Summary
We boden gevangen mangoest placebo orale rabiës vaccin lokaas met ethyl of methyl iophenoxinezuur als biomarker en geverifieerde Bait opname met behulp van een nieuwe vloeistofchromatografie met tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) methode.
Abstract
De kleine Indische mangoest (Herpestes auropunctatus) is een reservoir van rabiësvirus (rabv) in Puerto Rico en omvat meer dan 70% van dieren rabiës gevallen gerapporteerd per jaar. De controle van RABV circulatie in wild reservoirs wordt meestal bewerkstelligd door een strategie van orale rabiësvaccinatie (ORV). Momenteel bestaat er geen Wildlife ORV programma in Puerto Rico. Onderzoek naar orale rabiës vaccins en verschillende Bait types voor mangoest is uitgevoerd met veelbelovende resultaten. Het monitoren van het succes van ORV berust op het inschatten van de opname van aas door DOELDIERSOORTEN, wat meestal gepaard gaat met het evalueren van een verandering in RABV neutraliserende antilichamen (RVNA) na vaccinatie. Deze strategie kan moeilijk te interpreteren zijn in gebieden met een actief Wildlife orv-programma of in gebieden waar rabv enzoötische boviene is en achtergrondniveaus van rvna aanwezig zijn in reservoir soorten. In dergelijke situaties kan een biomarker die met het vaccin of de Bait matrix is verwerkt, nuttig zijn. We boden 16 gevangen mangoest placebo orv lokaas aan die ethyl-iopfenoxinezuur (et-IPA) bevatten in concentraties van 0,4% en 1% in het aas en 0,14% in de externe Bait matrix. We boden ook 12 gevangen mangoest orv lokaas aan die methyl-iopfenoxinezuur (me-IPA) bevatten in concentraties van 0,035%, 0,07% en 0,14% in de externe Bait matrix. We hebben een serummonster verzameld voorafgaand aan het aas en vervolgens wekelijks voor maximaal acht weken na het aanbieden. We hebben Iopfenoxische zuren uit sera geëxtraheerd in acetonitril en gekwantificeerd met behulp van vloeibare chromatografie/massaspectrometrie. We analyseerden sera voor et-IPA of me-IPA door vloeistofchromatografie-massaspectrometrie. We vonden adequate Markeer baarheid voor ten minste acht en vier weken voor et-en me-IPA, respectievelijk. Beide IPA-derivaten kunnen geschikt zijn voor veld evaluatie van de opname van ORV Bait in mangoest. Vanwege de levensduur van de marker in Mongoose sera, moet er voor gezorgd worden dat de resultaten niet worden verhaald door hetzelfde IPA-derivaat te gebruiken tijdens opeenvolgende evaluaties.
Introduction
Rabies virus (RABV) is een negatief gevoel enkel strandde Lyssavirus, en circuleert tussen diverse wild reservoir soorten binnen de bestellingen Carnivora en Chiroptera. Meerdere soorten mangoesten zijn reservoirs van RABV, en de kleine Indische mangoest (Herpestes auropunctatus) is het enige stuwmeer in Puerto Rico en andere Caribische eilanden in het westelijk halfrond1,2,3 . De controle van RABV circulatie in wild reservoirs wordt meestal bewerkstelligd door een strategie van orale rabiësvaccinatie (ORV). In de Verenigde Staten (VS) wordt deze beheeractiviteit gecoördineerd door het USDA/APHIS-en Wildlife Services National rabies Management Program (NRMP)4. Momenteel bestaat er geen Wildlife ORV programma in Puerto Rico. Onderzoek naar rabiës vaccins en verschillende Bait types voor mangoest is uitgevoerd met veelbelovende resultaten die suggereren dat een orv-programma voor mangoest mogelijk is5,6,7,8.
Het monitoren van de impact van ORV berust op het inschatten van de opname van aas door DOELDIERSOORTEN, wat meestal gepaard gaat met het evalueren van een verandering in RV antilichamen seroprevalentie. Echter, deze strategie kan uitdagend zijn in gebieden met een actieve Wildlife orv Programma's of in gebieden waar RV is enzoötische boviene en achtergrondniveaus van rabv neutraliserende antilichamen (rvna) aanwezig zijn in het reservoir soorten. In dergelijke situaties kan een biomarker die is opgenomen in het aas of de externe Bait matrix nuttig zijn.
Verschillende biologische markers zijn gebruikt voor het monitoren van de opname van aas bij tal van soorten, waaronder wasberen (Procyon lotor)9,10, stoats (Mustela Hermelijn)11,12, Europese Badgers ( Meles meles) 13, wilde zwijnen (Sus scrofa)14, kleine Indische mangoest15 en prairie honden (cynomysludovicianus)16,17, onder anderen. In de VS bevatten operationele orv-lokaas vaak een 1% tetracycline biomarker in de Bait matrix om aas-opname18,19te bewaken. Nadelen van het gebruik van tetracycline omvatten echter een toenemende bezorgdheid over de verspreiding van antibiotica in het milieu en dat de detectie van tetracycline typisch invasief is, waarbij tandextractie of vernietiging van het dier nodig is om bot te verkrijgen voorbeelden20. Rhodamine B is geëvalueerd als een marker in een verscheidenheid van weefsels en kan worden gedetecteerd met behulp van ultraviolet (UV) licht en fluorescentie in haar en snorharen10,21.
Iophenoxinezuur (IPA) is een wit kristallijn poeder dat is gebruikt om de consumptie van aas in coyotes te evalueren(Canis latrans)22, Arctic Fox (Vulpes lagopus)23, Red Fox (Vulpes vulpes)24, wasberen 9 , 25, everzwijn14, edelhert (Cervus elaphus scoticus)26, Europese Badgers12 en fretten (M. furo)27, onder verschillende andere zoogdiersoorten. Retentietijden van IPA varieert per soort van minder dan twee weken in sommige buideldieren28,29, tot ten minste 26 weken in hoefdieren26 en meer dan 52 weken in huis honden (Canis lupus familiaris)30. Retentietijden kunnen ook dosis-afhankelijke31zijn. Iophenoxinezuur bindt sterk aan serumalbumine en werd historisch ontdekt door het meten van bloed jodium niveaus32. Deze indirecte aanpak werd vervangen door krachtige vloeistofchromatografie (HPLC)-methoden om de iophenoxinezuur concentraties direct te meten met UV-detectie33, en uiteindelijk met vloeibare chromatografie en massaspectrometrie (lcm's) 34,35. Voor deze studie werd een zeer gevoelige en selectieve vloeistofchromatografie met tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS)-methode ontwikkeld die meerdere reactie monitoring (MRM) gebruikt om twee analogen van iopfenoxinezuur te kwantificeren. Ons doel was om deze LC-MS/MS-methode te gebruiken om het markerings vermogen van 2-(3-hydroxy-2, 4, 6-triiodobenzyl) propanoïne zuur (methyl-IPA of me-IPA) en 2-(3-hydroxy-2, 4, 6-triiodobenzyl) butaanzuur (ethyl-IPA of et-IPA) en bij levering in een ORV aas naar Captive mangoest.
Mangoest waren levend gevangen in kooi vallen met in de handel verkrijgbare gerookte worstjes en visolie. Mangoest werden ondergebracht in individuele 60 cm x 60 cm x 40 cm roestvrijstalen kooien en gevoed met een dagelijks rantsoen van ~ 50 g commercieel droog kattenvoer, tweemaal per week aangevuld met een in de handel verkrijgbare kippen dij. Water was beschikbaar ad libitum. We leverden twee derivaten van IPA, ethyl-IPA en methyl-IPA, aan gevangen mangoest in placebo ORV Baits. Alle aas bestond uit een 28 mm x 20 mm x 9 mm folie blisterverpakking met een uitwendige coating (hierna "Bait matrix") met poedervormige kip ei en gelatine (tabel van materialen). Baits bevatte 0,7 mL water of IPA-derivaat en woog ongeveer 3 g, waarvan ~ 2 g de externe Bait matrix was.
We boden 16 Captive mangoest et-IPA in drie concentraties aan: 0,14% (2,8 mg et-IPA in ~ 2 g Bait matrix; 3 mannetjes [m], 3 vrouwtjes [f]), 0,4% (2,8 mg et-IPA in 0,7 mL blisterverpakking volume; 3m, 3F), en 1,0% (7,0 mg ethyl-IPA in 0,7 mL blisterverpakking volume; 2m , 2F). De totale dosis van 2,8 mg komt overeen met een doserings percentage van 5 mg/kg27,36 en is gebaseerd op een gemiddeld mongans gewicht van 560 g in Puerto Rico. We selecteerden 1% als de hoogste concentratie als onderzoek suggereert dat de smaak afaversie van sommige biomarkers kan voorkomen bij concentraties > 1% bij sommige soorten37. We boden de dosis van 1% alleen aan in de blisterverpakking, omdat flocculatie verhinderde dat de opgeloste stof in het oplosmiddel voldoende werd opgenomen om gelijkmatig in de Bait matrix te worden verwerkt. Eén controlegroep (2m, 1f) kreeg aas gevuld met steriel water en geen IPA. We boden loten aan mangoest in de ochtend (~ 8 a.m.) tijdens of voorafgaand aan het voeden van hun dagelijkse onderhoud rantsoen. Aas resten werden verwijderd na ongeveer 24 uur. We verzamelde bloedmonsters voorafgaand aan de behandeling, een dag na de behandeling en vervolgens wekelijks tot 8 weken na de behandeling. We verdoofd mangoest door inademing van Isofluraan gas en verzameld tot 1,0 ml volbloed door venipunctie van de craniale Vena Cava zoals beschreven voor fretten38. We hebben volbloed monsters gecentrifugeerd, sera overgebracht naar cryoflacons en ze opgeslagen bij-80 °C tot de analyse. Niet alle dieren werden bemonsterd gedurende alle perioden om de effecten van herhaalde bloed trekkingen op de gezondheid van de dieren te minimaliseren. Controledieren werden bemonsterd op dag 0, daarna wekelijks gedurende maximaal 8 weken na de behandeling.
We leverden me-IPA in drie concentraties: 0,035% (0,7 mg), 0,07% (1,4 mg) en 0,14% (2,8 mg), allemaal opgenomen in de Bait matrix, met 2 mannetjes en 2 vrouwtjes per behandelgroep. Twee mannetjes en twee vrouwtjes kregen aas gevuld met steriel water en geen IPA. Aas bieden tijden en Mongoose anesthesie worden hierboven beschreven. We verzamelde bloedmonsters voorafgaand aan de behandeling op dag 1, en vervolgens wekelijks tot 4 weken na de behandeling.
We testten de serumconcentratie gegevens voor normaliteit en geschatte gemiddelden voor serum IPA-concentraties van verschillende behandelingsgroepen. We gebruikten een lineair gemengd model om de gemiddelde serum-et-IPA-concentraties te vergelijken die over individuen werden samengevoegd. Bait type (matrix/blisterverpakking) was een vast effect naast de experimentele dag, terwijl dierlijke ID een willekeurig effect was. Alle procedures werden uitgevoerd met behulp van gemeenschappelijke statistische software (tabel met materialen) en significantie werd geëvalueerd bij α = 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door het USDA National Wildlife Research Center van het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité onder goedgekeurd onderzoeksprotocol QA-2597.
Opmerking: het volgende protocol beschrijft de analyseprocedure voor het opsporen van methyl-iophenoxinezuur in het Mongoose serum. Deze methode is de definitieve versie van een iteratief proces dat begon met analyse van ethyl-iopfenoxinezuur in Mongoose serum. Tijdens de initiële evaluatie van ethyl-iopfenoxinezuur werden kleine wijzigingen aangebracht in de methoden, wat resulteerde in het uiteindelijke protocol dat hieronder werd gepresenteerd. Representatieve resultaten omvatten die verkregen tijdens beide iteraties.
1. voorbereiding van oplossingen en normen
- Koop me-IPA en et-IPA.
- Voor mobiele fase A, bereid 1 L van 0,1% (v/v) mierenzuur in water door 1 mL mierenzuur te combineren met 1 L ultrazuiver water (≥ 18 MΩ). Voor mobiele fase B, bereid 1 L van 0,1% (v/v) mierenzuur in acetonitril (ACN) door 1 mL mierenzuur te combineren met 1 L ACN.
- Bereid voor oplosmiddel 200 mL 0,5% (v/v) trifluorazijnzuur (TFA) in ACN door 1 mL TFA te combineren met 200 mL ACN.
- Bereid geconcentreerde IPA-stamoplossingen van mij-IPA en et-IPA in ACN in bij concentraties van ongeveer 1.000 μg/mL.
- Weeg ongeveer 10 mg van mij-IPA op een microbalans en noteer de massa tot ± 0,0001 mg. Breng de me-IPA kwantitatief over in een volumetrische kolf van 10 mL met 45 mL ACN. Sonicate 1 min om alle vaste stoffen op te lossen en breng vervolgens naar het volume met ACN.
- Breng ~ 8 mL van elk voorraad naar Amber 8 mL glazen flesjes met poly-tetrafluorethyleen (PTFE)-beklede doppen. Bewaren bij kamertemperatuur (RT). Breng de resterende voorraad over naar gevaarlijk afval.
- Voor de 25x-7 me-IPA voorraad (tabel 1), bereid een voorraad van mij-IPA in ACN op ongeveer 200 μg/ml. Voorbeeld: Breng 1 mL van de me-IPA geconcentreerde kolf over van stap 1.4.2 naar een maatkolf van 5 mL met een glazen spuit van 1.000 μL. Verdun tot het volume met ACN. Breng de kolf over in een amberkleurige glazen Injectieflacon van 8 mL met een PTFE-gevoerde dop. Store bij RT.
- Bereid de zes extra 25x me-IPA-aandelen voor zoals beschreven in tabel 1. Combineer voor elke kolf de volumes die worden aangegeven met een herhaalde pipet in een amberkleurige glazen Injectieflacon van 8 ml met een PTFE-gevoerde dop. Bewaar elke kolf op RT.
- Voor de 25x surrogaat voorraad, bereidt u een vervangende voorraad van mij-IPA voor in ACN op ongeveer 10 μg/mL uit de geconcentreerde kolf die in stap 1.4.2 is bereid. Breng 0,100 mL van de geconcentreerde me-IPA-kolf over in een volumetrische kolf van 10 mL met een glazen spuit van 100 μL en Verdun vervolgens tot het volume met ACN.
- Breng ~ 8 mL over in een amberkleurige glazen Injectieflacon van 8 mL met een PTFE-gevoerde dop. Store bij RT. Breng de resterende voorraad over naar gevaarlijk afval.
- Bereid 4x voorraden met beide analyten in 2 mL schroef-top glazen autosampler flesjes zoals beschreven in tabel 2.
- Als u bijvoorbeeld de voorraad 4x-7 wilt voorbereiden op een Injectieflacon van 2 ml, voegt u 0,20 ml van de 25x-7 me-IPA kolf toe vanaf stap 1,5 met behulp van een herhaalde pipet met een tip van 0,5 ml capaciteit. Voeg 0,20 ml van de 25x surrogaat et-IPA kolf toe vanaf stap 1,7 met behulp van een herhaalde pipet met een tip van 0,5 ml capaciteit.
- Voeg 0,85 ml ACN toe met een herhaalde pipet met een tip van 1 ml capaciteit. Sluit de injectieflacon stevig aan en keer 5x om te mengen.
- Bereid de standaard curve in 2 mL schroef-top autosampler flesjes zoals beschreven in tabel 3.
- Als u bijvoorbeeld standaard 7 (STD 7) wilt bereiden op een 2-ml injectieflacon, voegt u 0,20 ml van de 4x-7 kolf toe vanaf stap 1.8.2 met behulp van een herhaalde pipet met een tip van 0,5 ml capaciteit. Voeg 0,60 ml ultrapuur di water toe met behulp van een herhaalde pipet met een tip van 1 ml capaciteit. Sluit de injectieflacon stevig aan en keer 5x om te mengen.
2. monstervoorbereiding
Let op: personeel dat deze procedure uitvoert, moet de volledige serie rabiës pre-exposure profylaxe hebben ontvangen en een gedocumenteerde rabiës antilichaamtiter boven 0,5 IU hebben van een federale medische faciliteit voor gezondheid op het werk. Het personeel moet bij het uitvoeren van de extractie te allen tijde laboratoriumjassen en Oogbescherming dragen. Voorzichtig: Voer stappen 2.3 − 2.6 uit in een klasse II bioveiligheid Cabinet.
- Bereid voor elk monster een micro centrifugebuis van 1,5 mL met 200 − 300 mg NaCl. Orden de buizen in een plastic rek van 80-positie. Gereserveerd voor gebruik in stap 2,6.
Opmerking: voor grote aantallen monsters wordt een microscoop (of een ander klein meetapparaat) aanbevolen. - Label twee 1,5 mL micro centrifugebuizen voor elk monster: één als "A" en de andere als "B". Regel de buizen in een plastic rack met 80 posities.
- Plaats de volgende materialen en apparatuur die nodig zijn voor serum extractie in een klasse II bioveiligheid Cabinet: Micro centrifugebuizen (in racks) bereid in de stappen 2,1 en 2,2, een Vortex mixer, herhaalde pipet met 0,5 ml en 5 ml capaciteits tips, 100 − 1000 μL luchtverplaatsing Pipetteer met 1.000 μL tips, containers met ongeveer 100 mL, elk verdunningsmiddel en ultrapuur DI water, en een Biohazard afvalbak.
- Verwijder serummonsters van bevroren opslag en warm tot RT in de bioveiligheidskast. Vortex Meng elk serummonster vóór de bemonstering.
- Gebruik een herhaalde pipet met een tip van 0,5 ml, verdeel 0,050 ml Mongoose serum in de buis "a" en Voeg 0,050 ml 25x surrogaat kolf toe. Voeg vervolgens 0,950 ml verdunningsmiddel toe aan de buis "A" met behulp van een herhaalde pipet met een tip van 5 ml capaciteit. Dop stevig en Vortex mix voor 10 − 15 s.
- Doseer de vooraf gewogen NaCl van stap 2,1 in de buis "A" en Vortex mix 3x voor 8 − 12 s. Veeg de buitenoppervlakken van het flacon rek met de buis "A" af met 70% (v/v) isopropanol.
Opmerking: het rek van de monsters kan nu worden verwijderd uit de klasse II bioveiligheid Cabinet. - Centrifuge buis "A" bij 12.000 x g gedurende 1 minuut om de waterige en ACN-fasen te scheiden. Pipetteer 0,80 mL van de bovenste ACN-fase naar de buis "B" met behulp van een pipet met een luchtverplaatsing van 100 − 1000 μL. Breng de resterende oplossing in buis "A" over naar gevaarlijk afval en gooi de lege buis weg in een biogevaarlijke afvalbak.
- Verwijder ACN en TFA van Tube "B" met een zachte stroom van N2 gas in een waterbad van 45 °c.
- Voeg 0,250 mL ACN toe aan Tube "B" met behulp van een herhaalde pipettor, Vortex mix voor 4 − 5 s, en centrifugeer vervolgens kort (2 − 4 s) bij 12.000 x g om de vloeistof in de bodem van de buis te verzamelen.
- Voeg 0,750 ml ultrapuur di water toe aan de buis "B" met behulp van een herhaalde pipet met een tip van 5 ml, Vortex mix voor 4 − 5 s, en centrifugeer vervolgens 1 minuut bij 12.000 x g om het monster te verduidelijken.
- Breng 0,75 mL van de supernatant over naar een injectieflacon met autosampler met behulp van een pipet met een luchtverplaatsing van 1.000 μL. Gooi pipetpunten weg in de Biohazard Waste container.
- Cap autosampler flesjes veilig en analyseren door LC-MS/MS (sectie 4). Breng de resterende oplossing in buis "B" over naar gevaarlijk afval en gooi de lege buis weg naar een biogevaarlijke afvalbak. Verwijder alle biogevaarlijke afvalstoffen door autoclaven of verbranding.
3. monsters van de kwaliteitscontrole
Let op: Volg de waarschuwingen die worden beschreven in paragraaf 2.
Opmerking: de volgende procedure beschrijft het minimum aantal kwaliteitscontrole (QC) monsters die nodig zijn voor een analyse. Replicaten op elk niveau worden aanbevolen als voldoende controle Mongoose serum beschikbaar is.
- Maak vier 1,5 mL microcentrifugebuisjes met 200 − 300 mg NaCl. Regel de buizen in een plastic rack met 80 posities.
- Label twee 1,5 mL micro centrifugebuizen voor elk QC-monster: een als "A" en de andere als "B". Regel de buizen in een plastic rack met 80 posities.
- Herhaal stap 2,3.
- Verwijder Control Mongoose serum van bevroren opslag en warm tot rt in de bioveiligheid Cabinet. Vortex Meng het controleserum voorafgaand aan de bemonstering.
- Breng 0,050 ml Control Mongoose serum in de vier 1,5-ml "A"-buisjes met behulp van een herhaalde pipet met een tip van 0,5 ml capaciteit.
- Versterk elk van de vier QC-monsters zoals gespecificeerd in tabel 4 met behulp van een herhaalde pipet met een tip van 0,5 ml capaciteit. Dop elk QC-monster veilig en Vortex mix voor 10 − 15 s.
- Voer de extractieprocedure uit zoals beschreven in stap 2.6 − 2.12.
4. LC-MS/MS-analyse
- Configureer de LC-MS/MS met alle parameters die worden beschreven in tabel 5. Schakel de LC-MS/MS in en laat de kolom oplopen tot 70 °C voordat de stroomsnelheid wordt ingesteld op 0,800 mL/min.
- Stel een reeks in de software voor gegevensverzameling in (tabel met materialen) om de standaard curve voor en na elke batch te injecteren, bestaande uit kwaliteitscontrole monsters en onbekende monsters.
- Injecteer alle normen en monsters en verkrijg MRM-ionen chromatogrammen met behulp van de in tabel 5vermelde parameters.
- Schakel na voltooiing van de sequentie de LC-MS/MS uit en gooi alle injectieflacons met autosampler weg als gevaarlijk afval.
5. kwantificering
- Gebruik de data-analyse software om een kalibratiecurve te genereren van relatieve responsen versus relatieve concentraties voor mij-IPA met behulp van et-IPA als de interne standaard. Bereken de relatieve responsen van de kwantor MRM transitie voor mij-IPA (556,6 → 428,7) gedeeld door de MRM overgang voor et-IPA (570,7 → 442,7). Bouw een kalibratiekromme van 7 niveaus met een tweede orde kwadratische functie die gewogen 1/x is en de oorsprong negeert.
- Bereken de serumconcentratie (Cserum) van mij-IPA met behulp van de volgende vergelijking:
Wanneer c-instrument de concentratie is die wordt bepaald door het instrument van de ijkcurve in eenheden van μg/ml, is 1,25
de verdunningsfactor, v-finale het uiteindelijke monstervolume (1,0 ml) en het serum volume in ml ( 0,050 mL nominaal).
de verdunningsfactor, v-finale het uiteindelijke monstervolume (1,0 ml) en het serum volume in ml ( 0,050 mL nominaal).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve ionen chromatogrammen uit een me-IPA-analyse worden weergegeven in Figuur 1. Het Control Mongoose serum (Figuur 1a) illustreert de retentietijd van et-IPA (surrogaat analyt) en de afwezigheid van mij-IPA op de aangegeven retentietijd. De kwaliteitscontrole sample (Figuur 1b) illustreert de baseline scheiding van me-IPA van et-IPA, evenals de kwantor en kwalificatie overgangen voor mij-IPA. Afbeelding 1c toont een representatief monster uit de studie met een waargenomen serumconcentratie van 33,5 μg/ml me-IPA.
Een representatieve kalibratiecurve van een me-IPA-analyse wordt weergegeven in Figuur 2. De 7-niveau, 14-punts standaard curve varieert van 0,00202 tot 8,27 μg/mL me-IPA met een correlatiecoëfficiënt (r2) van 0,9998. De correlatiecoëfficiënten varieerden van 0,9998 tot 0,99997 voor de vijf me-IPA analyses. De surrogaat analyt et-IPA concentratie was 0,502 μg/mL in alle normen.
Tabel 6 presenteert de nauwkeurigheid en precisie resultaten voor Control Mongoose serum versterkt met 0, 1,3, 31, en 82 μg/ml me-IPA (n = 10 op elk niveau). De resultaten werden verzameld uit vijf afzonderlijke analyses. Percentage terugvorderingen varieerden van 96,9% tot 109%. Het percentage relatieve standaarddeviatie (% RSD) op de drie vesting-niveaus bedroeg respectievelijk 3,4%, 1,7% en 2,3%.
De signaal-ruis verhouding (S/N) waargenomen bij kwaliteitscontrole monsters (n = 10 negatieve controles; n = 10 bij 1,3 μg/mL me-IPA) werd gebruikt om de detectiegrens (DL; 3 x S/N) en kwantitatie limiet (QL; 10 x S/N) te bepalen. De DL en QL voor mij-IPA in het Mongoose serum waren respectievelijk 0,012 μg/mL en 0,042 μg/mL.
De piek gebied reacties van de kwalificatie MRM overgang gedeeld door de kwantor MRM overgang (
werd berekend voor alle normen en monsters. Deze verhouding voor elk monster werd vervolgens gedeeld door de gemiddelde ratio die in de kalibratie normen werd waargenomen om het kwalificatie percentage te bepalen. De kwalificatie ratio voor het voorbeeld in afbeelding 1c was 0,439, met een 96,3% match.
Het herstel van de et-IPA surrogaat analyt werd berekend voor alle QC-monsters en onbekende monsters door de respons van het et-IPA-piek gebied te delen door de gemiddelde et-IPA-piekoppervlak respons die in de ijkstandaarden werd waargenomen. De gemiddelde terugvindingen van surrogaat analyt waren 91,0% (negatieve controles), 91,4% (1,3 μg/mL), 92,8% (31 μg/mL) en 95,4% (82 μg/mL).
Geen interferentie pieken voor de kwantor of kwalificatie overgangen van me-IPA werden waargenomen in Control Mongoose serum (Figuur 1a).
De extractieprocedure en instrumentale omstandigheden die werden gebruikt om et-IPA in het Mongoose serum te bepalen (Figuur 3 en tabel 7) was identiek aan de me-IPA methode, maar met de volgende veranderingen. Propyliopfenoxinezuur (PR-IPA) werd gebruikt als surrogaat analyt en er werd een oudere, minder gevoelige LC-MS/MS gebruikt. De bron drooggas temperatuur was 350 ° c met een stroom van 12 L/min en een vernevelaar druk van 35 psi. De capillaire spanning was-2.500 V. De bron had geen mantel gas of middelen om de nozzle-spanning aan te passen. De kwantor MRM transitie voor et-IPA was 570,7 → 442,8 (584,7 → 456,8 voor PR-IPA). De fragmentor was 80 V en de botsing energie was 10 V voor beide analyten. De kwalificatie MRM voor et-IPA was 570,7 → 126,8 met een aanvarings-energie van 40 V.
Het testen van alle Mongoose serummonsters voor et-IPA werd uitgevoerd over acht analyses. De kalibratiekromme van 7 niveaus varieerde van 0,00207 tot 8,48 μg/mL met correlatiecoëfficiënten (r2) variërend van 0,9990 tot 0,9999. De surrogaat analyt PR-IPA-concentratie was 0,512 μg/mL. Tabel 7 presenteert de nauwkeurigheid en precisie resultaten voor Control Mongoose serum versterkt met 0, 1,3, 13, 32, 85, en 170 μg/ml me-IPA. De resultaten werden verzameld uit acht afzonderlijke analyses. Percentage terugvorderingen varieerden van 89,5% tot 115%. De% RSD op de vijf vesting-niveaus bedroeg respectievelijk 4,3%, 1,5%, 2,3%, 5,6% en 1,1%. De S/N waargenomen in monsters van de kwaliteitscontrole (n = 21 negatieve controles; n = 21 bij 1,3 μg/mL me-IPA) werd gebruikt om de DL en QL te bepalen. De DL en QL voor mij-IPA in het Mongoose serum waren respectievelijk 0,12 μg/mL en 0,42 μg/mL. Het gemiddelde surrogaat-analyt herstel van de kwaliteitscontrole monsters bedroeg 86,8% (n = 75). Geen interferentie pieken voor de kwantor of kwalificatie overgangen van et-IPA werden waargenomen in Control Mongoose serum.
Alle mangoest aangeboden et-IPA lokaas verbruikt ≥ 25% van het aas binnen de 24 uur tijdsbeperking en had kwantificeerbare niveaus van et-IPA in hun Sera (tabel 8). Uit de gemengde modelanalyse waren de totale gemiddelde serum IPA-concentraties in vergelijking met de blisterverpakking (9,8 μg/ml, 95% bi 4,0 − 15,6 μg/ml) met 2,8 mg biomarker in de lokaas-17,5 matrix, in verhouding tot de doordrukstrips (95/milliliters), een marginaal hoger dan het totaal gehalte van lokaas (= 3,6 , P = 0,07). Concentraties voor beide aas soorten vervallen met experimentele dag (β =-0,15 ± 0,04, F = 14,4, P = 0,0005). Individuele variabiliteit in serum IPA concentraties werd waargenomen (dierlijke ID covariantie parameter schatting = 46,6 ± 20,7). Alle mangoest verbruikt 100% van de controle loten met alleen de lege folie blisterverpakking resterend. De gemiddelde concentratie van et-IPA-residu in het serum was variabel per tijdsperiode en leek niet consistent te dalen na verloop van tijd (Figuur 3).
Alle mangoest bood me-IPA lokaas verbruikt ≥ 25% van het aas binnen de 24 uur tijdslimiet en had kwantificeerbare niveaus van mij-IPA in hun Sera (tabel 9). De gemiddelde sero logische concentratie van et-en me-IPA in Mongoose sera verscheen afhankelijk van de concentratie van IPA in het aas. Hogere concentraties van IPA in het aas resulteerden in hogere serum residuen, zelfs in gevallen waarin de totale dosis (2,8 mg in het geval van et-IPA) onveranderd bleef. Interessant is dat ik-IPA leek te produceren een meer gelijkmatige afbraak patroon na verloop van tijd met een eerste piek op dag 1, gevolgd door een gestage daling tot dag 14 waar concentraties leek op Plateau (Figuur 4).
Figuur 1 : Representatieve ionen chromatogrammen. A) het representatieve MRM-ionen chromatogram van het Control Mongoose serum dat is verrijkt met surrogaat analyt ethyl-iopfenoxinezuur (et-IPA). De pijl geeft de retentietijd aan voor methyl-iophenoxinezuur (me-IPA). B) representatief MRM-ionchromatogram van controle Mongoose serum versterkt met 31 μg/ml me-IPA. De relatieve intensiteiten van de kwantor (Quant) en kwalificatie (qual) overgangen voor mij-IPA worden getoond. C) representatief MRM-ionen chromatogram van een Mongoose-serummonster met een waargenomen me-IPA-concentratie van 33,5 μg/ml. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Representatieve kalibratiecurve. Een originele kalibratiecurve gegenereerd door de data analysis software voor methyl-iophenoxic acid (me-IPA). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Gemiddelde serum ethyl IPA (et-IPA)-concentratie door het type aas en de concentratie in de tijd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Gemiddelde concentratie in serum METHYL IPA (me-IPA) door het lokaas in de loop van de tijd. Alle me-IPA concentraties werden opgenomen in de externe Bait matrix. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| me-IPA-concentratie (μg/mL) | ||
| Id | ||
| 25x-7 | Zie stap 1,6 | 200 |
| 25x-6 | Combineer 1,000 mL 25x-7 voorraad met 3,000 mL ACN | 50 |
| 25x-5 | Combineer 1,000 mL 25x-6 voorraad met 3,000 mL ACN | 13 |
| 25x-4 | Combineer 1,000 mL 25x-5 voorraad met 3,000 mL ACN | 3,1 |
| 25x-3 | Combineer 1,000 mL 25x-4 voorraad met 3,000 mL ACN | 0,78 |
| 25x-2 | Combineer 1,000 mL 25x-3 voorraad met 3,000 mL ACN | 0,2 |
| 25x-1 | Combineer 1,000 mL 25x-2 voorraad met 3,000 mL ACN | 0,049 |
Tabel 1: voorbereiding van 25x me-IPA-aandelen in ACN (in glazen flesjes van 8 mL).
| Concentratie (μg/mL) | |||
| Id | me-IPA | et-IPA | |
| 4x-7 | 0,200 mL 25x-7 + 0,200 mL 25x surrogaat + 0,850 mL ACN | 32 | 1,6 |
| 4x-6 | 0,200 mL 25x-6 + 0,200 mL 25x surrogaat + 0,850 mL ACN | 8 | 1,6 |
| 4x-5 | 0,200 mL 25x-5 + 0,200 mL 25x surrogaat + 0,850 mL ACN | 2 | 1,6 |
| 4x-4 | 0,200 mL 25x-4 + 0,200 mL 25x surrogaat + 0,850 mL ACN | 0,5 | 1,6 |
| 4x-3 | 0,200 mL 25x-3 + 0,200 mL 25x surrogaat + 0,850 mL ACN | 0,12 | 1,6 |
| 4x-2 | 0,200 mL 25x-2 + 0,200 mL 25x surrogaat + 0,850 mL ACN | 0,031 | 1,6 |
| 4x-1 | 0,200 mL 25x-1 + 0,200 mL 25x surrogaat + 0,850 mL ACN | 0,008 | 1,6 |
| 4x-0 | 0,200 mL 25x surrogaat + 1,050 mL ACN | 0 | 1,6 |
Tabel 2: voorbereiding van 4x IPA-aandelen in ACN (in flesjes van 2 mL voor autosampler).
| Concentratie (μg/mL) | |||
| Id | me-IPA | et-IPA | |
| Std 7 | 0,200 mL 4x-7 + 0,600 mL DI water | 8 | 0,4 |
| Std 6 | 0,200 mL 4x-6 + 0,600 mL DI water | 2 | 0,4 |
| Std 5 | 0,200 mL 4x-5 + 0,600 mL DI water | 0,5 | 0,4 |
| Std 4 | 0,200 mL 4x-4 + 0,600 mL DI water | 0,13 | 0,4 |
| Std 3 | 0,200 mL 4x-3 + 0,600 mL DI water | 0,03 | 0,4 |
| Std 2 | 0,200 mL 4x-2 + 0,600 mL DI water | 0,0078 | 0,4 |
| Std 1 | 0,200 mL 4x-1 + 0,600 mL DI water | 0,002 | 0,4 |
| Std 0 | 0,200 mL 4x-0 + 0,600 mL DI water | 0 | 0,4 |
| Lege | 0,200 mL ACN + 0,600 mL DI water | 0 | 0 |
Tabel 3: voorbereiding van mij-IPA normen in 75/25 water/ACN (in 2-mL autosampler flesjes).
| Concentratie (μg/mL) in serum | |||
| Id | me-IPA | et-IPA | |
| Negatieve controle | 0,050 mL 25x surrogaat + 0,950 mL Verdunent | 0 | 10 |
| Weinig vesting | 0,050 mL 25x surrogaat + 0,020 mL 25x-4 + 0,930 mL Verdunent | 1,2 | 10 |
| Mid vesting | 0,050 mL 25x surrogaat + 0,030 mL 25x-6 + 0,920 mL Verdunent | 30 | 10 |
| Hoge vesting | 0,050 mL 25x surrogaat + 0,020 mL 25x-7 + 0,930 mL Verdunent | 80 | 10 |
Tabel 4: monstername van kwaliteitscontrole (voorbereiding in 1,5-mL micro centrifugebuizen).
| Vloeibare chromatografie: | |||||||||||||||||||||
| Kolom: | C18, 2,1 x 50 mm, 2,5 μm deeltjesgrootte | ||||||||||||||||||||
| Kolomtemperatuur: | 70 °C | ||||||||||||||||||||
| Injectievolume: | 5 μL | ||||||||||||||||||||
| Debiet: | 0,800 mL/min | ||||||||||||||||||||
| Mobiele fase: | Oplosmiddel A: | 0,1% mierenzuur in water | |||||||||||||||||||
| Oplosmiddel B: | 0,1% mierenzuur in ACN | ||||||||||||||||||||
| Verloop programma: | |||||||||||||||||||||
| Tijd (min): | 0 | 0,25 | 2,25 | 2,26 | 3,4 | 3,41 | 4,75 | ||||||||||||||
| B | 40 | 40 | 55 | 100 | 100 | 40 | 40 | ||||||||||||||
| Naald wassen: ACN, 3 s | |||||||||||||||||||||
| MS/MS Bron: ESI (negatieve modus) | |||||||||||||||||||||
| Temperatuur van het gas: | 300 °C | ||||||||||||||||||||
| Gasstroom: | 5 L/min | ||||||||||||||||||||
| Vernevelaar | 45 psi | ||||||||||||||||||||
| Capillaire: | -4000 V | ||||||||||||||||||||
| Nozzle voltage: | -500 V | ||||||||||||||||||||
| Mantel gastemperatuur: | 250 °C | ||||||||||||||||||||
| Mantel gasstroom: | 7 L/min | ||||||||||||||||||||
| MRM-overgangen: | |||||||||||||||||||||
| Analyt | Precursor Ion (m/z) | Product-Ion (m/z) * | Fragmentor (V) | Botsing energie (V) | Dwelltijd (MS) | Tijd segment | |||||||||||||||
| Me-IPA | 556,6 | 428,7 | 74 | 12 | 60 | 2 | |||||||||||||||
| 126,9 | 65 | 60 | |||||||||||||||||||
| 126,8 | 61 | 60 | |||||||||||||||||||
| Et-IPA | 570,7 | 442,7 | 87 | 16 | 60 | ||||||||||||||||
| Tijdsegmenten: | |||||||||||||||||||||
| Segment | Start (min) | Einde (min) | Type | Omsteller | Delta EMV | Polariteit | Opgeslagen gegevens | ||||||||||||||
| 1 | 0 | 0,6 | MS2 scan | Te verspillen | 0 | Negatieve | No | ||||||||||||||
| 2 | 0,6 | 2 | Mrm | Aan MS | -100 | Negatieve | Ja | ||||||||||||||
| 3 | 2 | 4,75 | MS2 scan | Te verspillen | 0 | Positieve | No | ||||||||||||||
| * Kwantor overgangen zijn vetgebold. | |||||||||||||||||||||
Tabel 5: LC-MS/MS parameters. Kwantifier product ionen zijn vetgebold.
| Doel | Waargenomen | Procent | ||||
| Id | Dag | me-IPA | me-IPA | Herstel | ||
| QC-1 | 1 | 0 | Nd | N/a | ||
| QC-2 | 1 | 0 | Nd | N/a | ||
| QC-11 | 2 | 0 | Nd | N/a | ||
| QC-12 | 2 | 0 | Nd | N/a | ||
| QC-21 | 3 | 0 | Nd | N/a | ||
| QC-22 | 3 | 0 | Nd | N/a | ||
| QC-31 | 4 | 0 | Nd | N/a | ||
| QC-32 | 4 | 0 | Nd | N/a | ||
| QC-3 | 5 | 0 | Nd | N/a | ||
| QC-4 | 5 | 0 | Nd | N/a | ||
| QC-13 | 1 | 1,25 | 1,26 | 101% | Ave (10) = | 102% |
| QC-14 | 1 | 1,25 | 1,23 | 98,40% | SD = | 3,50% |
| QC-23 | 2 | 1,25 | 1,26 | 101% | % RSD = | 3,40% |
| QC-24 | 2 | 1,25 | 1,28 | 102% | ||
| QC-33 | 3 | 1,29 | 1,3 | 101% | ||
| QC-34 | 3 | 1,29 | 1,25 | 96,90% | ||
| QC-5 | 4 | 1,29 | 1,37 | 106% | ||
| QC-6 | 4 | 1,29 | 1,41 | 109% | ||
| QC-15 | 5 | 1,29 | 1,3 | 101% | ||
| QC-16 | 5 | 1,29 | 1,34 | 104% | ||
| QC-25 | 1 | 30,1 | 30,2 | 100% | Ave (10) = | 103% |
| QC-26 | 1 | 30,1 | 31,2 | 104% | SD = | 1,80% |
| QC-35 | 2 | 30,1 | 31,1 | 103% | % RSD = | 1,70% |
| QC-36 | 2 | 30,1 | 31,1 | 103% | ||
| QC-7 | 3 | 31 | 31,6 | 102% | ||
| QC-8 | 3 | 31 | 31,4 | 101% | ||
| QC-17 | 4 | 31 | 32,5 | 105% | ||
| QC-18 | 4 | 31 | 32,8 | 106% | ||
| QC-27 | 5 | 31 | 31,7 | 102% | ||
| QC-28 | 5 | 31 | 32,1 | 104% | ||
| QC-37 | 1 | 80,2 | 77,8 | 97,00% | Ave (10) = | 101% |
| QC-38 | 1 | 80,2 | 78,9 | 98,40% | SD = | 2,30% |
| QC-9 | 2 | 80,2 | 81,8 | 102% | % RSD = | 2,30% |
| QC-10 | 2 | 80,2 | 79,8 | 99,50% | ||
| QC-19 | 3 | 82,7 | 83,5 | 101% | ||
| QC-20 | 3 | 82,7 | 84 | 102% | ||
| QC-29 | 4 | 82,7 | 84,7 | 102% | ||
| QC-30 | 4 | 82,7 | 87,2 | 105% | ||
| QC-39 | 5 | 82,7 | 83 | 100% | ||
| QC-40 | 5 | 82,7 | 84,1 | 102% |
Tabel 6: QC-resultaten voor mij-IPA in serum van Mongoose (μg/mL).
| Doel-et-IPA (μg/mL) | N | Gemiddelde (%) | SD (%) | % RSD |
| 0 | 21 | |||
| 1,3 | 12 | 103 | 4,5 | 4,3 |
| 13 | 9 | 91,7 | 1,4 | 1,5 |
| 32 | 12 | 106 | 2,4 | 2,3 |
| 85 | 12 | 105 | 5,8 | 5,6 |
| 170 | 9 | 106 | 1,1 | 1,1 |
Tabel 7: QC-resultaten voor et-IPA in serum van Mongoose (μg/mL).
| Type aas en ethyl IPA Bait concentratie (μg/mL) | ||||||||
| Tijdsperiode | 0,4%-blister | 1,0%-blister | 0,14%-matrix | Controle | ||||
| Gemiddelde (SD) | N | Gemiddelde (SD) | N | Gemiddelde (SD) | N | Gemiddelde (SD) | N | |
| Dag 0 | Nd | 5 | Nd | 4 | Nd | 6 | Nd | 3 |
| Dag 1 | 13,7 (10,9) | 2 | 11,2 (10,4) | 4 | 20,6 (17,3) | 2 | NA | NA |
| Dag 7 | 11,5 (6,3) | 6 | 9,9 (9,6) | 4 | 21,4 (10,9) | 6 | Nd | 3 |
| Dag 14 | 10,2 (5,2) | 6 | 5,7 (2,5) | 3 | 17,8 (10,2) | 6 | Nd | 3 |
| Dag 21 | 8,9 (4,1) | 4 | 10,0 (9,5) | 4 | 23,8 (5,3) | 3 | Nd | 2 |
| Dag 28 | 8,5 (3,9) | 5 | 11,1 (10,6) | 3 | 17,7 (9,3) | 4 | Nd | 3 |
| Dag 35 | 17,0 (NA) | 1 | 9,1 (9,0) | 4 | 21,7 (9,3) | 2 | Nd | 1 |
| Dag 42 | NA | 0 | 8,4 (8,5) | 4 | 16,5 (NA) | 1 | Nd | 2 |
| Dag 49 | 10,2 (5,8) | 2 | 8,1 (8,4) | 4 | 17,5 (4,7) | 2 | Nd | 2 |
| Dag 56 | 10,9 (5,4) | 2 | 3,8 (1,1) | 3 | 17,6 (6,1) | 2 | Nd | 2 |
Tabel 8: gemiddelde (stand deviatie [SD]) ethyl-IPA-serumconcentratie door type aas. ND = niet gedetecteerd, nb = niet van toepassing.
| Dosis en methyl IPA-concentratie (μg/mL) | ||||||||
| Tijdsperiode | 0,04% | 0,07% | 0,14% | Controle | ||||
| Gemiddelde (SD) | N | Gemiddelde (SD) | N | Gemiddelde (SD) | N | Gemiddelde (SD) | N | |
| Dag 0 | ND (NA) | 4 | ND (NA) | 4 | ND (NA) | 4 | ND (NA) | 4 |
| Dag 1 | 7,8 (7,1) | 4 | 22,2 (9,2) | 4 | 29,1 (16,0) | 4 | ND (NA) | 4 |
| Dag 7 | 4,4 (4,8) | 4 | 14,4 (4,6) | 4 | 21,3 (12,0) | 4 | ND (NA) | 4 |
| Dag 14 | 5,7 (5,9) | 4 | 12,0 (3,5) | 4 | 19,6 (10,6) | 4 | ND (NA) | 4 |
| Dag 21 | 4,9 (4,5) | 4 | 12,0 (0,8) | 3 | 18,3 (9,9) | 4 | ND (NA) | 4 |
| Dag 28 | 5,4 (5,0) | 4 | 9,8 (2,4) | 4 | 16,4 (8,1) | 4 | ND (NA) | 4 |
Tabel 9: gemiddelde (SD) methyl-IPA serumconcentratie per dosis. ND = niet gedetecteerd, nb = niet van toepassing. Alle methyl IPA concentraties werden opgenomen in de externe Bait matrix.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De LC-MS/MS-methode die voor de studies werd ontwikkeld, gebruikte de selectiviteit van meervoudige reactie monitoring om me-IPA en et-IPA in het Mongoose serum nauwkeurig te kwantificeren. De selectiviteit van MS/MS-detectie was ook toegestaan voor een eenvoudig clean-up-protocol dat uitsluitend gebaseerd was op acetonitril om eiwitten uit serum te precipiteren voorafgaand aan de analyse.
Iopfenoxische zuren zijn oplosbaar in ACN, maar zijn vrijwel onoplosbaar in water. Om water uit de ACN-extractie uit te sluiten, werd natriumchloride toegevoegd om een helder water te forceren: fasescheiding van ACN door de Ionische sterkte van de waterige (serum) fase te verhogen. Het vluchtige zuur trifluorazijnzuur (TFA) werd ook toegevoegd om te waarborgen dat iopfenoxische zuren tijdens de extractie geprotoneerd werden en gemakkelijker in de ACN-fase zouden worden gesolubiliseerd. TFA wordt verwijderd tijdens de droge stap voorafgaand aan de LC-MS/MS-analyse.
Bloed trekkingen van Mongoose waren ongeveer 1 mL, wat 0,5 mL of minder van sera oplevert. Om replicaatanalyses van elk monster uit te voeren, was een micro-schaal monster voorbereidingsprocedure vereist die gebruikte microcentrifuge buizen in plaats van typische analytische laboratoriumglaswerk zoals klasse A volumetrische pipetten en kolven. Om nauwkeurige en precieze resultaten te behalen, is het noodzakelijk dat analisten bedreven zijn in het gebruik van glazen microliter spuiten en herhalings pipettoren met positieve verplaatsing met microliter-maat tips.
Een beperking van deze methode is dat het kostbare LC-MS/MS instrumentatie en analisten getraind in het gebruik en onderhoud vereist. Omdat me-IPA en et-IPA echter worden opgelost met behulp van de beschreven HPLC-condities, kan de methode mogelijk worden aangepast aan een single-quadrupole LCMS of HPLC met UV-detector, mits er geen interferenties werden waargenomen.
Het verschil in gemiddelde serumconcentraties tussen mangoest die lokaas verbruikt met et-IPA in de blisterverpakking en Bait matrix bij de dosis van 2,8 mg, suggereert morsen wanneer de marker in de blisterverpakking zit, in plaats van opgenomen in de Bait matrix. Dit kan gevolgen hebben voor het inschatten van het vaccin in tegenstelling tot het gebruik van aas. Bijvoorbeeld, het opnemen van de marker in de externe Bait matrix kan de inschatting van de dekking van het vaccin opblazen als het dier de matrix eet, maar het vaccin uitmorst. Regelgevende beperkingen kunnen echter de mogelijkheid uitsluiten om een biologische marker rechtstreeks met een vaccin in de blisterverpakking te mengen. In de gevallen waarin < 100% verbruik werd geregistreerd, waren er drie gevallen met lokaas die et-IPA bevatten in de blisterverpakking, waarvan er twee de hogere concentratie van 1% waren. Dit suggereert mogelijke smaak aversie wanneer et-IPA is in hogere concentraties. Wanneer lokaas met 1% (20,0 mg) et-IPA opgenomen in de Bait matrix werden aangeboden aan mangoest, alle dieren verwierp het aas.
De gemiddelde IPA-concentraties voor et-en me-IPA op dag 14 waren respectievelijk ongeveer 17 en 19 μg/mL. Vergelijkbaar onderzoek uitgevoerd bij Instituto de onderzoeken en Recursos Cinegéticos, Ciudad Real, Spanje, met behulp van butyl en pentyl-IPA gevonden dag 14 concentraties van ongeveer 45 en 10 μg/mL in Mongoose sera bij levering in dezelfde concentratie en aas formulering zoals in onze studie. Deze verschillen suggereren dat verschillende derivaten van IPA kunnen metaboliseren bij verschillende tarieven in mangoest, die nuttig kunnen zijn wanneer marker retentie (hetzij korte of langetermijnretentie) is een zorg.
Verschillen in de Fysiologie van het maagdarmstelsel kunnen de absorptie en uitscheiding van IPA in verschillende soorten beïnvloeden. De plasma eliminatie halfwaardetijd van IPA bij tamme katten (Felis Catus) bij levering bij 1,5 mg/kg was 107 dagen, terwijl de snelheid in penseel staart Possums bij hetzelfde dosis tarief ongeveer één dag28bedroeg. Toen IPA werd gegeven aan binnenlandse geiten (Capra aegagrus hircus) met een dosis snelheid van 1,5 mg/kg was de terminale eliminatie HALFWAARDETIJD van IPA 81 dagen, hoewel onderzoekers verhoogde jodium concentraties bleven vinden tot 160 dagen na toediening 39. het gastro-intestinale systeem van leden van de vivveridae (de familie waaraan mangoest voorheen40was toegewezen) wordt beschreven als vergelijkbaar met die van de binnenlandse kat41, die de retentietijd van IPA kan verklaren in mangoest. Onderzoek suggereert ook IPA kan worden gemetaboliseerd anders in buideldieren, waardoor voor een snellere uitscheiding dan in eutherian soort29.
Beide derivaten van IPA geëvalueerd in deze studie verstrekt op lange termijn (4 − 8 weken) markering vermogen in mangoest. Het gebruik van IPA als biologische marker in mangoest moet rekening houden met de studie doelstellingen en de gewenste duur van de markering. In gevallen waarin dieren tijdens opeenvolgende perioden uit dezelfde studiegebieden moeten worden gemerkt, kunnen verschillende derivaten van IPA worden gebruikt om ervoor te zorgen dat de resultaten van één markerings gebeurtenis niet worden verward door markeringen tijdens eerdere gebeurtenissen. Als onderdeel van de operationele ORV voor wilde dieren in de VS, bemonstering van de doelsoort en testen op de aanwezigheid van RVNA en biomarker wordt meestal uitgevoerd 4 − 6 weken na ORV-verdeling42. Vanuit een praktisch oogpunt, het lijkt of et-of me-IPA kan gemakkelijk worden gedetecteerd in deze periode. Toekomstig onderzoek om de functie residu verval te evalueren in mangoest bood verschillende concentraties van beide congeneren van IPA geëvalueerd in deze studie zou nuttig zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs AV en zo zijn fulltime medewerkers van een oraal rabiës vaccin Bait fabrikant.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd deels gesteund door het intramurale onderzoeksprogramma van het Amerikaanse ministerie van landbouw, dier en Plant Health Inspection Service, Wildlife Services, National rabies Management Program en IDT Biologika (Dessau-Rosslau, Duitsland).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile, Optima grade | Fisher | A996 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS204 | |
| C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size | Waters Corp. | 186003085 | |
| ESI Source | Agilent | G1958-65138 | |
| Ethyl-iophenoxic acid, 97 % | Sigma Aldrich | N/A | Lot MKBP5399V |
| Formic acid, LC/MS grade | Fisher | A117 | |
| LCMS software | Agilent | MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis | |
| Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lot PR0709514717 |
| Microanalytical balance | Mettler Toledo | XP6U | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415C | |
| MS/MS | Agilent | G6470A | |
| N-Evap | Organomation | 115 | |
| Oral Rabies Vaccine Baits | IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany | N/A | |
| Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lot PR100612108RR |
| Repeat pipettor | Eppendorf | M4 | |
| Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined | Agilent | 5190-7024 | |
| Sodium chloride, Certified ACS grade | Fisher | S271 | |
| Statistical Software Package | SAS Institute, Cary, North Carolina, USA | N/A | |
| Trifluoroacetic acid, 99 % | Alfa Aesar | L06374 | |
| UPLC | Agilent | 1290 Series | |
| Vortex Mixer | Glas-Col | 099A PV6 | |
| 0.2-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.413 | |
| 0.5-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.421 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher | 14-666-325 | |
| 1250-µL capacity pipette tips | GeneMate | P-1233-1250 | |
| 1-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.43 | |
| 2-mL amber screw-top autosampler vials | Agilent | 5182-0716 | |
| 5-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.456 | |
| 80-position microcentrifuge tube rack | Fisher | 05-541-2 | |
| 8-mL amber vials with PTFE-lined caps | Wheaton | 224754 | |
| 70 % (v/v) isopropanol | Fisher | A459 | |
| 100-1000 µL air displacement pipette | Eppendorf | ES-100 |
References
- Nel, L. H., et al. Mongoose rabies in southern Africa: a re-evaluation based on molecular epidemiology. Virus Research. 109 (2), 165-173 (2005).
- Zieger, Z., et al. The phylogeography of rabies in Grenada, West Indies, and implications for control. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (10), e3251 (2004).
- Monroe, B. P., et al. Rabies surveillance in the United States during 2014. Journal of the American Veterinary Medical Association. 248 (7), 777-788 (2015).
- Slate, D., et al. Status of oral rabies vaccination in wild carnivores in the United States. Virus Research. 111, 68-76 (2005).
- Blanton, J. D., et al. Vaccination of small Asian mongoose (Herpestes javanicus) against rabies. Journal of Wildlife Diseases. 42 (3), 663-666 (2006).
- Vos, A., et al. Oral vaccination of captive small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) against rabies. Journal of Wildlife Diseases. 49 (4), 1033-1036 (2013).
- Berentsen, A. R., Johnson, S. R., VerCauteren, K. C. Evaluation of ONRAB® bait matrix flavor preference by mongoose (Herpestes auropunctatus) in Puerto Rico: Implications for Oral Rabies Vaccination. Caribbean Journal of Science. 48 (1), 52-58 (2014).
- Ortmann, S., et al. Safety studies with the oral rabies virus vaccine strain SPBN GASGAS in the small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus). BMC Veterinary Research. 14 (1), 90 (2018).
- Linhart, S. B., et al. A field evaluation of baits for delivering oral rabies vaccines to raccoons (Procyon lotor). Journal of Wildlife Diseases. 30 (2), 185-194 (1994).
- Fry, T. L., Atwood, T., Dunbar, M. R. Evaluation of rhodamine B as a biomarker for raccoons. Human Wildlife Interactions. 4 (2), 275-280 (2010).
- Jones, C., Moller, H., Hamilton, W. A review of potential techniques for identifying individual stoats (Mustela erminea) visiting control or monitoring stations. New Zealand Journal of Zoology. 31 (3), 193-203 (2004).
- de Leeuw, A. N. S., Smith, G. C., Woods, J. A. Use of iophenoxic acid to assess bait uptake by European badgers. Advances in Vertebrate Pest Management. 4, 243-254 (2006).
- Southey, A. K., Sleeman, D. P., Gormley, E. Sulfadimethoxine and rhodamine B as oral biomarkers for European badgers (Meles meles). Journal of Wildlife Diseases. 38 (2), 378-384 (2002).
- Massei, G., Jones, A., Platt, T., Cowan, D. P. Iophenoxic Acid as a Long-Term Marker for Wild Boar. Journal of Wildlife Management. 73 (3), 458-461 (2009).
- Creekmore, T. E., et al. Field evaluation of baits and baiting strategies for delivering oral vaccine to mongooses in Antigua, West Indies. Journal of Wildlife Diseases. 30 (4), 497-505 (1994).
- Creekmore, T. E., Rock, R. E., Hurley, J. A baiting system for delivery of an oral plague vaccine to black-tailed prairie dogs. Journal of Wildlife Diseases. 38 (1), 32-39 (2002).
- Fernandez, J. R. R., Rocke, R. E. Use of Rhodamine B as a biomarker for oral plague vaccination of prairie dogs. Journal of Wildlife Diseases. 47 (3), 765-768 (2011).
- Johnston, J. J., et al. Evaluation and significance of tetracycline stability in rabies vaccine baits. Journal of Wildlife Diseases. 41 (3), 549-558 (2005).
- Algeo, T. P., et al. Oral rabies vaccination variation in tetracycline biomarking among Ohio Raccoons. Journal of Wildlife Diseases. 49 (2), 332-337 (2013).
- Crier, J. K. Tetracyclines as a fluorescent marker in bones and teeth of rodents. Journal of Wildlife Management. 34 (4), 829-834 (1970).
- Fisher, P. Review of using Rhodamine B as a marker for wildlife studies. Wildlife Society Bulletin. 27 (2), 318-329 (1999).
- Knowlton, F. K., Savarie, P. J., Wahlgren, C. E., Hayes, D. J. Physiological marks by coyotes ingesting baits containing iophenoxic acid, Mirex and Rhodamine B. Vertebrate Pest Control and Management Materials. Shumake, S. A., Bullard, R. W. , American Society for Testing and Materials. Philadelphia. 5th Volume. STP 974 141-147 (1987).
- Follmann, E. H., Savarie, P. J., Ritter, D. G., Baer, G. M. Plasma marking of arctic foxes with iophenoxic acid. Journal of Wildlife Diseases. 23 (4), 709-712 (1987).
- Saunders, G., Harris, S., Eason, C. T. Iophenoxic acid as a quantitative bait marker for foxes. Wildlife Research. 20, 297-302 (1993).
- Hadidian, J., et al. Acceptance of simulated oral rabies vaccine baits by urban raccoons. Journal of Wildlife Diseases. 25 (1), 1-9 (1989).
- Sweetapple, P. J., Nugent, G. Iophenoxic acid as a serum marker for red deer (Cervus elaphus scoticus). Wildlife Research. 25, 649-654 (1998).
- Ogilvie, S. C., Eason, C. T. Evaluation of iophenoxic acid and rhodamine B for marking feral ferrets (Mustela furo). New Zealand Journal of Zoology. 25 (2), 105-108 (1998).
- Eason, C. T., Batcheler, D., Frampton, C. M. Comparative pharmacokinetics of iophenoxic acid in cats and brushtail possums. Wildlife Research. 21, 377-380 (1994).
- Fisher, P. M., Marks, C. A. Evaluation of iophenoxic acid as a biomarker for swamp wallabies (Wallabia bicolor). Wildlife Research. 24, 97-103 (1997).
- Baer, G. M., Shaddock, J. H., Hayes, D. J., Savarie, P. Iophenoxic acid as a serum marker in carnivores. Journal of Wildlife Management. 49 (1), 49-51 (1985).
- Spurr, E. B. Iophenoxic acid as a systemic blood marker for assessment of bait acceptance by stoats (Mustela ermine) and weasels (Mustela nivalis). New Zealand Journal of Zoology. 29 (2), 135-142 (2002).
- Mudge, G. H., Strewler, G. J., Desbiens, N., Berndt, W. O., Wade, D. N. Excretion and distribution of iophenoxic acid. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 178 (1), 159-172 (1971).
- Jones, A. High-performance liquid chromatographic determination of iophenoxic acid in serum. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 654 (2), 293-296 (1994).
- Wiles, M. C., Campbell, T. A. Liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry for direct identification and quantification of iophenoxic acid in serum. Journal of Chromatography B. 832 (1), 144-157 (2006).
- Ballesteros, C., et al. Analysis by LC/ESI-MS of iophenoxic acid derivatives and evaluation as markers of oral baits to deliver pharmaceuticals to wildlife. Journal of Chromatography B. 878 (22), 1997-2002 (2010).
- Purdey, D. C., Petcu, M., King, C. M. A simplified protocol for detecting two systemic bait markers (Rhodamine B and iophenoxic acid) in small mammals. New Zealand Journal of Zoology. 30 (3), 175-184 (2003).
- Tobin, M. E., Koehler, A. E., Sugihara, R. Tetracyclines as a fluorescent marker in bones and teeth of rodents. Journal of Wildlife Management. 60 (1), 202-207 (1996).
- Briscoe, J. A., Syring, R. Techniques for emergency airway and vascular access in special species. Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine. 13 (3), 118-131 (2004).
- Eason, C. T., Frampton, C. M. The plasma pharmacokinetics of iophenoxic and iopanoic acids in goat. Xenobiotica. 2 (2), 185-189 (1992).
- Hilton, H. E., Dunn, A. M. S. Mongooses: their natural history. , Oliver and Boyd. Edinburgh and London. (1967).
- Stevens, C. E., Hume, I. D. Comparative physiology of the vertebrate digestive system. Second edition. , Cambridge University Press. Cambridge. (1995).
- National Rabies Management Program (NRMP). Oral rabies vaccination draft operations manual. , USDA APHIS Wildlife Services. (2009).
