Summary
שחייה המושרה assay התנהגותית ומבוססת חקר המנגנונים המשמשת כבסיס של דופמין איתות ב Caenorhabditis elegans (C. elegans) היא שיתוק (SWIP). עם זאת, שיטה מפורטת כדי לבצע את הבדיקה לוקה בחסר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול צעד אחר צעד עבור SWIP.
Abstract
וזמינותו שחייה שמתואר פרוטוקול זה הוא כלי תקף כדי לזהות חלבונים ויסות של דופאמין synapses. בדומה יונקים, דופמין (DA) קובע מספר פונקציות ב- C. elegans כולל למידה ופעילות מוטורית. תנאי זה לעורר שחרור דא (למשל, אמפטמין (AMPH) טיפולים) או זה למנוע DA סיווג (למשל, חיות חסר המשגר DA (dat-1) אשר אינם מסוגלים reaccumulating DA לתוך הנוירונים) ליצור עודף של DA חוץ-תאית בסופו של דבר וכתוצאה מכך ומכניקה עכבות. תופעה זו בולטת במיוחד כאשר בעלי החיים לשחות במים. למעשה, בעוד חיות פראי-סוג להמשיך לשחות לתקופה ממושכת, מוטציות null dat-1 ופראי-סוג שטופלו AMPH או מעכבים של המשגר DA לשקוע לתחתית הבאר ואל תזוז. תופעה זו נקראת "שחייה המושרה שיתוק" (SWIP). למרות וזמינותו SWIP וותיקה, תיאור מפורט של השיטה לוקה בחסר. כאן, אנו מתארים מדריך צעד אחר צעד כדי לבצע SWIP. כדי לבצע את הבדיקה, מאחר חיות הבמה-4 דרגות זחל מוצבים צלחת זכוכית ספוט המכיל סוכרוז פתרון בקרת עם או בלי AMPH. בעלי חיים הם הבקיע עבור התנהגותם שחייה באופן ידני על-ידי ויזואליזציה תחת סטריאוסקופ או באופן אוטומטי על ידי הקלטה עם מצלמה רכוב על סטריאוסקופ. קטעי וידאו הם מכן נותחו באמצעות תוכנת מעקב, אשר מניב ייצוג חזותי של תדירות בהלקאה ושיתוק בצורה של מפות חום. שתי המערכות ידניים ואוטומטיים מבטיח של הבדיקה לכימות בקלות של יכולת שחייה החיה, ובכך להקל על הקרנה עבור חיות הנושאת מוטציות בתוך מערכת וכולינרגיים או גנים עזר. בנוסף, ניתן להשתמש SWIP כדי להבהיר את מנגנון הפעולה של תרופות של התעללות כגון AMPH.
Introduction
חיות לבצע מגוון רחב של התנהגויות מולדת ומורכבים מתווכת על ידי נוירוטרנסמיטרים שונים מתואמת על ידי תהליכים מסובכים איתות. הנוירוטרנסמיטר דופמין (DA) שמתווכת התנהגויות שנשמרת מאוד על פני מינים, כולל למידה, המוטורית ועיבוד גמול.
נמטודות קרקע C. elegans, עם מערכת עצבים פשוטה יחסית וממופים היטב המורכב הנוירונים רק 302, מראה התנהגויות מורכבות בצורה ניכרת, כולל רבים שמווסתים על-ידי DA כגון ההזדווגות, למידה, שיחור מזון, גפיים, הנחת הביצה 1. בין תכונות אחרות, מחזור חיים קצר, קלות הטיפול ושימור של מולקולות איתות, להדגיש יתרונות השימוש C. elegans כמודל ללימוד הבסיס העצבי של התנהגויות ההכפלה.
ההרמפרודיט C. elegans מכיל נוירונים דופאמין שמונה; בנוסף לכך, הזכר מכיל שישה זוגות נוספים להזדווגות למטרות. כמו יונקים, הנוירונים הללו לסנתז DA ולבטא את המשגר DA (DAT-1), חלבון ממברנה נמצאו אך ורק בנוירונים דופאמין, אשר מסיע DA שפורסם החריץ הסינפטית בחזרה לתוך הנוירונים דופאמין. יתר על כן, רוב החלבונים המעורבים בכל שלב של סינתזה, אריזה ועל שחרור דא מאוד נשמרים בין תולעים ובני ו, כמו אצל יונקים, DA ממיקרו התנהגויות האכלה ובאופן C. elegans2.
C. elegans זוחל על משטחים מוצקים, שוחה עם התנהגות אופיינית בהלקאה במים. מעניין, מוטציות חסר הבעה של DAT-1 (dat-1) לזחול בדרך כלל על משטח מוצק אבל להיכשל לקיים את השחייה כאשר הושקע במים. התנהגות זו היה כינה שחייה המושרה שיתוק או SWIP. ניסויים קודמים הראו כי SWIP, בין השאר, נגרמת על ידי עודף של DA בתוך החריץ סינפטית זה בסופו של דבר מהתזונה קולטני postsynaptic כמו D2 (DOP-3). אמנם במקור שזוהתה dat-1 ההסתרה חיות3, SWIP הוא ציין גם אצל בעלי חיים פראי-סוג לטפל בתרופות שמונעים הפעילות של DAT (כגון imipramine4) ו/או לגרום שחרור דא (למשל, אמפטמין5). מצד שני, למנוע מניפולציות תרופתי או מחלה גנטית הסב סינתזה ושחרור של DA וחסימת פונקציה קולטן DOP-3 SWIP6. יחדיו, אלה נתונים שפורסמו כבר הקמנו SWIP בתור כלי אמין כדי לחקור את ההשפעות התנהגותית נגרם על ידי מוטציה חלבונים בתוך וכולינרגיים הסינפסות3,4,7 וכדי להיות מועסק העברה של מסכי גנטי לצורך זיהוי הרומן משעולים רגולטוריות מעורב DA איתות7,8,9,10,11,12. בנוסף, על ידי מתן של הבדיקה לכימות בקלות של שיכרון התנהגות בבעלי חיים, SWIP מאפשרת הבהרה של מנגנוני הפעולה של תרופות כמו אמפטמין (AMPH), azaperone-דופאמין synapses5, 6 , 13 , 14 , 15.
פרוטוקולים עבור ביצוע מבחני SWIP את תוארו לפני16. כאן נתאר בפירוט את המתודולוגיה ואת ההתקנה כדי לבצע את הבדיקה עם המטרה של מתן כמדריך חזותי עבור הקהילה C. elegans לבצע ביעילות SWIP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת פתרונות ומדיה
- הכנת מאגר M9 על ידי המסת ח'2PO4 3.0 g (22.05 מ מ), נה2HPO4 g 6.0 (42.2 מ מ), ו- g NaCl 5.0 (85.5 מ מ) ב 1 ליטר של מים יונים בלוק. הוסף 1.0 מ"ל של 1 מ' MgSO4 (12 גרם באמצעי אחסון הסופי של 100 מ ל מים יונים בלוק) אחרי autoclaving. מיקס 100 מ"ל של x 10 וכתוצאה מכך M9 עם 900 מל של בלוק יונים מים כדי ליצור פתרון 1 x.
- כדי להפוך את הביצה מאגר, להמיס 6.896 g של NaCl (118 מ מ), g 3.578 של אשלגן כלורי (48 מ מ), 0.294 גר' CaCl2-2 H2O (2 מ מ), 0.406 גר' MgCl2-6 H2O (2 מ מ) ו- g 5.958 (25 מ מ) של HEPES ב 1 ליטר של מים יונים בלוק. להתאים את ה-pH ל 7.3 באמצעות NaOH.
- להכין נתרן תת-כלורי טריים/NaOH פתרון על-ידי הוספת 1 מ"ל של 5-6% נתרן תת-כלורי (אקונומיקה) 180 µL של 10 N NaOH 3.8 מ ל מים יונים.
- שוקל 60 גר' סוכרוז, להתמוסס במים יונים בלוק לאמצעי הסופי של 100 מ ל לעשות 60% סוכרוז פתרון.
- להמיס 0.684 גר' סוכרוז ב 10 מ"ל מים יונים בלוק לעשות 200 מ"מ סוכרוז. לבדוק ולהתאים אותה על osmolarity באמצעות osmometer. להפוך aliquots 1 מ"ל ב 1.5 mL microcentrifuge צינורות ומקפיאים ב-20 ° C.
- שוקל 0.184 גר' AMPH (משקל מולקולרי 184.75 g/mol), להמיס 10 מ"ל של מים יונים כדי ליצור פתרון מניות 100 מ מ. לערבב 2 µL של הפתרון מניות ב- 400 µL של מים כדי ליצור הפתרון עובד 0.5 מ מ.
-
להכין צמיחה מזין לוחות מדיה (NGM)
- מערבבים דור 3 של NaCl (52.65 מ מ), 20 גרם של peptone, 25 גרם של מה נשארתי-אגר, 975 מ ל מים יונים בבקבוקון Erlenmeyer 2 ל'. כוללים בר מערבבים מגנטי autoclave (121 מעלות צלזיוס, 15 PSI) למשך שעה באמצעות מחזור נוזלי.
- מגניב כדי, לשמור על הטמפרטורה כ 50 ° C על-ידי הצבת את הבקבוק על הגל תוך כדי ערבוב. להוסיף 0.5 מ"ל של כולסטרול (5 מ"ג/מ"ל אתנול), 1 מ"ל של MgSO 1 מ'4, 1 מ"ל של 1 מ' CaCl2 , 25 מ ל 1 מ' אשלגן פוספט מאגר, pH 7.4 (g 108.3 של ח'2PO4, 35.6 g K-2-HPO-4 יונים מים 1 ליטר).
- פיפטה 25 מ ל כל אחד לתוך צלחות פטרי 100 מ"מ x 15 מ"מ ולאפשר התקשורת לגבש. חנות את הלוחיות הפוך ב 4 ° C בקופסה עד 4 שבועות.
-
הכנת ציר מרק (ליברות) Lysogeny
- להמיס 5 גר' LB לערבב אבקת ב 200 מ ל מים יונים הבקבוק Erlenmeyer. אוטוקלב במשך 30 דקות ניצול של עיקור נוזלי מחזור. לאפשר שהמרק להתקרר. לאחסן בטמפרטורת החדר במשך 1-2 שבועות.
-
הכנת לוחות חיידקי NA22
- השתמש טיפ פיפטה סטרילי או לולאה חיידקי סטרילי צובעות צלחת ליברות עם נפח קטן של חיידקים NA22 e. coli במלאי גליצרול, דגירה את הצלחת במהופך בתוך חממה 37 ° C בלילה לגדול מושבות המבודד. לבחור להציג שמושבה בודדת לתוך 200 מ ל LB מרק מוכן בשלב 1.8 ותנו לגדול בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס על פלטפורמה חזק.
- כדי להפיץ את הצלחות, לוותר על 200 µL של התרבות חיידקי על גבי הלוחות NGM שהוכן קודם לכן בשלב 1.7 ולהפיץ עם מקל הוקי זכוכית סטריליים. . תן את הצלחות יבש לילה או יותר תחת ברדס ולאחסן upside מטה בתיבת אטום ב 4 º C.
- כדי להפוך את הכלי ריסים/פלטינה לאסוף תולעים, דבק ריסים עבים או של נימה פלטינה לתוך כוס פיפטה פסטר באמצעות דבק סופר. חותכים את קצה עפעף בזווית באמצעות סכין גילוח. לחלופין, ניתן להשתמש מבער בונזן להמיס את קצה פיפטה מזכוכית סביב נימה פלטינה.
2. גידול C. elegans
הערה: תרבות פראי-סוג N2C. elegans עומס על צלחות NA22 Escherichia coli . השיטות תרבות מפורט שיפורטו להלן.
-
הכנה של תרבות תולעת
- כדי להפוך את תרבות starter של תולעים, לחתוך חתיכה קטנה של אגר מצלחת המכיל חיות מוזן היטב ולהעביר אותה אל צלחת חיידקים NA22 e. coli מוכן בשלב 1.9 בעזרת מרית סטרילי. דגירה צלחות ב 20 מעלות צלזיוס במשך 3-4 ימים. תחת מיקרוסקופ סטריאו, חזותית לאשר הנוכחות של מבוגרים gravid.
-
הכנת מסונכרן אוכלוסיית תולעים
- לאסוף מבוגרים gravid לפחות 2 צלחות על ידי מחלק מים יונים בלוק סביב הלוח באמצעות בקבוק מים. מה עוללת בעדינות את הצלחת לסלק את התולעים ולאסוף את התולעים לתוך 15 מ"ל פוליסטירן חרוט צינור באמצעות פיפטה פלסטיק חד פעמיות
- ספין דרך צינור ומפרידה ב x 140 גרם למשך 2 דקות הצניפה התולעים, ואז וארוקן את supernatant באמצעות משאבת ואקום או עם בנה בואקום מעבדה.
- Resuspend ושטוף התולעים על-ידי מילוי את הצינור מים יונים בלוק, מיקס, צנטריפוגה ב 140 x גרם עבור 2 דק וארוקן את תגובת שיקוע וחזור זה יימשך צעד שני פעמים נוספות, או עד תולעים ברורים מחיידקים (מים מופיע ברור כשמערבבים. עם התולעים).
- הוסף 5 מ של נתרן תת-כלורי טרי/NaOH פתרון (שלב 1.3) בגדר תולעת ומערבבים במהירות באמצעות מערבולת. דגירה הצינור על כיסא נדנדה למשך כ- 4-8 דקות. תקופת הדגירה עם נתרן תת-כלורי/NaOH פתרון שנעה בין 4-8 דקות על סמך איכות הפתרון מניות נתרן תת-כלורי (אקונומיקה).
- לשים טיפה (2-50 µL) של לאודנום תולעים על משטח זכוכית מיקרוסקופ ולבדוק כל 2 דקות תחת המיקרוסקופ על פירוק תולעת. כאשר כ- 70% של התולעים הן lysed ביצים משתחררים, ממלאים את הצינור מאגר ביצים המבושלות שלב 1.2 ומיד צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- 140 x גרם הצניפה העוברים והתולעת הגוויות.
- וארוקן את תגובת שיקוע ולשטוף בגדר 3 פעמים נוספות על-ידי מילוי את הצינור בכל פעם עם מאגר ביצה. ספין למטה ב x 140 גרם עבור 1 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע בכל פעם. בגדר הופך ללבן בסוף שוטף.
- לאחר השטיפה הסופית להפריד את העוברים הגוויות מת ב 30% סוכרוז פתרון. הוסף 5 מ ל מים יונים בלוק בגדר, resuspend, הוסף 5 מ של 60% סוכרוז מוכן בשלב 1.4. לערבב ביסודיות, צנטריפוגה ב 160 x גרם במשך 6 דקות.
- השתמש כוס פסטר פיפטה להעברת העוברים צף-מניסקוס העליון לתוך צינור חרוטי טריים 15 מ"ל. אין ליטול יותר מ- 3-4 מ"ל. כדי להסיר כל סוכרוז הנותרים, לשטוף את העוברים 3 פעמים עם מים בלוק על ידי צריך שתוציאו ב 140 x גרם במשך 3 דקות, הסרת את תגובת שיקוע, resuspending בגדר (וממלאים את הצינור) בכל פעם.
- חזור על שוטף עם מאגר x M9 1. לאחר השטיפה הסופית resuspend בגדר ב 10 מ"ל של M9. להשאיר את הצינורות מטרף בן לילה (לא יותר מ- 14 h) על הביצים לבקוע לזחלים L1. תולעים יישארו ב- L1 הפרפרים והעשים בשל חוסר מזון.
- לשטוף L1 הזחלים 3 פעמים עם מים בלוק להסיר שאפריש פרומונים שפורסמו על ידי הזחלים על ידי צריך שתוציאו ב x 140 גרם עבור 2 דק Resuspend הזחלים ב 1 מ"ל של מים. להפוך 1:10 דילול של תולעים מים, pipette טיפה 10 µL על משטח זכוכית, לשים על coverslip, לספור את מספר תולעים מתחת סטריאוסקופ. חזור על פעולה זו פעמיים, ממוצע התוצאות.
- פיפטה הנפח של תולעים שמתאים כאלף תולעים על גבי צלחת NA22 (שהובאו קודם לכן לטמפרטורת החדר) על-ידי הצבת קטן טיפות על הצלחת. להשאיר את הצלחת פתוח למחצה עד הטיפה מתייבש. לאחר מכן לכסות את הצלחת, דגירה במהופך בתוך חממה 20 ° C כ- 44-48 שעות או עד התולעים מגיע שלב L4 מאוחר, כמו מאושרות באופן חזותי תחת stereomicroscope. עכשיו התולעים מוכנים להיבדק על SWIP.
3. SWIP
הערה: אנו מתארים את השיטה הידנית של הערכת SWIP בעיר וורמס פראי-סוג שטופלו AMPH. נדון בקצרה גם את המעקב אחר תולעים, ניתוח נוסף של תולעת קינטיקה באמצעות גשש תולעת אוטומטיים ותוכנות מעקב אשר שתוארו קודם לכן על-ידי הארדוויי ואח '10.
-
שיטה ידנית כדי לבדוק את SWIP
- µL 40 aliquot של mOsm/L 200 סוכרוז פתרון עם או בלי 0.5 מ מ AMPH לתוך צלחת זכוכית ספוט. תחת סטריאוסקופ, לבחור בשלב מאוחר-L4 8-10 תולעים עם עפעף או פלטינה לבחור ויציפו האיסוף בצלחת המכילה את הפתרון עד תולעים תרדו האיסוף ולשחות אל הפתרון. הערה מספר תולעים בחרה לתוך הבאר, להתחיל את הטיימר, לצפות ולהקליט את המספר של תולעים המציגות SWIP כל סימן דקה.
- העתק את הנתונים הגולמיים לתוך גיליון אלקטרוני לחשב את האחוזים של תולעים משותק על ידי חלוקת מספר תולעים משותק בכל רגע על ידי המספר הכולל של תולעים נבדק ברחבי וזמינותו, להכפיל ב- 100. להעתיק את ערכי אחוזים כל יצירת גרפים ועצב תוכנה סטטיסטית, מגרש הנתונים עם ערכי אחוז על ציר Y זמן על ציר שימוש בגרף XY X.
- לבצע ANOVA דו-כיווני שלאחריה יבוא ניתוח פוסט-הוק (למשל, Bonferroni פוסט-מבחן) כדי לבדוק מובהקות סטטיסטית בין שליטה, קבוצות AMPH וזמן הטיפול.
-
ניתוח אוטומטיות של SWIP
- לבצע ניתוח אוטומטיות על תולעת אחת בכל פעם. פרוטוקול כדי להגדיר את המצלמה, תוכנת המעקב התולעת ואת script להפעלת תוכנת מעקב ניתוח מתוארים בפירוט הארדוויי et al.16.
- בקצרה, מקום אנדרוגינוס הבמה L4 מאוחר יחיד לתוך צלחת זכוכית ספוט ניצול מכוש עפעף, כפי שמתואר השיטה הידנית בסעיף 3.1.2. להקליט קטעי וידאו שחיה של תולעת אחת בזמן ולהשתמש את תוכנת המעקב תולעת כדי לחשב את התדירות של הגוף מתכופף.
- בצע את קובץ ה-script מסופק עם תוכנת מעקב כדי להשיג את תדירות בהלקאה תולעת וכדי ליצור מפות חום מתוך נתוני בהלקאה תולעת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נציג דוגמה SWIP assay המושרה על ידי טיפול AMPH. איור 1 מציג ייצוג סכמטי של ההתקנה assay כמתואר לעיל. עבור assay ידנית, בערך בגיל 8-10 מסונכרן תולעים בשלב מאוחר של L4 נאספים עם עפעף או פלטינה לבחור להציב לתוך צלחת ספוט זכוכית מלאים µL 40 של 200 סוכרוז mOsm/L (פתרון שליטה) או סוכרוז עם 0.5 מ מ AMPH ונבדק SWIP.
כאשר בעלי חיים מפסיקים לשחות (קרי: SWIP), תערוכה הם שוקעים לתחתית הבאר ואל תזוז מהר. לכן, האפליה בין חיות עדיין לשחות על פני המים מול אלה יציבה בתחתית הבאר הוא מאוד פשוט. מרבית התולעים נבדק שחייה פתרון שליטה באופן רציף במשך לפחות 10 דקות, ואילו תחת טיפול AMPH, מגדילה את מספר החיות מפגין SWIP בהדרגה. האחוז המקסימלי של חיות מפגין SWIP הוא יחסי לריכוז AMPH בשימוש1,5,13. כאשר DAT-1 נוקאאוט (dat-1) תולעים נבדקים בפתרון שליטה, 40-70% תולעים התערוכה SWIP בתוך 10 דקות4,13. תוצאה זו משולה האחוז של חיות משותק נמדד חיות פראי-סוג שטופלו 0.5 מ מ AMPH (איור 2).
תולעים נחשפים סוכרוז או סוכרוז המכיל AMPH אינם מראים SWIP בדקה הראשונה של התבוננות (איור 2). עם זאת, בעוד תולעים מטופלים עם סוכרוז ממשיכים לשחות למשך 10 דקות, תולעים שטופלו AMPH להתחיל שהפגינו SWIP אחרי 2 דקות של טיפול ואחרי 10 דקות, 66 ± 3% בעלי חיים מראים SWIP (איור 2).
לניתוח אוטומטי, סרטי וידאו של תולעים תחת שליטה או טיפולים AMPH מוקלטים תולעת אחת בכל פעם באמצעות תוכנת הקלטת וידאו. תוכנת מעקב אחר המחשב משמש כדי לעקוב אחר בהלקאה תולעת, הנתונים המתקבלים הם מיובאים לתוך וניתח עם החליפה תוכנה. דוגמאות של מפות חום של בעלי חיים שנחשפו לפקד או AMPH, מציג באופן פעיל לגור חיות תולעים אדומות, משותק בירוק, מוצגים באיור3.
איור 1 : Assay להגדיר עבור SWIP. Gravid פראי-סוג (N2) תולעי היו lysed עם נתרן תת-כלורי/NaOH טיפול לשחרר את העוברים. העוברים היו מותר כדי לבקוע מתפתחות לזחלים L1 מסונכרן M9 למאגר עבור 14 h במטרף, ואז מצופה בצלחת NGM עם חיידקים NA22. לאחר 42-48 h הזחלים בשלב מאוחר של L4 היו חזותית מזוהה תחת סטריאוסקופ אסף עם דוקרן עפעף לתוך צלחת ספוט עם או בלי אמפטמין תמיסת סוכרוז שליטה, הבקיע עבור SWIP באופן ידני או דרך ניתוח אוטומטיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : SWIP הנוצרות על-ידי אמפטמין שימוש assay ידנית. תולעים סוכרוז או סוכרוז עם אמפטמין 0.5 מ מ (AMPH) זכו חזותית להתנהגות SWIP כל דקה באמצעות סטריאוסקופ. האחוזים של חיות ש-SWIP מפגין מחושב על ידי חלוקת המספר משותק תולעים על ידי המספר הכולל של תולעים לבדיקה עבור כל נקודת זמן ולאחר מכן הכפלת התוצאה ב- 100. האחוזים של תולעים נחשפים AMPH (ריבועים כחול) מציג SWIP עליות נוספות, בעוד התולעים ללא טיפול (עיגולים אדומים) ממשיכים לשחות במהלך החלון כ-10 דקות. N מייצג את מספר החיות נבדק בכל קבוצה. קווי שגיאה מצביעים על שגיאת תקן של אמצעים (SEM). מובהקות סטטיסטית הוערכה על ידי ביצוע ANOVA דו כיוונית עם Bonferroni מבחן השוואה מרובים (p < 0.0001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : אמפטמין-induced SWIP באמצעות ניתוח אוטומטיות. קטעי וידאו של תולעים סוכרוז או סוכרוז עם 0.5 מ מ AMPH נרשמו בעזרת מצלמה רכוב על סטריאוסקופ. סרטי וידאו שחיה של תולעים בודדים היו במעקב עם תוכנת מעקב, נותחה באמצעות מעקב אחר תוכנה החליפה. מפות חום נוצרו מתוך הנתונים שבו אזורים אדומים להראות את התולעים כי הם נעים באופן פעיל, שטחים ירוקים מציינים תולעים משותק. כל קבוצה ניסיונית היא הנציגה של חיות 6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול שלב אחר שלב כדי לבצע וזמינותו התנהגותית, SWIP, ב- C. elegans. פרוטוקול זה הוא פשוט וישיר עם לא צבעוני טכנית ביצוע assay משתמש מאוד ידידותי. למרות זאת, ישנם כמה היבטים קריטיים זה צריכים לקחת בחשבון על מנת לבצע ביעילות וזמינותו.
צריך לקחת כדי להבטיח כי התולעים המשמש וזמינותו לשובע, מאז ההגבלה תזונה משפיעה על SWIP17. עדין טיפול של תולעים בזמן לקטוף, כמו טיפול מתוזמן היטב כמו נתרן תת-כלורי/NaOH במהלך פירוק הם שלבים קריטיים, טראומה במהלך האיסוף (נפוץ יותר בעת שימוש מעדר פלטינה) או חשיפה ממושכת של עוברי נתרן תת-כלורי/NaOH פתרון יכול לגרום לנזק בלתי הפיך תולעים18 , ובכך לסכן את היכולת שלהם לשחות.
צריכה להיות מלווה טכניקות סטרילי כדי למנוע זיהום. זיהום של הלוחות אגר פוגעת הבריאות של בעלי החיים, ובכך משנה את היכולת שלהם לשחות. שינוי קל באחוזים של חיות מפגין SWIP ניתן לצפות באמצעות פלטות אגר נזרע עם זנים שונים של חיידקים e. coli (NA22, OP50, וכו '.). בפרוטוקול שלנו, אנו משתמשים NA22 להניב כמות גדולה של תולעים.
צלחות זכוכית-ספוט, השתמשו במהלך וזמינותו SWIP, העדיפו צלחות פלסטיק כי הם יכולים ביסודיות להישטף, בלוק, בהם שימוש חוזר כאשר נבחנים על סוגים שונים של תרופות.
גורם חשוב נוסף כדי להיחשב ב וזמינותו SWIP הוא osmolarity של התקשורת נוזלי שבו בעלי החיים הם נבדקו19. בפרוטוקול שלנו, אנו משתמשים סוכרוז להביא את osmolarity של מים עד 200 mOsm/L אשר הוצגה קודם לכן להיות מצב אופטימלי עבור בעלי החיים (תקשורת אישית בלייקלי רואד...). מים עם osmolarity מבוקרת עדיף מכיוון שהוא מבטל הבדלים אפשריים איכות המים על פני מספר מבחני הופיעה שונה בימים, שבועות או חודשים. ראוי לציין, dat-1 ופראי-סוג חיות שטופלו AMPH לא התערוכה SWIP אם פתרונות מלוחה (למשל, פתרון M9) משמשים בקרת מדיה.
הזמן הנדרש עבור רוב בעלי החיים שהפגינו SWIP יכול להשתנות מעט בין שלבים שונים תולעת (L1-L4). לדוגמה, Masoudi et al. (2014) דיווחו כי לאחר 5 דקות 80% של dat-1 L1 חיות עדיין לשחות, ובכך רק 20% של בעלי החיים מוצג SWIP. מצד שני, רק 50% מחיות dat-1 L4 עדיין. לשחות אחרי 5 דקות20 לכן, חשוב כי חיות לגילוי SWIP הם לבדיקה באותו גיל. לנו יש אופטימיזציה שלנו assay באמצעות בעלי חיים L4 מבוים תמיד מאחרת. הזחלים L4 מאוחר יש את היתרון של להיות קל לזיהוי בין הזחל אחרים כי, בשלב זה, בעלי חיים הגיעו לגודל הבוגרים שלהם ולהציג קו דק האופיינית חלוקת המקום לבן במרכז הגוף שלהם, זה יהיה מאוחר להבדיל לתוך הפות בוגר. משך הזמן של וזמינותו גם היא קריטית. לדוגמה, לאחר 15 דקות 90% של מוטציות dat-1 L4 התערוכה SWIP אך במועד מאוחר יותר (30 דקות), רק 60% מהם מוצג SWIP20.
וזמינותו SWIP האוטומטי מבטל טעויות אנוש ומשפר את ההקרנה תפוקה גבוהה ביחס מבחני ידנית. עם זאת, תוכנת מעקב אחר תוכניות הן זמן רב מאז הם רק יכולים לאתר תולעת אחת בכל פעם.
לגבי התנהגויות אחרות תלויות-DA C. elegans , SWIP הוא סוג assay פחות זמן רב. למשל, התגובה מאבדים2 הבסיס אינה בסוג מיידית של וזמינותו. למעשה, תולעים צריך להיות מוזן באופן כרוני עם הסמים, התוצאה עלולה תופעות penetrant את המטרה. לכן, זה לא יכול להיות יעיל על המסך עבור תרופות.
אחד היישומים העיקריים של SWIP הוא על המסך עבור תרופות שונות את המטרה מסלול דופאמין. במקרים איפה הסמים אינם מסיסים במים (למשל, mazindol), דילולים נכונה צריכה להתבצע כדי להשיג ריכוזי איפה הפתרון המוביל אינו רעיל את התולעים. יתר על כן, אם ריכוזים שונים של אותו בשימוש5,13,14, עקומות מנה-תגובה ניתן גם לנתח. לדוגמה, הקצב של ההתקדמות (שיפוע של העקומה של חיות לדקה, איור 2) יכול להיות המדווח הפונקציה של הריכוז, להשתמש כדי להשוות את ההשפעות של תרופות שונות (למשל, AMPH vs. קוקאין).
כאשר SWIP משמשת כדי לחקור את מנגנון הפעולה של תרופות על הסינפסות דופאמין, תשומת הלב צריך להיות משולם אם תוצאות מורחבות בעלי חיים אחרים. למשל, imipramine, מעכב ספציפי של המשגר בתרבית של נוראדרנלין (נטו) שימש לזירוז לתווך DA SWIP N2 בעלי חיים4. C. elegans עושה לא synthetize נוראדרנלין, כתוצאה מכך ואינה מבטאת נטו. עם זאת, המשגר C. elegans DA מניות הומולוגיה עם נטו בתרבית של21. מסיבה זו, תרופות כי הם מעכבים ספציפיים של יונקים נטו מוגבלים השפעות על יונקים DAT (כגון imipramine) להראות סלקטיביות גבוהה C. elegans ידיים למעלה לפיכך, מינים סלקטיביות עלולה להגביל את היכולת שלנו להסיק ממצאים C. elegans לבני אדם.
הגורם החשוב ביותר שיש לקחת בחשבון כאשר מבחני בעיצוב SWIP הוא ההכללה של ניסויים כדי להוכיח כי SWIP מתווך על ידי מערכת דופאמין. למעשה, שחייה לקוי יכולים להיווצר על-ידי גורמים אחרים מלבד גנים הקשורים למערכת דה (למשל, כללי פגמים התכווצות שרירים). כדי להבטיח כי SWIP אכן מתווך על ידי DA, הפרוטוקולים צריכה לכלול ניסויים המבוצעת עם חיות שבו התרוקן DA. זו יכולה להיות מושגת על-ידי שימוש ההסתרה חיות חסר הבעה של חתול-2, homologue C. elegans של hydroxylase טירוזין, המהווה האנזים הגבלת קצב סינתזת דה, או על ידי חיות פראי-סוג מראש לטיפול עם reserpine, . סם שגורם DA ריקון שלפוחית3 למשל, מקדונלד ואח3 הראה הבזליים SWIP הנהוגות מוטציות dat-1 נמצאה כאשר בעלי חיים אלה היו מראש מטופלים עם reserpine. תוצאה זו עולה כי SWIP הוא בתיווך DA. מצד שני, באמצעות חתול-2, dat-1 ומוטציות חסר הביטוי של כל אחד קולטני דופאמין, Safratowich et al. (2014) הדגימו מעקב אמין β-phenylethylamine (βPEA) גורם SWIP בתוך דקה 1 של טיפול באופן עצמאי DA אלא על ידי הפעלה ישירה של יונים ממותגת ליגנד ערוץ LGC-5514. המחברים הראו כי βPEA - ו DA-induced SWIP שונים mechanistically, הם יכולים בקלות שיפלו השפעול. למעשה, בעוד βPEA-induced SWIP DA - ו dop-3-עצמאית, שיגיע ערכים מקסימליים בתוך 1 דקות וה -במהירות ירידות לאחר 2 דקות14, בתיווך DA SWIP החתול-2 ו- dop 3 התלויים היא בעצם אפס אחרי 1 דקה (איור 2). לפיכך, יש הבדל גדול הזמן הנדרש כדי להגיע אפקטים מקסימלי, זה מאפשר במהירות להפלות בין שתי התופעות: 1) SWIP βPEA-induced מהר בתוך דקה 1 מתקבל על ידי הפעלה ישירה של הערוצים LGC-55 ו- 2) איטי בתיווך DA SWIP המתרחש כאשר עודף של DA חוץ-תאית מצטבר לאורך זמן (10-15 דקות) והם קולטני DA DOP-3 והנראה3.
לסיכום, עם ערכת ניסויים, אשר כוללים את השימוש ההסתרה חיות גנים שחקן המפתח של מערכת דופאמין (חתול-2, dat-1, dop-3), השימוש בסמים depleting DA מחסני (reserpine), SWIP כבר משתמשים בהצלחה התירי את מנגנון הפעולה של תרופות כמו AMPH5,13, βPEA14,15 ו azaperone6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצה להודות ד ר אוסמה Refai מהמעבדה של ד ר רנדי בלייקלי להדרכה עם ניתוח אוטומטיות של SWIP. עבודה זו נתמכה על ידי מימון NIH R01 DA042156 כדי LC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionized water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500 g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate - DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate - MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12x16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
References
- de Bono, M., Villu Maricq, A. Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).
- Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
- McDonald, P. W., et al. Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).
- Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).
- Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans. Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).
- Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. Neurochemistry International. , (2018).
- Bermingham, D. P., et al. The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).
- Nass, R., et al. A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).
- Hardaway, J. A., et al. Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis. G3. 2 (8), Bethesda, Md. 961-975 (2012).
- Hardaway, J. A., et al. Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling. Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).
- Felton, C. M., Johnson, C. M. Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels. G3. 4 (6), Bethesda, Md. 1081-1089 (2014).
- Lanzo, A., et al. Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans. Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).
- Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).
- Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel. Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).
- Carvelli, L. Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel. Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).
- Hardaway, J. A., et al. et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis. Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).
- Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -C., Döring, F. Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental Biology. 217, Pt 14 2480-2488 (2014).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).
- Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -L., Holmes, A., Gartner, A. Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans. PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).
- Jayanthi, L. D., et al. The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter. Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).
