Summary
Dit protocol voorziet een nieuwe methode van lipide druppel isolatie en zuivering van muis levers, met behulp van een gevestigde endoplasmatisch reticulum isolatie kit.
Abstract
Lipide druppels (LDs) zijn bioactieve organellen binnen het cytosol van de meeste eukaryotische en sommige prokaryote cellen gevonden. LDs bestaan uit neutrale lipiden ingekapseld door een monolayer van fosfolipiden en eiwitten. Hepatische LD lipiden, zoals Ceramiden en eiwitten zijn betrokken bij verschillende ziekten die leiden hepatische steatosis tot. Hoewel vorige methoden zijn vastgesteld voor LD isolatie, ze vereisen een tijdrovende voorbereiding van reagentia en zijn niet bedoeld voor de isolatie van meerdere subcellular compartimenten. We geprobeerd om een nieuw protocol zodat het isolement van de LDs, endoplasmatisch reticulum (ER) en lysosomen uit de lever van een simpele muisklik.
Verder alle reagentia gebruikt in het protocol hier gepresenteerd zijn commercieel verkrijgbaar en vereisen minimaal reagens voorbereiding zonder in te boeten LD zuiverheid. Hier presenteren we gegevens vergelijken van dit nieuwe protocol aan een standaard sacharose kleurovergang protocol, vergelijkbare zuiverheid, morfologie en opbrengst demonstreren. Bovendien, kunnen we isoleren ER en lysosomen met behulp van hetzelfde monster, gedetailleerde inzicht bijbrengen in de vorming en de intracellulaire flux van lipiden en hun geassocieerde eiwitten.
Introduction
LDs zijn bioactieve organellen gevonden in het cytosol meest eukaryotische cellen en sommige prokaryotische cellen1,2,3. De LD-kern bestaat uit neutrale lipiden zoals triglyceriden (TG) en cholesterol esters. Ze bevatten ook Ceramiden, bioactieve lipiden die betrokken zijn bij cellulaire signalering trajecten4,5. LDs zijn omgeven door een fosfolipide enkelgelaagde en bekleed met eiwitten, met inbegrip van de perilipin eiwitten perilipin 2 (PLIN2) en 3 (PLIN3)1,5,6. Ook aanwezig zijn lipogenic enzymen, lipasen en mensenhandel membraaneiwitten die zijn gekoppeld aan verschillende hepatische steatotic ziekten, met inbegrip van vette leverziekte en alcoholische leverziekte hepatitis C3,5 ,6,7,8,9,10.
LDs worden verondersteld om te vormen van de buitenmembraan van de ER en nieuw samengestelde TG afkomstig uit vrije vetzuren ER afkomstige11bevatten. Het blijft echter onbekend of de gepoolde lipiden bud, verbonden blijven, of worden weggesneden uit het ER6,11, waardoor het isolement van LDs vrij van ER technisch uitdagende. Vrije vetzuren kunnen worden bevrijd uit LDs door de inwerking van oppervlakte lipasen energieproductie of membraan synthese te voorzien. Bovendien kunnen de LDs via lipophagy worden afgebroken als een regelgevende mechanisme en voor de productie van vrije vetzuren12.
Naast de ER en lysosomen, zijn er andere organellen — zoals mitochondriën, Endosomen, peroxisomen en het plasma membraan — die zijn te vinden in nauwe samenwerking van LDS-11. Deze strakke polygamie maakt het moeilijk om uit te voeren van een zuivere LD-extractie. Echter, neutrale lipiden aangeboren lage dichtheid kan worden benut via centrifugeren5.
Traditioneel, zijn LDs geïsoleerd met behulp van een sacharose dichtheid kleurovergang1,5,,13. Deze methoden zijn echter niet ontworpen om te isoleren van andere organellen. Bovendien vereisen ze de tijdrovende voorbereiding van reagentia. Dit protocol past een verkrijgbare ER isolatie kit (Zie de Tabel van materialen) om LD isolatie voorzien. We gebruiken de buffer van de extractie geboden door de kit, een LD isolatie stap toe te voegen. Bovendien kan het protocol ook worden gebruikt om ER en lysosomale isolatie met behulp van de dezelfde monsters, waardoor een vollediger beeld van de hele levenscyclus van LDs. Voor het valideren van deze nieuwe methode, assay wij LD opbrengst, de morfologie, de grootte en de zuiverheid. We vergelijken de resultaten die hier gepresenteerd die verkregen met een gebruikte protocol met behulp van een kleurovergang van sacharose voor LD isolatie.
We gebruikten een 10 - tot 12-weken oude, 20 g vrouwelijke C57BL/6 muis gevast voor 16 h (voedsel verwijdering op 17.00 uur voor een 9.00 LD isolatie keer) met gratis toegang tot water. De typische opbrengst voor TG is 0,6 mg/g lever, en voor LD eiwit, het is 0,25 mg/g lever. Dit biedt genoeg materiaal voor 10 ~ immunoblots door SDS-PAGE. Het protocol hieronder details de gebruikte reagentia en een protocol geschikt voor een enkele 1 g lever. Het protocol van de kleurovergang isolatie sacharose is aangepast van Sato14 en Wu15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd op een laboratorium bankje met persoonlijke beschermingsmiddelen die geschikt is voor bioveiligheidsniveau 1, met inbegrip van een lab-jas, handschoenen en veiligheidsbril. Experimenten werden uitgevoerd volgens de protocollen die zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Pennsylvania. Alle inspanningen werden gedaan om het dier ongemak te minimaliseren, en de dieren werden behandeld met humane zorg.
1. LD isolatie met behulp van een ER isolatie kit
-
Voorbereiding
Opmerking: De genoemde bedragen zijn geschikt voor een enkele 1 g muis lever.- 10 mL 1 x isotone extractie buffer (IE buffer, uit de ER isolatie kit) voor te bereiden door 2 mL 5 x IE buffer met 8 mL ultrazuiver water verdunnen. Koel de buffer door deze te plaatsen op het ijs.
- 100 mL, 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor te bereiden door 10 mL 10 x PBS in 90 mL ultrazuiver water verdunnen. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.
- 10 mL 5% polyethyleenglycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenyl ether (PGPE) bereid door verdunnen 500 µL van PGPE in 9.5 mL ultrazuiver water. Gebruik een 1 mL spuit om te meten uit PGPE aangezien het viskeus. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.
- Alle buizen cool door ze te plaatsen op het ijs: 1,7 mL microcentrifuge buizen, centrifuge buizen van 15 mL en 50 mL high-speed centrifuge buizen 13 mL ultracentrifuge buizen.
- Cool alle vereiste centrifuges tot en met 4 ° C: een microcentrifuge, een hoge capaciteit centrifuge voor 15 mL tubes, een snelle centrifuge voor 50 mL buizen en een ultracentrifuge.
- Pincet en dissectie schaar in autoclaaf steriliseren.
-
Weefsel voorbereiding
- De muis door deze te plaatsen in een kamer gevuld met 100% CO2 voor 10 min. bevestigen euthanasie door het uitvoeren van cervicale dislocatie euthanaseren.
- Met behulp van steriele pincet en dissectie schaar, snijden de lagen van de huid en spieren van de buik op de achterste/anterior as bloot van de lever.
- Snijd de ligamenten die de lever verbinden met het middenrif en de darm. Gebruik pincet te trekken van de darm uit de buurt van de lever, richting de posterior, bloot de ligamenten.
- Gesneden tussen de lever en de dorsale ribbenkast, verplaatsen van anterior to posterior totdat de lever is bevrijd.
- De lever overbrengen in een koude 5 cm petrischaal met 10 mL koude 1 x PBS.
- Wassen van de lever 2 x op een rockende platform in 10 mL koude 1 x PBS voor 5 min bij 4 ° C in de 5 cm petrischaal. Giet af 1 x PBS na de laatste wasbeurt.
- Gebruik een steriele chirurgische mes grootte-10 (Zie de Tabel van materialen) aan de lever dobbelstenen in 3 – 5 mm stukken in de 5 cm petrischaal (figuur 1A).
- Wassen van de blokjes lever 2 x met 10 mL koude 1 x PBS voor 5 min bij 4 ° C in de 5 cm petrischaal.
Opmerking: Voor lysosoom isolatie, 0,5 g lever overbrengen in een schone 45 mL homogenizer en volg de aanwijzingen geleverd door het lysosoom extractie kit (Zie de Tabel van de materialen). - 1 x PBS decanteren en breng de blokjes lever stukken naar de koude 45 mL Dounce homogenizer. Zorgen dat alle stukken Ga naar de onderkant van de homogenizer.
- Voeg 7 mL koude 1 x IE buffer (uit de ER isolatie kit) en meng op ijs door het bewegen van de stamper op en neer 20 x. Zorg ervoor dat de stamper naar de onderkant van de homogenizer tijdens elke streek gaat.
- Het homogenaat (figuur 1B) overbrengen in een centrifugebuis koude 15 mL.
- Spoel de homogenizer met 1 mL koude 1 x IE buffer (uit de ER isolatie kit) en voeg dit toe aan de rest van het homogenaat.
-
LD isolatie
- Verwijder de kernen door centrifugering van het homogenaat in een centrifuge van de hoge capaciteit bij 1.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C (Figuur 1 c).
- Het postnuclear supernatant (PNS) overbrengen in een centrifugebuis nieuwe, koude 50 mL. LD om verlies te voorkomen, ervoor zorgen dat elke lipide verzamelden zich bij de bovenkant van de tube van 15 mL is geresuspendeerde vóór de overbrenging van de PNS.
- Neem een 100 µL aliquoot van de PNS zuiverheid p.a. en plaats het in een koude 1,7 mL microcentrifuge buis. Zet het opzij op het ijs.
- Als u wilt verwijderen van mitochondriën, Centrifugeer het PNS monster, niet het afgepipetteerde deel, in een gekoelde snelle centrifuge op 12.000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.
- Optioneel: voor ruwe LD (CLD) isolaten (met cytosol en celmembraan besmetting), de bovenste lipide-laag met behulp van een precisiepipet glas verzamelen en overbrengen naar een tube van 1,7 mL microcentrifuge. Blijven sectie 1.4.
- Het postmitochondrial supernatant (PMS) overbrengen in een buis van de ultracentrifuge. LD om verlies te voorkomen, ervoor zorgen dat elke lipide verzameld aan de bovenkant is geresuspendeerde vóór de overbrenging van het PMS.
- Neem een 100 µL aliquoot van de PMS zuiverheid p.a. en plaats het in een koude 1,7 mL microcentrifuge buis. Zet het opzij op het ijs.
- Vul een ultracentrifuge buis aan de rand met koude 1 x IE buffer om te voorkomen dat de buis bezwijken tijdens ultracentrifugatie.
- Evenwicht van de monsters en centrifugeer ze in een ultracentrifuge bij 100.000 x g gedurende 60 min bij 4 ° C (Figuur 1 d).
- Als u wilt verwijderen van de LD-laag, kantelen van de buis onder een hoek van 45° en gecombineerd met een glazen pipet. De pellet overbrengen in een koude 1,7 mL microcentrifuge buis.
Opmerking: De pellet bevat geïsoleerde ER. Gebruik dit gedeelte stroomafwaarts om ER te isoleren. - Het verzamelen van 100 µL van het supernatans dat post-ER (PER) onder de lipide-laag voor zuiverheid analyse.
-
LD wassen
- 1 x PBS op de breuk van de LD verzameld in een 1.7 microcentrifuge buis, tot een totaal volume van 1.3 mL toevoegen.
- Vortex het monster.
- Centrifugeer in een microcentrifuge op topsnelheid gedurende 5 minuten bij 4 ° C tot elke cel puin pellet. Warm de tube zachtjes met de handen om te helpen resuspendeer de LD-laag. Overdracht van de bovendrijvende substantie, met inbegrip van de lipide laag, een nieuwe 1,7 mL microcentrifuge buis.
- Herhaal stappen 1.4.1–1.4.3 2 x-3 x, totdat de pellet is niet meer zichtbaar.
- 1 x PBS aan de pellet-vrije LD supernatant tot een eindvolume van 1,5 mL toevoegen. Wassen van de lipide breuk door centrifugeren in een microcentrifuge op topsnelheid gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Verwijder 1 mL 1 x PBS (onder de lipid layer) met een glazen pipet zonder verstoring van de lipide-laag.
- Herhaal stap 1.4.5 en 1.4.6 4 x-5 x, totdat de 1 x PBS is visueel transparant met geen turbiditeit.
- Verwijder alle PBS van de 1 x onder de lipide-laag, met behulp van een glazen pipet (figuur 1E).
- Het resultaat, een zuivere LD Fractie, stroomafwaarts p.a. gebruiken
-
LD eiwit kwantificatie door zure test van bicinchoninic
Opmerking: Gebruik geen een bicinchoninic zuur assay (BCA) als LD morfologie worden beoordeeld.- Resuspendeer de LD in 500 μL van 5% PGPE.
- Kook de monsters gedurende 5 minuten bij 95 ° C, vortex, en broeden van de monsters bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten afkoelen.
- Herhaal stap 1.5.2 een extra 2 x.
- Bewerk ultrasone trillingen ten de monsters gedurende 5 minuten met een 30 s in- / uitschakelen cyclus, bij een gemiddelde intensiteit.
- Normaliseren de monsters door het meten van de eiwitconcentratie in alle zuiverheid analyse monsters en in de LD-fractie door BCA assay.
2. LD isolatie met behulp van sacharose dichtheid verloop
-
Voorbereiding
- Breng 200 mL TE buffer (10 mM Tris-HCl [pH 7.4], 1 mM EDTA [pH 8,0]). Koel het door deze te plaatsen op het ijs.
- 100 mL van 60% (m/v) sacharoseoplossing in buffer TE maken door ontbinding van 60 g van sacharose in TE buffer, het eindvolume te brengen tot 100 mL. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.
- 6 mL sacharoseoplossing 40% (m/v) door toevoeging van 4 mL van 60% sucrose aan 2 mL buffer TE maken. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.
- 6 mL sacharoseoplossing 25% (m/v) door toevoeging van 2.5 mL van 60% sucrose aan 3,5 mL buffer TE maken. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.
- 4 mL 10% (m/v) sacharoseoplossing door toevoeging van 0,7 mL van 60% sucrose 3,3 ml buffer TE maken. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.
- 10 mL protease en phosphatase remmer oplossing door toevoeging van een tablet van zowel protease en phosphatase inhibitors tot 10 mL van de buffer TE maken.
- Bereiden weefsel homogenaat buffer door toevoeging van 4 mL protease en phosphatase remmer oplossing aan 50 mL stockoplossing van 60% sucrose. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.
- Overlay buffer door toevoeging van 2 mL van protease en phosphatase remmer oplossing aan 50 mL buffer TE bereiden. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.
- 100 mL 1 x PBS bereid door verdunning van 10 mL 10 x PBS in 90 mL ultrazuiver water. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.
- Bereiden van 10 mL 5% PGPE door verdunnen 500 µL van PGPE in 9.5 mL ultrazuiver water. Gebruik een 1 mL spuit om te meten uit PGPE aangezien het viskeus. Koel het door deze te plaatsen op het ijs.
- De volgende centrifuge buizen cool door ze te plaatsen op het ijs: 1,7 mL microcentrifuge buizen, centrifuge buizen van 15 mL en 50 mL high-speed centrifuge buizen 13 mL ultracentrifuge buizen.
- Koel de vereiste centrifuges tot en met 4 ° C: een microcentrifuge, een hoge capaciteit centrifuge (voor 15 mL tubes), een snelle centrifuge (voor 50 mL tubes) en een ultracentrifuge.
-
Weefsel voorbereiding
- Gebruik de stappen 1.2.1–1.2.9 voor te bereiden op het weefsel homogenisering.
- Voeg 7 mL koude weefsel homogenaat buffer en meng het op ijs door het bewegen van de stamper op en neer 20 x. Tijdens de eerste vijf lijnen, waarborgen dat de stamper gaat naar de onderkant van de homogenizer.
- Het homogenaat overbrengen in een centrifugebuis koude 15 mL.
- Spoel de homogenizer met 1 mL koude weefsel homogenaat buffer en het overbrengen van de centrifugebuis eerder gebruikte 15 mL.
- Breng het volume van het homogenaat tot 10 mL met weefsel homogenaat buffer.
- Centrifugeer het monster in een centrifuge van de hoge capaciteit bij 1.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- 8 mL van het supernatans overbrengen in een centrifugebuis 50 mL.
- Overdragen 100 µL van de resterende bovendrijvende substantie als PNS ingewogen analysemateriaal zuiverheid.
-
Sacharose verloop
- De 50 mL centrifugebuis waarin de 8 mL PNS in een hoek van 45° te kantelen. Voeg voorzichtig 6 mL 40% sacharoseoplossing, ervoor te zorgen dat de twee fasen gescheiden blijven.
- Op een gelijkaardige manier, Voeg langzaam 6 mL 25% sacharoseoplossing; Voeg vervolgens 4 mL 10% sacharoseoplossing; Ten slotte voeg 8 mL overlay buffer.
- Centrifugeer het monster in een high-speed centrifuge bij 30.000 x g bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
- Overdracht van de bovenste laag met de LDs tot een koker van 1,7 mL microcentrifuge.
- Voor het wassen van de LD, volg de stappen in sectie 1.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wij hebben de LD-isolatie met de kit ER uitgevoerd op ongeveer 30 muizen en vergeleken de resultaten met degenen die het protocol van de isolatie van sacharose volgen op ongeveer 40 muizen. De gerapporteerde bevindingen zijn typisch voor beide protocollen. Muizen werden 's nachts met gratis toegang tot water, te verhogen van het rendement van de LD gevast. LD isolatie met een verloop van sacharose is uitgevoerd in parallel met de kit ER LD isolatie protocol. Monsters van PNS, PMS, PER, CLDs en LDs werden verzameld in de kit ER LD isolatie protocol. Als gevolg van de beperking van de workflow van het protocol van de isolatie van sacharose, alleen de PNS en LD isolaat werden verzameld.
50 µL van geïsoleerde LDs waren voor fluorescent microscopie vermengd met een gelijk volume van 100 µM 4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene (DPBDI). Monsters werden beschermd tegen licht en bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten geïncubeerd. De monsters werden gewassen door toevoeging van 1 mL 1 x PBS, gevolgd door centrifugeren en verwijdering van overtollige buffer. Van de LD-breuk, was 1 µL geplaatst op een microscoopglaasje en coverslipped. Representatieve 20 x TL en helderveld LD beelden werden genomen uit zowel de ER kit LD isolatie en het isolement van sacharose LD (figuur 2A-D) methoden, met behulp van een Microscoop omgekeerde onderzoek (Zie de Tabel van de materialen). De helderveld beelden openbaren vergelijkbare niveaus van zwevende deeltjes, suggereren vergelijkbare purities met behulp van de verschillende protocollen.
Om te bepalen van verschillen in rendement tussen de twee protocollen, we gebruikten vergelijkbaar formaat muizen en muis levers (figuur 2EF). Volgende zuivering, LD TG en proteïne niveaus werden gemeten met behulp van de colorimetrische testen (Zie de Tabel van materialen) en de gegevens waren genormaliseerd naar lever gewicht (Figuur 2 gH). Vonden we, wanneer we de grondstof, genormaliseerd dat de LD eiwit en TG opbrengst na LD isolatie met behulp van de kit ER en sacharose waren vergelijkbaar. Om te bepalen als de LD-grootte ook gelijk was, we gekwantificeerd LD diameters met behulp van de software van de analyse van de afbeelding (Zie de Tabel van de materialen). LDs varieerden van 0,27 tot 6.37 µm. De frequentie-verdeling van de diameter van de LD toont dat de ER kit LD isolatie (Figuur 3 bis) en sucrose LD isolatie (figuur 3B) LDs vergelijkbare capaciteit opleveren.
Om te beoordelen LD zuiverheid, waren de monsters bepaald door immunoblotting. Een bedrag van 20 µg eiwit per steekproef werd bepaald door SDS-PAGE. De monsters werden gesondeerd met antilichaam markeringen voor LDs (PLIN2 en PLIN3), ER (Sec61), mitochondriën (VDAC), lysosomen (LAMP1), plasma membraan (MEK1), kernen (Histon H3) en cytosol (GAPDH) (figuur 4A). PLIN2 werd ontdekt in alle monsters met uitzondering van de kit ER LD isolatie PER en van de sucrose PNS. Het LDs afgeleid van de kit ER LD isolatie en het sacharose kleurovergang protocol beide had gelijk zuiverheid. Geen bands verscheen voor de ER (Sec61), mitochondriën (VDAC1), lysosomen (LAMP1), plasma membraan (Mek1) of het cytosol (GAPDH). De CLD had plasmamembraan en cytosol besmetting maar geen zichtbare verontreiniging uit het ER, mitochondriën of lysosomen. De intensiteit van de PLIN2 band in het aangepast ER protocol geeft aan dat het protocol ER had een ongeveer 14-fold hogere PLIN2 uitdrukking in de Fractie van de LD vergeleken met de PNS, terwijl het protocol van sacharose had een zesvoudig hogere PLIN2 uitdrukking in de (LD) breuk gegevens niet worden weergegeven).
Omdat dit protocol ook de optie heeft om het zuiveren ER en lysosomen, wij ook uitgevoerd westelijke bevlekken om te beoordelen van de zuiverheid van deze organellen. Figuur 4B toont aan dat de immunoblots van gezuiverde ER van hetzelfde monster met behulp van de ER kit (Zie de Tabel van materialen) vrij waren van PLIN2 maar had aanzienlijke niveaus van het eiwit ER Sec61A. Met behulp van de lysosomale verrijking kit (Zie de Tabel van materialen), Lysosomen werden verder geïsoleerd en immunoblotted voor LD (PLIN2), ER (Sec61A) en lysosoom (LAMP1)-markeringen (figuur 4C). Samen zijn deze gegevens tonen aan dat het protocol gepresenteerd hier, in combinatie met verkrijgbare lysosoom reiniging kits, toestaan voor de pure isolatie van lever LDs, ER en lysosomen van afzonderlijke dieren.
Figuur 1: verwijst naar foto's genomen tijdens de LD isolatie met behulp van een ER isolatie kit . (A) in blokjes gesneden 5 mm lever stukken in een 5 cm petrischaal. (B) lever homogenaat na homogenisatie in een Dounce homogenizer. (C) lever homogenaat na centrifugeren bij 1.000 x g; Opmerking de lichte lipide-laag op de top, de PNS en de pellet met cel puin en nucleaire breuk. (D) LD laag na ultracentrifugatie bij 100.000 x g; Opmerking de prominente lipide-laag op de top, de PER en de breuk ER op de bodem. (E) Washed LD fractie vóór de definitieve verwijdering van de PBS. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: opname en analyse van de kwantitatieve vergelijking van de Fractie van de LD geïsoleerd met een ER kit en de Fractie van de LD geïsoleerd met sacharose. Vertegenwoordiger 20 x TL opname van (A) een fractie DPBDI gebeitste LD, geïsoleerd met een ER kit en (B) LDs geïsoleerd met sacharose. (C) helderveld opname van de LD-breuk geïsoleerd met een ER kit en (D) de Fractie van de LD geïsoleerd met sacharose. De schaal bar = 20 muis gewicht µm. (E) en (F) lever gewicht. (G) TG opbrengst uit gezuiverde LDs genormaliseerd naar lever gewicht. (H) eiwit opbrengst uit gezuiverde LDs genormaliseerd naar lever gewicht. De gegevens zijn gemiddelde ± SEM (N = 4). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Frequentieverdeling van LD maten. Monsters van vier verschillende muizen werden gekleurd met DPBDI en vertegenwoordiger 20 x velden werden gekwantificeerd. De diameters werden gemeten met behulp van de software van de analyse van een afbeelding. (A) frequentieverdeling (Fractie) van een breuk van de LD geïsoleerd met behulp van een ER-kit. (B) frequentieverdeling (Fractie) van een breuk van de LD geïsoleerd met behulp van sacharose kleurovergang dichtheid. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: analyse van LD zuiverheid immunoblotting. (A) het aangepast protocol van de isolatie ER kit LD en het protocol van de isolatie van sacharose, 20 µg eiwit per monster te vergelijken was immunoblotted. De volgende voorbeelden werden geladen: postnuclear supernatant (PNS), postmitochondrial supernatant (PMS), postendoplasmic reticulum supernatant (PER), ruwe LDs (CLD) en LDs (LD). Monsters werden immunoblotted voor LDs (PLIN2 en PLIN3), ER (SEC61A), mitochondriën (VDAC1), lysosoom (LAMP1), celmembraan (MEK1), kernen (Histon H3) en markeringen cytosol (GAPDH). (B) analyse van de zuiverheid van een breuk ER na verdere zuivering van de ER met behulp van de isolatie ER kit LD protocol (Zie de Tabel van de materialen). PNS, PMS, ER en LDs werden geladen en immunoblotted voor LDs (PLIN2) en ER (SEC61A). (C) analyse van de zuiverheid van de lysosomale breuk na verdere zuivering van lysosomen met behulp van het lysosoom verrijking kit protocol (Zie de Tabel van de materialen). PNS en een lysosomale fractie waren geladen en immunoblotted voor LDs (PLIN2), ER (SEC61A) en lysosomen (LAMP1). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hepatische LD biologie wordt steeds meer erkend als een belangrijke regulator van hepatocellulaire fysiologie in zowel de volksgezondheid als de ziekte. Als bonafide organellen, LDs zijn dynamische interactie met andere cellulaire structuren en bevatten binnen hen bioactieve componenten betrokken bij zowel lipide en glucose homeostase. Het verloop van sacharose wordt routinematig gebruikt voor LD isolatie en kan onderzoekers bestuderen LD structuur, maar het vereist hen om talrijke buffers. We hebben aangetoond dat het gebruik van een commercieel beschikbare ER isolatie kit is een ander hulpmiddel dat gebruikt worden kan voor niet alleen LD isolatie maar voor tandem isolatie van ER en lysosoom, zodat voor een meer uitgebreid overzicht van cellulaire dynamiek in reactie op de verschillende experimentele omstandigheden, zonder aanzienlijke toename van de werkstroom.
De sterkte van dit nieuwe protocol is het gebruiksgemak instellen met behulp van commercieel of beschikbaar reagentia en haar vermogen om gelijktijdig meerdere organellen isoleren. Er zijn echter ook potentiële nadelen aan deze nieuwe methode om in gedachten te houden. Verschillende stappen in dit protocol kunnen het nadeel van het isolement van supersized LDs uit de lever. Dounce homogenisering heeft het potentieel om het verstoren van grote LDs via schuifspanning. Een losjes montage Dounce homogenizer setup enkele spanning te groot LDs. Bovendien kan verlichten, een 100.000 x g spin werkzaam is, rekening houdend met de scheiding van LD en ER. Deze snelheid kan ook leiden tot een verlies van groot LDs, zoals één verslag 2.000 x g voor lever LD zuivering2 aanbeveelt. Een beperking van deze procedure is dat het kan niet worden gebruikt voor het isoleren van LDs van verschillende grootte als recent beschreven16. Bovendien, hoewel sacharose buffers fragiele LDs intact door het gebruik van zachte homogenisering2houden kunnen, levert homogenisatie met 1 x IE buffer pure LDs met soortgelijke morfologie en grootteverdeling als die afgeleid van sacharose kleurovergang isolatie . Verder onderzoek zal nodig zijn om te bepalen als de biologische activiteit wordt beïnvloed door het gebruik van een buffer van PBS, die minder zacht is dan gebruikte isotone buffers2. Vanwege deze potentiële beperkingen, het is van cruciaal belang tijdens de eerste twee centrifuge stappen volledig resuspendeer de lipide verzameld boven vóór de overbrenging van de bovendrijvende substantie en empirisch vaststellen van het effect van het nummer van de lijn op de opbrengst van de LD voor verschillende weefsels. De lever protocol gepresenteerd hier gebruikt 20 slagen, een distributie van vergelijkbare omvang naar andere gepubliceerde werk2oplevert.
LD isolatie met behulp van het endoplasmatisch reticulum isolatie kit levert zowel ruwe als pure LD-isolaten. CLD isolaten celmembraan en cytosol componenten bevatten maar voldoende voor sommige toepassingen, zoals de evaluatie van LD morfologie met microscopie kunnen blijken. Het zuivere LD isolaat, ontbreekt zoals bepaald door PLIN2 expressie, ER, mitochondriaal, lysosomale, celmembraan of cytosol besmetting. Inderdaad, het pure isolaat uit de kit ER LD isolatie protocol verrijkt PLIN2 meer dan dubbele met de methode van sacharose LD isolatie vergeleken. Dit verschil was onverwacht, gezien de gelijkenis in eiwit en TG opleveren, maar kan te wijten zijn aan het gebruik van PBS als een buffer hersuspensie in tegenstelling tot sacharose of isotone buffer.
LD isolatie door traditionele methoden kan ook besmetting van de LD-breuk lijden door het plasmamembraan2. Hoewel dit mede isolatie gebruikelijk in alle LD isolatie methoden is en moet in gedachten worden gehouden wanneer het analyseren van LD isolaten2, de hier gepresenteerde gegevens aantonen dat verdere ultracentrifugatie van het CLD isolaat bevrijdt de steekproef van dergelijke verontreinigingen ( Figuur 4). Toekomstige aanpassingen kunnen omvatten het gebruik van een Franse pers of stikstof bom te verstoren de celmembraan meer voorzichtig en verdere vermindering van de verontreiniging van de CLD isoleren2.
Kortom, is de ER kit LD isolatie methode een nieuwe toepassing van een gebruikte celbiologie-tool. Deze methode voert ook aan sacharose kleurovergang isolement, met minder voorbereiding reagens. Bovendien verbetert de opname van bereid reagentia in de kit ER LD isolatie protocol de strengheid en de reproduceerbaarheid van de experimentele omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Carr krijgt ondersteuning van het onderzoek van farmaceutica van de onderscheppen.
Acknowledgments
Wij danken de Abramson familie Cancer Research Institute. Dit werk wordt ondersteund door de volgende subsidies: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation Harold Amos medische faculteit Development Award, 7158, IDOM DRC Pilot Award P30 DK019525 (R.C.M.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH P30-DK050306 en de faciliteiten van de kern (moleculaire pathologie en Imaging Core, moleculaire biologie/gen expressie Core en cel cultuur Core) en haar piloot verlenen programma. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
References
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
- Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
- Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
- Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
- Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
- Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
- Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
- Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
- Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R. 3rd, McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
- Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).
