Studiare i normali effetti di radiazione dei tessuti utilizzando idrogel a matrice extracellulare

Summary

Questo protocollo presenta un metodo per la decellularizzazione e la successiva formazione di idrogel di cuscinetti di grasso mammari a seguito di irradiazione ex vivo.

Abstract

La radiazione è una terapia per pazienti con carcinoma mammario triplo negativo. L'effetto della radiazione sulla matrice extracellulare (ECM) del tessuto mammario sano e il suo ruolo nella ricorrenza locale nel sito tumorale primario sono sconosciuti. Qui presentiamo un metodo per la decellularizzazione, la linfafazione e la fabbricazione di idrogel ECM derivati da cuscinetti di grasso mammari murno. I risultati sono presentati sull'efficacia del processo di decellularizzazione e sono stati valutati i parametri reologici. Le cellule del cancro al seno etichettate GFP e luciferasi incapsulate negli idrogel hanno dimostrato un aumento della proliferazione degli idrogel irradiati. Infine, la colorazione coniugata phalloidin è stata impiegata per visualizzare l'organizzazione del citoscheletro delle cellule tumorali incapsulate. Il nostro obiettivo è quello di presentare un metodo per la fabbricazione di idrogel per lo studio in vitro che imitano l'ambiente del tessuto mammario in vivo e la sua risposta alle radiazioni al fine di studiare il comportamento delle cellule tumorali.

Introduction

Il cancro è caratterizzato da un'eccessiva proliferazione di cellule che possono eludere l'apoptosi e anche metastasi a siti distanti¹. Il cancro al seno è una delle forme più comuni tra le femmine negli Stati Uniti, con una stima di 266.000 nuovi casi e 40.000 decessi nel 2018². Un sottotipo particolarmente aggressivo e difficile da trattare è il cancro al seno triplo negativo (TNBC), che manca di recettore estrogeno (ER), recettore progesterone (PR), e fattore di crescita epidermica umana (HER2). La radioterapia è comunemente usata nel cancro al seno per eliminare le cellule tumorali residue dopo la lumpectomia, ma olt....

Protocol

Gli studi sugli animali sono stati effettuati in conformità con le linee guida istituzionali e i protocolli approvati dal Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Preparazione ed irradiazione ex vivo di MFP

1. Sacrificare i topi atimici Nu/Nu (8-10 settimane) usando l'asfissia di CO₂ seguita dalla lussazione cervicale.
2. Pulire la pelle con 70% di etanolo.
3. Raccogliere pastiglie di grasso mammaria (MFP) da topi sacrificati utilizzando forbici pre-sterilizzate e pinze in un tubo conico da 15 mL contenente supporti RPMI completi (RPMI integrati con 1% penicillina-streptomicina e 10% siero b....

Results

Le Unità multifunzione sono state decellularizzate in seguito all'irradiazione mediante la procedura illustrata nella figura 1A. Vengono mostrati i PFP pre-decellularizzazione (Figura 1B) e post-decellularizzazione (Figura 1C). La decellularizzazione è stata confermata utilizzando la colorazione ematossilia ed eosina (H & E) e 1-([4-(Xylylazo)xylyl]-2-naphthol colorazione è stato utilizzato per valutare il contenuto lipidico (.......

Discussion

Questo metodo di formazione di idrogel dipende in gran parte dalla quantità di tessuto iniziale. Gli MFP Murine sono piccoli e il processo di decellularizzazione comporta una significativa riduzione del materiale (Tabella1). Il processo può essere ripetuto con più MFP per aumentare la resa finale. La fresatura è un altro passo importante che può portare alla perdita di materiale. Altri hanno dimostrato successo con un mulino criogenico, ma questo protocollo si basa sulla fresatura tramite un mortaio port.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalina tamponata neutra, cubo con rubinetto	VWR	16004-128-2-metilbutano
	Alfa Aesar	19387-AR
2000ex Reometro	TA Instruments	10D4335	reometro
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	A1933-25G-calceina
acetossimetile (calceina AM)	Molecular Probes, Inc.	C1430-D-luciferina
Lucciola, sale di potassio	Biosynth Chimica & Biologia	L-8820	(S)-4,5-Diidro-2-(6-idrossi-2-benzotiazolil)-4-tiazolecarbossilico sale di potassio
DPX Mountant per istologia	Sigma-Aldrich	06522-500ML-Soluzione
salina tamponata con fosfato di Dulbecco	Gibco
14040133-Eosin-Y con Phloxine	Richard-Allan Scientific	71304	eosina
etidio omodimero	Sonde molecolari, Inc.	E1169	omodimero di etidio-1 (EthD-1)
Siero fetale bovino	Sigma-Aldrich	F0926-500ML-Fisher
Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	terreno di inclusione del criostato
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01	terreno di montaggio a base acquosa
FreeZone 4.5	Labconco	7751020	liofilizzatore
Hoechst 33342 Soluzione (20 mM)	Thermo Scientific	62249	colorante fluorescente blu
Acido cloridrico	Sigma-Aldrich	258148-500ML-IVIS
Lumina III	PerkinElmer	CLS136334	sistema di imaging a bioluminescenza
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly Clark		salviette
delicate per attivitàn-propanolo (senza perossido/sequenziamento), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500-Oil
Red O	Sigma-Aldrich	O0625-25G	1-([4-(Xylylazo)xilyl]azo)-2-naphthol
OPS Diagnostics CryoGrinder	OPS Diagnostics, LLC	CG-08-02-PBS
(10X), pH 7.4	Quality Biological, Inc.	119-069-151	Soluzione salina tamponata con fosfato
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140-122-Pepsina
dalla mucosa gastrica suina	Sigma-Aldrich	P6887-5G	pepsina
Acido peracetico	Sigma-Aldrich	77240-100ML-Phalloidin-iFluor
594 Reagente (ab176757)	abcam	ab176757	coniugato
alla falloidinaGlicole propilenico	Sigma-Aldrich	W294004-1KG-K-Richard-Allan
Scientific Signature Series Reagente azzurrante	Richard-Allan Scientific	7301L
Scientific Signature Series Ematossilina 7211	Richard-Allan Scientific	7211-RPMI
Medium 1640	Gibco	11875-093-Sodio
desossicolato, 98%	Frontier Scientific	JK559522	acido desossicolico
saccarosio	Sigma-Aldrich	S5016-Triton
x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML<	em>t-ottilfenossipolietossietanolo
tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo	Gibco	25200-056-Whatman
carta da filtro qualitativa, grado 4	Whatman	1004-110	carta da filtro qualitativa grado 4
xileni (Certificata ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-4	-