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Behavior

Uso de molinos de vuelo para medir la propensión de vuelo y el rendimiento de la raíz de maíz occidental, Diabrotica virgifera virgifera (LeConte)

Published: October 29, 2019 doi: 10.3791/59196
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Entomology, Iowa State University, 2Corn Insects & Crop Genetics Research Unit, USDA-ARS

Summary

Las fábricas de vuelo son herramientas importantes para comparar cómo la edad, el sexo, el estado de apareamiento, la temperatura u otros factores pueden influir en el comportamiento de vuelo de uninsecto. Aquí describimos los protocolos para atear y medir la propensión de vuelo y el rendimiento de la raíz de maíz occidental bajo diferentes tratamientos.

Abstract

La raíz de maíz occidental, Diabrotica virgifera virgifera (LeConte) (Coleóptera: Chrysomelidae), es una plaga de maíz económicamente importante en el norte de los Estados Unidos. Algunas poblaciones han desarrollado resistencia a las estrategias de manejo, incluyendo el maíz transgénico que produce toxinas insecticidas derivadas de la bacteria Bacillus thuringiensis (Bt). El conocimiento de la dispersión de gusanos de raíz de maíz occidental es de importancia crítica para los modelos de evolución de la resistencia, propagación y mitigación. El comportamiento de vuelo de un insecto, especialmente a larga distancia, es inherentemente difícil de observar y caracterizar. Las fábricas de vuelo proporcionan un medio para probar directamente los impactos y consecuencias fisiológicas y de desarrollo del vuelo en el laboratorio que no se pueden obtener en estudios de campo. En este estudio, se utilizaron molinos de vuelo para medir el momento de la actividad de vuelo, el número total de vuelos y la distancia, duración y velocidad de los vuelos realizados por gusanos de raíz hembra durante un período de prueba de 22 h. Dieciséis molinos de vuelo fueron alojados en una cámara ambiental con iluminación programable, temperatura y control de humedad. El molino de vuelo descrito es de un diseño típico, donde un brazo de vuelo es libre de girar alrededor de un pivote central. La rotación es causada por el vuelo de un insecto atado a un extremo del brazo de vuelo, y cada rotación es registrada por un sensor con una marca de tiempo. Los datos sin procesar se compilan mediante software, que posteriormente se procesan para proporcionar estadísticas resumidas de los parámetros de vuelo de interés. La tarea más difícil para cualquier estudio de molino de vuelo es la fijación de la atación al insecto con un adhesivo, y el método utilizado debe adaptarse a cada especie. El accesorio debe ser lo suficientemente fuerte como para sujetar al insecto en una orientación rígida y para evitar el desprendimiento durante el movimiento, sin interferir con el movimiento natural del ala durante el vuelo. El proceso de fijación requiere destreza, delicadeza y velocidad, haciendo imágenes de video del proceso para gusanos de raíz de valor.

Introduction

La raíz de maíz occidental, Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae), fue identificada como una plaga de maíz cultivado en 19091. Hoy en día, es la plaga más importante de maíz (Zea mays L.) en el Cinturón de Maíz de los Estados Unidos, con la alimentación larval de raíces de maíz causando la mayor parte de la pérdida de rendimiento asociada con esta plaga. Se estima que los costes anuales de gestión y pérdidas de producción de maíz debidos a la gusano de raíz de maíz superan los 1.000 millonesde dólares 2. El gusano de raíz de maíz occidental es altamente adaptable, y las poblaciones han desarrollado resistencia a múltiples estrategias de manejo, incluyendo insecticidas, rotación de cultivos y maíz Bt transgénico3. Determinar las dimensiones espaciales sobre qué tácticas deben aplicarse para mitigar el desarrollo local de resistencia, o un punto de acceso de resistencia, depende de una mejor comprensión de la dispersión4. Las medidas de mitigación no tendrán éxito si se limitan a una escala espacial demasiado pequeña alrededor de un punto de acceso de resistencia, porque los adultos resistentes se dispersarán más allá del área de mitigación5. Comprender el comportamiento de vuelo de la gusano de maíz occidental es importante para crear planes eficaces de manejo de la resistencia para esta plaga.

La dispersión por vuelo juega un papel importante en la historia de vida de la gusano de raíz de maíz occidental adulta y la ecología6,y el comportamiento de vuelo de esta plaga se puede estudiar en el laboratorio. Se pueden utilizar varios métodos para medir el comportamiento de vuelo en el laboratorio. Un actograph, que restringe el vuelo en un plano vertical, puede medir la cantidad de tiempo que un insecto está en vuelo. Los actográficos se han utilizado para comparar la duración del vuelo y los patrones de periodicidad de los machos y hembras de gusano de maíz occidental a diferentes edades, tamaños corporales, temperaturas, susceptibilidad a insecticidas y exposición a insecticidas7,8, 9. Los túneles de vuelo, que consisten en una cámara de seguimiento y un flujo de aire dirigido, son especialmente útiles para examinar el comportamiento de vuelo de los insectos al seguir un penacho de olor, como los componentes de feromonas candidatas10 o los volátiles de las plantas11. Los molinos de vuelo son quizás el método más común para los estudios de laboratorio del comportamiento de vuelo de insectos y pueden caracterizar varios aspectos de la propensión y el rendimiento del vuelo. En los estudios de la raíz de maíz occidental se han empleado molinos de vuelo de laboratorio para caracterizar la propensión a realizar vuelos cortos y sostenidos, así como el control hormonal del vuelo sostenido12,13.

Las fábricas de vuelo proporcionan una forma relativamente sencilla de estudiar el comportamiento de vuelo de los insectos en condiciones de laboratorio al permitir a los investigadores medir varios parámetros de vuelo, incluida la periodicidad, la velocidad, la distancia y la duración. Muchos de los molinos de vuelo utilizados hoy en día se derivan de las rotondas de Kennedy et al.14 y Krogh y Weis-Fogh15. Los molinos de vuelo pueden ser diferentes en forma y tamaño, pero el principio básico sigue siendo el mismo. Un insecto está atado y montado en un brazo horizontal radial que es libre de girar, con una fricción mínima, alrededor de un eje vertical. A medida que el insecto vuela hacia adelante, su camino se limita a dar vueltas en un plano horizontal, con la distancia recorrida por rotación dictada por la longitud del brazo. Un sensor se utiliza típicamente para detectar cada rotación del brazo causada por la actividad de vuelo del insecto. Los datos sin procesar incluyen rotaciones por unidad de tiempo y se produjo la hora del vuelo del día. Los datos se introducen en un ordenador para su grabación. Los datos de varias fábricas de vuelo a menudo se registran en paralelo, esencialmente simultáneamente, con bancos de 16 y 32 molinos de vuelo comunes. Los datos sin procesar son procesados por software personalizado para proporcionar valores para variables tales como la velocidad de vuelo, el número total de vuelos separados, la distancia y la duración volada, etc.

Cada especie de insecto es diferente cuando se trata del mejor método para amarre debido a variables morfológicas como el tamaño general, el tamaño y la forma del área objetivo para unir la atación, la suavidad y la flexibilidad del insecto, la necesidad y el método para anestesia, potencial para ensuciar las alas y/o la cabeza con adhesivo extraviado o desbordado, y muchos, muchos más detalles. En los casos de anclaje visualizado de un insecto plataspid16 y un escarabajo ambrosía17,las áreas objetivo respectivas para la fijación de ate son relativamente grandes y tolerantes a la colocación de adhesivo sin precisión porque la cabeza y las alas son algo bien separados del sitio de fijación. Esto no es para restar importancia a la dificultad de atear a estos insectos, lo que es exigente para cualquier especie. Pero el gusano de raíz de maíz occidental es un insecto particularmente difícil de atar: el pronoto es estrecho y corto, haciendo un apego muy preciso con una cantidad mínima de adhesivo (cera dental en este caso) necesario para evitar interferencias con la apertura del elytra para el vuelo y con la cabeza, donde el contacto con los ojos o antenas puede afectar el comportamiento. Al mismo tiempo, la atela debe estar firmemente unida para evitar el desalojamiento por este volador fuerte. La demostración de ateo de adultos gusanos de raíz es la oferta más importante en este artículo. Debe ser de ayuda para otros que trabajan con este o insectos similares donde el método visualizado aquí podría ser una opción útil.

Este artículo describe los métodos utilizados para atear y caracterizar eficazmente la actividad de vuelo de los adultos de gusano de raíz de maíz occidental que fueron criados en diferentes densidades larvales. Las fábricas de vuelo y el software utilizados en este estudio(Figura 1) se derivaron de diseños publicados en Internet por Jones et al.18 Técnicas de tethering fueron modificadas a partir de la descripción en Stebbing et al.9 Una matriz de 16 molinos de vuelo fue alojado en una cámara ambiental, diseñada para controlar la iluminación, la humedad y la temperatura(Figura 2). El uso de esta configuración o similar junto con las siguientes técnicas permite probar factores que pueden influir en la propensión de vuelo y el rendimiento de la gusano de raíz de maíz occidental, incluyendo la edad, el sexo, la temperatura, el fotoperiodo y muchos otros.

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Protocol

1. Tilo de raíz de maíz occidental trasero para pruebas de vuelo

NOTA: Si la edad del adulto debe ser controlada o conocida, los adultos primero deben ser recogidos en el campo seguido de la crianza de su descendencia a la edad adulta para las pruebas. Si la edad del escarabajo o un entorno de cría estandarizado no es preocupante, entonces es posible probar directamente a los adultos recogidos en el campo, y el protocolo puede comenzar con el paso 2.

  1. Recoger al menos 500 adultos de gusano de maíz occidental de un campo de maíz de interés para asegurarse de que se obtienen suficientes huevos para criar un número adecuado de adultos. Utilice un aspirador manual para recoger adultos del campo.
    NOTA: Se recomienda recoger adultos durante la abundancia máxima, alrededor de finales de julio en el Cinturón de Maíz de los Estados Unidos, para asegurar la recolección de ambos sexos. La mayoría de los adultos serán varones si se recogen antes, mientras que la mayoría serán hembras si se recogen más tarde.
  2. Coloque a los adultos machos y hembras recogidos en una jaula de malla que contenga oreja de maíz picada, tejido de hoja de maíz, un sólido de agar del 1,5% y un sustrato de oviposición. Una jaula de 18 x 18 x 18 cm (tamaño de malla de 44 x 32, 650 ám de apertura) puede contener hasta 500 adultos a la vez.
    1. Utilice el maíz cultivado en el campo como fuente de oreja de maíz, que se recogerá en la etapa R3, o leche del desarrollo del grano19. El núcleo R3 es amarillo en el exterior, mientras que el líquido interno es blanco lechoso debido a la acumulación de almidón. Las orejas de maíz se pueden congelar y almacenar hasta un año hasta que se necesiten. Para alimentar al gusano de raíz, retire la cáscara y corte el maíz en secciones transversales horizontales de unos 3 cm de espesor. El maíz picado es la dieta principal para los adultos y debe cambiarse dos veces por semana.
    2. Obtener hojas de plantas de maíz cultivadas en invernadero de cualquier edad. La cantidad de tejido de la hoja variará con el número de adultos en la jaula. Evite el uso de plantas de campo, ya que pueden introducir enfermedades.
    3. Para hacer el agar sólido, mezclar 15 g de polvo de agar con 1 L de agua DI. Calienta la mezcla hasta que hierva. Vierta el líquido en los platos de Petri (100 mm x 15 mm) mientras está caliente. Coloque una tapa en la placa Petri una vez que se enfríe y colóquela en un depósito en frío (6oC). El agar proporciona a los adultos una fuente de humedad y debe cambiarse dos veces por semana.
    4. Para preparar un sustrato de oviposición, coloque 40 g de suelo de campo tamizado (<180 m) en una placa Petri. Humedezca el suelo con agua desionizada. Asegúrese de que el suelo en la parte inferior de la placa Petri aparece húmedo. Anota la parte superior del suelo humedecido con una herramienta de aguja. Retire el sustrato de oviposición semanalmente y colóquelo en una incubadora a 25oC y 60% de humedad relativa durante al menos un mes.
  3. Después de incubar los huevos durante un mes, lave el contenido del sustrato de oviposición a través de un tamiz de 250 m hasta que se haya eliminado todo el suelo. Cuantifique los huevos colocando los huevos lavados en un cilindro graduado de 10 ml. Hay aproximadamente 10.000 huevos por 1 ml.
  4. Colocar los huevos cuantificados en un recipiente de 44 ml y cubrir con suelo de campo tamizado (<180 m). Los huevos de gusano de raíz de maíz occidental se someten a una diapausa obligatoria durante el invierno20. Para romper la diapausa, coloque los óvulos en el almacenamiento en frío (6oC) durante al menos 6 meses.
    NOTA: Los huevos pueden mantenerse en almacenamiento en frío durante más de 5 meses, pero la viabilidad del huevo disminuye con el tiempo. Después de 12 meses, puede haber poca o ninguna escotilla.
  5. Después de un mínimo de 5 meses, retire los huevos del almacenamiento en frío y colóquelos en una incubadora a 25oC y 60% de humedad relativa. Los neonatos eclosionan tan pronto como 16 días después de la extracción del almacenamiento en frío.
  6. Una vez que los huevos eclosionen, coloque tres granos germinados en la parte inferior de un recipiente de plástico de 44 ml con raíces expuestas (es decir, no cubiertas con tierra). Usa un cepillo de cerdas suaves para transferir 12 neonatos a la superficie de las raíces.
  7. Añadir 4,5 ml de agua DI a 40 ml de suelo tamizado (<600 m). Coloque el suelo humedecido sobre los granos germinados que han sido infestados con neonatos y cubra el recipiente con tejido de malla para evitar que las larvas escapen.
  8. El mismo día que se configura el recipiente de plástico de 44 ml con neonatos, preparar un recipiente de 473 ml con granos de maíz que no hayan germinado. Las larvas de gusano de raíz se transferirán a este recipiente más grande más adelante. El número de granos determina la densidad larval deseada por planta. Añadir 120 g de mezcla de suelo compuesta por un 50% de suelo de campo tamizado (<600 m) y un 50% de suelo humedecido con 20 ml de agua desionizada.
  9. Después de 7 días, transfiera todo el contenido del contenedor de 44 ml al contenedor de 473 ml. Las larvas serán segundas estrellas en el momento de la transferencia.
    NOTA: Esta transferencia a un recipiente más grande es necesaria para suministrar a las larvas suficiente masa radicular para alimentarse a través de la pupación.
  10. Observe la aparición de adultos típicamente alrededor de 26 días después de la eclosión del huevo. Los adultos son volantes activos al momento de la aparición y pueden escapar del contenedor de 473 ml cuando intentan recogerlos a mano. En su lugar, use un aspirador con un aspirador para recoger adultos.
  11. Segregar a los adultos por sexo y/o fecha si es necesario para pruebas comparativas. El sexo de la raíz de maíz occidental se puede determinar observando la morfología del basitarsi protorácico21. Los machos tienen basitarsi protorácico ancho, de forma cuadrada, mientras que los de las hembras son estrechos y de forma cónica.
    1. Coloque el escarabajo en un vial de plástico de poliestireno transparente de 45 ml y cúbralo con una tapa con 6 orificios pequeños (de 1 mm de diámetro).
    2. Anestesia el escarabajo. Coloque el extremo de un tubo unido a un regulador de tanque CO2 sobre los orificios de la tapa y permita que un flujo suave deCO2 entre en el tubo durante aproximadamente 10 a 15 s hasta que el adulto pierda su agarre en la pared del vial.
      NOTA: El insecto anestesiado permanecerá inmovilizado durante aproximadamente 1 min.
    3. Coloque el escarabajo anestesiado, lado ventral hacia arriba, en un fondo de plástico invertido. Coloque cuidadosamente la tapa no invertida de la placa petri sobre el escarabajo. Asegúrese de que el tarsi del escarabajo presione contra la tapa, permitiendo una fácil observación del basitarsi protorácico bajo un microscopio de disección.
  12. Si el experimento requiere que los escarabajos se apareen antes del vuelo, entonces use machos de al menos 5 días de edad para aparearse con las hembras recién emergidas.
    NOTA: El uso de machos mayores asegura que sean sexualmente maduros en su introducción a las hembras vírgenes. Las hembras son sexualmente maduras tras la aparición adulta, mientras que los machos requieren de 5 a 7 días de desarrollo post-emergencia para alcanzar la madurez sexual22,23.

2. Inicie el programa de software de la fresa de vuelo antes de las pruebas de vuelo

NOTA: Los archivos de programa de molino de vuelo (extensiones de archivo .vi que se ejecutan en una plataforma de software comercial, ver Tabla de materiales) y los detalles para su uso se proporcionan para su descarga a través de enlaces ("rutina de análisis de datos" e "Instrucciones de molino de vuelo circular", respectivamente) en la sección "Cableado y software de molino de vuelo" en el sitio web de Jones et al.18. Si los programas ya no funcionan en versiones más recientes o futuras de la plataforma de software, o si el usuario desea agregar nuevas capacidades, las rutinas proporcionadas por Jones et al. 18 pueden ser modificadas por el usuario según sea necesario.

  1. Abra el programa de software de molino de vuelo(Figura 3).
  2. Introduzca la información en la ficha Inicialización.
    1. Establezca la Hora de inicio y la Hora de finalización para la duración deseada de la prueba de vuelo.
      NOTA: Todos los adultos deben estar atados y montados en molinos de vuelo 30 minutos antes de la hora de inicio. Puede tomar una persona experimentada de 30 minutos a 45 minutos para atear y preparar 16 escarabajos para las pruebas de vuelo (ver Sección 3).
    2. Establezca el Umbral mínimo (mín.) en 0. Esto garantiza que cualquier detección del paso del brazo de vuelo se registrará, y es el valor predeterminado recomendado por Jones et al. 18.
    3. Establezca el Umbral máximo (min) en 1. Aquí, se utilizó 1 min. Este valor significa que debe transcurrir 1 min entre la detección del sensor del brazo de vuelo para "llamar" al final de un vuelo.
    4. Escriba un nombre para el archivo.
    5. Establezca Intervalo de registro de datos sin procesar (min) en 1. Este valor controla el intervalo durante el cual se compilarán los datos sin procesar para los informes de salida. Aquí, se establece en 1 min. Por lo tanto, la salida de las revoluciones, por ejemplo, se registrará por minuto.
      NOTA: El intervalo de tiempo real entre el escaneo electrónico de la actividad del sensor es muy corto, pero un intervalo de 1 minuto permite el registro a una escala lo suficientemente fina para la mayoría de los propósitos de investigación, mientras que restringe el número de líneas en la salida de la hoja de cálculo a un número razonable para examinar a simple vista.
  3. En la pestaña Información del asunto, rellene las columnas etiquetadas ID, dieta, sexo, especies y comentarios como desee.
  4. Haga clic en el botón START situado en el lado izquierdo de la pantalla. El programa comenzará a recopilar datos sin procesar una vez que la hora actual coincida con la hora de inicio.

3. Tether western corn rootworm to flight mill

  1. Doble un alambre de acero de 40 mm de longitud de 28 calibres 90o en el centro.
    NOTA: El cable también puede ser de otro metal como cobre o latón.
  2. Tome una pequeña cantidad de cera dental, ligeramente más grande que una cabeza de alfiler, y rodar entre las yemas de los dedos hasta que se forme una bola. Asegúrese de que los dedos estén limpios para evitar que los desechos, la suciedad y el aceite se incorporen a la cera, ya que puede impedir que la cera se adhiera al insecto.
  3. Empuje un extremo de los 40 mm del alambre doblado en el centro de la bola de cera.
  4. Anestetizar al adulto de prueba con CO2 como se ha descrito anteriormente (véanse 1.11.1 y 1.11.2).
  5. Coloque al adulto anestesiado sobre una superficie plana y coloque su lado dorsal hacia arriba. Si el escarabajo no se encuentra completamente plano en la superficie, vuelva a colocar las patas para que lo haga. Es importante que el escarabajo se quede lo más plano posible en la superficie para asegurar el posicionamiento correcto del cable.
  6. Brevemente (< 1 s) calentar la cera dental en el alambre con un encendedor de butano. Si la cera se calienta durante demasiado tiempo, la cera derretida caerá del cable. No reutilice la cera si se ha caído del alambre, ya que no se adhiere eficazmente a la cutícula del insecto.
  7. Coloque cuidadosamente el extremo del alambre de acero con la cera dental derretida en la superficie dorsal del pronoto, mientras apunta el otro extremo del alambre, (es decir, el extremo sin cera dental), a lo largo de la línea media del abdomen. Alternativamente, apunte el extremo del cable sin la cera dental hacia la cabeza si lo desea. En ese caso, un escarabajo volador empujará el brazo de vuelo en lugar de tirar de él. Asegúrese de que la cera derretida no se sume a la elytra o a sus suturas, ya que puede prevenir o dificultar el vuelo.
  8. Coloque el extremo libre del cable en la abertura del tubo metálico hueco del brazo del molino de vuelo. Asegúrese de que el cable se ajuste lo suficientemente apretado como para mantenerlo en su lugar por fricción. El escarabajo atado puede colocarse para volar en el sentido de las agujas del reloj o en el sentido contrario a las agujas del reloj.
  9. Inmediatamente después de montar un escarabajo, rasgue una pequeña pieza de papel tisú de un tejido más grande. Ofrezca la pieza de tejido al escarabajo atado que cuelga de la fábrica de vuelo para el contacto tarsal; la mayoría de los escarabajos agarrarán el tejido y lo sostendrán contra la gravedad hasta que lo liberen al comienzo de su primera actividad de vuelo. Esto reducirá en gran medida el comportamiento inicial de escape o vuelo de aterrizaje.
    NOTA: La presencia humana en la sala de pruebas de vuelo debe limitarse a conectar y retirar a los adultos de las fábricas de vuelo. El período de prueba generalmente no comienza hasta que han transcurrido al menos 30 minutos desde la fijación (ver Nota bajo 2.2.1), y los seres humanos no deben estar presentes en la sala de vuelo durante este tiempo o durante el período de prueba en sí.
  10. Retire a todos los adultos probados en vuelo después de completar una prueba de molino de vuelo. Retire la perla de cera que conecta la atela al pronoto pelando suavemente el alambre del pronoto. La cera se separará fácilmente sin dañar la cutícula, haciendo que el insecto esté disponible para su posterior experimentación si se desea.

4. Guarde los datos recopilados del programa de molino de vuelo.

  1. El programa se puede ajustar en MANUAL o AUTO. Si el programa está configurado como manual, el usuario debe finalizar el programa haciendo clic en el botón STOP. Si el programa se establece en AUTO, el programa dejará de recopilar datos sin procesar una vez que la hora actual coincida con la hora de finalización.
  2. Haga clic en EXIT una vez finalizado el período de prueba de vuelo.
  3. Asegúrese de que un archivo TDMS se guarda bajo el nombre de archivo introducido durante la inicialización del programa (paso 2.2).
  4. Haga clic en el archivo TDMS y guarde el documento como una hoja de cálculo (.xlsx).

5. Recuperar parámetros de vuelo de la hoja de cálculo guardada (.xlsx)

NOTA: Una hoja de cálculo se puede diseñar a medida para manipular la salida de datos sin procesar del software de molino de vuelo. Aquí, el programa de software era el mismo descrito por Jones et al. 18, pero se agregó una rutina adicional para reconocer y resumir el vuelo ininterrumpido más largo por un insecto individual durante el período de prueba.

  1. Para cada persona que participa en la actividad de vuelo, la hoja de cálculo incluirá la siguiente información: número de vuelo, revoluciones totales, hora de inicio, hora de finalización y duración del vuelo en minutos.
    1. Para calcular la distancia total volada durante el período de prueba, sume la columna denominada "Reves total" y multiplíquela por la distancia volada por revolución. La distancia por revolución depende de la longitud del brazo de vuelo desde el pivote central hasta el insecto adjunto. Por ejemplo, si esta distancia es de 15,9 cm, cada revolución es equivalente a un metro volado. El número total de revoluciones también se puede encontrar en la pestaña "Estadísticas de prueba".
    2. Para calcular la duración total volada durante el período de prueba, sume la columna denominada 'Duración de vuelo (min)'.
    3. Para determinar la distancia y la duración del vuelo ininterrumpido más largo, vaya a la pestaña "Estadísticas de prueba" y busque debajo de la columna "Vuelo más largo".
    4. La velocidad de vuelo se puede calcular dividiendo la distancia volada por la duración del vuelo. En el lugar de los insectos, la velocidad se expresa comúnmente en m/s o km/h.

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Representative Results

La Figura 4 muestra ejemplos representativos de salidas esperadas después de las pruebas de vuelo. Los datos de vuelo se obtuvieron de trabajos experimentales realizados en el Departamento de Entomología de la Universidad Estatal de Iowa. Los adultos hembras de gusano de maíz occidental de seis días de edad y apareados fueron atados a molinos de vuelo y colocados en una cámara ambiental controlada establecida en 14:10 L:D, 60 % de humedad relativa y 25oC. Los escarabajos fueron dejados en las fábricas de vuelo durante 22 horas consecutivas a partir de 30 minutos antes del inicio del amanecer simulado, y su actividad de vuelo se registró(Figura 4). El amanecer y el anochecer fueron simulados por un cambio programado y gradual en la intensidad de la luz de apagado completo a encendido al amanecer (o viceversa al atardecer) durante un período de 30 minutos. La primera pestaña de la hoja de cálculo resultante resume los adultos individuales que se probaron, utilizando la información introducida en el paso 2.3. Las pestañas siguientes incluyen datos de vuelo para cada individuo. Las dos últimas pestañas se etiquetan como 'RAW DATA' y 'Test Stats'. 'RAW DATA' incluye la actividad de tiempo de vuelo para todas las personas. 'Estadísticas de prueba' indica el vuelo ininterrumpido más largo para cada escarabajo, y resúmenes de la duración del vuelo ininterrumpido más largo en minutos, el tiempo total pasado en vuelo durante el período de prueba en minutos, y el número total de revoluciones durante el período de prueba. Las marcas de tiempo para el inicio y el final de cada vuelo independiente permiten analizar la periodicidad del vuelo.

Para el escarabajo hembra atado a molino de vuelo #2(Figura 4B),la hoja de cálculo muestra el número de vuelos, las revoluciones totales por vuelo, la hora de inicio y finalización de cada vuelo, y la duración de cada vuelo. Esta mujer participó en varios vuelos independientes, la mayoría de los cuales eran muy cortos. Sin embargo, en vuelo #5 la hembra viajó 1.258 m (lo que equivale al número de revoluciones en este caso, porque la distancia por revolución era de 1 m) durante un período de 37,8 minutos de vuelo ininterrumpido. El escarabajo hembra atado al molino de vuelo #1(Figura 4C) no se realizó en vuelo durante el período de prueba, por lo que se muestra una hoja de cálculo en blanco.

Como ejemplo, los resultados se presentan a partir de una simple comparación de las características de vuelo entre dos grupos de gusanos de raíz de maíz occidental hembra. Los adultos fueron recolectados en campos comerciales de maíz de dos lugares en Iowa y se les permitió oviposit en el laboratorio. Se recogieron huevos, y descendencia criada como se describe en el Paso 1 del protocolo en una densidad post-neonada (paso 1.9) de 12 larvas por 36 plántulas. Las hembras adultas resultantes fueron ateadas y probadas como se describe en los pasos 2 y 3. La Tabla 1 muestra un resumen de los parámetros de vuelo de los datos sin procesar recuperados del software del molino de vuelo como se describe en los pasos 4 y 5. Los parámetros de vuelo totales se refieren a la suma de todos los vuelos de un individuo durante el período de prueba de 22 horas, mientras que los parámetros de vuelo más largos se refieren al vuelo ininterrumpido más largo durante la prueba.

Figure 1
Figura 1. Molinos de vuelo de insectos utilizados para experimentos atados. (A) Molino de vuelo de insectos enteros y (B) parte de trabajo del molino de vuelo. (A) La parte de trabajo del molino de vuelo está en círculo, (B) (1) brazo de vuelo del tubo hipodérmico de 1 m, (2, 3) repeliendo imanes de anillo de ferrita, (4) sensor de efecto Hall digital, (5) imán de anillo de níquel pequeño utilizado para activar el sensor, y (6) tubo de pared delgado hipodérmico ("pin central") que separa los imanes repelentes (2,3). Los molinos de vuelo modificados ligeramente del diseño original de Jones et al.18  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Componentes de la cámara ambiental del molino de vuelo. (A) Las características de la cámara exterior incluyen (1) controlador Intellus, (2) panel de control y (3) desconexión de energía principal. (B) Las características de la cámara interior incluyen (1) enfriadores de unidades (detrás del panel del techo), (2) módulos LED, (3) estanterías y (4) humidificador de tipo pan.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Una interfaz del programa de software de molino de vuelo. (A) La primera pestaña, etiquetada "Inicialización", requiere información, incluidas las horas de inicio y finalización, y el nombre del archivo. (B) La segunda pestaña, denominada "Información del sujeto", no requiere que se introduzca ninguna información, sino que se utiliza para diferenciar entre varias personas evaluadas en una sola prueba de vuelo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Datos de vuelo representativos de escarabajos de raíz de maíz occidental de 6 días de edad. (A) La primera pestaña de la salida resume la información sobre siete personas probadas en vuelo en un día determinado. (B) Datos de vuelo de la hembra en el #2 de la fábrica de vuelo (FM-2), que realizaron múltiples vuelos independientes durante el período de prueba de 22 horas. (C) La hembra colocada en el molino de vuelo #1 (FM-1) no se realizó en vuelo durante el período de prueba de 22 horas, lo que dio lugar a una hoja de cálculo en blanco.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Ubicación
Ames Nashua
Tamaño de la muestra1  23 31
Distancia total de vuelo (m) 387,83 a 146,21 949,10 a 267,73
Duración total del vuelo (min) 14,34 á 5,06 37,01 a 10,51
Velocidad total de vuelo (m/s) 0,42 a 0,04 0,44 a 0,06
Distancia de vuelo más larga (m) 184,48 a 81,82 590,13 a 186,01
Duración de vuelo más larga (min) 6,27 x 2,26 22,15 a 7,67
Velocidad de vuelo más larga (m/s) 0,46 a 0,04 0,44 a 0,03
1 Voló al menos 1 minuto

Tabla 1. Rendimiento medio (SE) en molinos de vuelo de gusanos de raíz de maíz occidental hembra de dos lugares en Iowa. El vuelo más largo se refiere al vuelo ininterrumpido más largo (es decir, continuo) realizado por cada individuo durante el período de prueba.

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Discussion

Caracterizar el comportamiento de vuelo de gusano de raíz de maíz occidental es importante para diseñar planes eficaces de gestión de la resistencia. El comportamiento de vuelo de esta plaga se ha estudiado en el laboratorio utilizando varios métodos, incluyendo actographs, túneles de vuelo y molinos de vuelo. Las fábricas de vuelo, como se describe e ilustran en este documento, permiten a los insectos realizar vuelos ininterrumpidos para que los investigadores puedan cuantificar los parámetros de vuelo, como la distancia, la duración, la periodicidad y la velocidad de los vuelos individuales, durante todo un período de prueba.

El paso más difícil en el protocolo para la experimentación de molinos de vuelo con gusano de raíz de maíz occidental, como lo es para la mayoría de las especies de insectos, es aplicar correctamente una atación al adulto (Paso 3). Esto puede ser una tarea difícil debido a la pequeña cantidad de superficie disponible en el pronoto para la fijación del alambre, así como la gran cantidad de ceras naturales en la superficie de la cutícula. La tarea se hace más difícil por el tiempo limitado disponible para aplicar la atación antes de que el insecto comience a agitarse a medida que emerge de la anestesia CO2. Es importante que la atación esté alineada correctamente y se adhiera al pronoto del escarabajo durante todo el período de prueba. Si la atadura está desalineada, el escarabajo puede tener dificultades para participar en el vuelo mientras está en el molino de vuelo, lo que resulta en una distancia, duración y velocidad. El escarabajo puede escapar durante el período de prueba si la cera dental no se adhiere el alambre con la suficiente fuerza al pronoto. Por lo tanto, es importante tener manos limpias y firmes, un buen sentido para calentar la cera a una temperatura viable, y confianza mientras se atean los escarabajos, todos los cuales son alcanzables con una práctica adecuada.

Se debe tomar una decisión sobre lo que constituye un evento de vuelo independiente para que se pueda establecer el valor umbral máximo (paso 2.2.3). Una persona no puede hacer vuelos, un vuelo o docenas de vuelos durante un período de prueba, dependiendo de su actividad de parada y salida, pero también del valor de Umbral máximo asignado. El valor predeterminado reportado por Jones et al.18 es 5 s. En este estudio de la raíz de maíz occidental, el Umbral Máximo se estableció en 1 min. El escenario más apropiado es una llamada de juicio basada en las especies de insectos y los objetivos del investigador. Hay compensaciones. Un insecto que deja de volar pero sigue dando vueltas por una o más revoluciones debido al impulso tendrá esas revoluciones contadas incorrectamente como parte del vuelo anterior cuando el valor se establece en 1 min. Si el valor se establece en 5 s, la mayoría de las revoluciones adicionales que no sean de vuelo no se contarán y el registro de ese vuelo se terminará correctamente. Por otro lado, a veces un insecto ralentiza su vuelo sustancialmente en un esfuerzo por controlar su dirección, aterrizar o por otras razones, luego reanuda el vuelo a mayor velocidad sin haber detenido nunca el vuelo activo. Tal comportamiento en los molinos de vuelo es común y se ha observado en el gusano de raíz de maíz occidental; a menudo se registraría como dos vuelos separados cuando el umbral máximo se establece en 5 s, pero se registraría correctamente como un vuelo ininterrumpido cuando el umbral es de 1 min. Bajo el umbral de 1 minuto, sin embargo, el vuelo de un insecto que realmente deja de volar y luego reanuda el vuelo dentro de 1 min se registraría incorrectamente como que no se detuvo.

Se puede utilizar un umbral mínimo de vuelo (por ejemplo, al menos un vuelo de al menos un minuto) para excluir de los análisis posteriores a cualquier adulto que pueda haber sido dañado durante el manejo o que estén en mal estado de salud. El equilibrio de protección contra tales falsos ceros (o falsos vuelos muy cortos) es la posibilidad de excluir los ceros verdaderos (o verdaderos vuelos muy cortos), es decir, las personas que estaban sanas pero no estaban motivadas a volar. El investigador debe decidir cómo manejar los ceros (o vuelos muy cortos) en función de los objetivos del experimento, así como qué tipo de error es más probable y cuál es menos deseable a la hora de interpretar los resultados. Además, un problema común ocurre cuando la posición del brazo de vuelo que sostiene un escarabajo inactivo pasa a estar directamente sobre, o muy cerca, del sensor, donde pequeños movimientos del brazo causados por movimientos no voladores del insecto o ligeras corrientes de aire en el cámara puede ser falsamente registrado como revoluciones. Para evitar que este artefacto metodológico infunde la frecuencia de duraciones de vuelo más cortas, se recomienda excluir de los análisis todos los vuelos que duren 1 minuto. Este tipo de lectura artística, si se lleva a realizar durante más tiempo, también puede resultar en una alta velocidad sin sentido (por ejemplo, > 2 m/s) para un "vuelo" grabado; cuando se detectan, esos datos de "vuelo" deben eliminarse para esa persona.

Aunque los estudios de molino de vuelo han proporcionado información importante sobre el comportamiento de vuelo de gusanos de raíz de maíz occidental, como con cualquier especie hay complicaciones en la relación con el vuelo atado al vuelo natural en el campo24. Un insecto en un molino de vuelo está suspendido, lo que proporciona soporte vertical para su peso. Por lo tanto, la energía gastada para proporcionar elevación durante el vuelo natural no puede ser invertida por insectos atados en molinos de vuelo25. Por otro lado, un insecto atado debe proporcionar más empuje que en vuelo libre para superar la fricción en el pivote, el peso añadido del brazo de vuelo, y la resistencia aerodinámica desde el brazo de vuelo25,26. El vuelo natural de la raíz de maíz occidental también ocurre a veces en altitudes por encima de su capa límite de vuelo27,donde la distancia cubierta durante el vuelo puede ser fuertemente influenciada por velocidades de viento que son mucho mayores que la velocidad de vuelo sin ayuda del insecto 28. Los molinos de vuelo imponen un vuelo unidireccional, de modo que la distancia recorrida puede sobreestimar el desplazamiento total en el campo donde la ruta de vuelo puede estar serpenteando. Proporcionar contacto tarsal con un pequeño trozo de tejido después de montar el insecto en el molino de vuelo (paso 3.9) reduce el vuelo de escape inicial, así como la actividad de vuelo asociada con un intento de aterrizar. Sin embargo, una vez que el escarabajo deja caer el tejido durante un experimento, se encuentra el mismo problema de incapacidad para terminar el vuelo por aterrizaje. Se han utilizado sistemas de actografía alternativos en experimentos de vuelo de laboratorio con8,9 o 7 gusanos de raíz de maíz occidentales. Si bien alivian el problema de la terminación de vuelo al permitir el contacto tarsal espontáneo, el equilibrio es la incapacidad para medir la distancia de vuelo o la velocidad. A pesar de estas limitaciones, el molino de vuelo es muy útil como una herramienta comparativa para examinar cómo una variedad de factores de desarrollo, bióticos y abióticos influyen en la propensión de un insecto a participar en vuelo, y cómo el comportamiento de vuelo en sí se ve afectado. Cuando se combina con otras pruebas, como la proporcionada por los experimentos de captura de marcas29,los datos de captura30y las estimaciones del flujo genético31, los conocimientos únicos obtenidos de los experimentos de molinos de vuelo contribuyen a una comprensión de la dispersión de la raíz de maíz occidental en el campo y sus consecuencias a nivel de la población.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

La asistencia de posgrado de E.Y.Y. fue apoyada por la National Science Foundation I/UCRC, el Center for Artthropod Management Technologies, bajo la Beca No. IIP-1338775 y socios de la industria.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Butane multi-purpose lighter BIC UXMPFD2DC To soften wax when tethering
Clear polystyrene plastic vial (45-ml) Freund Container and Supply AS112 To hold beetle while anesthetizing
Dehydrated culture media, agar powder Fisher Scientific S14153 To make agar for holding moisture for adults
Delrin rod (1" diameter, 3.75" long) Many suppliers: can use cheapest on the internet. For post of flight mill
Dental wax DenTek 47701000335 Adheres wire tether to prothorax
Ferrite ring magnets (OD: 0.69”, ID: 0.29”, Thickness: 0.118”; 7oz pull) Magnet Shop 63B06929118 Opposing - to generate the float.
Hall effect sensor Optikinc OHN3120U Look under magnetic sensors on the left side of the Optekinc website then look for the part number. A link is given for current suppliers.
Hypodermic tubing (22 gauge; 0.0358” OD x 0.01975” ID x 0.004” wall) Small Parts, Inc. HTX-22T-12 Used for flight mill arms and main axis rod.
Incubator (104.1 x 85.4 x 196.1 cm) Percival Scientific I-41VL
LabVIEW Full Development System software, system-design platform National Instruments (See http://www.ni.com/en-us/shop/labview/select-edition.html) LabVIEW 2018 (Full Edition)  Provides environment needed to run flight mill files (.vi extensions) available for download from Jones et al.18 at http://entomology.tfrec.wsu.edu/VPJ_Lab/Flight-Mill.  LabVIEW 2018 Full is compatible with Win/Mac/Linux operating systems.
Mesh cage (18 x 18 x 18 cm) MegaView Science Co. Ltd. BugDorm-4M1515 mesh size = 44 x 32, 650 µm aperture
Needle tool BLICK 34920-1063 For scoring soil surface for egg laying in laboratory
Nickel ring magnets (3/16” OD x 1/16” ID x: 1/16” thick) K&J Magnetics R311 Used to trigger the digital hall effect sensor.
Petri dish (100 mm x 15 mm) Fisher Scientific S33580A
Plastic container (44-ml) Dart 150PC For initial rearing of young larvae
Plastic container (473-ml) Placon 22885 For rearing of older larvae
Round brush (size 2) Simply Simmons 10472906 For transferring freshly hatched neonates to surface of roots
Sieve (250-µm) Fisher Scientific 08-418-05 To separate eggs from soil
Steel wire (28-gauge) The Hillman Group 38902350282
Teflon rod (3/8" diameter, 3/4" length) United States Plastic Corporation 47503 To accept the rotating arm.
Vacuum  Gast Manufacturing, Inc. 1531-107B-G288X For aspirating adults in laboratory
White poly chiffon fabric Hobby Lobby 194811 To prevent escape of larvae from rearing container

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References

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Uso de molinos de vuelo para medir la propensión de vuelo y el rendimiento de la raíz de maíz occidental, <em>Diabrotica virgifera virgifera</em> (LeConte)
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Yu, E. Y., Gassmann, A. J.,… More

Yu, E. Y., Gassmann, A. J., Sappington, T. W. Using Flight Mills to Measure Flight Propensity and Performance of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera (LeConte). J. Vis. Exp. (152), e59196, doi:10.3791/59196 (2019).

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