ヒト脂肪由来間葉系幹細胞の単離・増殖のための酵素フリー法

Summary

このプロトコルは、腹筋形成術および脂肪吸引試料から間葉系幹細胞を切除するための酵素フリーの方法をexplant法を用いて提供する。過酷な酵素または遠心分離ステップの欠如は、インビトロの研究に使用したり、クリニックに戻って転送することができる臨床的に関連する幹細胞を提供します。

Abstract

間葉系幹細胞(MSC)は、脂肪組織を含む様々な成体および胎児組織から単離することができる多能性細胞の集団である。臨床的に関連する細胞型として、これらの細胞をインビトロで単離および拡張するための最適な方法が必要である。脂肪由来MSC(ADSC)を単離するほとんどの方法は、脂肪組織を消化するためにコラゲターゼなどの過酷な酵素に依存しています。しかし、脂肪組織を分解し、高いADSC回収を生み出す効果がある一方で、これらの酵素は高価であり、臨床応用に異種成分を使用するリスクを含むAdsCに有害な影響を及ぼす可能性があります。このプロトコルは、酵素を含まない新鮮なリポア吸引および腹部形成術サンプルからADSCを分離する方法を詳しく説明する。簡単に言えば、この方法は、任意のバルク組織の機械的な関連付けに依存し、その後、explant型培養システムが続く。ADSCは組織外および組織培養プレートに移行することができ、その後、ADCは任意の数の研究および/または臨床応用のためにインビトロで培養および拡張することができる。

Introduction

間葉系幹細胞(MSC)は、脂肪組織を含む様々な成体および胎児組織から単離することができる多能性成幹細胞のクラスである。これらの細胞は、インビトロのすべての生殖層の細胞に分化し、同種外形の障壁を越え、炎症の領域を有し、炎症を抑制するために、その可塑性のために基礎研究および臨床応用の両方にとって魅力的な細胞型である(Sherman, et^al.1でレビュー)。脂肪由来MSC(ASC)は、脂肪組織が一般的に定期的な脂肪吸引および腹部形成術の手順に従って廃棄組織と考えられているので、得られる容易さのために特に魅力的である。しかし、いったん得られると、サンプルは一般に、ASC2、3を単離するために、酵素状態または遠心分離のいずれかの過酷な条件を受ける。この方法は、過酷な酵素または遠心分離ステップがない場合に、エクスプラント法を使用してASCを分離するための簡単な手順を示しています。

ASCを分離する最も一般的な方法は、脂肪サンプルを洗浄し、サンプルをコラゲナーゼで酵素的に消化し、サンプルを遠心分離し、最後にASC⁴を培養する前に赤血球を分解する。ASCの高収率を分離する効率は良いが、異種成分の使用(例えば、コラゲラ酵素による酵素消化)は、米国食品医薬品局によって「最小限に操作された」以上と考えられており、免疫反応などのリスクを引き起こす可能性があり、診療所^5、6における細胞の使用を禁止する。異種成分のリスクを最小限に抑えるために、多くのグループは、脂肪組織を消化するために非動物由来、製造酵素を示唆している。しかし、これらの酵素はまだ過酷であり、細胞表現型⁷を変化させることができる。

ASCを分離する他の方法としては、高速遠心分離、1,200 x gの高い力を使用すること、およびASC⁸を分離するためのボルテックスが含まれる。400 x gの低い力でさえ、実行可能な ASC⁹を分離するのに十分でした。これらの細胞は大量の生存細胞を産生するが、多くのプロトコルは14日⁸日を超えて増殖できなかった。また、機械的単離は酵素消化よりも回収細胞が少なく、単離細胞の割合が高かったが、通路⁰¹⁰で脂肪組織に内因性の他の細胞と比較してASCであった。

より純粋で生存可能なASC集団を短時間で分離すると、異種成分のコストとリスクと相まって、酵素消化が少なくなり、クリニックへの翻訳に魅力が少なくなります。機械的絶縁は当初有利なアプローチであるが、使用される方法に有意な格差があり、処理される組織の体積は特殊遠心単位の大きさに限定され、オペレータの一貫性²に依存し得る。

酵素消化と遠心分離の両方が急速に大量のASCを生じる一方で、これらの単離された細胞は表現型変化を示し、患者²に戻った場合の行動に関する疑問を生じる。このプロトコルで説明されているように、ASC分離のexplantベースの方法は、したがって、いくつかのグループによって採用され、それによってASCは固体脂肪組織^3、11、12の小片から移動する。この移行は、栄養豊富な媒体に引き込まれる細胞の効果である可能性が高い。MSCの他の集団と同様に、ASCはプラスチックに付着し、使用された組織培養媒体(以下の成分)で生存し、増殖し、脂肪組織から他の細胞型からの単離を可能にする。最初に回収される細胞は少ないが、多くの場合、組織培養プレート上に細胞が見えるまで>1週間を取るが、これらの未操作のASCはインビトロで増殖し、細胞を臨床的に関連する体積^11、12、13に増殖させる。

Protocol

リポアズパイレーツおよび腹部形成術サンプルの使用は、ラトガース大学の機関審査委員会(IRB)によって承認されました - ニューアークキャンパス。

1. 組織培養媒体の調製

1. ASCを分離する前に、500mLの組織培養媒体を無菌に調製します。培養媒体を調製するには、10%定義された胎児子牛血清(FCS)とペニシリン・ストレプトマイシン(10,000 U/100 mL)を、高グルコースと2mM L-グルタミンを含むダルベッコの最小限の必須メディア(DMEM)に加えます。メディアは4 °Cで最大3週間保存でき、常に温暖(室温から37°Cまで)を使用する必要があります。
   1. 幹細胞の培養に別の媒体が好ましい場合は、代わりにそのメディアを準備します。

2. 脂肪組織からのASCの分離

1. 脂肪吸引または腹部形成術サンプルを得る。IRBの承認に従って、様々な外科的処置に従って組織を廃棄するようなサンプルを得る。外科医が組織を取り除いたどの血管で実験室に脂肪吸引器を輸送;手術室の標本袋または容器の腹部形成術のサンプルを輸送する。
2. すぐに処理しない場合は、室温で最大6時間、または4°Cで24時間保存します。前述の時間を超えて処理された組織サンプルは、細胞収率が低下する可能性が高い。1x滅菌リン酸緩衝生理食塩糸を添加して、腹部形成術サンプルを湿らせておいてください。
3. この時点以降、無菌条件下で層流フード内のすべてのステップを実行します。個人的な保護のために手袋を着用してください。近くに10%の漂白剤、70%のエタノール、ペーパータオルを保管して、生物学的な流出を迅速にクリーンアップします。余分な組織を生物医学廃棄物として処分する。
4. サンプルを < 1 mm 個にミンチします。腹部形成術ブロックが大きすぎて作業できない場合は、ミンチする前にブロックから組織の管理可能なサイズを切り取ります。腹部形成術組織を滅菌100mmプレートのふたに移す。滅菌針を使用して組織を所定の場所に保持し、滅菌メスを使用して、バルク組織を切断または穏やかに細断することによって破片をミンチオフします。
   1. このステップは、一般的にリポアズパイレーツには必要ありません。しかし、リポアズパイレーツで大きな組織塊が観察された場合は、滅菌鉗子でそのような塊を除去し、上記のように処理する。
5. 組織を新鮮なチューブに移し、サンプルを5~6回反転または振って、すべての層の混合を確実にします。オプション:リポアシテリングが完全に落ち着いた場合は、混合する前にオイル層を取り外して廃棄します。
6. 2.5~5 mLの組織を100mm真空ガスプラズマ処理組織培養プレート(材料の表)に移す。新鮮な遠心管に注いでサンプルの体積を測定します。必要に応じて、滅菌スパチュラを使用して組織の移入を支援します。
7. 同等の体積の組織培養媒体をプレートに加える。プレートを軽く旋回して内容物を混ぜます。
8. プレートの基部に十分な数の細胞が見つかるまで、5%CO2で37°Cでパテをインキュベートします。時間が経つにつれて、細胞は組織の中からプレート表面に移動し、その時点でプラスチックに付着します。彼らは組織を出ると、細胞は組織片の周りに小さなクラスターとして現れます。
9. 24時間ごとに、できるだけ多くの流体を取り除き、同様の量のメディアに交換します。可能であれば、組織の断片を所定の場所に置いておきます。
10. 十分な数の細胞がプレート上に表示されたら(プレート上の>15~25細胞の>10個のクラスター)、または7日後に、より早い方で残りの組織をすべて取り除きます。
11. 組織培養媒体中のASCを70%のコンフルエンスに達するまで、またはクラスターが密になるまで(プレート上の細胞の5つの密なクラスター、それぞれ直径が約500μm)、その時点で細胞を通過させる。

3 ASCの文化

1. 親プレートが約70%のコンフルエンシーに達したときのASCの通過。ASC文化の不一伴性を避けるように注意してください。
2. 1xリン酸緩衝生理食塩糸でプレートを軽くすりすり、接着細胞をトリプシンします。細胞をトリプシン化するには、リン酸緩衝生理食塩糸を吸引し、各プレートに0.25%EDTAでトリプシンを1mL加え、37°Cで5分間インキュベートします。5分後、顕微鏡検査により付着解除を確認する。細胞がまだ付着している場合は、さらに5分間インキュベーターに細胞を戻します。
3. プレートに少量のメディア(トリプシン体積の約25%)を加えてトリプシンを非アクティブにし、メディア/トリプシンを使用してプレートのベースを軽く洗浄します。プレートを洗浄するには、プレートをわずかな角度で保持し、プレートの上部からメディア/トリプシンをゆっくりと下にピペットし、プレートから毎週取り付けたセルを緩めます。細胞は1:3比で再めっきするか、プレートあたり120,000〜500,000細胞の密度で播種することができます。
   1. 細胞数に基づいて播種する場合は、トリプシン/メディアをプレートから円錐形遠心管に移し、300 x gで遠心分離して細胞を7分間ペレット化し、組織培養媒中の細胞を再中断し(初期プレート当たり約1mL)、播種前に細胞を数える。細胞を数えるには、細胞懸濁液の10μLをヘモサイトメーターに移し、グリッドの各コーナーの4 x 4象限に存在する細胞をカウントする。これらの値を平均化し、値に 10⁴を掛けてセル番号を計算します。
   2. 細胞を播種する前に、プレートにメディアを追加します。セルをドロップワイズで追加し、プレートを旋回してプレート全体の均等な分布を確保します。
      注:3つの通路の後、接着細胞は非対称で紡錘状に見えるはずです。ASC表現型および挙動は、フローサイトメトリーおよび分化アッセイを用いて確認することができる。
4. フローサイトメトリーと分化アッセイを用いたASC表現型と挙動の確認
   1. フローサイトメトリー
      1. 上述のように細胞を収集し、ペレットする。1xリン酸緩衝生理食塩糸でペレットを洗浄し、抗体の製造業者推奨体積で細胞にラベルを付けます。フローサイトメトリーのための詳細なプロトコルは、一般的な実験室の手順は、ここで^12、14、15を見つけることができます。
      2. ASC表現型を確認するには、次のサーフェスマーカーパネルを選択します: CD14、CD31、CD34、CD45、およびCD106の負。CD29、CD36、CD44、CD73、CD90、および CD105^{16、17、18、19}の場合^は正の値です。CD36の存在とCD106の不在は、骨髄由来^MSC20からASCを識別する。
   2. 差別化アッセイ: MSC 差別化キットを使用して多系統分化を確認します。キットは、脂肪原性、骨原性、軟骨分化能力を確認するために、複数のメーカーから入手可能です。3週間、または形態学的分化が観察されるまで、メーカーのプロトコルに従って3~4日ごとにキット提供のメディアを交換します。
5. 複数の通路の細胞を培養します。必要な通路の数は、アプリケーションによって異なります。各通路で、前述の細胞表面マーカーを用いてMSC細胞形態と表現型を確認し、多系分化能力が失われていないことを確認する。拡張の可能性はドナー間で異なりますが、ほとんどのサンプルは最大6〜9の通路のために拡張することができます。
6. 将来の使用のために細胞を保存し、液体窒素に保存します。

4 ASCの凍結保存

1. 凍結溶液AおよびBの10 mLを準備する。
   1. 凍結溶液Aの場合は、高グルコースのDMEMに20%FCSを加えます。
   2. 凍結溶液Bの場合、高グルコースのDMEMに20%FCSと20%ジメチルスルフィド(DMSO)を加えます。
2. 細胞を300 x gで5分間遠心分離してペレットを行い、少量の凍結溶液Aで細胞を再休止し、ステップ3.3.1のようにヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントする。
3. 500,000 ~ 1,000,000 セル/mL の最終的なセル濃度に達するために、セルが再懸濁される最終的な体積を計算します。凍結溶液Aを使用して、その最終容積の50%でペレットを再サスペンドします。チューブを攪拌しながら、凍結溶液Bの等量をゆっくりと加え、最終的な細胞濃度に達する。
4. 直ちに1~2mLの凍結で細胞を凍結する。クリオビアーを制御レート冷凍庫または-80°Cに入れた冷凍容器に入れ、温度を1°C/分下げます。制御された凍結(凍結容器のために一晩)に続いて、細胞を液体窒素に移し、長期保存する。

Representative Results

ここで詳述した方法を用いて、ASCはリポアズパイレーツおよび腹部形成術サンプルから正常に分離された(図1)。3つの通路の後、単離された細胞は、酵素消化に続くASCと同様に、MSC形態(非対称、スピンドル形状)および表現型を有することが判明した(図2)。私たちのグループおよび他からの以前の研究は、脂肪細胞、骨細胞、および他の手段^11、21によって単離されたASCを含む他のMSCのようなニューロンに分化するためにこれらのASCを示している。

ほとんどの場合、組織培養プレートへのASCの移行は、明視野顕微鏡によって3〜5日以内に可視化することができる。ただし、場合によっては、7 日後に疎なセルのみが表示されます。まれに、細胞がプレート上に移行せず、第3の通路まで増殖しない。この結果は、一般に、組織試料の処理の遅延と相関する。

図1:腹部形成術およびリポアズパイレーツ試料からのASC分離の概略表現腹部形成術および脂肪吸引試料は、定期的な外科的処置に従って廃棄組織として得られた。腹部形成術試料を細断し、その後、腹部形成術または脂肪吸引試料のいずれかを組織培養媒体中の除植物としてめっきした。ASCは組織から、栄養豊富な媒体に向かって移行した。1週間後、除植物を除去し、下流の実験および/または臨床応用のためにASCを培養した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:MSC形態と表現型を有する単離されたASC酵素フリー、エクスプラント法により単離されたASCは、通路3にMSC形態および表現型を有する。(A)他のMSCと同様に、これらのASCは、植物または酵素法(例えば、コラゲナーゼ)によって単離されるかどうかにかかわらず、非対称的なスピンドル形状を有する。酵素法を用いて単離されたASCは、エクスプラント単離ASCと比較して、より長く狭い形態を生じる。後者は、骨髄由来MSCのような他の酵素フリー分離方法に由来するMSCに似ています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

ASCは組織の容易なアクセスによるMSCの魅力的な源である。臨床および研究の両方の適用のために、科学者はこれらの細胞を分離し、培養するときドナーの変動を念頭に置く必要があります。理由はまだ解明されていないが、異なるドナーからのMSCは、インビトロで増殖するために異なる能力を示し、その後、脂肪のエクスプラントと増殖能力からのASCの移行に影響を与える。これらの酵素フリーの外植から単離されたASCが共管に到達するまでにかかる時間で変動性を観察できるが、インビトロで増殖しないサンプルは稀であった。

ドナーの変動を超えて、細胞の障害の最も可能性の高い原因は、組織から移動し、インビトロで増殖する可能性が最も高い、組織が処理前に保存された時間の長さである。サンプルが処理前に>12時間座らせたり、収穫と処理の間に湿気を保たなかったりした場合、より悪い移行および増殖速度が観察された。頻繁に増殖できなかった唯一のサンプルは、生理線溶液で湿っと保たれなかった腹部形成術サンプルでした:これらの場合、組織ブロックの中心にある組織はしばしば処理するのに十分湿っていましたが、時には廃棄する必要がありました。したがって、収穫時から処理まで組織を湿らせておく必要があります。

ASCが1週間のマークでプレート上で観察されない場合、脂肪の出現植物は組織壊死が起こらないように組織培養プレートから除去されるべきである。細胞が少なすぎて簡単に識別できない場合もありますが、培養システム内で拡張できる細胞は少ないです。細胞がまだ3週間で観察されない場合、分離は失敗したとみなされるべきである。

場合によっては、特に腹部形成術において、外科分野内の限界のために真の無菌試料を得ることはできない。手術室から層流フードに組織を輸送するために滅菌容器を使用することができない場合は、組織の外側1cmを除去することは、一般に微生物汚染を防ぐのに十分である。腹部形成術サンプルが皮膚に付着している場合、皮膚を70%エタノールで拭き取り、脂肪組織をミンチする前にその表面を殺菌することができる。

ミンチプロセス中に、組織が小さく、細かい部分に細かく切り込まれることが重要です。除植物が大きすぎると、ASCが組織からプレートに移動するのに十分な表面積が不足します。また、組織が壊死性になるまで、組織が必要以上にプレートに残留しないことが重要である。

この方法の制限は、組織培養プロセス中にASCを剥離する酵素(記載のプロトコル、トリプシン)の使用である。アキュタスのような他の非動物由来酵素は、動物由来の製品の必要性を除去するために置き換えることができるが、これは組織培養のコストを増加させるであろう。このため、とりわけ、多数のグループが、バイオリアクターや足場ベースのシステムなどの非二次元組織培養方法を研究し、MSC増殖ポテンシャルを高める一方で、細胞を基質²²から剥離する必要性を最小限に抑えている。

ASCを診療所に移す場合、エクスプラント分離法の大きな制限は、多くの医療センターに欠けている良好な製造実践(GMP)レベルの組織培養施設への依存である。これらの場合、自己囲まれた市販の酵素または遠心分離ベースの方法のいずれかを採用する必要があります。しかし、GMP施設の普及が一般的になるにつれて、この効果は限定的になると予想されます。一方、GMP組織培養設備を欠くそのような施設であっても、インビトロでASCを研究するためのエクスプラント法を使用することを検討することができる:操作が少ないほど、これらの細胞は、彼らの生体内対応^物11に近い。

この方法は、過酷な酵素または遠心分離ステップがない場合に、脂肪組織(脂肪吸引剤と腹部形成術の両方)からASCを分離する簡単な方法を提供します。ASCの初期歩留まりは他の方法よりも低いが、ASCはインビトロで増殖し、初期歩留まりが低い場合の影響を最小限に抑える。過剰または強制的な操作の欠如は、質問が少ないので、このような方法でASCを分離させます(すなわち、観察された効果が細胞自体によるものか、分離プロセス中の細胞の操作によるものか)).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Bioreagents	BP231
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5671
Falcon 3003 tissue culture plates	Corning	Corning
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	serum is batch tested to ensure it supports MSC growth
L-Glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513
Mr. Frosty	Nalgene	5100-0001
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049