Questo protocollo presenta un metodo per la decellularizzazione e la successiva formazione di idrogel di cuscinetti di grasso mammari a seguito di irradiazione ex vivo.
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Articolo metodologico
Studiare i normali effetti di radiazione dei tessuti utilizzando idrogel a matrice extracellulare
In questo articolo
Sommario
Abstract
La radiazione è una terapia per pazienti con carcinoma mammario triplo negativo. L'effetto della radiazione sulla matrice extracellulare (ECM) del tessuto mammario sano e il suo ruolo nella ricorrenza locale nel sito tumorale primario sono sconosciuti. Qui presentiamo un metodo per la decellularizzazione, la linfafazione e la fabbricazione di idrogel ECM derivati da cuscinetti di grasso mammari murno. I risultati sono presentati sull'efficacia del processo di decellularizzazione e sono stati valutati i parametri reologici. Le cellule del cancro al seno etichettate GFP e luciferasi incapsulate negli idrogel hanno dimostrato un aumento della proliferazione degli idrogel irradiati. Infine, la colorazione coniugata phalloidin è stata impiegata per visualizzare l'organizzazione del citoscheletro delle cellule tumorali incapsulate. Il nostro obiettivo è quello di presentare un metodo per la fabbricazione di idrogel per lo studio in vitro che imitano l'ambiente del tessuto mammario in vivo e la sua risposta alle radiazioni al fine di studiare il comportamento delle cellule tumorali.
Introduzione
Il cancro è caratterizzato da un'eccessiva proliferazione di cellule che possono eludere l'apoptosi e anche metastasi a siti distanti1. Il cancro al seno è una delle forme più comuni tra le femmine negli Stati Uniti, con una stima di 266.000 nuovi casi e 40.000 decessi nel 20182. Un sottotipo particolarmente aggressivo e difficile da trattare è il cancro al seno triplo negativo (TNBC), che manca di recettore estrogeno (ER), recettore progesterone (PR), e fattore di crescita epidermica umana (HER2). La radioterapia è comunemente usata nel cancro al seno per eliminare le cellule tumorali residue dopo la lumpectomia, ma olt....
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Protocollo
Gli studi sugli animali sono stati effettuati in conformità con le linee guida istituzionali e i protocolli approvati dal Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Preparazione ed irradiazione ex vivo di MFP
- Sacrificare i topi atimici Nu/Nu (8-10 settimane) usando l'asfissia di CO2 seguita dalla lussazione cervicale.
- Pulire la pelle con 70% di etanolo.
- Raccogliere pastiglie di grasso mammaria (MFP) da topi sacrificati utilizzando forbici pre-sterilizzate e pinze in un tubo conico da 15 mL contenente supporti RPMI completi (RPMI integrati con 1% penicillina-streptomicina e 10% siero b....
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Risultati
Le Unità multifunzione sono state decellularizzate in seguito all'irradiazione mediante la procedura illustrata nella figura 1A. Vengono mostrati i PFP pre-decellularizzazione (Figura 1B) e post-decellularizzazione (Figura 1C). La decellularizzazione è stata confermata utilizzando la colorazione ematossilia ed eosina (H & E) e 1-([4-(Xylylazo)xylyl]-2-naphthol colorazione è stato utilizzato per valutare il contenuto lipidico (.......
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Discussione
Questo metodo di formazione di idrogel dipende in gran parte dalla quantità di tessuto iniziale. Gli MFP Murine sono piccoli e il processo di decellularizzazione comporta una significativa riduzione del materiale (Tabella1). Il processo può essere ripetuto con più MFP per aumentare la resa finale. La fresatura è un altro passo importante che può portare alla perdita di materiale. Altri hanno dimostrato successo con un mulino criogenico, ma questo protocollo si basa sulla fresatura tramite un mortaio port.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano la dott.ssa Laura L. Bronsart per aver fornito le cellule GFP e luciferase-4T1, il Dr. Edward L. LaGory per un consiglio su 1-((4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol che staina, il Dr. Craig L. Duvall per IVIS e lyophilizer use, e Dr. Scott A. usare. Questa ricerca è stata sostenuta finanziariamente da NIH grant #R00CA201304.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10% Formalina tamponata neutra, cubo con rubinetto | VWR | 16004-128-2-metilbutano | |
| Alfa Aesar | 19387-AR | ||
| 2000ex Reometro | TA Instruments | 10D4335 | reometro |
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich | A1933-25G-calceina | |
| acetossimetile (calceina AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430-D-luciferina | |
| Lucciola, sale di potassio | Biosynth Chimica & Biologia | L-8820 | (S)-4,5-Diidro-2-(6-idrossi-2-benzotiazolil)-4-tiazolecarbossilico sale di potassio |
| DPX Mountant per istologia | Sigma-Aldrich | 06522-500ML-Soluzione | |
| salina tamponata con fosfato di Dulbecco | Gibco | ||
| 14040133-Eosin-Y con Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosina |
| etidio omodimero | Sonde molecolari, Inc. | E1169 | omodimero di etidio-1 (EthD-1) |
| Siero fetale bovino | Sigma-Aldrich | F0926-500ML-Fisher | |
| Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | terreno di inclusione del criostato |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | terreno di montaggio a base acquosa |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | liofilizzatore |
| Hoechst 33342 Soluzione (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | colorante fluorescente blu |
| Acido cloridrico | Sigma-Aldrich | 258148-500ML-IVIS | |
| Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | sistema di imaging a bioluminescenza |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | salviette | |
| delicate per attivitàn-propanolo (senza perossido/sequenziamento), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500-Oil | |
| Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xilyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02-PBS | |
| (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Soluzione salina tamponata con fosfato |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15140-122-Pepsina | |
| dalla mucosa gastrica suina | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsina |
| Acido peracetico | Sigma-Aldrich | 77240-100ML-Phalloidin-iFluor | |
| 594 Reagente (ab176757) | abcam | ab176757 | coniugato |
| alla falloidinaGlicole propilenico | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K-Richard-Allan | |
| Scientific Signature Series Reagente azzurrante | Richard-Allan Scientific | 7301L | |
| Scientific Signature Series Ematossilina 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211-RPMI | |
| Medium 1640 | Gibco | 11875-093-Sodio | |
| desossicolato, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | acido desossicolico |
| saccarosio | Sigma-Aldrich | S5016-Triton | |
| x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML< | em>t-ottilfenossipolietossietanolo |
| tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo | Gibco | 25200-056-Whatman | |
| carta da filtro qualitativa, grado 4 | Whatman | 1004-110 | carta da filtro qualitativa grado 4 |
| xileni (Certificata ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | - |
Riferimenti
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J.
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Ristampe e permessi
