
| 5F | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTCTAGTAGTAG | T7 PCR | ||
| 5G | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTAGTCATAGG | T7 PCR | ||
| 6 | GTATGACCATGAATACTATGG | T7 PCR | ||
Таблица 3: Праймеры для сайта направленного мутагенеза и T7 темплатного синтеза
Жирный шрифт: сайты признание энзима ограничения (BamHI, PstI и AatII)
Подчеркнутый: мутации нуклеотидов
Рисунок 1: стратегия ПЦР для сайта Направленный мутагенез. A) три праймеры используются в 2-х ступенчатый подход ПЦР представить сайт направленных мутаций ген интереса. Грунты, 1 и 3 усиливает гена (продукт PCR я), в то время как грунтовка 2 вводит специфических мутаций (*). Грунтовка пар 1 + 2 усиливает небольшой фрагмент на любом конце ДНК интерес синтезировать продукт PCR II (шаг 1). Полученный продукт PCR затем используется как грунт вместе с грунт 3 синтезировать продукт PCR III с сайта направлено мутация включены (шаг 2). B) четыре праймеры используются в подходе PCR 3-шаг представить сайт направленных мутаций ген интереса. Праймеры 1 и 4 усиливает гена (продукт PCR я), в то время как праймеры 2 и 3 вводит специфических мутаций (*). Грунтовка пары 1 + 2 и 3 + 4 используются в две первые шаги PCR синтезировать продукт PCR II и III (шаг 1 & 2). На третьем шаге продукты PCR II и III используются как шаблон с парой грунтовка 1 + 4 синтезировать IV продукт PCR с сайта направленных мутаций включены (шаг 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: продукты PCR от сайта Направленный мутагенез. PCR были выполнены с грунтовки и шаблоны, как описано в тексте. Продукты PCR были запущены на 2% гель агарозы бромидом ethidium (~ 0,5 мкг/мл) с 1 мкг ДНК лестницы смесь (Таблица материалов). Правильный размер полосы, отмеченные красной площади. A) в большинстве реакциях PCR видна только одна полоса правильного размера. Однако, реакция PCR IVB имеет два видны полосы которых верхняя полоса (чуть выше 300 bp) имеет правильную длину. Как ожидается, сумма длины продуктов ПЦР II и IIIC равняться длине продуктов ПЦР I и IV (A: csgD ПЦР продукты, продукты B: McaS PCR, дикого типа I: csgD/McaS усиливается с помощью грунтовки 1A/B + 4а/B, II + III: промежуточные продукты PCR усиливаются с помощью грунтовки 1A/B + 2A/B и 3A/B + 4а/B, соответственно, IV: мутировал продукт PCR усиливаются с помощью грунтовки 1A/B + 4а/B с промежуточных продуктов ПЦР II и III как шаблоны). Во всех реакциях PCR видна только одна полоса правильного размера. В этом случае почти все молекулы продуктов ПЦР, добавленные II в реакциях PCR III были использованы для синтеза продуктов ПЦР III. Только для PCR IIIE это продукт PCR IIE еще видны (IA: продукт PCR csgD дикого типа усиливается использованием праймера 1A + 3A, IIC-G: промежуточные продукты PCR усиливается, используя праймер 1A + 2 C-G, IIIC-G: мутировал ПЦР продукты, усиленный, используя праймер 3A с продуктов ПЦР IA и МСК-G как шаблоны). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: In vivo эксперимент с сайта направленных csgD и мутанты McaS. Западный анализ помаркой штаммов, укрывательство указанных векторов. Штаммы были выросла до экспоненциальной фазе и индуцированных за 10 мин с 1 мм ИПТГ (McaS) следуют индукции 5 мин с 1 мм арабинозы (csgD). Α-флаг антитела были использованы для флага тегами CsgD и α-GroEL антитела были использованы для уборки белка GroEL (разбавленный 10 000 и 50 000 раз, соответственно). Мыши и кролик HRP-конъюгированных антител были использованы как вторичные антитела (разбавленный 2 000 раз). Эта цифра была изменена от2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: В пробирке эксперимент с сайта направленных csgD мутантов. EMSA в пробирке транскрибируется csgD дикого типа (WT) и мутанта (Группа C-G) РНК в отношении Hfq привязки. CsgD аллели (WT и мутанта C-G) были radiolabeled и смешанные с 0, 0,25, 0,5, 1 или 2 мкм мономерных Hfq. гибридизации реакции были запущены на-денатурации полиакриламидных гелей. Количественно относительную интенсивность смещенные полос и сигмовидной кривой был установлен к данным. Диссоциация значения констант (Kd) были определены с использованием SigmaPlot. Этот рисунок был изменен с4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сайт Направленный мутагенез имеет широкий спектр различных приложений, и здесь, представитель результаты от in vivo и эксперимент в лабораторных условиях были включены в качестве примеров того, как сделать биологических выводы, используя технику. Сайт Направленный мутагенез уже давно золотой стандарт для исследования взаимодействия РНК. Сила технику в комбинации внедрения соответствующих мутаций с течению анализов и эксперименты (Западная помарка или EMSA), чтобы сделать выводы о конкретных сайтов ДНК и их значение в функции гена-продуктов в вопрос. При принятии решения сделать сайт направленного мутагенеза, Дизайн грунтовки должны быть тщательно спланированы чтобы получить максимум от технику (например какие сайты мутировать); не забудьте включить правильный свесы и места ограничения и уделять внимание грунт/шаблон характеристики.
Фактической мутагенеза, указанных в настоящем Протоколе опирается на ПЦР. Наиболее важной частью протокола является таким образом условия для этого. Есть несколько способов оптимизации PCR, включая градиенты мг2 + концентрации, концентрации ДМСО и температуры отжига шага. Для получения дополнительной информации см3. Помимо оптимизации реакции PCR, сам, две вещи, стоит сделать конечно когда делать сайт Направленный мутагенез: шаблоны высокого качества и тщательно разработанные грунтовки.
Наличие качественных шаблонов для PCR часто делает разницу между неудачных и успешных ПЦР. Хотя можно использовать lysate клетки предоставить шаблон ДНК, очищенная ДНК (геномной-, вектор - или ПЦР-ДНК) всегда предпочтительнее. Кроме того когда дело доходит до количество шаблонов, часто меньше больше; особенно в последний шаг 3-шаг ПЦР (шаг 4.2.5). Например попробуйте серию разбавления 10 x шаблона, чтобы найти оптимальное, при необходимости.
Оптимальное грунтовка дизайн зависит от характеристик ДНК полимеразы и интерес. Всякий раз, когда это возможно, всегда пытаются разрабатывать грунты соответственно. Однако во многих случаях грунтовки должны быть спроектированы на определенном сайте и поэтому не может быть спроектирована конкретных критериев. В тех случаях, это может быть необходимо делать больше оптимизации ПЦР вместо условия (протокол PCR6и см. выше), но с условия даже трудно PCR обычно успешно.
Несколько альтернативных методов для сайта Направленный мутагенез доступны, такие как Канкел в метод10, весь плазмида мутагенеза11, кассета мутагенеза12, Джин синтез de novo и ТРИФОСФАТЫ13,14.
Кункель метод и мутагенез всему плазмида опирается на ДНК интерес, уже находясь в плазмиду (вектор) и использует праймеры синтезировать одинарная или двойная нить ДНК мутировал, соответственно. В обоих методах весь плазмида в настоящее время синтезированных и используется для преобразования, в то время как 2 - или 3-шаг PCR только синтезирует ДНК кусок интерес. От 2 - или 3-шаг PCR, недостатком является, что ДНК интерес должен быть синтезированы дважды, увеличивая риск мутации нем. С другой стороны плазмида не должны быть обобщены, таким образом снижая риск мутации здесь вместо. Кроме того используя 2 - или 3-шаг PCR, дикого типа variant не нужно быть клонированы в вектор заранее, таким образом снижая время клонирования на несколько дней.
Кассета мутагенеза не полагаться на применение грунтовки или полимеразы. Вместо этого небольшой фрагмент ДНК является de novo обобщены и включены в ДНК интерес с помощью энзимов ограничения. Этот метод, однако, зависит от наличия подходящих ограничение участков вблизи целевого сайта, который не всегда присутствует. Этот подход также требует дикого типа вариант клонируемый в вектор заранее, увеличивая время клонирования, по сравнению с 2 - х или 3-х ступенчатый метод ПЦР.
С снижение стоимости de novo синтеза гена (большие фрагменты ДНК) она становится все более доступным для внедрения мутаций, заказав нужную последовательность коммерчески. Этот метод является, однако, по-прежнему дорогостоящей по сравнению другие упомянутые методы. Во время написания de novo синтез примерно 3 раза дороже, чем метод, представленные здесь.
Другим новым вариантом является долгожданной ТРИФОСФАТЫ метод для изменения генома. Этот метод является весьма эффективной и гибкой по сравнению с другими методами, используемые для эукариотических клеток. Однако с относительной легкостью и многие имеющиеся методы клонирования в организме проще как бактерии, ТРИФОСФАТЫ редко является более подходящим, чем обычные клонирования. Таким образом полезность ТРИФОСФАТЫ главным образом зависит от организма изучается.
При выборе сделать сайт направленного мутагенеза, важно разработать его тщательно; так что касается нисходящие приложения, а также фактический метод используется. Метод ПЦР 2 - и 3-шаг, описанный здесь применимо к почти любой исследование мутаций и с его низкой стоимости он подходит для любого бюджета лаборатории.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют не конкурирующие интересы.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Университет Южной Дании открытого доступа политики грантов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GroEL antibody produced in rabbit | Merck | G6532 | Primary antibody |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel imaging workstation |
| Custom DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spectrophotometer for nucleic acid measurements |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Ethidium bromide solution 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Dialysis tubes for electro elution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Horizontal electrophoresis system |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Merck | F3165 | Primary antibody |
| Mouse Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0447 | HRP conjucated secondary antibody |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | RNA purification |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris gels for protein separation |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP conjucated secondary antibody |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph and data analysis software tool |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR machine |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
References
- Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
- Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Antal, M., et al. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).
- Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
- Thomason, M. K., et al. A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
