Summary
여기서는 모션 큐와 같은 대체 시각적 기능이 물고기의 방향 결정에 미치는 영향을 정량화하는 행동 분석법을 보여 주는 프로토콜을 제시합니다. 대표적인 데이터는 골든 샤이너(노테미고누스 crysoleucas)가가상 물고기의 움직임을 따르는 속도와 정확성에 표시됩니다.
Abstract
집단 동물 행동은 개별적인 운동동기 및 개별적인 적피트를 위해 중요한 사회적인 상호 작용에서 생깁니다. 물고기는 오랫동안 집단 운동, 특히 생태 학적 맥락에서 환경 및 사회적 정보를 통합 할 수있는 능력에 대한 조사를 영감을 주었습니다. 이 데모는 컴퓨터 시각화 및 디지털 이미지 분석을 사용하여 시각적 자극에, 이 경우, 골든 샤이너(Notemigonus crysoleucas)의행동 반응을 정량화하는 데 사용되는 기술을 보여줍니다. 컴퓨터 시각화의 최근 발전은 시각적 기능을 제어하고 미세하게 조작하여 사회적 상호 작용의 메커니즘을 격리할 수 있는 실험실에서 경험적 테스트를 가능하게 합니다. 이 방법의 목적은 독방이든 그룹이든 개인의 방향 결정에 영향을 미칠 수있는 시각적 기능을 분리하는 것입니다. 이 프로토콜은 프로젝터 및 애니메이션의 물리적 Y-미로 도메인, 기록 장비, 설정 및 교정, 실험 단계 및 데이터 분석에 대한 세부 사항을 제공합니다. 이러한 기술은 컴퓨터 애니메이션이 생물학적으로 의미 있는 반응을 유도할 수 있음을 보여줍니다. 또한 이 기술은 광범위한 실험 응용 분야에 대한 대체 가설, 도메인 및 종을 테스트하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다. 가상 자극의 사용은 필요한 살아있는 동물의 수를 감소시키고 대체 할 수 있게 하고, 결과적으로 실험실 오버헤드를 감소시킵니다.
이 데모는 가상 컨특이성의 이동 속도(초당 2개의 바디 길이)의 작은 상대적 차이가 가상 에서 제공하는 방향 신호를 따르는 속도와 정확도를 향상시킨다는 가설을 테스트합니다. 실루엣. 결과에 따르면 배경 노이즈(이미지 일관성 67%)가 있는 경우에도 시각적 신호속도의 증가에 따라 방향 결정이 크게 영향을 받는 것으로 나타났습니다. 모션 큐가 없는 경우 피사체는 무작위로 방향을 선택했습니다. 결정 속도와 큐 속도 사이의 관계는 가변적이었고 큐 속도의 증가는 방향 정확도에 미미하게 불균형한 영향을 미쳤습니다.
Introduction
동물은 서식지를 지속적으로 감지하고 해석하여 다른 사람들과 상호 작용하고 시끄러운 주변 환경을 탐색 할 때 정보에 입각한 결정을 내보합니다. 개인은 자신의 행동에 사회적 정보를 통합하여 자신의 상황 인식과 의사 결정을 향상시킬 수 있습니다. 그러나 소셜 정보는 특정 메시지를 전달하기 위해 진화한 직접 신호(예: 흔들기)를 통해 신뢰할 수 없는 의도하지 않은 단서(즉, 포식자를 피하기 위한 갑작스런 기동)를 통한 추론에서 비롯됩니다. 꿀벌춤) 1. 개인이 사회적 단서또는 감각 정보의 가치를 신속하게 평가하는 방법을 식별하는 것은 특히 개인이 그룹으로 여행하는 경우 구도자에게 어려운 작업이 될 수 있습니다. 비전은 사회적 상호 작용을지배하는 데 중요한 역할을 한다 2,3,4 및 연구는 각 개인의 시야에 따라 물고기 학교에서 발생할 수있는 상호 작용 네트워크를 유추한 5, 6. 그러나 어류 학교는 동적 시스템이므로 그룹 구성원 간의 상호 작용으로 인해 발생하는 고유의 공선및 혼란스러운 요인으로 인해 특정 기능 또는 이웃 행동에 대한 개별 응답을 격리하기가 어렵습니다. 이 프로토콜의 목적은 대체 시각적 기능이 혼자 또는 그룹 내에서 여행하는 개인의 방향 결정에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 를 격리하여 현재 작업을 보완하는 것입니다.
현재 프로토콜의 장점은 조작 실험과 컴퓨터 시각화 기술을 결합하여 개인이 자연에서 경험할 수 있는 기본 시각적 기능을 분리하는 것입니다. 구체적으로, Y-미로(그림 1)는 이진 응답으로 방향 선택을 축소하고 가상 이웃의 수영 동작을 모방하도록 설계된 컴퓨터 애니메이션 이미지를 도입하는 데 사용된다. 이러한 이미지는 미로 아래에서 하나 이상의 피사체 아래에서 수영하는 conspecifics의 실루엣을 모방하기 위해 투영됩니다. 이러한 실루엣의 시각적 특성, 예: 형태, 속도, 일관성, 및 수영 동작은 대체 가설을 테스트하기 위해 쉽게 맞춤화되어7.
이 논문은 모델 사회 어종의 개인, 골든 샤이너(Notemigonus crysoleucas)가가상 이웃의 상대적 속도에 어떻게 반응하는지 고립시킴으로써이 접근법의 유용성을 보여줍니다. 여기서 프로토콜 포커스는 가상 이웃의 방향 영향이 속도에 따라 변화하는지 여부와 그렇다면 관찰된 관계의 형태를 정량화하는 것입니다. 특히, 방향 신호는 실루엣의 고정 된 비율이 리더 역할을하고 한 팔 또는 다른 쪽으로 탄도적으로 이동함으로써 생성됩니다. 나머지 실루엣은 지시선/산만 비율을 조정하여 조정할 수 있는 배경 노이즈를 제공하기 위해 임의로 이동하여 산만하게 작동합니다. 지시자와 산만도의 비율은 방향 단서의 일관성을 캡처하고 그에 따라 조정할 수 있습니다. 산만 한 실루엣은 결정 영역 ("DA", 그림 1A)에국한 된 실루엣이 경계에서 반사하도록 합니다. 그러나 리더 실루엣은 DA 영역을 떠나 지정된 팔을 입력한 후 실루엣이 팔 길이의 1/3을 통과하면 서서히 사라지도록 허용됩니다. 리더가 DA를 떠날 때, 새로운 리더 실루엣은 자신의 자리를 차지하고 리더 / 산만 비율이 실험 전반에 걸쳐 DA에서 일정하게 유지되도록 자신의 정확한 경로를 되돌리.
가상 물고기의 사용은 시각적 인 감각 정보의 제어를 허용, 피사체의 방향 반응을 모니터링하면서, 이는 그룹으로 사회 탐색, 운동, 또는 의사 결정의 새로운 기능을 공개 할 수있다. 여기서 사용되는 접근 방식은 컴퓨터 애니메이션을 조작하여 다양한 복잡성의 행동 패턴을 생성하여 치명적인 스트레스 또는 사회적 상호 작용에 대한 포식의 영향과 같은 광범위한 질문에 적용할 수 있습니다.
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Protocol
모든 실험 프로토콜은 환경 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다, 미국 육군 엔지니어 및 연구 개발 센터, 빅스 버그, MS, 미국 (IACUC # 2013-3284-01).
1. 감각 미로 디자인
- 전용실에서 투명 지지 플랫폼 위에 놓인 방수 폴리 메틸 메타크릴레이트 Y-미로 플랫폼(사내 제작)에서 실험을 수행한다. 플랫폼은 두께가 1.9cm이며 폭 1.3m, 길이 1.3m, 높이 0.19m의 압출 알루미늄 빔 4 7.62cm로 지지됩니다.
- 건설에서 동일한 지주 및 결정영역을 구성합니다(그림 1A). 여기서 Y-미로 암은 길이 46cm, 너비 23cm, 깊이 20cm이며 중앙 결정 영역은 약 46cm입니다.
- Y-maze 하단의 흰색 프로젝트 스루 극장 화면을 부착하여 시각적 자극을 도메인에 투사합니다.
- Y-미로의 측면을 흰색 비닐로 코팅하여 외부 시각적 자극을 제한합니다.
- (투명 모노필라멘트를 통해) 원격으로 제어된 클리어 게이트를 설치하여 중앙 결정 영역에서 홀딩 영역을 분할하여 응고 후 피사체를 미로로 방출합니다.
- 도어 프레임의 바닥에 닿는 조명 차단 블라인드와 같이 물고기가 외부 방이나 복도에서 빛의 영향과 그림자 움직임을 최소화하지 못하도록 블라인드를 추가로 배치합니다.
2. 녹음 장비
- 배경 이미지, 가상 물고기 및 피사체 물고기 사이의 대비에 따라 오버헤드 카메라(흑백)를 선택합니다.
- 위에서 미로를 기록하고 물고기의 행동과 시각적 프로젝션을 기록하기 위해 오버 헤드 카메라를 설치합니다.
- 이 데모에서는 9m IP 케이블이 제어실에 1Gb 이더넷 카드가 있는 컴퓨터에 부착되도록 기가바이트 이더넷(GigE) 카메라를 사용합니다.
- 카메라를 인접한 공간의 컴퓨터에 연결하여 관찰자가 게이트, 시각 자극 프로그램 및 카메라 녹화 소프트웨어를 원격으로 제어할 수 있습니다.
- 카메라 설정이 샘플링 및 주파수 속도로 켜져 있는지 확인하여 카메라와 소프트웨어가 실내 조명으로 위상을 벗어났을 때 발생하는 깜박임 효과를 방지합니다.
- 위치의 전기 주파수를 확인; 카메라 샘플링 속도(초당 프레임, fps)를 오프셋하여 AC 주파수를 정수로 곱하거나 나누어 깜박이는 것을 방지합니다.
- 소프트웨어와 컴퓨터를 사용하여 이미지 선명도가 최적화되어 관련 동작을 시각화하도록 카메라 설정을 설정합니다.
- 이 데모에서는 공간 해상도가 1280픽셀 x 1024픽셀인 30fps에서 샘플링을 수행합니다.
3. 조명, 프로젝터 및 카메라 설정 보정
- 실험실 의 벽을 따라 4개의 오버헤드 트랙 조명 시스템을 설치합니다.
- 조명에 조정 가능한 제어 스위치를 설치하여 올바른 실내 주변 광원을 보다 유연하게 조정할 수 있습니다.
- 미로에 반사를 피하기 위해 조명을 배치합니다(그림1B).
- 미로의 지지 구조의 하단 가장자리에 짧은 던지기 (ST) 프로젝터를 고정 (그림1C).
- 투영 해상도를 선택합니다(이 데모의 경우 1440픽셀 x 900픽셀로 설정).
- 오버헤드 라이트와 프로젝터에 의해 생성된 주변 광레벨을 피사체의 하우징 룸에서 볼 수 있는 조명 조건에 맞게 조정합니다(여기서는 흐린 날의 자연 조명과 동등한 데모 실험 중 134±5 lux로 설정됨).
- 실험 시험 중 쉽고 일관성을 위해 조광기 스위치의 위치를 잠그거나 표시합니다.
- 카메라 뷰어 프로그램을 사용하여 노출 모드, 게인 및 화이트 밸런스 제어를 제어하도록 카메라를 구성합니다.
- 이 데모에서는 Pylon 뷰어를 "연속 샷", 8000μs 노출 시간, 0 게인 및 96 화이트 밸런스로 설정하여 비디오 녹화를 제어할 수 있습니다.
4. 시각적 프로젝션 프로그램 보정 : 배경
- 균일한 배경을 미로 바닥에 투사하고 프로젝터의 라이트 왜곡을 측정합니다. 여기서 배경은 과학 프로젝트 (https://processing.org/examples/)에 대한 사용자 정의 시각화를 만들 수있는 견인 및잘 문서화 된 플랫폼인 Processing (v. 3)을 사용하여 만들어졌습니다.
- 미로의 맨 아래에 투영할 처리 창을 실행하는 프로그램을 만듭니다. 창의 배경 색 을 사용자 지정하는 것은 RGB 색상 코드를 허용하는 배경 명령으로 수행됩니다. 몇 가지 작은 예제 프로그램은 처리자습서 (https://processing.org/tutorials/)에서 찾을 수 있습니다.
- 배경 색 프로그램을 사용하여 프로젝터 및 외부 조명 조건을 교정합니다.
- 이미지 처리 프로그램을 사용하여 프로젝터에서 생성된 라이트 왜곡을 측정하여 생성된 예상 균일한 배경의 편차를 식별합니다. 다음 단계는 ImageJ(v. 1.52h) 사용에 적용됩니다. https://imagej.nih.gov/ij/).
- 균일한 배경색으로 조명된 Y-미로의 스틸 프레임 이미지를 캡처하고 ImageJ에서 엽니다.
- 직선, 세그먼트 또는 자유형 선 도구를 사용하여 핫스팟 중앙의 가장 밝은 위치에서 Y-미로의 맨 위까지직선 수직 선을 그립니다(그림 2A).
- 분석 메뉴에서 플롯 프로파일을 선택하여 회색 축척 값과 거리 의 픽셀 그래프를 만듭니다.
- 픽셀 데이터를 인덱스 열과 픽셀 값 열로 구성된 쉼표 분리 된 파일(.csv 파일 확장자)으로 저장합니다.
- 투영 영역을 미로(그림2B)에 정렬하고 원치 않는 라이트 왜곡을 모델링하여 프로젝터에서 생성할 수 있는 색상 왜곡을 줄입니다(그림2C). 다음 에서는 현재 데모에서 수행한 단계를 간략하게 설명합니다.
- 적절한 탭으로 구분된 읽기 함수를 사용하여 ImageJ 픽셀 강도 데이터 파일을 가져옵니다(예: tidyverse 패키지에서 read_csv를 사용하여 쉼표 분리된 파일에서 읽습니다).
- 배경에서 생성된 왜곡 수준에 대한 기준 참조를 제공하기 위해 변형 계수와 같이 샘플 트랜스를 따라 광 강도의 가변성을 계산합니다.
- 원시 픽셀 값을 변환하여 가장 밝은 픽셀에서 가장 어두운 강도로 의 상대적인 강도 변화를 반영하여 가장 작은 픽셀 강도가 이미지 프로그램에서 선택한 원하는 배경 색 값에 접근합니다.
- 변칙의 가장 밝은 부분에서 시작하는 변환 픽셀 강도 값을 플롯하면 일반적으로 소스로부터의 거리의 함수로서 강도 값의 감소 추세를 생성합니다. 비선형 최소 제곱(함수 nls)을사용하여 데이터에 가장 적합한 매개 변수 값을 추정합니다(여기 가우시안 감쇠 함수).
- R(v. 3.5.1)을 사용하여 프로젝터에서 생성할 수 있는 색상 왜곡을 줄이기 위해 배경 카운터 이미지를 생성하기 위해 채택된 동일한 프로그램을 사용하여 카운터 그라데이션을 만듭니다(처리 v. 3).
주: 그라데이션 함수는 중심으로부터의 거리의 함수로서 픽셀 강도가 변경되는 이미지에서 가장 밝은 지점을 중심으로 일련의 동심원을 생성합니다. 각 링의 색상은 모델이 배경색에서 예측한 픽셀 강도의 변화를 빼서 정의됩니다. 이에 따라 링 반지 반지는 소스로부터의 거리에 따라 증가합니다. 가장 적합한 모델은 그라데이션 전체의 픽셀 강도를 줄여 배경 균일성을 제공해야 합니다.- 필요한 매개 변수를 조정하여
시각적 자극 프로그램을 사용하여 가우시안 그라데이션() 만들기- 매개변수 매개변수는 가우시안 분포 그라데이션의 밝기/어두움에 영향을 줍니다. 값이 높을수록 그라데이션이 어두워지게 됩니다.
- 매개변수 b는 그라데이션의 분산에 영향을 줍니다. 값이 클수록 원하는 배경 픽셀 강도c로 수평을 지정하기 전에 그라데이션이 확장됩니다.
- 매개 변수 c는 원하는 배경 픽셀 강도를 설정합니다. 값이 클수록 배경이 어두워지게 됩니다.
- saveFrame 기능을 사용하여 이미지를 폴더에 저장하여 실험 실험 중에 자극을 렌더링할 때 메모리 부하를 최소화하기 위해 실험 중에 고정된 배경 이미지를 업로드할 수 있습니다.
- 그림 2C와같이 배경 생성 프로그램을 다시 실행하고 결과를 시각적으로 검사합니다. 4.3 단계를 반복하여 시료 트랜스에 걸쳐 광 강도의 가변성을 줄이는 관찰된 개선사항을 정량화합니다.
- 필요한 매개 변수를 조정하여
- 적응 영역의 RGB 값이 결정 영역과 유사할 때까지 추가 수동 조정을 위해 조명 레벨, 모델 매개변수 또는 트랜스커트(예: 카운터 그라데이션의 외부 반지름)로 덮인 거리를 경험적으로 조정합니다. 이 테스트의 모델 매개변수는 a = 215, b = 800 및 c = 4입니다.
- 실험 시각적 자극 프로그램에 최종 필터를 추가합니다.
시각적 자극 프로그램을 사용하여 가우시안 그라데이션() 만들기5. 시각 투영 프로그램 보정 : 시각적 자극
참고: 시각적 자극을 렌더링하고 애니메이션하는 작업은 플랫폼 자습서와 함께 아래 단계를 가이드로 사용하여 처리할 수도 있습니다. 현재 프로그램의 논리의 도식은(그림3)에 제공되며 추가 세부 사항은 Lemasson 외(2018)7에서확인할 수 있습니다. 다음 단계는 현재 실험에서 수행된 교정 단계의 예를 제공합니다.
- 시각적 프로젝션 프로그램 Vfish.pde를 열어 미로의 결정 영역(그림1A)내에서 투영을 중앙에 놓고 테스트 중인 가설을 기반으로 시각적 투영을 보정합니다(예: 일치하는 실루엣의 크기와 속도 보정) 시험 대상자의 경우). 교정은 미리 선택된 디버깅 플래그를 사용하여 기본 프로그램(Vfish.pde)의 헤더에서 손으로 조정됩니다. 디버깅 모드(DEBUG = TRUE)에서 각 디버깅_LEVEL_# 플래그(숫자 0-2)를 순차적으로 단계별로 단계별로 조정하여 필요한 조정을 합니다.
- 디버깅_LEVEL_0 플래그를 'true'로 설정하고 스케치 창에서 재생 아이콘을 눌러 프로그램을 실행합니다. 투영이 중심이 될 때까지 x 및 y 위치 값(도메인 매개변수 dx 및 dy)을 각각 변경합니다.
- 디버깅_LEVEL_1을 'true'로 설정하여 물고기 실루엣의 크기를 조정합니다(타원으로 렌더링됨). 프로그램을 실행하고 타원의 너비(eW) 및 길이(eL)를 시험 대상자의 평균 크기와 일치할 때까지 반복적으로 조정합니다. 그런 다음 디버깅_LEVEL_2를 'true'로 설정하여 실루엣(ss)의 기준 속도를 조정합니다.
- 디버그 = FALSE를 설정하여 디버깅 모드를 종료합니다.
- 산만한 실루엣이 결정 영역(DA, 그림 1A)에바인딩된 상태로 유지되고, 지시선 실루엣 궤적이 양쪽 팔과 제대로 정렬되고 DA 내의 지시선/산만 비율이 일정하게 유지되는지 확인합니다.
- 옵션의 기능을 보장하기 위해 프로그램의 GUI를 단계별로 확인합니다.
- 데이터가 파일에 제대로 기록되고 있는지 확인합니다.
- 레코딩 소프트웨어가 시각적 투영이 있는 피사체 물고기를 추적할 수 있는지 확인합니다. 물고기를 추적하는 단계는 이전에 Kaidanovich-Berlin 외 (2011)8, Holcomb et al. (2014)9,Way et al. (2016)10 및 Zhang et al. (2018)11에기재되어 있다.
6. 동물 준비
- 성별, 연령, 유전자형을 포함한 연구 질문 및 적용에 기초하여 대상 종을 선택한다. 실험 용 탱크에 대상을 할당하고 기준선 생체 통계 (예를 들어, 신체 길이 및 질량)를 기록합니다.
- 미로의 환경 조건을 유지 시스템의 환경 조건을 설정합니다. 행동의 기준선 실험에 대한 수질 조건은 종종 종과 실험 도메인 설정에 대한 최적의 상태로 유지됩니다.
- 이 데모에서는 12 h 빛 / 12 h 암흑 주기, 오버 헤드 플리커프리 할로겐 조명을 134 ± 5 lux, 22 ± 0.3 ° C, 97.4 ± 1.3 % 용존 산소 및 pH 7.8 ± 0.1로 설정하십시오.
- 실험 시험이 시작되기 전에 컴퓨터로 생성된 시각적 자극(예를 들어, 물고기 실루엣)없이 5일 동안 하루 최대 30분 동안 도메인으로 동물을 옮기어 동물을 습관화한다.
- 그 당시의 대상 물고기가 선택, 할당, 계량, 측정 및 실험 탱크로 전송되었는지 확인하십시오.
참고: 여기서, 골든 샤이너스 표준 길이 및 습식 중량은 각각 63.4±3.5 mm SL 및 1.8±0.3 g WW였다. - 탱크와 미로 사이에서 물고기를 이동할 때 물 대 물 전달을 사용하여 취급 및 공기 노출로 인한 스트레스를 줄입니다.
- 피험자의 자연적인 생물학적 리듬을 반영하는 정기적인 고정광 주기 동안 실험을 수행합니다. 이것은 행동에 소화 효력을 제한하기 위하여 매일의 실험 적인 예심의 끝에 피험자가 공급될 수 있습니다.
7. 실험 절차
- 실내 프로젝터와 LED 조명 트랙 시스템을 미리 정해진 밝기 수준(이 데모에서는 134±5 lux)으로 켜서 전구가 따뜻해집니다(약 10분).
- 카메라 뷰어 프로그램을 열고 설정에서 저장된 조리개, 색상 및 녹화에 대한 설정을 로드하여 최고 품질의 비디오를 얻을 수 있습니다.
- 파일론 뷰어를 열고 녹화에 사용할 카메라를 활성화합니다.
- 카메라 드롭다운 메뉴에서 피처 로드를 선택하고 저장된 카메라 설정 폴더로 이동합니다.
- 저장된 설정(여기에 camerasettings_20181001로 표시됨)을 열어 비디오 품질을 보장하고 연속 촬영을 클릭합니다.
- 파일론 뷰어를 닫습니다.
- 시각적 프로젝션 프로그램 Vfish.pde를 열고 프로젝션이 미로의 중심에 있는지, DataOut 폴더가 비어 있는지, 프로그램이 예상대로 작동하고 있는지 확인합니다.
- 5.1.1단계를 사용하여 교정 링이 DA의 중심에 있는지 확인합니다.
- DataOut 폴더를 열어 하루 동안 비어 있는지 확인합니다.
- Vfish.pde의 스케치 창에서 재생을 눌러 시각적 자극 프로그램을 실행하고 프로그램 기능을 보장하기 위해 더미 변수를 사용합니다.
- 물고기 ID 번호(1-16)를 입력한 다음 Enter를 누른 다음 Y 또는 N을 예로 또는 아니요로 눌러 선택을 확인합니다.
- 그룹 크기(여기에 1로 고정됨)를 입력하고 선택을 확인합니다.
- 원하는 실루엣 속도 (0-10 BL /s)를 입력 하 고 선택을 확인 합니다.
- Enter를 눌러 적응 기간을 지나이동하여 결정 영역에서 가상 물고기의 투영을 확인합니다.
- 일시 중지를 눌러 프로그램을 일시 중지하고 더미 결과 선택(예: 왼쪽(1) 또는 오른쪽(2)을 입력합니다.
- 중지를 눌러 프로그램을 종료하고 데이터를 파일에 기록합니다.
- 데이터가 DataOut 폴더에 파일로 제대로 작성되었는지 확인하고 물고기를 적응을 위해 도메인에 배치하기 전에 랩 노트에서 테스트 실행으로 파일을 기록합니다.
- 클럭 타임과 스톱워치를 사용하여 랩 노트북에서 시험의 시작 및 중지 시간을 기록하여 일부 복제 시험의 짧은 기간으로 인해 비디오 재생에서 나중에 추출할 수 있는 경과 시간을 보완할 수 있습니다.
- 물 변경 수행(예: 30%) 미로에 피사체를 전송하기 전에 유지 시스템 통근 물을 사용하여.
- 수질이 미로와 홀딩 시스템 사이에 유사한지 확인하고 게이트가 물 높이 바로 위로 부드럽게 미끄러지는지 확인합니다.
- 실험의 과정에 걸쳐 대상 치료 노출을 무작위로 한 소정의 실험 일정을 사용하여, 현재 시험에 대해 선택된 값을 입력한다(적응화 화면에서 정지, 단계 7.3.3.1- 7.3.3.3).
- 처리 조합 데이터를 랩 노트북에 기록합니다.
- 10 분 적응 기간 동안 Y-미로 보유 영역으로 피사체를 전송합니다.
- 비디오 녹화를 시작한 다음 적응 기간이 끝나면 Vfish.pde 창에서 반환 키를 누르고 있습니다. 이렇게 하면 시각적 프로젝션이 시작됩니다.
- 가상 물고기가 도메인에 나타나면 시계 시간을 기록하고 홀딩게이트를 들어 올립니다(그림 4A).
- 피험자의 신체 50%가 선택 암(그림4B)으로이동하거나 지정된 기간이 경과할 때(예: 5분) 시험을 종료합니다.
- 시계 시간, 스톱워치에서 의시작 및 정지 시간, 피사체의 선택(예: 왼쪽(1), 오른쪽(2) 또는 선택 안 함(0)을 기록합니다.
- 비디오 녹화를 중지하고 시각적 자극 프로그램에서 일시 중지를 누르면 사용자에게 평가판 결과 데이터(선택한 팔 번호 또는 0을 선택하지 없음을 표시)를 표시합니다. 선택을 확인하면 프로그램이 첫 번째 화면으로 돌아가 다음 실험 에 예상되는 값을 기다립니다.
- 피사체를 수집하고 각 보유 탱크로 되돌아갑니다. 각 평가판에 대해 7.7-7.13 단계를 반복합니다.
- 세션이 끝나면 (오전 또는 오후) 세션의 마지막 물고기가 결정을 내린 후 프로그램에서 중지를 누릅니다. 중지를 누르면 세션의 데이터가 파일로 기록됩니다.
- 수질 안정성을 보장하기 위해 아침 세션이 끝날 때 물 교환을 반복하십시오.
- 하루의 마지막 시험이 끝나면 랩 노트북을 검토하고 필요한 메모를 합니다.
- 시각적 자극 프로그램에서 중지를 눌러 수집된 데이터를 DataOut 폴더로 출력합니다.
- 시각화 프로그램에서 저장한 데이터 파일의 번호, 이름 및 위치를 확인합니다.
- 아침 설정과 비교할 수있는 미로 방의 조명 수준과 함께 수질을 기록하십시오. 폭기 시스템과 히터를 Y-미로에 넣습니다.
- 프로젝터 및 실험실 추적 조명을 끕니다.
- 미리 정해진 일일 배급을 물고기에게 먹이라.
8. 데이터 분석
- 실험 데이터에 필요한 변수(예: 날짜, 평가판, 제목 ID, 프로그램에서 선택한 팔, 테스트된 시각적 요인, 주제 선택, 시작 및 중지 시간 및 주석)가 포함되어 있는지 확인합니다.
- 기록 오류(사람이나 프로그램이 유도된)가 있는지 확인합니다.
- 응답을 표로 하고 피험자의 부분에 대한 방향성 편향의 징후를 확인합니다(예를 들어, 대조군 조건에서 팔 선택에대한 이항 시험) 7.
- 실험이 동일한 개인에 대한 반복 측정을 사용하여 설계된 경우, 여기에있는 경우와 같이, 혼합 효과 모델의 사용을 제안한다.
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Representative Results
가설 및 설계
이 실험 시스템의 유용성을 입증하기 위해 우리는 골든 샤이너가 시각적 신호를 따르는 정확도가 그 단서의 속도로 향상될 것이라는 가설을 테스트했습니다. 야생형 골든 샤이너는사용하였다(N=16, 체길이, BL, 및 습식 중량, WW, 63.4±3.5 mm 및 1.8±0.3 g, 정중하게). 시각적 자극(리더/산만비율)의 일관성은 0.67로 고정되었으며, 모션 큐(즉, 리더)가 산만함으로 이동하는 속도를 조작했습니다. 지향성 신호를 제공하는 리더 실루엣의 속도 수준은 0-10 BL/s(2배 증가)에 이르는데, 이는 일반적으로 물고기12에서지속적, 장기간 또는 버스트 수영 모드를 반영하는 것으로 간주되는 속도 범위에 걸쳐 있다. 제어 수준에서 0, 리더 실루엣은 임의로 방향이 지정된 산만한 사람들 사이에서 대상 팔을 향하게 되었지만 실루엣은 움직이지 않았습니다. 대상 팔은 프로그램에 의해 각 평가판에 대해 무작위로 선택되었습니다. 거리 단위는 피사체의 평균 표준 길이로 정의된 바디 길이이며 시간은 초단위입니다. 현재 대표적인 분석은 1차 반응 변수(의사 결정 속도 및 정확도)를 측정하는 데 중점을 두고 있지만, 실험 설계를 통해 조사자가 피사체의 움직임을 추적하고 분석하여 추가 정보를 추출할 수 있습니다. 운동학.
우리의 물고기 과목은 프로토콜의 섹션 6 다음 보관했다. 각 피험체는 하루에 1단계의 치료에 노출되었다. 우리는 피험자 치료 수준 (큐 속도) 일 및 피험자가 매일 테스트 된 순서 내에서 모두 무작위화했습니다. 선형 및 일반화 선형 혼합 효과 모델(각각 LMM 및 GLMM)은 피사체가 시각적 자극을 따르는 속도와 정확도에 대한 리더 실루엣 속도의 효과를 테스트하는 데 사용되었습니다. 주체 ID는 두 모델 모두에서 임의의 효과로 포함되었다.
데이터 및 결과
어떤 모션 큐의 부재에서 골든 샤이너는 예상대로 행동하고 무작위로 자신의 방향을 선택 (자극 속도 = 0, 이노미얼 테스트, n왼쪽= 33, n오른쪽= 40, = 0.45, P = 0.483). 대부분의 과목은 도메인 내에서 스트레스 행동의 흔적을 보여주지 않고 할당 된 시간 (5 분) 이내에 결정적인 결정을 내렸지만, 22 %의 피험자는 보류 영역을 떠나거나 결정 영역에 들어가는 것을 꺼리는 것으로 나타났습니다. 이러한 우유부단한 물고기의 데이터는 분석에 포함되지 않았습니다. 나머지 78%의 피험자는 그 자극의 속도가 증가함에 따라 방향 자극을 따르는 정확도에서 현저한 개선을 보였다(GLMM, z = 1.937, P = 0.053). 그림 5A는 자극 속도 레벨의 각 증가에 대한 방향 정확도가 1.2배 증가하는 이 관계의 특성을 보여줍니다. 이 관계는 단지 겸손하게 불균형하고, 그 자체로, 큐 속도의 변화에 대한 임계 응답의 암시하지 않습니다. 자극 속도의 증가는 또한 결정 속도의 현저한 증가로 이어졌다(LMM, F1,56= 4.774, P = 0.033). 그러나 그림 5B에서 알 수 있듯이 결정 속도의 추세는 자극 속도 수준에서 일관되지 않고 매우 가변적이었습니다. 이러한 결정 속도 데이터에서 명백한 것은 자극이 움직이지 않았을 때보다 자극이 움직일 때보다 5-20배 더 오래 걸리는 피험자(자극에 대한 결정 속도 4.6±2.3 s 및 81.4±74.7s)가 더 오래 걸렸다는 것입니다. 각각 0과 8의 속도, ± 표준 편차, SD). 실제로, 제어 레벨없이 우리는 자극 속도의 함수로 결정 속도에 큰 변화를 발견하지 않았다.
그림 1. Y-미로 도메인. A. 의사 결정 시험을 위한 Y-미로 장치의 이미지. 주석은 유지 영역(HA, 녹색), 결정 영역(DA, 파란색), 왼쪽 결정 암(LDA) 및 오른쪽 결정 암(RDA)을 나타냅니다. B. Y-미로의 이미지와 오버 헤드 조정 트랙 조명 및 GigE 카메라 배치 (4 개의 오버 헤드 라이트 스트립 중 하나만 볼 수 있음). C. 시험 중 또는 그 사이의 움직임을 제거하기 위해 슬라이딩 캐리지에 의해 잠긴 프로젝터 배치를 포함한 Y-미로(측면 보기)의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 배경 및 자극 보정. A. 균일한 배경색과 픽셀 강도의 Transect(녹색 선)을 가진 조명된 Y-미로의 이미지는 유지 영역과 결정 영역 사이의 DA(평균 픽셀 강도 112±1278)이다. 프로젝터의 전구(핫스팟)에서 생성된 광그라데이션을 명확하게 볼 수 있습니다. B. DA와 투영의 정렬을 보여주는 이미지입니다. C. 필터링 된 배경과 교정 (크기, 속도)을 위해 DA의 중앙에 투영 된 고독한 실루엣이있는 미로 이미지. (C)에 카운터 그라데이션 배경을 추가하면 어두운 배경(평균 픽셀 강도 143.1±5.5) 및 공간 가변성(변형 계수 11.4(A.)에서 0.03(C.)으로 떨어집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 실험에 사용된 시각화 프로그램에서 작업의 일반적인 흐름에 대한 회로도입니다. 추가 절차 정보는 7을참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 실제 물고기 실루엣과 가상 물고기 실루엣 모두 실험 시험. A. 이미지 a (라이브) 골든 샤이너 가 유지 영역을 떠나 (녹색 원). B. 가상 물고기 실루엣 중 결정 영역 (녹색 원)에서 (라이브) 골든 샤이너의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 모션 큐의 상대 속도 변화에 대한 방향 응답의 정확도 및 속도입니다. A. 골든 샤이너가 자극 속도(BL/s)에 대해 그려진 '리더' 실루엣을 따랐던 물고기 결정 정확도그래프. B. 자극 속도 (BL / s)에 대해 플롯 물고기 결정 속도의 그래프. 데이터는 ± 표준 오차를 의미하며, SE. 15개의 가상 실루엣 그룹은 67% 일관성 수준(15개의 실루엣 중 10개가 리더역할을 하고 나머지 5개의 실루엣은 산만함으로 작용함)으로 의사 결정 영역에 걸쳐 무작위로 분포되어 있으며, 0-10 BL/s. 산만 속도는 실루엣이 움직이지 않는 컨트롤을 제외한 모든 속도 에서 1 BL/s로 고정된 상태로 유지되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
시각적 단서는 흑백 격자(13)에 노출 된 물고기에서 광운동 반응을 유발하는 것으로 알려져 있으며 이웃 속도가 동적 상호 작용을 관리하는 데 영향을 미치는 이론적 및 경험적 증거가 증가하고 있습니다. 물고기 학교에서관찰 7,14,15,16,17. 그룹의 개인이 모든 식별 가능한 단서14에비례하여 반응하거나 모션 임계값 응답17을채택하거나 충돌 시간을 모니터링하는 것과 같은 이웃 움직임을 통합하는 방법을 설명하기 위해 대조되는 가설이 존재합니다. 18. 이러한 대체 가설을 테스트하는 첫 번째 단계는 기본 가정을 검증하는 것입니다. 여기에서는 특정 감각 기능이 방향 성 결정을 내리는 데 미칠 수 있는 역할을 식별하는 데 있어 프로토콜의 유용성을 입증했습니다.
우리는 사회 물고기 종의 개인, 골든 샤이너, 학교에서 conspecifics를 모방하도록 설계 시각적 자극의 상대적 속도의 변화에 대응하는 방법을 격리. 골든 샤이너 방향 정확도는 시각적 자극의 상대적 속도의 증가로 개선되었지만, 이러한 변수 들 사이의 기능적 관계는 미미하게 불균형했다. 결정 속도와 자극 속도 사이의 관계는 중요하지만 매우 가변적이고 일관성이 없었습니다. 그러나 결과는 이러한 물고기의 시야에 흩어져 있는 이미지에서 발견되는 속도 차이가 응답을 트리거하고 주의를 기울이는 데 중요한 역할을 한다는 것을 보여줍니다. 개별이 특정 이웃의 행동 사이에서 선택하는 방법을 따로 괴롭히는 것은 자극에 있는 충돌하는 방향을 소개해서 현재 디자인으로 조사될 수 있었습니다.
Zebrafish, Danio rerio와의 최근 실험에서, 우리는 독방시험7에서 우유부단의 증거를 발견하지 못했습니다, 그러나 이 데모에서 골든 샤이너는 보유 지역을 떠나는 것을 더 큰 꺼림을 보였습니다. 이 두 종 사이의 차이점은 그들의 생활 역사 전략과 그들의 사회적 경향의 상대적 강도에 의해 설명 될 수있다 (또는 의존). Zebrafish는 골든 샤이너스보다 더 다양한 사회적 일관성을 보이는 것으로 보입니다(예: 학부 대 의무 학생 3). 골든 샤이너에서 강한 사회적 일관성은 수줍음의 높은 수준을 보여주는 주제에 기여 했을 가능성이 높습니다., 또는 그들의 얼룩말 물고기 대응 보다 도메인 내에서 주저.
단계의 순서는 프로토콜에서 미묘하지만 중요합니다. 조명, 프로젝터 및 프로그램 필터의 균형을 맞추는 과정은 새 도메인에 대해 예상하는 것보다 더 많은 시간이 걸릴 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 벽(도메인이 아닌)에서 반사되는 트랙 라이트 사용, 조정 가능한 조명 컨트롤러 및 프로젝터용 프로그램 생성 필터와 같이 설정 및 조명 균형 시간을 줄이기 위해 학습한 교훈이 포함되어 있습니다. 또한 사람의 눈에 시각적으로 허용되는 것으로 보이는 것은 카메라와 소프트웨어가 동일한 방식으로 볼 수 없으므로 조명 조건에서 추가 조정이 필요할 수 있습니다. 모니터 각도가 약간 변경되더라도 배경 그라데이션이 변경됩니다. 따라서 파일 설정을 자세히 작성하고 저장하면 실험 중에 변경이 발생할 가능성이 크게 줄어듭니다. 여기에 제시된 대로 물리적에서 필터링으로 프로세스를 진행하면 성공으로 가는 가장 빠른 단계가 생성됩니다.
ST 프로젝터를 사용하면 모니터보다 공간 유연성을 높일 수 있지만 이 방법을 사용하면 "핫스팟"이라고 불리는 원치 않는 시각적 이상이 생성됩니다. 핫스팟은 프로젝터 의 전구 근접에 의해 생성된 투영 표면의 밝은 지점입니다. 프로토콜에서 섹션 4는 백그라운드 필터를 만들고 도메인 전체에서 균일한 번개를 확인하는 데 전념했습니다. 여기에 제공된 단계는 사용자가 원치 않는 그라데이션을 모델링하고 모델을 사용하여 역 그라데이션을 재현하여 효과를 방지하거나 최소화하는 데 도움이 됩니다. 마지막으로 ST 프로젝터 모델은 다양하지만 이미지 조정(회전, 뒤집기, 전면 또는 후면 화면 프로젝션) 및 키스톤 보정(±3-5도)은 원하는 이미지가 도메인에 적합하고 왜곡을 위해 조정할 수 있도록 하는 유용한 기능입니다.
시간이 지남에 따라 실험실은 하드웨어(예: 카메라, 케이블, 비디오 카드, 모니터)의 변경으로 쉽게 업데이트되었습니다. 하드웨어 변경으로 인해 조명의 균형을 맞추고 잠재적인 프로그램 문제를 해결하는 데 추가적인 시동 시간이 발생할 수 있다는 점에 주목할 필요가 있습니다. 따라서 원하는 실험이 완료될 때까지 모든 하드웨어를 시스템 전용으로 전용으로 하는 것이 좋습니다. 대부분의 과제는 모니터, 비디오 카드 및 카메라 간의 성능 차이로 인해 프로그래밍 코드가 변경되는 경우가 있습니다. 이 작업 이후 내부 테스트 도메인을 제거하고 다른 테스트 도메인으로 전환할 수 있는 새 도메인이 개발되었습니다. 실험 도메인 및 지원 구조를 디자인할 때 이러한 유연성을 고려하는 것이 좋습니다.
현재 프로토콜을 통해 조사관은 학교 내에서 예상되는 시각적 환경을 반영하는 방식으로 시각적 기능을 분리하고 조작하는 동시에 실제 conspecifics에 대한 노출을 수반하는 혼란스러운 요인(예: , 굶주림, 친숙함, 침략)7. 일반적으로, 가상 물고기의 컴퓨터 애니메이션(CA)(즉, 실루엣)은 행동 반응을자극하는 19,20,21의뚜렷한 장점으로 인해 보다 일반적인 장소가 되는 관행이다. CA는 시각 신호(방향, 속도, 일관성 또는 형태)를 사용자 정의할 수 있게 해주며, 살아있는 동물을 자극제로 사용할 때 달성할 수 있는 것을 초과하는 원하는 자극에 표준화 및 반복성을 도입할 수 있습니다. 동물22와 인간23모두에서 행동 연구에서 가상 현실의 사용은 또한 꾸준히 증가하고 기술이 더 이용 가능하고 견인될 수록 강력한 경험적 도구가 될 것을 약속합니다. 이러한 가상 접근법을 종합하면, 이러한 가상 접근법은 또한 과학(예: IACUC, AAALAC 및 ACURO)의 살아있는 동물 윤리 요건을 대체하고 감소시키면서 실험실 비용과 부담을 동시에 줄입니다.
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Disclosures
모든 저자는 실험 설계, 분석 및 논문 작성에 기여했습니다. A.C.U. 및 C.M.W. 설정 및 수집 데이터. 저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 설치 지원을 위해 브라이튼 힉슨 감사합니다. 이 프로그램은 기본 연구 프로그램, 환경 품질 및 설치 (EQI) 지원되었다; 엘리자베스 퍼거슨 박사, 기술 이사), 미 육군 엔지니어 연구 개발 센터.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black and white IP camera | Noldus, Leesburg, VA, USA | https://www.noldus.com/ | |
| Extruded aluminum | 80/20 Inc., Columbia City, IN, USA | 3030-S | https://www.8020.net 3.00" X 3.00" Smooth T-Slotted Profile, Eight Open T-Slots |
| Finfish Starter with Vpak, 1.5 mm extruded pellets | Zeigler Bros. Inc., Gardners, PA, USA | http://www.zeiglerfeed.com/ | |
| Golden shiners | Saul Minnow Farm, AR, USA | http://saulminnow.com/ | |
| ImageJ (v 1.52h) freeware | National Institute for Health (NIH), USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LED track lighting | Lithonia Lightening, Conyers, GA, USA | BR20MW-M4 | https://lithonia.acuitybrands.com/residential-track |
| Oracle 651 white cut vinyl | 651Vinyl, Louisville, KY, USA | 651-010M-12:5ft | http://www.651vinyl.com. Can order various sizes. |
| PowerLite 570 overhead projector | Epson, Long Beach CA, USA | V11H605020 | https://epson.com/For-Work/Projectors/Classroom/PowerLite-570-XGA-3LCD-Projector/p/V11H605020 |
| Processing (v 3) freeware | Processing Foundation | https://processing.org/ | |
| R (3.5.1) freeware | The R Project for Statistical Computing | https://www.r-project.org/ | |
| Ultra-white 360 theater screen | Alternative Screen Solutions, Clinton, MI, USA | 1950 | https://www.gooscreen.com. Must call for special cut size |
| Z-Hab system | Pentair Aquatic Ecosystems, Apopka, FL, USA | https://pentairaes.com/. Call for details and sizing. |
References
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