Summary
Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Dezellularisierung und anschließenden Hydrogelbildung von murinen Brustfettpolstern nach ex vivo Bestrahlung dar.
Abstract
Strahlende Strahlung ist eine Therapie für Patienten mit dreifach negativem Brustkrebs. Die Wirkung der Strahlung auf die extrazelluläre Matrix (ECM) von gesundem Brustgewebe und ihre Rolle bei der lokalen Rezidivanz an der primären Tumorstelle sind unbekannt. Hier stellen wir eine Methode zur Dezellularisierung, Lyophilisierung und Herstellung von ECM-Hydrogelen aus murinen Brustfettpolstern vor. Die Ergebnisse werden über die Wirksamkeit des Dezellularisierungsprozesses vorgestellt und rheologische Parameter bewertet. GFP- und luziferase-markierte Brustkrebszellen, die in den Hydrogelen verkapselt sind, zeigten eine Zunahme der Proliferation in bestrahlten Hydrogelen. Schließlich wurde Phalloidin-Konjugatfärbung eingesetzt, um die Zytoskelett-Organisation von verkapselten Tumorzellen zu visualisieren. Unser Ziel ist es, eine Methode zur Herstellung von Hydrogelen für In-vitro-Studien zu präsentieren, die die in vivo Brustgewebeumgebung und ihre Reaktion auf Strahlung imitieren, um das Verhalten von Tumorzellen zu untersuchen.
Introduction
Krebs ist gekennzeichnet durch übermäßige Proliferation von Zellen, die Apoptose umgehen und auch metastasieren zu entfernten Stellen1. Brustkrebs ist eine der häufigsten Formen bei Frauen in den USA, mit schätzungsweise 266.000 neuen Fällen und 40.000 Todesfällen im Jahr 20182. Ein besonders aggressiver und schwer zu behandelnder Subtyp ist dreifach negativer Brustkrebs (TNBC), dem es an Östrogenrezeptor (ER), Progesteronrezeptor (PR) und menschlichem epidermalen Wachstumsfaktor (HER2) mangelt. Strahlentherapie wird häufig bei Brustkrebs verwendet, um Resttumorzellen nach Derlumpektomie zu beseitigen, aber über 13% der TNBC-Patienten erleben immer noch ein Rezidiv an der primären Tumorstelle3.
Es ist bekannt, dass die Strahlentherapie wirksam bei der Milderung von Metastasen und Rezidiven ist, da die Kombination von Lumpektomie und Strahlung zu demselben langfristigen Überleben führt wie Mastektomie4. Jedoch, Es hat sich vor kurzem gezeigt, dass Strahlenbehandlung mit lokalen Rezidiv an der primären Tumorstelle in immungeschwächten Einstellungen5,6verbunden ist. Es ist auch bekannt, dass Strahlung die extrazelluläre Matrix (ECM) des normalen Gewebes verändert, indem sie Fibrose induziert7. Daher ist es wichtig, die Rolle von strahlungsinduzierten ECM-Änderungen bei der Diktat des Tumorzellverhaltens zu verstehen.
Dezellularisierte Gewebe wurden als In-vitro-Modelle zur Untersuchung der Krankheit8,9verwendet. Diese dezellularisierten Gewebe bewahren die ECM-Zusammensetzung und rekapitulieren den Komplex in vivo ECM. Dieses dezellularisierte Gewebe ECM kann weiterverarbeitet und verdaut werden, um rekonstituierte ECM-Hydrogele zu bilden, die verwendet werden können, um Zellwachstum und Funktion10,11zu untersuchen. Zum Beispiel dienten injizierbare Hydrogele, die aus dezellularisiertem humanem Lipoaspirat und aus Myokardgewebe gewonnen wurden, als nicht-invasive Methoden der Gewebetechnik, und ein Hydrogel aus Schweinelungengewebe wurde als In-vitro-Testmethode verwendet. mesenchymale Stammzellanhaftung und Lebensfähigkeit12,13,14. Die Auswirkungen normaler Gewebestrahlungsschäden auf die ECM-Eigenschaften wurden jedoch nicht untersucht.
Hydrogele aus dem ECM haben das größte Potenzial für In-vitro-Studien von In-vivo-Phänomenen. Mehrere andere Materialien wurden untersucht, einschließlich Kollagen, Fibrin und Matrigel, aber es ist schwierig, die Zusammensetzung des ECM13synthetisch zu rekapitulieren. Ein Vorteil der Verwendung von ECM-abgeleiteten Hydrogelen ist, dass das ECM die notwendigen Proteine und Wachstumsfaktoren für ein bestimmtes Gewebe enthält14,15. Die Bestrahlung von normalem Gewebe während der Lumpektomie bewirkt signifikante Veränderungen am ECM, und ECM-abgeleitete Hydrogele können verwendet werden, um diesen Effekt in vitro zu untersuchen. Diese Methode könnte zu komplexeren und genaueren In-vitro-Krankheitsmodellen führen.
In dieser Studie haben wir murine Brustfettpolster (MFPs) der Strahlung ex vivo ausgesetzt. Die MFPs wurden dezellularisiert und zu einer Vor-Gel-Lösung hergestellt. Hydrogele wurden mit eingebetteten 4T1-Zellen gebildet, einer murinen TNBC-Zelllinie. Die rheologischen Eigenschaften des Hydrogelmaterials wurden untersucht und die Tumorzelldynamik innerhalb der Hydrogele untersucht. Hydrogele, die aus bestrahlten MFPs hergestellt werden, verbesserten die Tumorzellproliferation. Zukünftige Studien werden andere Zelltypen einbeziehen, um Zell-Zell-Wechselwirkungen im Zusammenhang mit dem Krebsrezidiv nach der Therapie zu untersuchen.
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Protocol
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit institutionellen Richtlinien und Protokollen durchgeführt, die vom Vanderbilt University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt wurden.
1. Vorbereitung und Ex-vivo-Bestrahlung von MFPs
- Opfern Sie athymische Nu/Nu-Mäuse (8–10 Wochen) mit CO2-Erstickung, gefolgt von zervikaler Dislokation.
- Reinigen Sie die Haut mit 70% Ethanol.
- Sammeln Sie Brustfettpolster (MFPs) von geopferten Mäusen mit vorsterilisierten Scheren und Zangen in einem 15 ml konischen Rohr, das komplette RPMI-Medien enthält (RPMI ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin und 10% fetalem Rinderserum) (siehe Tabelle der Materialien) ).
- Bestrahlen Sie Proben auf 20 Gy mit einer Cäsiumquelle.
- Bringen Sie die bestrahlten MFPs und kompletten RPMI-Medien in ein Biosicherheitskabinett. Die Medien werden von der Zelllinie abhängen, die im endgültigen Hydrogel angebaut werden soll. Füllen Sie 6 cm oder 10 cm Geschirr mit genügend Medien, um die MFPs zu untertauchen. Für 6 cm Geschirr, verwenden Sie 8 ml Medien, und für 10 cm Geschirr, verwenden Sie 20 ml Medien.
- Inkubieren Sie in einem 37 °C/5% CO2-Inkubator für zwei Tage. Die Zeitdauer im Inkubator kann angepasst werden.
- Gewebe in phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) abspülen, überschüssige Feuchtigkeit auslöschen und MFPs in 15 ml konische Rohre zur Lagerung bei -80 °C bis zur Dezellularisierung legen. Dieser Gefrierschritt unterstützt den Entzellungsschritt und die Probe sollte eingefroren werden, auch wenn die nächsten Schritte sonst bereit sind.
2. Dezellularisierung (angepasst aus den Referenzen12,16,17)
ANMERKUNG: Dieses Verfahren wurde von zuvor veröffentlichten Methoden angepasst, die sich auf die Adipopularisierung konzentrierten, die das Idononikum Natriumdeoxycholat anstelle von Natriumdodecylsulfat umfasste, um DIE DNA effizient zu entfernen12,16 , 17.
- Am ersten Taggefrorene MFPs von -80 °C entfernen und bei Raumtemperatur auftauen.
- Nach dem Auftauen, trocknen MFPs kurz auf einem empfindlichen Aufgabenwischen. Wiegen Sie die MFPs mit einer analytischen Skala.
- Teilen Sie gewebe mit einem Zangenpaar mit Schere oder skalpell in 3 mm x 3 mm x 3 mm Proben auf, um das intakte ECM und das restliche Gewebe für die Hydrogelproduktion zu untersuchen.
ANMERKUNG: Die Anzahl der Proben hängt von der Anzahl der Prüfmethoden ab, z. B. wird die Entnahme von zwei Proben unten beschrieben: eine für paraffineinbettende (Schritt 2.5) und eine zum Einfrieren in Kryostateinbettungsmedium, falls gewünscht (siehe Tabelle der Materialien schritt 2.6). - Wiegen Sie das Gewebe. Wenn Sie paraffin zum Schnitt in Paraffin einbetten, fahren Sie mit Schritt 2.5 fort. Wenn das Einfrieren in Kryostat-Einbettungsmedium für Schnitte, fahren Sie mit Schritt 2.6 fort.
- In einer chemischen Haube das Gewebe in 10% neutral gepuffertes Formalin (NBF) (siehe Materialtabelle)für 24 h bei 4 °C untertauchen. Waschen Sie 3 mal in PBS für 5 min jeder. Tauchen Sie das Gewebe in 30% Saccharose für 48 h bei 4 °C.
- Wiegen Sie das Gewebe jetzt, da dieses Stück entfernt wurde. Fahren Sie mit Schritt 2.6 fort.
- In einer chemischen Kapuze mandlassen, mFP-Stücke in eine beschriftete Kassette geben, die mit Kryostat-Einbettungsmedium versehen ist. Fügen Sie weitere Kryostat-Einbettungsmittel hinzu, um das Gewebe zu bedecken.
- Legen Sie die Kassette in ein Becherglas aus 2-Methylbutan (siehe Materialtabelle), das mit flüssigem Stickstoff vorgekühlt ist. Der Becher sollte genug 2-Methylbutan haben, um den Boden zu bedecken, aber nicht genug, um die Kassette zu untertauchen, da das Kryostat-Einbettmedium das 2-Methylbutan nicht berühren sollte. Lassen Sie die Kassette im 2-Methylbutan sitzen, bis das Kryostateinbettungsmedium gefriert und undurchsichtig wird.
- Die Kassette in Folie, Etikett wickeln und bei -80 °C lassen, bis sie zum Schnitt verwendet wird.
ANMERKUNG: Gewebe, die sofort in Kryostat-Einbettungsmedium gelegt wurden, wurden auf 5 m geschnitten, während in Saccharose inkubierte Gewebe auf 30 m geschnitten wurden, um die Adipozytenmorphologie beizubehalten.
- Verwenden Sie Zangen, um das verbleibende Gewebe manuell zu massieren.
HINWEIS: Gewebestücke können auch in 10% NBF für 24–48 h platziert, in PBS gespült und in 70% Ethanol gelassen werden, bis sie in Paraffin eingebettet werden. Nach der Einbettung können 5 m Abschnitte für Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H & E) verwendet werden (siehe Abschnitt 7 unten). - Legen Sie die MFPs in 6 cm Geschirr mit 5 ml 0,02% Trypsin/0,05% EDTA-Lösung. Bei 37 °C für 1 h inkubieren und die Schale mit 70% Ethanol abwischen, bevor sie in den Inkubator geben.
- Verwenden Sie 0,7 mm Siebe, um die MFPs mit deionisiertem (DI) Wasser zu waschen, indem Sie dreimal Wasser über das Gewebe gießen. Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe zwischen den Wärten manuell zu massieren.
- Kurz trockenes Gewebe auf einer empfindlichen Aufgabe wischen und wiegen. Legen Sie Gewebe in einen vorautoklavischen Becher, der einen entsprechend großen Rührstab enthält. Gewebe mit 60 ml 3% t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (siehe Materialtabelle)pro 1 g Gewebe abdecken und 1 h bei Raumtemperatur umrühren. Verwenden Sie mindestens 20 ml.
- Gewebe und Inhalt in ein Sieb werfen. Spülen Sie den Becher mit DI-Wasser und gießen Sie auf Gewebe. Wiederholen Sie dies noch zwei Mal. Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe zwischen den Spülungen manuell zu massieren.
- Kurz trockenes Gewebe auf einer empfindlichen Aufgabe wischen und wiegen. Gewebe und Rührstäbe wieder in die gleichen Becher legen und mit 60 ml 4% Desoxycholsäure pro 1 g Gewebe abdecken. 1 h bei Raumtemperatur umrühren. Verwenden Sie mindestens 20 ml.
- Gewebe und Inhalt in ein Netzsieb werfen. Spülen Sie den Becher mit DI-Wasser und gießen Sie auf Gewebe. Wiederholen Sie dies noch zwei Mal. Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe zwischen den Spülungen manuell zu massieren.
- Kurz trockenes Gewebe auf einer empfindlichen Aufgabe wischen und wiegen.
- Legen Sie Gewebe in den gleichen Becher mit frischem DI-Wasser, ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin. Dicht mit Paraffinfolie bedecken. Über Nacht bei 4 °C lassen.
- Waschen Sie sich Sie und Becher für den nächsten Tag.
- Am 2. Tagbecheren Sie den Inhalt des Bechers in ein Sieb ab. Kurz trockenes Gewebe auf einer empfindlichen Aufgabe wischen und wiegen.
- Legen Sie MFPs in den gleichen Becher mit einer entsprechend großen Rührstange. Abdeckung mit 60 ml 4% Ethanol/0,1% Peressigsäurelösung pro 1 g Gewebe. Verwenden Sie mindestens 20 ml. 2 h bei Raumtemperatur umrühren.
- Gewebe und Inhalt in ein 0,7 mm Sieb werfen. Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe manuell zu massieren. Legen Sie den Inhalt wieder in den Becher. Waschen Sie Gewebe, indem Sie es mit 60 ml 1x PBS pro 1 g Gewebe bedecken. Verwenden Sie mindestens 20 ml. 15 min bei Raumtemperatur umrühren. Wiederholen Sie dies einmal.
- Gewebe und Inhalt in ein 0,7 mm Sieb werfen. Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe manuell zu massieren. Legen Sie den Inhalt wieder in den Becher. Waschen Sie Gewebe, indem Sie es mit 60 ml DI-Wasser pro 1 g Gewebe bedecken. Verwenden Sie mindestens 20 ml. 15 min bei Raumtemperatur umrühren. Wiederholen Sie dies einmal.
- Kurz trockenes Gewebe auf einer empfindlichen Aufgabe wischen und wiegen. Gewebe und Inhalt in ein Sieb werfen. Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe manuell zu massieren.
- Legen Sie den Inhalt wieder in den Becher. Gewebe mit 60 ml 100% n-Propanol pro 1 g Gewebe abdecken. Verwenden Sie mindestens 20 ml. 1 h bei Raumtemperatur umrühren.
- Kurz trockenes Gewebe auf einer empfindlichen Aufgabe wischen und wiegen. Gewebe und Inhalt in ein 0,7 mm Sieb werfen. Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe manuell zu massieren.
- Legen Sie den Inhalt wieder in den Becher. Waschen Sie Gewebe, indem Sie es mit 60 ml DI-Wasser pro 1 g Gewebe bedecken. Verwenden Sie mindestens 20 ml. 15 min bei Raumtemperatur umrühren. Wiederholen Sie dies dreimal.
- Gewebe und Inhalt in ein Sieb werfen. Wiederholen Sie die Schritte 2.3–2.6, um Gewebestücke für die Saccharoseinkubation und das Einfrieren im Kryostateinbettungsmedium zu sammeln.
- Kurz trockenes Gewebe auf einer empfindlichen Aufgabe wischen und wiegen. In ein beschriftetes 15 ml-Rohr geben. Über Nacht bei -80 °C einfrieren.
3. Lyophilisierung
- Entfernen Sie die 15 ml Rohre von -80 °C und legen Sie sie auf Trockeneis. Halten Sie die Proben auf Trockeneis eingefroren, bis auf dem Lyophilisator.
- Entfernen Sie die Kappen. Verwenden Sie ein Gummiband, um eine empfindliche Aufgabe wischen an der Oberseite zu befestigen, um die Öffnung zu decken. Legen Sie Proben auf den Lyophilisator für mindestens 2 Tage.
- Entfernen Sie Proben vom Lyophilisator und legen Sie Diertuben auf Trockeneis. Entfernen Sie empfindliche Aufgabentücher wiegen jede Probe auf einer analytischen Skala. Kappen befestigen und über Nacht bei -80 °C platzieren.
4. Fräsen
- Füllen Sie einen flachen Behälter mit flüssigem Stickstoff. Proben aus dem Gefrierschrank -80 °C entfernen. Wiegen Sie jedes lyophilisierte MFP.
- Legen Sie eine Probe in den Mörtel. Verwenden Sie einen kryogenen Handschuh, um den Mörtel im flüssigen Stickstoff zu halten.
- Verwenden Sie einen Stößel, der an einem Handbohrer befestigt ist, um die Probe zu fräsen. Fräsen Sie in 1 min Intervallen, um den Fortschritt zu überprüfen und die handgeliebte Hand aus flüssigem Stickstoff zu entfernen. Mühle für mindestens 5 min.
- Wiederholen Sie dies für alle Proben. Sprühen und wischen Sie den Mörtel und Stößel mit Ethanol zwischen jeder Probe.
- Pulverproben in 15 ml-Rohren bei -80 °C lagern, bis sie einsatzbereit sind.
HINWEIS: Proben können sofort verwendet oder über Nacht gelagert werden.
5. Hydrogelbildung
- Bei -80 °C über Nacht lagern, bei Raumtemperatur entfernen und auftauen. Berechnen Sie beim Auftauen das erforderliche Gewicht von Pepsin (siehe Materialtabelle)und das Volumen der Salzsäure (HCl), die für jede Probe benötigt wird, die zu einer Lösung mit 1% w/v Probenpulver und 0,1% w/v Pepsin in 0,01 M HCl führt. Fügen Sie das Pepsin zur HCl hinzu, um sich zu bilden. eine Pepsin-HCl-Lösung.
- Probepulver und Pepsin-HCl-Lösung in ein 15 ml-Rohr geben. Fügen Sie eine kleine Rührstange hinzu und rühren Sie für 48 h.
- Legen Sie die Rohre für 5 min auf Eis. Berechnen Sie das erforderliche Volumen von 10x PBS für jede Probe, die zu einer Lösung mit einer 1x PBS-Konzentration führt. Fügen Sie jedem Rohr das entsprechende Volumen von 10x PBS hinzu.
- Fügen Sie 10% v/v 0,1 M NaOH zu jeder Lösung hinzu, um pH 7,4 zu erreichen. Verwenden Sie ein pH-Papier, um einzeln zu testen.
HINWEIS: Die Gellösung kann eine Woche lang bei 4 °C gelagert werden.
6. Verkapseln von Zellen in Hydrogelen
- Verwendung von GFP- und Luziferase-markierten Zellen
- Mit der pH 7,4-Gellösung die pelletierten GFP- und Luziferase-markierten 4T1-Zellen auf eine Konzentration von 500.000 oder 1.000.000 Zellen/ml Gellösung aufheben. Fügen Sie jedem Bohrgut einer 16-Well-Kammerrutsche 16 L Gel-Zell-Lösung hinzu. 30 min bei 37 °C inkubieren.
- Fügen Sie jedem Bohrwert 100 L vollständige RPMI-Medien hinzu. Inkubation für 48 h bei 37 °C fortsetzen. Die GFP- und Luziferase-markierten Zellen können mit Fluoreszenzmikroskopie nach 0 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden nach der Gelation visualisiert werden.
ANMERKUNG: Die Zellproliferation kann für die hier verwendeten GFP- und Luziferase-markierten 4T1-Zellen gemessen werden, indem den Brunnen 10 min (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylsäuresäuresalz (siehe Materialtabelle)hinzugefügt wird. und die Durchführung von Biolumineszenz-Bildgebung mit einem Biolumineszenz-Bildgebungssystem (siehe Tabelle der Materialien). Nach der Biolumineszenz-Bildgebung kann das Zytoskelett visualisiert werden (siehe Abschnitt 10).
- Verwenden nicht beschrifteter Zellen
- Mit der pH 7,4-Gellösung werden pelletierte 4T1-Zellen auf eine Konzentration von 500.000 oder 1.000.000 Zellen/ml Gellösung wieder aufsetzen. Fügen Sie jedem Brunnen einer 16-Well-Kammerrutsche und einer 96-Well-Platte 16 L Gelzelllösung hinzu. 30 min bei 37 °C inkubieren.
- Fügen Sie jedem Brunnen 100 L Medien hinzu. Inkubation für 48 h bei 37 °C fortsetzen.
ANMERKUNG: Die Zelllebensfähigkeit kann gemessen werden (siehe Abschnitt 11). Der 16-Well-Kammerschlitten kann für die Bildgebung verwendet werden, und die 96-Well-Platte kann für die Quantifizierung verwendet werden.
7. H & E Färbung
- Für formalinfixiertes, paraffinintegriertes Gewebe tauchen Dias mit 5 m Abschnitten zweimal in 100% Xylol (5–10 min) zur Deparaffinierung ein. Rehydrieren Sie durch Untertauchen in 100%, 95%, 85% und 70% Ethanol für je 5 min, gefolgt von DI-Wasser für 5 min. Fahren Sie mit Schritt 7.6 fort.
- Für gefrorene Gewebeabschnitte Abschnitte sofort aus dem Gefrierschrank nehmen und in 10% NBF für 10 min untertauchen. Waschen Sie in 1x PBS dreimal für 5 min jeder. Spülen Sie in Wasser für 5 min.
- Nuklei mit Hämatoxylin für 3 min. In fließendem Leitungswasser abspülen.
- Differenzieren Sie sich durch 1-2-faches Eintauchen in 0,3% sauren Alkohol (0,3% HCl in 70% Ethanol). Spülen Sie in fließendes Leitungswasser für 5 min.
- Bluing-Mittel für 30 s hinzufügen. Spülen Sie in fließendes Leitungswasser für 5 min. In 95% Ethanol für 30 s untertauchen.
- Mit Eosin für 90 s bei Raumtemperatur inkubieren. Dehydrieren Sie in 3 Veränderungen von 100% Ethanol für je 5 min.
- Zweimal in 100% Xylol für jeweils 5 min untertauchen. Distyrene-Plasticiser-Xylol (DPX0-Montagemedium zum Schlitten hinzufügen und einen Deckelschliff hinzufügen. Lassen Sie es über Nacht vor der Bildgebung heilen.
8. 1-(4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol Färbung
- Bereiten Sie 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol-Lösung vor.
- 0,5 g 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-Naphtholpulver zu einem Becher mit 100 ml Propylenglykol geben. Auf 95–100 °C erhitzen und mindestens 30 min rühren. Verhindern Sie, dass die Temperatur 100 °C überschreitet.
- Becher von der Hitze entfernen und leicht abkühlen lassen. Gießen Sie die Lösung durch qualitatives Filterpapier der Klasse 4, um Restpartikel zu entfernen.
HINWEIS: Die Lösung kann bei Raumtemperatur gelagert werden und sollte unmittelbar vor der Färbung durch einen 0,45-mm-Spritzenfilter gefiltert werden.
- Flecken gefrorene Gewebeabschnitte.
- Entfernen Sie die Dias aus dem Gefrierschrank von -80 °C und trocknen Sie 30 min. 10% NBF bei -20 °C für 30 min in einem Coplin-Glas vorkühlen. Fixieren Sie die Dias bei Raumtemperatur für 10 min. Waschen Sie in DI-Wasser 3 mal für 5 min jeder.
- Entfernen Sie überschüssiges Wasser mit einem empfindlichen Aufgabenwischen, bevor Sie in Propylenglykol 2 mal für jeweils 5 min eintauchen. Entfernen Sie Dias aus Propylenglykol. Nicht ausspülen.
- Dias in Spritze gefiltertÖl Rot O Färbung Lösung für 3 h bei Raumtemperatur.
- Unterscheiden Sie durch die Platzierung von Dias in 85% Propylenglykol für 5 min. Proben in PBS zweimal für jeweils 5 min abspülen.
- Proben mit Hämatoxylin für 30 s färben. 5 min in fließendem Leitungswasser waschen und dann die Dias in DI-Wasser geben.
- Montieren Sie Proben mit wässrigem Montagemedium und lassen Sie Medien über Nacht vor der Bildgebung trocknen.
9. Rheologie
- Bringen Sie Vorgellösungen von Schritt 5.4 auf das Rheometer auf Eis.
- Befestigen Sie einen 25 mm Arm und eine Platte am Rheometer. Öffnen Sie die Rheologiesoftware auf dem Computer, der mit dem Rheometer verbunden ist.
- Führen Sie eine Rotationszuordnung durch, und bestimmen Sie die Nullspalte. Heben Sie den Arm, wenn sie fertig sind.
- Pipette 500 l Vorgel auf der Platte. Senken Sie den Arm, bis die Vorgellösung den Spalt zwischen Platte und Arm vollständig einnimmt. Seien Sie konservativ, weil das Absenken des Arms über diesen Punkt hinaus dazu führen wird, dass eine Vor-Gel-Lösung aus der Seite austritt.
- Führen Sie einen Frequenz-Sweep auf der Pre-Gel-Lösung von 0,1 bis 100 Hz durch, nachdem sie 30 min bei 37 °C verbleibt.
- Heben Sie den Rheometerarm an, wenn sie fertig ist. Wischen Sie Flüssigkeit mit einem empfindlichen Aufgabenwischen. Mit DI-Wasser abspülen und mit einem empfindlichen Aufgabenwisch abwischen. Wiederholen Sie die Schritte 9.4–9.6 mit zusätzlichen Beispielen.
10. Phalloidin-Konjugatfärbung von F-Actin
- Phalloidin-Konjugatlösung auf Raumtemperatur bringen. Kurz Zentrifuge mit niedriger Geschwindigkeit vor dem Öffnen. Aliquot genug Lösung für den Test, und speichern Sie den Rest bei -20 °C.
- Verdünnen Sie 1000x Phalloidin-Konjugat-Stammlösung zu einer 1x Arbeitslösung, indem 1 l Stofflösung zu 1 ml 1x PBS + 1% Rinderserumalbumin (BSA) hinzugefügt wird. Dies macht genug für 10 Bohrungen (100 l/well).
HINWEIS: Man kann einfache 1x PBS verwenden, aber 1x PBS + BSA wird bevorzugt, um zu verhindern, dass Phalloidin-Konjugat an der Röhre klebt. Bewahren Sie diese Lösung nicht nach dem Test auf. 1 L blauer Fluoreszenzfarbstoff (siehe Materialtabelle)Arbeitslösung kann zu Flecken für Kerne hinzugefügt werden. Die Arbeitslösung kann durch Mischen von 1 l mit 20 mM blauem Fluoreszenzfarbstoff mit 11,3 l 1x PBS hergestellt werden. - Aspirieren von Medien aus Brunnen (Schritt 6.1). Spülen Sie Brunnen mit 1x PBS.
- Fügen Sie 10% NBF hinzu. Inkubieren Sie Brunnen mit 10% NBF für 20 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie Überstand. Waschen Sie 3 mal mit PBS für 5 min jedes Mal.
- Fügen Sie 0.1% t-Octylphenoxypolyethoxyethanol in PBS für 5 min. Aspirieren und waschen 3 mal mit PBS für 5 min jedes Mal.
- Fügen Sie 100 L Arbeitslösung von Schritt 10.2 zu jedem Brunnen hinzu. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Aspirieren und waschen Sie 3 mal mit PBS für 5 min jedes Mal. In PBS bei 4 °C lassen.
- Ansaugen und Entfernen von Brunnen aus der Dichtung auf der Kammerrutsche. Verwenden Sie eine Nadelnasenpinzette, um die Dichtung von der Rutsche zu entfernen. Montage und Deckbedeckung von Proben mit wässrigem Montagemedium. Aushärten lassen (5 min).
- Beobachten Sie Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop bei anregung/Emission von 590/618 nm.
11. Viability Assay
- Spülen Sie die Zellen mit Dulbeccos PBS (DPBS). Fügen Sie 100 L DPBS, die 1 M Calcein AM und 2 M Ethidium-Homodimer enthalten, zu jedem Brunnen hinzu. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Bild der 16-Well-Kammerrutsche mittels Fluoreszenzmikroskopie. Calceinacetoxymethyl (Calcein AM) kann bei Anregung/Emission = 494/517 nm beobachtet werden. Ethidium homodimer kann bei Anregung/Emission = 528/645 nm beobachtet werden.
- Lesen Sie die 96-Well-Platte auf einem Plattenleser mit den gleichen Wellenlängen in Schritt 11.2.
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Representative Results
MFPs wurden nach beeimtisiert erwerden, indem das in Abbildung 1Adargestellte Verfahren verwendet wurde. Gezeigt werden MFPs vor der Dezellularisierung (Abbildung 1B) und die Post-Dezellularisierung (Abbildung 1C). Die Dezellularisierung wurde mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung bestätigt, und 1-([4-(Xylyl)xylyl]azo)-2-naphthol Färbung wurde verwendet, um den Lipidgehalt zu bewerten (Abbildung 2). Die rheologischen Eigenschaften der ECM-Hydrogele wurden ebenfalls bei 37 °C bewertet (Abbildung 3). Der Speichermodul war für alle Bedingungen höher als der Verlustmodul, was eine stabile Hydrogelbildung demonstrierte.
GFP- und Luziferase-markierte 4T1-Mammakarzinomzellen wurden in den Hydrogelen verkapselt. Die Zellproliferation wurde durch Fluoreszenzmikroskopie, Biolumineszenzmessungen und Lebensfähigkeitsfärbung 48 h nach Verkapselung untersucht (Abbildung 4). Bestrahlte Hydrogele zeigten einen zunehmenden Trend bei der Tumorzellproliferation. Phalloidin-Konjugat wurde verwendet, um F-Actin in den gekapselten Zellen zu visualisieren (Abbildung 5). Diese Technik kann verwendet werden, um Zellmorphologie und zytoskelettale Eigenschaften zu untersuchen.
Abbildung 1: Experimenteller Workflow. (A) Schemader der Hydrogelbildung. Digitalkamerabilder wurden von MFPs vor - (B) und Post-Dezellularisierung (C) aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bestätigung der Dezellularisierung und Delipidisierung in MFPs. Die Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H & E) von unirradiated MFPs, die in Paraffin eingebettet und in 5 m (A) geschnitten wurden, wurde mit MFPs verglichen, die in Kryostateinbettungsmedium (5 m Abschnitte) vor (B) und nach der Dezellularisierung (C) eingefroren wurden. vor dem Einfrieren in Kryostateinbettungsmedium mit Saccharose inkubiert und bei 30 m (D )geschnitten. 1-(4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol Färbung wurde durchgeführt, um lipidretention in MFPs eingefroren in Kryostat Einbettungsmedium (5 m Abschnitte) vor (E) und nach der Dezellularisierung (F) und inkubiert mit Saccharose vor dem Einfrieren in Kryostat-Einbettung mittel und schnittte in 30 m Abschnitte (G). Skalenbalken stellen 50 m dar. Decell = Dezellularisierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bestätigung der Hydrogelbildung. Rheologie wurde verwendet, um den Lager- und Verlustmodul der Kontrolle (A) und bestrahlt (B) Vorgellösung aus MFPs bei 37 °C und 0,5% Stamm zu bestimmen. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Proliferation von Tumorzellen bei bestrahlten ECM-Hydrogelen. 4T1 Zellproliferation 48 h nach Derokulation wird mit Vorgel aus Kontrolle abgeleitet (A) und bestrahlt (B) MFPs. (C) Biolumineszenzsignal von 4T1-Zellen in Kontrolle eingebettet und bestrahlthydrogel. Calcein AM gebeizte lebende Zellen und Ethidium homodimer gebeizte tote Zellen wurden unter Kontrolle (D) und bestrahlten (E) Hydrogelen bewertet, und das Leben-Tot-Verhältnis wurde quantifiziert (F). Skalenbalken stellen 200 m dar. Fehlerbalken zeigen Standardfehler an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Zytoskeletteigenschaften in ECM-Hydrogelen. Zellen innerhalb (A) Kontroll- und (B) bestrahlter ECM-Hydrogele sind mit Phalloidin-Konjugat gebeizt, um F-Actin (rot) und blauer Fluoreszenzfarbstoff zu visualisieren, um Nuklei (blau) in bestrahlten MFPs zu visualisieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Gewebegewicht (g) | Steuerung (0 Gy) |
Bestrahlt (20 Gy) |
| Anfängliches MFP-Gewicht | 0,461 | 0,457 |
| MFP-Gewicht nach Histologie-Probenentfernung | 0,423 | 0,416 |
| MFP-Gewicht nach Dezellularisierung | 0,025 | 0,025 |
| Dezellularisiertes MFP-Gewicht nach Histologie-Probenentfernung | 0,015 | 0,016 |
Tabelle 1: Gewebegewichte vor und nach der Dezellularisierung. Repräsentative Gewebegewichte für jede Bedingung wurden vor und nach der MFP-Dezellularisierung gemessen.
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Discussion
Diese Methode der Hydrogelbildung ist weitgehend abhängig von der Menge des Ausgangsgewebes. Murine MFPs sind klein, und der Dezellularisierungsprozess führt zu einer signifikanten Verringerung des Materials (Tabelle 1). Der Prozess kann mit mehr MFPs wiederholt werden, um die Endausbeute zu erhöhen. Das Fräsen ist ein weiterer wichtiger Schritt, der zu Materialverlust führen kann. Andere haben Erfolg mit einer kryogenen Mühle gezeigt, aber dieses Protokoll basiert auf Fräsen über einen Handmörtel und elektrischen Bohrer mit einem Stößel aufsatz8,17. Dies hat den Vorteil niedrigerer Kapitalkosten und der Minimierung von Materialverlusten, kann aber zu Variabilität im Endprodukt führen.
Eine Herausforderung zur Bestätigung der Dezellularisierung und Delipidation ist das Einfrieren von Fettgewebe im Kryostat-Einbettmedium. Abbildung 2A zeigt die H&E-Färbung eines unirradiateierten MFP, das in Paraffin eingebettet und geschnitten ist. Deutliche Kerne sind an den Rändern von Fettzellen in der Nähe von Knoten mit anderen Zellen sichtbar, und die Adipozytenmorphologie ist gut erhalten. Abbildung 2B ,C,E,F zeigen MFPs, die durch Einbetten und Einfrieren von MFPs in Kryostateinbettungsmittel und Schnittscheiben von 5 m hergestellt werden. Dieser Prozess konnte die Adipozytenmorphologie und -form nicht beibehalten. Die Dezellularisierung wurde jedoch durch den Verlust von Kernen und anderen DNA-Spuren bestätigt (Abbildung 2C), und die Delipidisierung wurde mit dem Verlust neutraler Lipidgehaltfärbung visualisiert (Abbildung 2F). Die Adipozytenmorphologie wurde durch inkubation von MFPs in Saccharose, Einbettung und Einfrieren in Kryostateinbettungsmedium und Schnitt von 30 'm-Scheiben aufrechterhalten (Abbildung 2D,G). Während die Visualisierung von H & E Färbung war schwierig mit dieser Methode (Abbildung 2D), 1-([4-(Xylylazo)xylyl)azo)-2-naphthol Färbung bestätigte die Beibehaltung der Adipozytenmorphologie (Abbildung 2G).
Wir haben ein In-vitro-Hydrogelmodell entwickelt, das die normale Gewebemikroumgebung in vivo und ihre Reaktion auf Strahlenschäden nachahmen kann. ECM-Hydrogele wurden in ähnlichen Studien hergestellt, aber die Auswirkungen von Strahlenschäden auf das Verhalten von Tumorzellen wurden nicht bewertet9,12,16,17,18. Wir gehen davon aus, dass die Bestrahlung von MFPs die Umgestaltung und Zusammensetzung des ECM verändern wird, und diese kompositorischen Veränderungen werden in zukünftigen Studien charakterisiert. Wir beobachteten einen zunehmenden Trend bei der Proliferation von 4T1-Zellen in bestrahlten ECM-Hydrogelen, die sowohl Biolumineszenz-Bildgebung als auch Lebensfähigkeitsfärbung verwenden (Abbildung 4). Darüber hinaus verwendeten wir Phalloidin-Konjugat, um F-Actin-Filamente in verkapselten Tumorzellen zu färben und fanden eine qualitative Zunahme der Aktinausrichtung und Tumorzelldehnung in bestrahlten ECM-Hydrogelen, was auf eine Erhöhung der Haftfestigkeit und invasive Kapazität (Abbildung 5)19,20. Zukünftige Experimente werden Veränderungen in der fokussischen Haftdynamik und proteasevermittelte Umgestaltung für die Bewertung von Zellmigration und Invasion untersuchen.
Diese Methode wurde mit einer murinen TNBC-Zelllinie entwickelt, aber diese Methode kann als Plattform für die Bewertung der Proliferation und Invasivität anderer Zelltypen verwendet werden. Zukünftige Studien können Immunzellen einbeziehen, um ihre Rolle als Reaktion auf Strahlung sowie andere Formen von Gewebeschäden (z. B. Chirurgie) zu bestimmen. Obwohl in dieser Studie ECM-Hydrogele von mfPs untersucht wurden, die ex vivo bestrahlt wurden, werden weitere Studien die In-vivo-Strahlung von MFPs untersuchen, um die Wirkung physiologischer Strahlungsreaktionen und das Infiltrieren von Immunzellen auf die ECM-Eigenschaften zu bewerten. Wir haben eine Methode zur Herstellung von ECM-Hydrogelen aus Maus-MFPs etabliert, um die Wirkung normaler Gewebestrahlung auf das Verhalten von Tumorzellen zu untersuchen, und diese Technik kann auf menschliches Gewebe für ein relevanteres Hydrogelmodell ausgedehnt werden. Insgesamt kann die Untersuchung normaler Gewebeschäden durch ECM-Hydrogele zu Erkenntnissen über die Rolle von ECM-Änderungen nach der Strahlentherapie bei lokalen Rezidiven führen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Laura L. Bronsart für die Bereitstellung der GFP- und Luziferase-4T1-Zellen, Dr. Edward L. LaGory für Beratung zu 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol Färbung, Dr. Craig L. Duvall für IVIS und Lyophilisatoris verwenden, und Dr. Scott A. Guelcher für Rheometer benutzen. Diese Forschung wurde durch nIH-#R00CA201304 finanziell unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | - |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | - |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | - |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | - |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | - |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | - |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | - |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | - |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | - |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | - |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | - |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | - |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | - |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | - |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | - |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | - |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | - |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | - |
References
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