Summary
Nous présentons ici un protocole visant à exprimer, solubiliser et purifier plusieurs transporteurs de borate eucaryotes avec une homologie avec la famille de transporteur SLC4 à l’aide de la levure. Nous décrivons également un test de réticulation chimique afin d’évaluer les protéines purifiées homomères multimériques l’Assemblée. Ces protocoles peuvent être adaptées pour d’autres protéines membranaires difficiles.
Abstract
La famille de soluté transporteur 4 (SLC4) des protéines est appelée les transporteurs de bicarbonate et comprend la protéine archétype Anion Exchanger 1 (AE1, également connu sous le nom de bande 3), protéine de membrane la plus abondante dans les globules rouges. La famille SLC4 est homologue avec des transporteurs de borate, qui ont été caractérisés chez les plantes et les champignons. Il reste un défi technique important d’exprimer et de purifier les protéines membranaires de transport jusqu'à homogénéité en quantités appropriées pour les études structurales ou fonctionnelles. Nous décrivons ici les modalités de la surexpression de transporteurs de borate dans Saccharomyces cerevisiae, l’isolement des membranes de levure, solubilisation de la protéine de détergent et de purification des homologues transporteur borate de S. cerevisiae, Arabidopsis thalianaet Oryza sativa. Nous détaillons également un glutaraldéhyde expérience pour dosage multimerization de homomères transporteurs de réticulation. Nos procédures généralisées peuvent être appliqués à tous les trois protéines et ont été optimisés pour l’efficacité. Bon nombre des stratégies développées ici peuvent être utilisés pour l’étude des autres protéines membranaires difficiles.
Introduction
La difficulté d’obtenir une quantité suffisante de protéine purifiée de la membrane reste un goulot d’étranglement critique dans la poursuite des études structurales et fonctionnelles des transporteurs, récepteurs et canaux ioniques. Nombreux protocoles existent pour pipelines modérément haut débit aux protéines de membrane de candidat écran et trouver qui expriment assez bien pour permettre à ultérieurs in vitro studies1,2,3,4 . En règle générale, les protéines sont marquées par une protéine fluorescente N-C-terminal ou verte (GFP), et les niveaux d’expression sont surveillés par la détection par fluorescence taille exclusion chromatographie (FSEC)5ou par fluorescence en gel. Ces approches permettent le tri des candidats de protéines membranaires en protéines exprimant élevée, modérées ou faibles exprimant des protéines, ou des protéines qui expriment peu ou pas du tout. Cette approche fonctionne bien quand le protocole expérimental est d’étudier un grand nombre de gènes candidats dans le but de sélectionner quelle que soit la protéine exprime le mieux. Toutefois, dans certains cas, une approche expérimentale repose sur l’étude d’une protéine de membrane particulière, qui peut être difficile quand les niveaux d’expression de la protéine sont dans la gamme moyenne ou faible. En outre, parfois dans ces cas, les niveaux d’expression peuvent n'être que très peu augmentés en modifiant la construction via troncations, mutations thermostabilizing ou optimisation de codons. Il est donc parfois nécessaire d’optimiser les protocoles d’expression et purification de protéine membranaire des protéines membranaires qui expriment seulement modérément bien.
La famille de SLC4 des transporteurs comprend le transporteur de bicarbonate Anion Exchanger 1 (également connu sous le nom de bande 3), la protéine membranaire plus abondante dans les globules rouges6et un moteur essentiel de la respiration cellulaire. La famille SLC4 est homologue avec des transporteurs de borate, qui sont essentielles dans les plantes et auraient dû être divulgués présentent une structure similaire aux Anion Exchanger 1 ainsi qu’à couplage sodium SLC4 transporteurs7,8,9 ,10. Nous rapportons ici les protocoles d’expression et purification de protéine optimisée à l’aide de S. cerevisiae pour purifier les trois transporteurs de borate différents trouvés chez les levures et les plantes. Nous mettons en évidence dans les étapes clés de détail, nous avons pris pour optimiser le rendement et l’efficacité de la purification jusqu'à homogénéité. En outre, les auteurs rapportent un dosage de réticulation chimique à l’aide de glutaraldéhyde à superviser le regroupement de multimères de ces transporteurs dans le cadre d’un complexe de protéines-détergent-lipides purifié. L’expérience de réticulation peut aider à évaluer des qualités homologue et détergent en évaluant l’état de multimères de transporteurs oligomériques après purification.
Ce protocole suppose que le transporteur désiré a été cloné dans un plasmide de 2 µ dérivés sous contrôle inductible du promoteur GAL1 pour l’expression chez S. cerevisiae. Pour ces procédures, l’ADN a été utilisé codage transporteurs pleine longueur sauvage borate Bor1 de Saccharomyces cerevisiae (ScBor1)11, Arabidopsis thaliana Bor1 (AtBor1)12et Oryza sativa Bor3 (OsBor3)13 . L’extrémité C-terminale dans chaque construction est ajouté avec un 10-His-tag et un site de clivage de la thrombine inséré entre le transporteur et la 10-His-tag pour permettre son retrait si vous le souhaitez. Le protocole assumera également que le plasmide a déjà été transformé en la DSY-5 expression souche de S. cerevisiae sur milieux sélectifs supplémentaires complètes (CSM) sans histidine.
Protocol
1. préparation des supports et tampons importants
- Préparer 500 mL de galactose de 40 % en ajoutant 200 g de galactose et de l’eau déminéralisée pour un volume total de 500 mL. Utiliser une plaque chauffante ou four à micro-ondes pour augmenter le taux de galactose dans la solution. Filtres stériles avec un appareil de filtration sous vide, consistant en un haut filtre de 0,2 µm attaché à une bouteille de verre stériles.
Remarque : Toutes les solutions de médias sont préparées à l’aide de l’eau déminéralisée. - Préparer 500 mL de glucose 40 % en ajoutant 200 g de glucose et d’eau pour un volume total de 500 mL. Autoclave pour stériliser.
- Dans chacune des quatre fioles 2 L, ajouter 0,4 g de mélange de complément complet sans histidine (CSM-His), 3,35 g levure azote base avec le sulfate d’ammonium (YNB + azote) et 475 mL d’eau. Autoclave. Ajouter 25 mL de glucose 40 % pour atteindre une concentration de glucose finale de 2 %.
- Ajouter, à une bouteille en verre, peptone de 50 g et 25 g de levure, extrait et à 375 mL d’eau. Autoclave. Ajouter 125 mL de galactose de 40 % de donner 5 x solution de peptone (YP) levure contenant 10 % de galactose.
- Ajouter, dans une fiole jaugée de 250 mL, 0,04 g CSM-His, 0,335 g YNB + azote et eau à 47,5 mL. Autoclave. Ajouter 2,5 mL de glucose 40 % d’obtenir 50 mL de CSM-His YNB + 2 % de glucose.
- Préparer 1 L de 1M Tris pH 7.0 en mélangeant 121,14 g de Tris base avec 800 mL d’eau. Ajouter l’acide chlorhydrique concentré jusqu'à pH 7.0. Ajouter de l’eau pour un volume final de 1 L et passer par un filtre de 0,2 µm.
- Préparer 500 mL de 0,5 M EDTA acide (EDTA) pH 8,0 en mélangeant 73,06 g d’EDTA avec 400 mL d’eau. Ajouter les pastilles d’hydroxyde de sodium jusqu'à ce que l’EDTA a dissous et le pH atteint 8.0. Ajouter de l’eau pour un volume final de 500 mL et passer par un filtre de 0,2 µm.
- Préparer 100 mL de fluorure de phénylméthanesulfonyle de 100 mM (PMSF) en mélangeant 1,74 g de PMSF à 200 éthanol preuve. Conserver à-20 ° C.
- Préparer les 225 mL de 2 x tampon de lavage perle comprenant 50 mM Tris pH 7.0, 1,4 M NaCl, 20 % de glycérol et 1 mM EDTA pH 8.0.
- Préparation de 100 mL de la taille de tampon de chromatographie d’exclusion (tampon S200) consistant en 20 mM 4-Morpholinoethanesulfonic acide hydrate (MES) pH 6.5, 100 mM NaCl, glycérol 2 % et 0,03 % n-dodécyl-bêta-D-Maltopyranoside (DDM).
- Préparer 100 mL de tampon de resuspension de membrane composée de 50 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl et de 10 % de glycérol.
- Préparer 10 mL d’un 3 x colorant de chargement de SDS-PAGE en mélangeant 3 mL 20 % dodécylsulfate de sodium (SDS), 3 mL de glycérol, 2,4 mL 1M Tris pH 6,8, 0,03 g de bleu de bromophénol et 1,6 mL 2-mercaptoéthanol.
2. la surexpression du transporteur de Borate chez S. cerevisiae
- Inoculer les trois colonies de levure transformée dans 50 mL de CSM-His + YNB + support de 2 % de glucose et agiter pendant la nuit à 190 tr/mn à 30 ° C.
- Le lendemain utilisez un spectrophotomètre pour déterminer la densité optique à une longueur d’onde de 600 nm (OD600) et ensemencer à une OD600 de 0,01 chacune de quatre flacons de 2 L qui contiennent chacun 500 mL de CSM-His YNB + 2 % médias de glucose.
- Agiter à 190 tr/mn à 30 ° C pendant 30 h permettre les cellules à consommer tous les glucose et atteindre une densité élevée.
NOTE : Un temps plus long de la croissance des résultats dans une cellule plus grande donne, plus grands rendements membrane récoltés, et finalement plus grande protéine purifiée donne. - Induisent l’expression en ajoutant 125 mL de 5 supports de x YP additionné de galactose de 10 % pour une concentration finale de l’induction du galactose de 2 %. Agiter à 190 tr/mn à 30 ° C pendant 16 h.
- Récolte des cellules de la filature à 4 000 x g pendant 15 min. remettre en suspension les cellules dans 100 mL d’eau froide.
Remarque : À ce stade les cellules peuvent être congelés à-80 ° C indéfiniment, ou continue la préparation dans la lyse des cellules et la membrane de récolte. Nous récoltons généralement 40-45 g de cellules.
3. récolte des Membranes de levure
- Ajouter à la resuspension de cellule 11,25 mL de 1M Tris pH 7.0, 0,45 mL d’EDTA 0,5 M et 2,25 mL de 100 mM PMSF, ce dernier, dont deux agissent comme inhibiteurs de la protéase. Ajouter de l’eau pour un volume final de 225 mL, ce qui se traduit par un tampon de resuspension de cellule de PMSF à 50 mM Tris pH 7.0, EDTA, 1 mM et 1 mM.
Remarque : Si vous utilisez des congelés de cellules permettre cellules de décongeler complètement, environ 1 h à température ambiante, parce que s’ils restent partiellement gelés, ils résisteront lyse par coups de talon. - Ajouter la remise en suspension des cellules dans un bidon métal 450 mL pour perle battant. Terminez le volume restant avec perles de verre froid 0,5 mm.
- Permet d’assembler une chambre perle-battant avec le rotor et plonger dans un bain de glace. Effectuer six impulsions de 1 min, séparées par des périodes de repos de 2 min pour éviter la surchauffe du lysat.
- Assembler un appareil de filtration sous vide à l’aide d’un plastique jetables bouteille filtre supérieur vissé dans une bouteille en verre. Enlever la membrane de filtration, parce que l’appareil reste en plastique peut capturer les perles tout en permettant un lysat de passer. Séparer les perles le lysat en versant le contenu de la chambre de coups de talon sur l’assemblage tout en appliquant le vide.
- Laver la chambre perle de battement 225 ml d’un 2 x tampon de lavage qui contient 50 mM Tris pH 7.0, 1 mM EDTA, PMSF 1 mM, 1,4 M de NaCl et 20 % de glycérol. Vider le contenu de la chambre sur les perles de la laver.
Remarque : Le lavage donne un volume final de cellules ~ 450 mL lysée et significativement les rendements hausses récoltées membrane. Les concentrations finales sont 50 mM Tris pH 7.0, 1 mM EDTA, PMSF 1 mM, 10 % de glycérol et de 700 mM NaCl, et l’objectif principal de l’élévation de la concentration en sel est d’aider à dissocier les protéines membranaires périphériques. - Tourner vers le bas de la cellule lysate à 15 000 x gpendant 15 minutes. Versez le liquide surnageant dans des bouteilles en polycarbonate et un essorage pendant 1 h à 135 000 x g dans une ultracentrifugeuse pour recueillir des membranes.
Remarque : Si une ultracentrifugeuse n’est pas disponible, les membranes peuvent être recueillies par rotation pendant 3 h à 53 000 x g, une force qui est réalisable dans les centrifugeuses modèle de plancher. - Jeter le surnageant et peser les bouteilles avec des granulés de membrane. Remettre en suspension les pellets de membrane dans environ 35 mL membrane resuspension tampon contenant 50 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl et 10 % de glycérol et ajouter à un verre de douncer. Peser les tubes à centrifuger vide pour déterminer la masse des membranes récoltés.
Remarque : Une récolte de membrane efficace, le poids des membranes sera égal à environ 20 % le poids des cellules utilisé pour la récolte de cette membrane. Ce protocole donne des rendements de cellule typique de 40-45 g, et nous attendons donc de même un rendement de membranes de 8-9 g. - Dounce homogénéiser les membranes et la partie aliquote dans des tubes de 50 mL conique qui peuvent désormais être conservés indéfiniment à-80 ° C.
Remarque : Pour cette expérience, en général deux parties aliquotes sont faites, afin de permettre des purifications de protéines distinctes deux à être exécutée à partir d’une préparation de cellules originales.
4. solubilisation et Purification de protéine
- Dans un bécher, ajouter une barre de remuer et 150 mg de n-dodécyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) par membrane g utilisé. Garder les protéines sur la glace ou à 4 ° C en permanence.
NOTE : DDM est hygroscopique et doit être conservé dans un bocal en verre avec déshydratant à-20 ° C quand pas en service. En outre, il est typique d’utiliser entre 4 à 5 g de membranes en une purification pour obtenir une quantité appréciable de protéines pures. - Décongeler les membranes et les porter à un volume final de 15 mL par g membrane dans le tampon de resuspension de membrane additionné de PMSF à 1 mM et 20 mM imidazole pH 8.0. Ajouter des membranes dans le bécher avec DDM et remuer pendant 1 h à 4 ° C.
Remarque : La concentration de la DDM sera 1 % p/v, mais pour la solubilisation des protéines de la membrane, il est plus essentiel d’être conscient de la masse du détergent ajoutée par membrane g. - Tournez pendant 25 min à 135 000 x g à 4 ° C pour granuler matériel non solubilisées. Filtrer le liquide surnageant à travers un filtre de seringue de 5 µm.
- Charge l’échantillon par la pompe péristaltique, réglé à un débit de 1 mL/min sur une colonne d’affinité de nickel immobilisée 1 mL équilibrées dans 20 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, 10 % de glycérol, 20 mM imidazole pH 8,0 et 0.05 % DDM.
NOTE : Pour les protéines exprimant inférieurs, rendements et pureté améliorée ont été observés en utilisant un 1 mL au lieu de colonne de 5 mL et nickel au lieu d’ions cobalt pour la chromatographie d’affinité. - Laver la colonne avec 10 volumes de colonne d’un tampon de lavage contenant 20 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, 10 % de glycérol, 80 mM imidazole pH 8,0 et 0.05 % DDM.
Remarque : La concentration de l’imidazole qui peut être utilisée au cours de lavages pour une protéine 10-His-tag est supérieure à est généralement apprécié et se traduit par une pureté améliorée. - Éluer la protéine dans la mémoire tampon contenant 20 mM Tris pH 7.0, 200 mM NaCl, 10 % de glycérol, 300 mM imidazole pH 8,0 et 0.05 % DDM. Recueillir l’éluat dans dix fractions de 1 mL et fonctionner sur un gel de Tris-glycine SDS-PAGE 4-20 % avec fractions solubilisés de lysats et laver.
- Fractions de pic de piscine, habituellement d’environ 5 à 6 mL et concentré à 500 µL ou moins volume dans un concentrateur de coupure de 50 kDa dans une centrifugeuse de paillasse au réfrigérateur à 4 ° C.
NOTE : 500 µL est un volume maximal typique injecté dans les colonnes de chromatographie (SEC) taille exclusion. À ce stade la protéine peuvent être conservés indéfiniment à-80 ° C ou continuer sur SEC. - La protéine filtrer sur un filtre de colonne de spin de 0,2 µm et injecter sur une exclusion colonne taille (p. ex., Superdex-200) s’équilibrée dans un tampon S200 : 20 mM Mes pH 6.5, 100 mM NaCl, glycérol 2 % et 0,03 % DDM.
Remarque : Pour le glutaraldéhyde ultérieur réticulation dosage, l’agent de mise en mémoire tampon ne doit pas contenir une amine primaire. S est l’occasion d’échanger des tampons si nécessaire, comme fait ici lors de l’échange des Tris pour Mes. - Exécuter que les fractions de pointe dans un 4-20 % Tris-glycine SDS-PAGE de gel. Souillez le gel, recueillir des fractions de pic pur et concentré dans un concentrateur de 50 kDa coupure à 4 ° C.
- Déterminer la concentration de protéine en mesurant l’absorbance à une longueur d’onde de 280 nm et les conserver indéfiniment à-80 ° C.
5. glutaraldéhyde réticulation Assay
- Préparer une réaction µL 10 en mélangeant 3 µL de protéine de 0,5 mg/mL dans un tampon S200 5 µL de tampon de S200, 1 µL de l’eau, ou 20 % dodécylsulfate de sodium (SDS), suivie de 1 µL de glutaraldéhyde à 1,5 %.
Remarque : Cela vous donnera une réaction 1 x de glutaraldéhyde protéines et 0,15 % de 0,15 mg/mL. Échantillons contenant un pré-traitement de la SDD sont témoins négatifs importants et devraient être mélangés et incubés à température ambiante pendant 5 min avant d’ajouter le glutaraldéhyde. - Incubez la réaction pendant 30 min à température ambiante. Mettre fin à la réaction en ajoutant 5 µl de 3 x gel SDS-PAGE chargement colorant, qui contient un excès de tampon Tris qui désaltère le glutaraldéhyde.
- Charger tous les 15 µL sur gel de Tris-glycine SDS-PAGE 4-20 %, qui se charge de 1,5 µg de protéines par voie. Exécutez le gel à 200 V pendant 30 min. tache et déterminer le degré de réticulation de dimère de preuves d’une bande qui s’exécute à deux fois la taille du monomère dénaturé.
Nota : Un titrage de glutaraldéhyde et le décours temporel peuvent être effectuées tout d’abord pour trouver les meilleures conditions pour un transporteur homomères.
Representative Results
Les gels typiques pour les fractions éluées d’effectuer une chromatographie d’affinité nickel montrent les trois protéines partiellement purifiés (Figure 1A). À droite de l’échelle est le lysat, qui, dans chaque cas ne montre pas une importante bande correspondant au transporteur de borate qui est typique pour les protéines qui surexpriment pas bien. La voie de lavage 80 mM montre une perte minimale de 10-His-tag protéine malgré la concentration relativement élevée d’imidazole. Bandes correspondant pour les transporteurs de borate sont évidentes dans les fractions éluées et fractions considéré comme contenant la plus grande partie de la protéine éluée sont concentrées avant d’injecter sur la colonne de filtration sur gel S200. À ce stade, les protéines sont insuffisamment purifiées pour de nombreuses applications en aval, comme il est indiqué par des bandes supplémentaires dans l’échantillon concentré avant de l’injecter dans la colonne S200 (Figure 1B). Cependant, l’injection de l’échantillon sur la colonne d’exclusion de taille révèle des fractions éluées de haute pureté (Figure 1B-C). Chromatogrammes et leurs gels correspondants à chacun des transporteurs borate sont présentés. Malgré la pureté moyenne des échantillons à élution de chromatographie d’affinité, la protéine est extrêmement pure à élution de la colonne de filtration sur gel. Critique, les chromatogrammes révèlent chaque protéine de migrer avant tout comme un pic unique monodispersés avec peu de protéines conservée dans le volume mort. Une protéine stable et pliée donne généralement un monodisperses et pointe symétrique, tandis que les protéines instables, mal repliées ou agrégées donnera généralement plusieurs pics asymétriques ou un pic important dans le volume mort. Il est courant d’obtenir un rendement final d’environ 2 mg purifiée de protéines par litre de culture de levures pour ScBor1 et environ 1 mg chaque purifiée AtBor1 et OsBor3 par la culture de L. Ces chiffres représentent la quantité de protéine purifiée à partir d’une aliquote de 4 à 5 g de membranes, qui provient d’une moitié de notre préparation de cellules originales.
L’expérience de réticulation montre que les transporteurs homomères purifié peuvent avoir leur Assemblée dans la solution évaluée facilement (Figure 2). Les échantillons contenant un pré-traitement de la SDD vise à montrer que la réticulation repose sur un état replié dans une solution et que la réticulation donc ne se produit pas lorsque multimerization est perturbée par un détergent sévère. Les résultats affichés distinguent que l’un des trois transporteurs borate, ScBor1, n'est pas mélanges quand purifiés dans DDM dans ces conditions, alors que les deux autres, AtBor1 et OsBor3, réticulation et montrent une dimérisation. Il est possible de voir que pas toutes les protéines peuvent réticuler. Dans cet exemple, des traces de monomère de OsBor3 sont visibles, tandis que AtBor1 Cross-Links jusqu'à la fin. Le degré de réticulation dépendra du nombre de résidus de lysine à proximité l’un de l’autre, et il est possible que les autres réactifs de réticulation peuvent réticuler efficacement les protéines membranaires différents.
Figure 1 . Purification de chromatographie exclusion affinité et de taille pour les trois transporteurs de borate de nickel. Chaque panneau vertical (A), (B), et (C) contient des données pour ScBor1, AtBor1 et OsBor3. (A) colonne d’affinité de Nickel. M est une échelle de poids moléculaire marqueurs avec des poids en kDa spécifié vers la gauche. L le lysat brut, et W est le lavage d’imidazole de 80 mM. Toutes les autres voies numérotées correspondent aux fractions de 1 mL éluées avec imidazole de 300 mM. Les barres au-dessus de fractions indiquent qui ont été sélectionnés pour être combinés et concentrés pour les injections dans la colonne. P (B) indique le concentré de protéine avant d’injecter dans la colonne S200. Fractions éluées de SEC sont à droite, avec entre parenthèses correspondant à gel ruelles avec leurs fractions chromatogramme en (C). Le volume de vide est juste après 8 mL. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Réticulation test évalue les transporteurs purifiées pour l’assemblage de multimères. Une échelle avec des poids moléculaires est indiquée sur la gauche. Avant tout autres voies est montré que la protéine est présente et si l’échantillon a avait ajouté de glutaraldéhyde ou un prétraitement du SDS avant l’ajout de glutaraldéhyde. Les flèches indiquent les positions des monomères et les dimères pour AtBor1 et OsBor3. ScBor1 est une petite protéine que AtBor1 et OsBor3 et s’exécute comme prévu. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Ici, nous avons partagé des protocoles détaillés qui donnent lieu à la purification à l’homogénéité des trois transporteurs de borate eucaryotes distincts. Les protocoles présentés ici sont tirées d’autres protocoles pour l’expression des protéines intégrales de membrane dans S. cerevisiae1,14et notre résultat d’optimisations en pureté améliorée et amélioration des rendements. Les paramètres optimisés ici comprennent des volumes de croissance de culture cellulaire et fois, perle-battant lyse, composition du tampon lors de la lyse cellulaire et purification de protéine, quantité de détergent utilisée par gramme membrane, les ions métalliques identifier dans la purification d’affinité, volume de la colonne d’affinité et la mise en œuvre d’un réticulation test afin d’évaluer les aptitudes homologue et détergent en évaluant l’état de multimères de transporteurs oligomères. Les protocoles sont réussis pour plusieurs homologues SLC4 des espèces végétales et fongiques. Une limitation de toutes les stratégies pour la purification de protéines intégrales de membrane, c’est qu’il n’existe aucune méthode de purification de protéine membrane universelle qui est garanti pour fonctionner. Il est possible que nos protocoles sont plus susceptibles de réussir aux protéines plus près dans l’identité de séquence et de la structure à SLC4 transporteurs et donc les membres de la famille SLC4, SLC23 et SLC26 peuvent être prometteurs cible15. De même, le plus évolutif éloignée par les transporteurs de borate un transporteur membranaire peut être, plus il est probable le protocole devra être différent, comme en faisant varier le système d’expression, détergent ou autres paramètres clés4.
Le protocole profite de la balise d’affinité plus couramment utilisé dans la purification de la protéine, l’His-tag. Malgré la présence d’impuretés dans les fractions éluées initiales, les combinaisons d’affinité de nickel, un lavage et purification SEC ultérieure entraîne la protéine hautement purifiée. Un 10-His-tag, permettant l’imidazole plus rigoureuse se lave et donc peut supprimer les protéines de liaison d’arrière-plan plus que peut être retiré en lavages permises par 8-His - ou 6-son-tags. Nos sélections pour les fractions pures err sur le camp conservateur des fractions plus gel très pure, qui correspondent aux fractions pointe SEC. Rendements de la protéine finale peuvent être augmentées par mise en commun et en se concentrant plus de fractions, mais avec le compromis de protéine pure un peu moins. Les méthodes présentées ici permis à la purification de AtBor1 dans des quantités qui a conduit à la détermination de son crystal structure7, avec des différences de purification consistant en coupant le son-tag et d’échanger le transporteur dans un autre détergent pour améliorer cristal diffraction7.
Notre protocole soulève des considérations importantes pour la sélection des homologues et le détergent utilisé pour solubiliser et les purifier. DDM est un premier choix commun pour le détergent car il est relativement doux, souvent avec succès à la solubilisation et a été utilisé dans les études structurales et fonctionnelles d’une grande variété de protéines membranaires. Pour déterminer si un détergent est un choix pauvre pour une membrane, une méthode commune d’évaluation est de déterminer si la protéine donne un pic unique monodispersés sur un chromatogramme SEC, plutôt qu’un pic important dans le volume vide ou une gamme de polydispersité pics, qui indiquer les protéines mal repliées ou instables. Un examen plus subtil est déclenché par notre purification de ScBor1. Il purifie en grandes quantités et semble favorable et monodispersés sur un chromatogramme SEC, ce qui suggère que ça pourrait être une cible attractive pour les études structurales. Cependant, notre essai réticulation révèle que c’est un monomère lorsque purifiés. Alors qu’il est possible que ScBor1 pourrait il existe nativement comme monomère dans la cellule, les études indiquent que les transporteurs SLC4 et leurs homologues sont susceptibles d’être des dimères7,8,9,10. Notre développement du dosage réticulation est survenu après la cristallisation et la structure du AtBor1 de problèmes. Cependant, nous avions pu évaluer ScBor1 par rapport AtBor1 avec le test de réticulation, efforts précieux de temps et de la recherche pourraient ont été redirigés vers la poursuite de AtBor1 au lieu de ScBor1, dont le dernier en fin de compte n’a pas réussi à expériences de cristallisation et de diffraction. Ce test peut ainsi aider les chercheurs à distinguer entre homologues ou détergents à utiliser lorsque l'on poursuit des études structurales afin de donner la priorité à des conditions où la protéine maintient sa conformation native présumée. En outre, le test peut être utilisé pour sonder les acides aminés sont essentiels pour multimerization, afin de trouver des substitutions d’acides aminés qui déstabilisent l’interface multimerization et à obliger les monomères. Une telle approche a été utilisée pour sonder la signification fonctionnelle de homomères Assemblée en membrane transporteurs16,17,18.
Un avantage général de notre méthode est que la levure a démontré pour permettre l’expression des protéines de membrane exigeant beaucoup de fonction diverse1. De plus, son faible coût et croissance fois promouvoir son accessibilité pour les nombreux efforts de recherche qui peut être moins en mesure d’utiliser des stratégies d’expression nécessitant des vitroplants ou milieux de croissance coûteuse. Les procédures présentées ici sont relativement peu coûteux et peuvent être effectuées en une semaine, qui met en évidence la faisabilité de l’approche. Mise en œuvre de ces protocoles peut aider à activer les études structurales et fonctionnelles des autres protéines membranaires difficiles.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par des fonds de démarrage au Davidson College.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES) | Acros | 172591000 | |
| Äkta Pure 25 L FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
| Amicon Ultra 15 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC905024 | for concentrating nickel column fractions |
| Amicon Ultra 4 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC805024 | for concentrating S200 fractions |
| Bacto Peptone | BD Diagnostics | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD Diagnostics | 288620 | |
| Glass Erlenmeyer flask, 2L | Sigma-Aldrich | CLS44442L | |
| Benchtop centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Bottle top filter | Nalgene | 595-4520 | the membrane is removed and used to filter glass beads |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Complete supplement mixture without histidine | Sunrise Science | 1006-100 | |
| D-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
| Ethanol, 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
| Gel tank SDS-PAGE system | Bio-Rad | 1658004 | |
| Glass bead-beating cell disruptor | BioSpec | 1107900 | |
| Glass beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105 | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | sent as an 8% solution under nitrogen |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| HiTrap IMAC FF column, 1 mL | GE Healthcare | 17-0921-02 | charged with nickel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imidazole | Acros | 12202 | |
| Instant Blue gel stain | Expedeon | ISB1L | |
| JA-10 rotor | Beckman | 369687 | |
| JA-14 rotor | Beckman | 339247 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Thermo Scientific | 3451 | |
| Microcentrifuge, refrigerated | Fisher | 13-100-676 | |
| Mini-Protean Tris-glycine gels, 4-20% | Bio-Rad | 456-1096 | |
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | F155005 | used for loading lysate onto affinity column |
| n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM) | Inalco | 1758-1350 | |
| Nickel(II) Sulfate Hexahydrate | Sigma-Aldrich | 227676 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick | C24 | |
| p423 GAL1 plasmid with borate transporter insert | available from authors | ||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Acros | 215740050 | |
| Polycarbonate ultracentrifuge tubes | Beckman | 355618 | |
| Polypropylene bottles, 250mL | Beckman | 356011 | |
| Polypropylene bottles, 500mL | Beckman | 355607 | |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | Bio-Rad | 1610375 | |
| S. cerevisiae expression strain DSY-5 | available from authors | ||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Spin column with 0.2 µm filter, 0.5mL | Millipore | UFC30GV0S | for filtering protein before injecting onto S200 column |
| Sterile Falcon tubes, 15mL | Lab Depot | TLD431696 | |
| Sterile Falcon tubes, 50mL | Lab Depot | TLD431698 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | used for SEC purification |
| Syringe filter, 5µm | Pall | 4650 | for filtering lysate before loading affinity column |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman | 337922 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-70M | |
| YNB+Nitrogen without amino acids | Sunrise Science | 1501-500 |
References
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