Summary
Здесь мы представляем протокол выразить, солюбилизировать последнего и очистить несколько эукариотических Борат транспортеры с гомологичностью к семье транспортер SLC4 использованием дрожжей. Мы также обсудим химической сшивки пробирного оценить белки очищенные homomeric для multimeric Ассамблеи. Эти протоколы могут быть адаптированы для других сложных мембранных белков.
Abstract
Экстракцию перевозчик 4 (SLC4) семейство белков называется бикарбонат перевозчиков и включает архетипической белка анион обменника 1 (AE1, также известный как Группа 3), наиболее обильные мембранные белки в красных кровяных клетках. Семья SLC4 гомологичных с Борат перевозчиков, которые характеризовались в растения и грибы. Она остается значительный технический вызов Экспресс и очищают мембранных белков транспорт до однородности в количествах, подходит для структурных или функциональных исследований. Здесь мы описываем подробные процедуры для гиперэкспрессия Борат транспортеров в Saccharomyces cerevisiae, изоляции дрожжей мембран, солюбилизация белка моющего средства, и очистка Борат транспортер гомолог от S. cerevisiae, Arabidopsis thalianaи Oryza sativa. Мы также подробно глютаральдегид, cross-linking эксперимент для анализа multimerization homomeric транспортеров. Наши обобщенной процедуры могут применяться для всех трех белков и были оптимизированы для эффективности. Многие из стратегий, разработанных здесь могут быть использованы для изучения других сложных мембранных белков.
Introduction
Трудности в получении достаточного количества очищенный мембранный белок остается наиболее узким местом в деле достижения структурных и функциональных исследований рецепторов, ионных каналов и перевозчиков. Многие протоколы существуют для умеренно высокой пропускной способности трубопроводов для экрана и найти кандидата мембранных белков, которые выражают достаточно хорошо, чтобы включить последующие в vitro исследования1,2,3,4 . Как правило белки отмеченных N - или C-терминал Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), и уровни выражения контролируются-гель флуоресценции или флуоресцентным обнаружением размер исключения хроматографии (FSEC)5. Такие подходы позволяют классифицирование мембранных белков кандидатов в высокой выражая белков, средней или низкой выражая белков, или белков, которые плохо или вовсе не. Этот подход хорошо работает, когда экспериментальный дизайн является для расследования большого числа генов кандидата с целью выбора, какой протеин выражает лучший. Однако в некоторых случаях, экспериментальный подход основывается на изучении конкретного мембранный белок, который может быть сложной задачей, когда уровни выражения этого белка находятся в диапазоне от средней или низкой. Кроме того иногда в таких случаях уровни выражения может быть только минимально увеличена путем изменения конструкции через усечения, thermostabilizing мутации или оптимизации кодон. Это, таким образом, иногда необходимо оптимизировать мембранных белков выражение и очистки протоколы для мембранных белков, которые выражают только умеренно хорошо.
SLC4 семейство транспортеров включает бикарбонат транспортер анион обменника 1 (также известный как Группа 3), наиболее обильные мембранный белок в6красных кровяных клеток и ключевым фактором клеточного дыхания. Семья SLC4 гомологичных с Борат перевозчиков, которые имеют решающее значение в растениях и показали проявить аналогичную структуру анион обменника 1, а также натрия в сочетании SLC4 транспортеры7,8,9 ,10. Здесь мы приводим оптимизированный белка выражение и очистки протоколы, используя S. cerevisiae очистить три различных Борат транспортеров в дрожжей и растений. Мы подчеркиваем в деталях ключевые шаги, которые мы приняли для оптимизации урожайности и эффективности очищения до однородности. Кроме того мы приводим химической сшивки пробирного, используя глютаральдегид для мониторинга multimeric Ассамблея этих перевозчиков в контексте очищенный белок-моющее средство липидного комплекса. Сшивки эксперимент может помочь оценить гомолога и моющего средства пригодности путем оценки состояния multimeric олигомерных транспортеров после очистки.
Этот протокол предполагает, что требуемой транспортер был клонирован в 2 µ производным плазмиды под индуцибельной контролем промотора GAL1 для выражения в S. cerevisiae. Для выполнения этих процедур, ДНК используется кодирование полнометражного одичал тип Борат транспортеры Saccharomyces cerevisiae Bor1 (ScBor1)11, Bor1 Arabidopsis thaliana (AtBor1)12и Bor3 Oryza sativa (OsBor3)13 . C-terminus в каждой конструкции добавляется с 10 его тегом и тромбина расщепления сайт вставляется между транспортера и 10-его тег, чтобы включить его удаления, если желаемого. Протокол будет также предположить, что плазмида уже был преобразован в DSY-5 выражение штамма S. cerevisiae на полный дополнительный избирательный СМИ (CSM) не хватает гистидина.
Protocol
1. подготовка средств массовой информации и важных буферов
- Подготовка 500 мл 40% галактозы, добавив 200 г галактозы и деионизированной воды до общего объема 500 мл. Используйте плита или Микроволновая печь для увеличения скорости галактозы, попадая в раствор. Стерильные фильтр с вакуумной фильтрации аппарат, состоящий из верхней фильтр 0.2 мкм, придает стерильной стеклянной бутылке.
Примечание: Все решения СМИ готовятся с использованием деионизированной водой. - Подготовка 500 мл 40% раствор глюкозы, добавив 200 г глюкозы и воды до общего объема 500 мл. Автоклав для стерилизации.
- В каждой из четырех колбы 2 Л добавьте 0,4 г полное дополнение смеси без гистидина (CSM-его), 3.35 г дрожжей азота с сульфата аммония (YNB + азота) и 475 мл воды. Автоклав. Добавьте 25 мл 40% глюкозы для достижения окончательного глюкозы 2%.
- Добавить в стеклянной бутылке, 50 г Пептон и 25 г дрожжей экстракт и воды до 375 мл. Автоклав. Добавьте 125 мл 40% галактозы дают 5 x дрожжи Пептон (YP) раствор, содержащий 10% галактозы.
- Добавить, чтобы флакон 250 мл, 0,04 г CSM-его, 0,335 g YNB + азота и воды до 47.5 мл. Автоклав. Добавьте 2.5 мл 40% раствор глюкозы получить 50 мл CSM-его YNB + 2% раствор глюкозы.
- Подготовка 1 Л 1 М трис pH 7.0 путем смешивания 121.14 g Tris база с 800 мл воды. Добавление концентрированной соляной кислоты до pH 7.0. Добавьте воду в окончательный объем 1 Л и пройти через фильтр 0.2 мкм.
- Подготовка 500 мл 0,5 М Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) рН 8.0 путем смешивания 73.06 g ЭДТА с 400 мл воды. Добавьте гидроксида натрия гранулы, до тех пор, пока ЭДТА не распущена, и достигает рН 8,0. Добавьте воду в окончательный объем 500 мл и пройти через фильтр 0.2 мкм.
- Подготовка 100 мл 100 мм phenylmethanesulfonyl фтора (PMSF) путем смешивания 1,74 g PMSF с 200 доказательство этанола. Хранить при температуре от-20 ° C.
- Подготовьте 225 мл 2 x шарик мыть буфера, состоящий из 50 мм трис pH 7.0, 1,4 М NaCl, 20% глицерина и 1 мм ЭДТА рН 8.0.
- Подготовка 100 мл размер буфера исключения хроматографии (S200 буфера), состоящий из 20 мм 4-Morpholinoethanesulfonic кислота гидрат (MES) pH 6.5, 100 мм NaCl, 2% глицерина и 0,03% н додецил бета D-Maltopyranoside (DDM).
- Подготовка 100 мл буфера ресуспендирования мембрана, состоящая из 50 мм трис pH 7.0, 500 мм NaCl и 10% глицерина.
- Подготовка 10 мл 3 x SDS-PAGE загрузки краситель, смешивая 3 мл 20% натрия Додециловый сульфат (SDS), 3 мл глицерина, 2,4 мл 1 М трис рН 6,8, 0,03 g бромфеноловый синий и 1,6 мл 2-меркаптоэтанол.
2. гиперэкспрессия Борат транспортер в S. cerevisiae
- Прививать три преобразованные дрожжи колоний в 50 мл CSM-его + YNB + 2% глюкозы СМИ и трясти ночлег в 190 об/мин при 30 ° C.
- Следующий день использовать спектрофотометр для определения оптической плотности на длине волны 600 Нм (600ОД) и прививать ОД600 0,01 четыре 2 L колбы, каждый из которых содержит 500 мл CSM-его YNB + 2% глюкозы СМИ.
- Погрозит 190 об/мин при 30 ° C за 30 h разрешить клетки, чтобы потреблять все глюкозы и расти до высокой плотности.
Примечание: Длительное время роста результатов в более крупных клеток дает, больше собранного мембраны урожайности, и дает в конечном итоге больше очищенный протеин. - Побудить выражение путем добавления 125 мл 5 x YP СМИ, дополнена галактозы 10% для окончательного индукции концентрации 2% галактозы. Погрозит 190 об/мин при 30 ° C для 16 h.
- Урожай клетки, спиннинг на 4000 x g 15 мин Ресуспензируйте клетки в 100 мл холодной воды.
Примечание: на данном этапе клетки могут быть заморожены при температуре-80 ° C на неопределенный срок, или prep может продолжаться в лизис клеток и мембран уборки. Мы обычно урожай 40-45 g клеток.
3. Сбор дрожжей мембран
- Добавьте в ячейку ресуспендирования 11,25 1 М трис рН 7.0, 0,45 мл 0,5 М ЭДТА до 2,25 мл 100 мм PMSF, последний, два из которых действуют как ингибиторы протеазы. Добавьте воду в окончательный объем 225 мл, что приводит в буфере ресуспендирования ячейки 50 Tris pH 7.0, 1 мм ЭДТА и 1 мм PMSF.
Примечание: Если с использованием замороженных клетки позволяют клеткам оттепель тщательно, около 1 ч при комнатной температуре, потому что если они частично заморожены, они будут лизису путем избиения шарик. - Добавьте ячейку ресуспендирования в жестяную баночку 450 мл для бисера избиение. Довершение оставшийся объем с холодной 0,5 мм бисер.
- Соберите шарик избиение камеры с ротором и погружать в ванну льда. Выполняют шесть импульсов 1 мин, разделенных 2 мин отдыха для предотвращения перегрева lysate.
- Соберите Аппарат вакуумной фильтрации, используя пластиковые одноразовые бутылки Топ фильтр пьяный в стеклянной бутылке. Удаление Фильтрующая мембрана, потому что остальные пластиковые устройство может захватить бисер позволяя lysate пройти. Отделите бисер от lysate, выливая содержимое камеры избиение шарик на Ассамблее при применении вакуум.
- Вымойте зале избиение шарик с 225 мл 2 x мыть буфер, содержащий 50 мм трис pH 7.0, 1 мм ЭДТА, 1 PMSF, 1.4 М NaCl и 20% глицерина. Вылейте содержимое камеры на бусы, чтобы вымыть их.
Примечание: Мыть дает конечный объем ~ 450 мл лизированы клеток и значительно увеличивает заготовленной мембраны дает. Окончательный концентрации 50 мм трис pH 7.0, 1 мм ЭДТА, 1 PMSF, 10% глицерина и 700 мм NaCl, и основная цель повышения концентрации соли помочь отделить периферийных мембранных белков. - Спин вниз ячейки lysate 15 мин на 15000 x g. Залейте супернатант в поликарбонатные бутыли и спина на 1 ч в 135000 x g в ультрацентрифуга собирать мембраны.
Примечание: Если не доступен ультрацентрифуги, мембраны могут быть собраны спиннинг для 3 h на 53000 x g, силой, что достижимо в полу модели центрифуги. - Отменить супернатант и весят бутылки с гранулами мембраны. Ресуспензируйте мембраны окатышей в приблизительно 35 мл мембраны ресуспендирования буфер, содержащий 50 мм трис pH 7.0, 500 мм NaCl и 10% глицерина и добавить в стакан douncer. Вес пустого пробирок для определения массы мембран собирают.
Примечание: В эффективную мембрану урожая, вес мембраны будет равен примерно 20% веса клеток используется для этого мембрана урожая. Этот протокол дает типичных клеток урожайности 40-45 g, и таким образом мы также ожидаем, что доходность 8-9 g мембран. - Dounce гомогенизировать мембраны и Алиготе в 50 мл конические трубы, которые теперь могут храниться бессрочно-80 ° c.
Примечание: Для этого эксперимента, обычно два аликвоты сделаны, чтобы разрешить два отдельных белка очищения выполняться из одного оригинального подготовка клетки.
4. солюбилизация и очистки белков
- В стакан добавьте перемешать бар и 150 мг n додецил β-D-Maltopyranoside (DDM) в g мембраны используются. Держите белка на льду или на 4 ° C на все времена.
Примечание: DDM гигроскопичен и следует хранить в стеклянной банке с осушителем при-20 ° C, когда не в пользе. Кроме того это типичный для использования между 4-5 g мембран в очищение получить достаточное количество чистого белка. - Оттепель мембраны и довести до окончательного объема 15 мл на g мембраны мембраны ресуспендирования буфера с 1 мм PMSF и 20 мм имидазола pH 8.0. Добавить стакан с DDM мембраны и размешать 1 ч при 4 ° C.
Примечание: Концентрация DDM будет 1% w/v, но для солюбилизация мембранных белков это более важно быть в курсе массы моющих средств, добавил на g мембраны. - Спина на 25 мин на 135 000 x g при 4 ° C для пеллет-солюбилизирован материал. Через шприц фильтр 5 мкм фильтр супернатант.
- Достижение равновесного уровня нагрузки, образец перистальтического насоса присвоено значение скорости потока 1 мл/мин на столбец сходства иммобилизованных никель 1 мл в 20 мм трис рН 7,0, 500 мм NaCl, 10% глицерина, 20 мм имидазола рН 8,0 и 0,05% DDM.
Примечание: Нижняя выражая белков, улучшение чистоты и урожаи были замечены с помощью 1 мл вместо 5 мл столбец и никель вместо ионов кобальта для аффинной хроматографии. - Промойте колонку с 10 томов столбец мыть буфера, содержащего 20 мм трис рН 7,0, 500 мм NaCl, 10% глицерина, 80 мм имидазола рН 8,0 и 0,05% DDM.
Примечание: Концентрация имидазола, который может использоваться во время мойки для 10-его тегами белка выше, чем обычно ценится и приводит к улучшению чистоты. - Элюировать белка в буфер, содержащий 20 мм трис рН 7,0, 200 мм NaCl, 10% глицерина, 300 мм имидазола рН 8,0 и 0,05% DDM. Собирать элюата в десяти 1 мл фракций и на геле трис глицин SDS-PAGE 4-20% вместе с растворимых lysate и мыть фракциях.
- Бассейн пик фракций, обычно около 5-6 мл и сосредоточиться на 500 мкл или меньше объем в 50 kDa отсечки концентратор в настольная центрифуга, в холодильнике при температуре 4 ° C.
Примечание: 500 мкл это типичный максимальный объем, вводят в размер исключения хроматографии (SEC) столбцов. На этом этапе белка может храниться бессрочно-80 ° c или продолжить на SEC. - Через фильтр столбцов спин 0.2 мкм фильтр белка и вставляют на размер исключения столбца (например, Superdex-200) достижение равновесного уровня в буфере S200: 20 мм Mes рН 6,5, 100 мм NaCl, 2% глицерина и 0,03% DDM.
Примечание: Для последующих глютаральдегид, cross-linking пробирного, буферизации агент не должен содержать Первичные амины. СЕК-это возможность обменяться буферов, при необходимости, как это сделано здесь при обмене трис для МЧС. - Запуск Пик фракций на трис глицин SDS-PAGE 4-20% гель. Пятно гель, собирать чисто пик фракций и сосредоточиться в 50 концентратор кДа отсечки при 4 ° C.
- Определить концентрацию протеина путем измерения поглощение на длине волны 280 Нм и хранить бессрочно в-80 ° C.
5. глютаральдегид, Cross-linking Assay
- Подготовка 10 мкл реакции путем смешивания 3 мкл белка 0.5 мг/мл в буфере S200, 5 мкл буфера S200, 1 мкл воды или 20% лаурилсульфат натрия (SDS), следуют 1 мкл глютаральдегид 1,5%.
Примечание: Это даст 1 x реакции белков и 0,15% глютаральдегид 0,15 мг/мл. Образцы, содержащие Предварительная обработка SDS важные негативный контроль и должен быть смешиваются и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут перед добавлением глютаральдегид. - Инкубируйте реакции на 30 минут при комнатной температуре. Прекратить реакции, добавив 5мкл 3 x загрузки краситель, который содержит избыток трис-буфер, который утоляет глютаральдегид геля SDS-PAGE.
- Загрузите все 15 мкл на гель трис глицин SDS-PAGE 4-20%, который будет загружать 1,5 мкг белка на пер. Побегите гель на 200 V для 30 min. пятно и определить степень димер cross-linking доказательств Группа, которая работает в два раза размер денатурированного мономера.
Примечание: Глутаровый титрования и времени курс может выполняться в первую очередь найти лучшие условия для homomeric транспортер.
Representative Results
Типичный гели для eluted дроби от выполнения хромотографию сродства никеля показывают все три белки частично очищенный (рис. 1А). Справа от лестницы является лизатных, который в каждом конкретном случае не показывает значительные группы, соответствующий Борат транспортер, что характерно для белков, которые не overexpress хорошо. 80 мм мыть Лейн показывает минимальные потери 10 его меткой белка, несмотря на относительно высокие имидазола концентрации. Полосы, соответствующие Борат транспортеры очевидны в eluted фракций, и фракции, считается, что содержат основную часть eluted белка сосредоточены перед инъекцией на столбце фильтрации геля S200. На данном этапе белки очищаются недостаточно для многих приложений, вниз по течению, как указано на дополнительных полос в образце концентрированной перед инъекцией на столбце S200 (рис. 1Б). Однако инъекционных образца на столбце исключения размер показывает eluted фракций высокой чистоты (Рисунок 1-B-C). Представлены хроматограммы и их соответствующие гели для каждого Борат транспортеров. Несмотря на умеренный чистоты образцов после элюции от аффинной хроматографии протеин высоки чисто по элюирующие из геля фильтрации столбца. Критически хроматограммы раскрыть каждый протеин мигрировать прежде всего как единый монодисперсных пик с мало белка, сохранена в том недействительным. Стабильной и сложенный протеин обычно дает монодисперсных и симметричные пик, в то время как нестабильная, смятых или агрегированных белка обычно даст несколько асимметричный пики или большой пик в том недействительным. Это типично для получения окончательного доходность около 2 мг очищенного белка на Л культуры дрожжей для ScBor1 и приблизительно 1 мг каждый очищенный AtBor1 и OsBor3 на L культуры. Эти цифры являются количество белка, очищенного от одной Алиготе 4-5 g мембраны, которая исходит от одной половины нашего оригинального препарата ячейки.
Сшивки эксперимент показывает, что очищенный homomeric транспортеры может иметь их сборку в решение легко оценивать (рис. 2). Образцы, содержащие Предварительная обработка SDS призвана показать, что cross-linking зависит сложенном состоянии в растворе и что cross-linking поэтому не происходит, когда multimerization прерывается вследствие суровых моющих средств. Результаты показали различать что один из трех перевозчиков Борат, ScBor1, является не димерной когда очищается в DDM в этих условиях, в то время как два других, AtBor1 и OsBor3, перекрестные ссылки и показать димеризации. Это можно увидеть, что не все белка может перекрестные ссылки. В этом примере следовые количества OsBor3 мономера видны, в то время как AtBor1 cross-links до завершения. Степени сшивки будет зависеть количество остатков лизина в близости друг к другу, и вполне возможно, что другие сшивки реагенты могут эффективно перекрестные ссылки различных мембранных белков.
Рисунок 1 . Никелевые очистки хроматографии исключения сродства и размер для трех перевозчиков Борат. Каждая вертикальная панель (A), (B) и (C) содержатся данные для ScBor1, AtBor1 и OsBor3. (A) колонке сродства никеля. M является трапом молекулярного веса маркеров с весами в кДа, указанной слева. L lysate сырой, и W мыть имидазола 80 мм. Все пронумерованные полосы соответствуют дроби 1 мл этого eluted с 300 мм имидазола. Полоски выше доли показывают, которые были отобраны следует объединить и концентрированный для инъекций на столбец. (B) P указывает концентрированных белков перед инъекцией на столбце S200. Eluted SEC фракций находятся справа, с скобки используются для сопоставления гель полосы с их Хроматограмма фракции в (C). Void объем-сразу после 8 мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Сшивки пробирного оценивает очищенный транспортеры для Ассамблеи multimeric. Лестница с молекулярной массой указывается слева. Прежде всего других полос показано какой белок присутствует и имеют ли образец глютаральдегид добавлены или предварительная обработка SDS до глютаральдегид сложения. Стрелки указывают позиции мономера и димера для AtBor1 и OsBor3. ScBor1 меньше протеина, чем AtBor1 и OsBor3 и работает как ожидалось. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Здесь у нас есть общие подробные протоколы, которые приводят к очистки до однородности три отдельных эукариотических Борат транспортеров. Здесь представлены протоколы являются производными от других протоколов для выражения неотъемлемой мембранных белков в S. cerevisiae1,14, и наш результат оптимизации в улучшение чистоты и повышения урожайности. Параметры оптимизации здесь включают объемы роста культуры клеток и раз, шарик избиение лизис процедуры, состав буфера во время лизис клеток и очищение протеина, количество моющего средства, используемые на грамм мембраны, ион металла в очищение сродства, объем в колонке сродства и осуществление сшивки пробирного оценки пригодности гомолога и моющих средств, оценки состояния multimeric олигомерных транспортеров. Протоколы для нескольких гомолог SLC4 от грибковых видов растений и успешным. Ограничение всех стратегий для очистки неотъемлемой мембранных белков является, что существует метод очистки белков, не универсальная мембрана гарантированно работать. Вполне возможно, что наши протоколы являются более вероятно, чтобы быть успешным для белков ближе в идентичности последовательность и структура SLC4 перевозчиков, и таким образом членов семей SLC4, SLC23 и SLC26 может быть перспективным цели15. Аналогичным образом более эволюционно далеких от Борат транспортеры мембраны транспортер может быть, тем более вероятно протокола должны быть разные, такие как изменяя выражение системы, моющего средства или другие ключевые параметры4.
Протокол использует наиболее часто используемых близость тегов в очищение протеина, его тег. Несмотря на наличие примесей в первоначальных eluted фракций комбинации сродства никеля, обширные стирки и последующей очистки сек приводит к высоко очищенный протеин. 10-его тег позволяет более строгие имидазола моет и таким образом можно удалить более белки, связывающие фон не может быть удален в моет, разрешается по 8-его - или 6-его тегов. Наш выбор для чистого фракций ошибаться на консервативной стороне наиболее высоко чистый гель фракций, которые соответствуют пик фракций сек. Окончательный белка урожай может быть увеличена путем объединения и концентрации более фракций, хотя и с компромисс немного менее чистого белка. Представленные здесь методы позволили очистки AtBor1 в количествах, которые привели к определения его структуры кристалл7, с очищения различия, состоящий из отрезав его тегов и обмена транспортера в различных моющее средство для улучшения кристалл дифракции7.
Наш протокол поднимает важные соображения для отбора гомолог и моющих средств, используемых для солюбилизировать последнего и очистить их. DDM является общим первым выбором для моющего средства, потому что это относительно мягкая, часто успешно растворяющие и был использован в структурных и функциональных исследований широкого спектра мембранных белков. В определении, является ли моющих средств плохой выбор для мембраны, распространенным методом оценки является того, дает ли белок одного монодисперсных пик на SEC Хроматограмма, а не большой пик в том недействительным или диапазон полидисперсных пиков, который Укажите смятых или нестабильной белка. Более тонкие рассмотрение поднятых нашими очистки ScBor1. Он очищает в больших количествах и выглядит благоприятным и монодисперсных на SEC Хроматограмма, который предполагает, что это может быть привлекательным объектом для структурных исследований. Однако наша сшивки пробирного показывает, что мономера, когда очищается. Хотя вполне возможно, что ScBor1 изначально может существовать как мономера в клетке, исследования показывают, что SLC4 перевозчиками и их гомолог правоподобны быть димеры7,8,9,10. Наше развитие сшивки assay произошло после кристаллизации и проблем в структуре AtBor1. Однако, мы смогли оценить ScBor1 по сравнению с AtBor1 с cross-linking assay, ценное время и исследовательские усилия могут переориентировали стремлению к AtBor1 вместо ScBor1, последний из которых в конечном счете не был успешным в кристаллизация и дифракции эксперименты. Этот assay может помочь таким образом исследователи различие между гомолог или моющих средств для использования при проведении структурных исследований для определения приоритетности условий, в которых белка сохраняет ее подозреваемых родной конформации. Кроме того assay может использоваться для зонда, какие аминокислоты имеют решающее значение для multimerization, для того чтобы найти аминокислотных замен, которые дестабилизировать multimerization интерфейс и привести обязать мономеров. Такой подход использовался для зонда функциональное значение в мембраны транспортеры16,,1718homomeric Ассамблеи.
Общее преимущество нашего метода является, что дрожжи было показано, чтобы включить выражение многих сложных мембранных белков различных функции1. Кроме того его низкой стоимости и роста раз содействовать ее доступность для многих исследований, которые могут быть в меньшей степени способны использовать выражение стратегии, которые требуют культуры ткани или дорогих роста средств массовой информации. Процедуры, представленные здесь относительно недороги и могут быть выполнены в течение одной недели, которая подчеркивает целесообразность подхода. Осуществление этих протоколов может помочь включение структурных и функциональных исследований других сложных мембранных белков.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано запуска средства колледжа Дэвидсон.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES) | Acros | 172591000 | |
| Äkta Pure 25 L FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
| Amicon Ultra 15 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC905024 | for concentrating nickel column fractions |
| Amicon Ultra 4 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC805024 | for concentrating S200 fractions |
| Bacto Peptone | BD Diagnostics | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD Diagnostics | 288620 | |
| Glass Erlenmeyer flask, 2L | Sigma-Aldrich | CLS44442L | |
| Benchtop centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Bottle top filter | Nalgene | 595-4520 | the membrane is removed and used to filter glass beads |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Complete supplement mixture without histidine | Sunrise Science | 1006-100 | |
| D-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
| Ethanol, 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
| Gel tank SDS-PAGE system | Bio-Rad | 1658004 | |
| Glass bead-beating cell disruptor | BioSpec | 1107900 | |
| Glass beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105 | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | sent as an 8% solution under nitrogen |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| HiTrap IMAC FF column, 1 mL | GE Healthcare | 17-0921-02 | charged with nickel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imidazole | Acros | 12202 | |
| Instant Blue gel stain | Expedeon | ISB1L | |
| JA-10 rotor | Beckman | 369687 | |
| JA-14 rotor | Beckman | 339247 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Thermo Scientific | 3451 | |
| Microcentrifuge, refrigerated | Fisher | 13-100-676 | |
| Mini-Protean Tris-glycine gels, 4-20% | Bio-Rad | 456-1096 | |
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | F155005 | used for loading lysate onto affinity column |
| n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM) | Inalco | 1758-1350 | |
| Nickel(II) Sulfate Hexahydrate | Sigma-Aldrich | 227676 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick | C24 | |
| p423 GAL1 plasmid with borate transporter insert | available from authors | ||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Acros | 215740050 | |
| Polycarbonate ultracentrifuge tubes | Beckman | 355618 | |
| Polypropylene bottles, 250mL | Beckman | 356011 | |
| Polypropylene bottles, 500mL | Beckman | 355607 | |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | Bio-Rad | 1610375 | |
| S. cerevisiae expression strain DSY-5 | available from authors | ||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Spin column with 0.2 µm filter, 0.5mL | Millipore | UFC30GV0S | for filtering protein before injecting onto S200 column |
| Sterile Falcon tubes, 15mL | Lab Depot | TLD431696 | |
| Sterile Falcon tubes, 50mL | Lab Depot | TLD431698 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | used for SEC purification |
| Syringe filter, 5µm | Pall | 4650 | for filtering lysate before loading affinity column |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman | 337922 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-70M | |
| YNB+Nitrogen without amino acids | Sunrise Science | 1501-500 |
References
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Andréll, J., Tate, C. G. Overexpression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Molecular Membrane Biology. 30 (1), 52-63 (2013).
- Lyons, J. A., Shahsavar, A., Paulsen, P. A., Pedersen, B. P., Nissen, P. Expression strategies for structural studies of eukaryotic membrane proteins. Current Opinion in Structural Biology. 38, 137-144 (2016).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).
- Thurtle-Schmidt, B. H., Stroud, R. M. Structure of Bor1 supports an elevator transport mechanism for SLC4 anion exchangers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10542-10546 (2016).
- Coudray, N., et al. Structure of the SLC4 transporter Bor1p in an inward-facing conformation. Protein Science. 26 (1), 130-145 (2016).
- Arakawa, T., et al. Crystal structure of the anion exchanger domain of human erythrocyte band 3. Science. 350 (6261), 680-684 (2015).
- Huynh, K. W., et al. CryoEM structure of the human SLC4A4 sodium-coupled acid-base transporter NBCe1. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Zhao, R., Reithmeier, R. A. Expression and characterization of the anion transporter homologue YNL275w in Saccharomyces cerevisiae. American Journal of Physiology Cell Physiology. 281 (1), 33-45 (2001).
- Takano, J., et al. Arabidopsis boron transporter for xylem loading. Nature. 420, 337-340 (2002).
- Nakagawa, Y., et al. Cell-type specificity of the expression of Os BOR1, a rice efflux boron transporter gene, is regulated in response to boron availability for efficient boron uptake and xylem loading. Plant Cell. 19 (8), 2624-2635 (2007).
- Hays, F. A., Roe-Zurz, Z., Stroud, R. M. Overexpression and purification of integral membrane proteins in yeast. Methods in Enzymology. 470, Issue C (2010).
- Chang, Y. -N., Geertsma, E. R. The novel class of seven transmembrane segment inverted repeat carriers. Biological Chemistry. 398 (2), 165-174 (2017).
- Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Design, function and structure of a monomeric ClC transporter. Nature. 468 (7325), 844-847 (2010).
- Last, N. B., Miller, C. Functional Monomerization of a ClC-Type Fluoride Transporter. Journal of Molecular Biology. 427 (22), 3607-3612 (2015).
- Yu, X., et al. Dimeric structure of the uracil:proton symporter UraA provides mechanistic insights into the SLC4/23/26 transporters. Cell Research. 27 (8), 1020-1033 (2017).
