Summary
Hier presenteren we een protocol dat isolatie en kweek van kraakbeen explanten van runderknieën beschrijft. Deze methode biedt een eenvoudig en toegankelijk hulpmiddel om weefselveranderingen te beschrijven in reactie op biologische stimuli of nieuwe therapieën gericht op het gewricht.
Abstract
Ex vivo cultuur systemen bestrijken een breed scala aan experimenten gewijd aan het bestuderen van weefsel en cellulaire functie in een inheemse setting. Kraakbeen is een uniek weefsel belangrijk voor de goede werking van het synoviale gewricht en wordt gevormd door een dichte extracellulaire matrix (ECM), rijk aan Proteoglycaan en type II collageen. Chondrocyten zijn het enige celtype aanwezig in kraakbeen en zijn wijdverbreid en relatief laag in aantal. Veranderde externe stimuli en cellulaire signalering kunnen leiden tot veranderingen in de samenstelling en verslechtering van de ECM, wat belangrijke pathologische kenmerken zijn bij ziekten zoals osteoartritis (OA) en reumatoïde artritis.
Ex vivo kraakbeen modellen toestaan 1) profilering van chondrocyten gemedieerde veranderingen van kraakbeenweefsel omzet, 2) visualiseren van de kraakbeen ECM samenstelling, en 3) chondrocyten omlegging rechtstreeks in het weefsel. Profilering van deze veranderingen in reactie op stimuli of behandelingen zijn van groot belang in verschillende aspecten van de biologie van het kraakbeen, en aanvulling in vitro experimenten in geïsoleerde chondrocyten, of complexere modellen in levende dieren waar experimentele omstandigheden moeilijker te beheersen zijn.
Kraakbeen explantaten presenteren een translationele en gemakkelijk toegankelijke methode voor het beoordelen van weefsel remodellering in de kraakbeen-ecm in regelbare instellingen. Hier beschrijven we een protocol voor het isoleren en kweken van levende runderkraakbeen Explants. De methode maakt gebruik van weefsel van de boviene knie, die gemakkelijk toegankelijk is vanaf de lokale slagerij. Zowel de explantaten als het geconditioneerde kweekmedium kunnen geanalyseerd worden om de weefsel omzet, de ECM-compositie en de chondrocyten-functie te onderzoeken.
Introduction
Chondrocyten produceren en onderhouden de kraakbeen matrix. Om de biologie van chondrocyten te bestuderen en hoe zij en de omringende ECM reageren op externe stimuli, is het cruciaal om ze te ondervragen in hun eigen omgeving1,2. Studie van kraakbeenweefsel omzet is belangrijk om het begrip van de onderliggende mechanismen in gewrichtsziekten zoals OA, een ziekte waarvoor momenteel geen ziekte modificerende behandeling te verbeteren. Bijgevolg is er een aanzienlijke behoefte aan betere Vertaal modellen2.
Ex vivo karakteriseren van cel-en weefsel effecten is essentieel voor het aanvullen van andere preklinische modellen, zowel in vitro, zoals chondrocyten monolaag culturen, als in vivo, zoals chirurgie-geïnduceerde OA modellen of het auto-immune collageen-geïnduceerde artritis model (CIA ). Talrijke studies hebben gewezen op de verschillen tussen hoe cellen zich gedragen in 2D monolaag culturen en 3D structuren of in hun eigen weefsel3,4. Veel cellen in 2D-lagen nemen onnatuurlijke morfologieën aan, waaronder verschillen in celpolariteit en weefsel hechting, wat resulteert in zowel visuele als functionele verschillen in cellen binnen native weefsels5. De verschillen zijn ook duidelijk in de functionaliteit van de cellen, die eiwit expressie kan verschuiven, wat leidt tot diep veranderde differentiatie patronen, regelgevende machines en celfunctionaliteit5,6,7 ,8.
De kraakbeen-ECM bestaat hoofdzakelijk uit type II collageen dat een matrix kader biedt, en aggrecan, een Proteoglycaan dat helpt vocht in het weefsel te behouden. Andere matrix moleculen zoals collageen type IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronectin, kraakbeen oligomere eiwitten (COMP), biglycan, decorin en perlecan zijn ook aanwezig9.
Terwijl de etiologie van OA onduidelijk blijft10,11, het begin van de ziekte wordt verondersteld te worden veroorzaakt door onevenwichtigheden in weefsel omzet en reparatie processen12,13. De afbraak van het articulaire kraakbeen is een kenmerk van OA. Chondrocyten of cellen in de omringende weefsels in het kraakbeen verhogen hun vrijlating van cytokinen, waardoor verhoogde productie van proteïnasen wordt gestimuleerd, zoals matrix matrixmetalloproteïnases (mmps) en aggrecanases, die de afbraak van kraakbeen ECM verhogen 14. deze degradatie resulteert in het vrijkomen van kleine unieke eiwit fragmenten genaamd Neo-epitopen, die kunnen worden gekwantificeerd in serum, urine of cultuurmedium15. Bij de vorming en rijping van collageen, zogenaamde profragments worden ook vrijgelaten; Deze kunnen worden gekwantificeerd als een maat voor matrix productie16.
Het doel van dit protocol is om een ex-vivo kraakbeen model op te zetten om het effect van stimulatie en/of medicamenteuze behandeling op de omzet van ECM-weefsel te vergelijken. De omzet van kraakbeen wordt geprofileerd door het meten van matrix-afgeleide Neo-epitope biomarkers direct in het conditioneerde kweekmedium met ELISA: AGNx1 (reflecterend aggrecanase activiteit), C2M-(reflecterende matrix MMP-activiteit) en ProC2 (reflecterend type II collageen formatie). De bevindingen kunnen worden geverifieerd door histologische kleuring van de ECM, die ook de organisatie van chondrocyten in de individuele Explants visualiseert. Het beschreven protocol kan worden gebruikt om het effect van nieuwe behandelingen op de chondrocyten-functie en de omzet van het kraakbeen ECM te testen. Een aantal studies hebben gebruik gemaakt van kraakbeen explantaten om biologische processen of het effect van ingrijpen op cytokine-uitgedaagd explantaten te beschrijven met behulp van kwantitatieve histologische of immunohistochemische benaderingen, mRNA, eiwit expressie of proteomica2 ,17,18. Deze protocollen vallen echter buiten het bereik van het huidige manuscript.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. weefsel isolatie
- Weefsel sourcing
- Voer de gehele weefsel sourcingsectie buiten een laminaire stroom afzuigkap uit in een aseptische omgeving.
- Van de lokale slachterij, verkrijgen van een hele verse rundertibiofemorale kniegewricht van kalveren tussen 1,5 en 2 jaar oud.
- De kuit knie zachtjes ontleden door eerst het overtollige vlees te verwijderen, de condyles, meniscus, pezen en synoviale membraan te bedekken. Snijd de pezen en synoviale membraan, waardoor het gewricht Dismember. Verwijder de meniscus om de femorale condyles bloot te leggen.
- Isoleer de explantaten uit het dragende gedeelte van de femorale condylen met behulp van een 3 mm biopsie Puncher en laat ze los van het gewrichtsoppervlak door te snijden met een scalpel parallel aan en zo dicht mogelijk bij het subchondrale bot. De harde structuur van het subchondrale bot moet ervoor zorgen dat explantaten geen verkalkte matrix bevatten. Streef naar explantaten met uniforme hoogte.
- Bewaar en meng onmiddellijk de explantaten in DMEM/F12-glutamax + 1% P/S kweekmedium in een tube van 50 ml of Petri schaal. Meng geen explantaten van verschillende koeien knieën maar houd ze apart voor elke studie.
- Weefselkweek
- Breng de explantaten over naar een steriele 96-put in een laminaire flow afzuigkap.
- Was de explantaten 3 keer in kweekmedium of PBS en kweek ze in 200 μL kweekmedium per well tot het begin van het experiment. Gebruik een wegwassende werking periode van 1 dag voor het synchroniseren van biopsie cellulaire activiteit en passieve biomarker release.
- Kweek de explantaten tot 10 weken in een incubator van 37 °c met 5% Co2. Plaats alle replicaten binnen elke groep diagonaal in de kweek plaat om de variatie veroorzaakt door verdamping te minimaliseren. Om de verdamping van het supernatant verder te voorkomen, voegt u PBS toe aan de buitenste putjes van de kweek plaat.
2. bovine kraakbeen explant behandeling en beoordeling van metabole activiteit
- Cultuurmedium verandering en behandeling
- Verander het kweekmedium elke 2-3 dagen in een laminaire stroom afzuigkap.
- Als u behandelingen toepast, moet u deze voorbereiden voordat u het medium wijzigt. Bereid de behandelingen voor op de gewenste concentratie in de explant putten door verdunning in het kweekmedium.
- Verwijder voorzichtig de supernatant van elke put en breng het over naar een nieuwe 96 goed bord. Bewaar het supernatant met afdichtingstape bij − 20 °C voor biomarkeranalyse van weefsel omzet en eiwit expressie.
- Voeg onmiddellijk 200 μL vers kweekmedium of een behandeling per put toe. Laat de explantaten niet uitdrogen tijdens de gemiddelde verandering en zorg ervoor dat alle explantaten volledig ondergedompeld zijn in het nieuwe medium.
- Resazurin kleuring
- Meet metabolische activiteit eenmaal per week als een indirecte meting van de levensvatbaarheid van de cel. De resazurin test is een eenvoudige manier om te beoordelen of de metabole activiteit van de explantaten verslechveert voor een individuele explant als gevolg van celdood of cellulaire veranderingen. Explants in kweekmedium alleen al een relatief stabiele resazurin lezing gedurende de experiment periode.
- Maak een oplossing van cultuurmedium met 10% resazurin.
- Oogst het supernatant zoals beschreven in stap 2.1.3.
- Dompel de explantaten onder in 10% resazurin oplossing voor 3 uur bij 37 °c of totdat de supernatanten paars worden. Inclusief 4 putten zonder explantaten als achtergrond besturingselementen.
- Breng de geconditioneerde en achtergrondcontrole resazurin oplossing over op een zwarte microtiterplaat en meet fluorescentie bij 540 nm excitatie/590 nm emissie.
- Was 3 keer grondig in kweekmedium of PBS en dompel de explantaten in het reinigingsmiddel voor 5-10 min in zodat de resazurin volledig diffuus kan worden. Voeg nieuwe kweekmedium of behandelingen toe indien gebruikt.
3. beëindiging, fixatie en monster opslag
- Beëindiging van de kweekperiode
- Meet de metabolische activiteit zoals beschreven in stap 2,2. Voeg 200 μL PBS per put toe.
- Fixatie en opslag
- Verwijder de PBS, voeg 200 μL formaldehyde per put toe en laat 2 uur bij kamertemperatuur liggen.
- Gooi de formaldehyde weg en voeg 200 μL PBS per put toe. Dek de plaat af met afdichtingsband en bewaar deze bij 4 °C voor histochemische analyse. We raden u aan histochemische analyse binnen 3 maanden uit te voeren.
4. weefsel omzet biomarkers (ELISA)
- Indirect concurrerende Elisa's
- Mantel een streptavidin-plaat met de specifieke biotinyleerd assay target-peptide verdund 1:100 in test buffer (100 μL per put) gedurende 30 min bij 20 °c.
- Was 5 keer met een standaard wasbuffer en voeg een monster-supernatant (20 μL per put) samen met primair monoklonaal antilichaam tegen de test doelstelling-peptide verdund 1:93.3 voor ProC2 en 1:100 in de test buffer voor AGNx1 (100 μL per put) en inincuberen voor 2 uur bij 20 °C met schudden voor ProC2 en 3 uur bij 20 °C voor AGNx1.
Opmerking: Het monstervolume wordt rechtstreeks uit de opgeslagen supernatant platen gehaald. Als de gemeten concentratie buiten het meetbereik van de test ligt, verdunt u het supernatant in een v-bodem verdunnings plaat in PBS of in een test buffer. - Was 5 keer met een standaard wasbuffer en inincuberen met peroxidase-gelabeld secundair antilichaam, verdund 1:100 in test buffer (100 μL per put) gedurende 1 uur bij 20 °C.
- Was 5 keer met een standaard wasbuffer en incubeer met 15 minuten schudden in het donker bij 20 °C met Tetramethylbenzidine (TMB) als peroxidase substraat (100 μL per put).
- Beëindig de reactie met de standaard stop oplossing, 0,1 M H2dus4 (100 μL per put).
- Lees de colorimetrische reactie bij een extinctie van 450 nm met een referentie-extinctie bij 650 nm op een standaard laboratorium plaat lezer.
- Directe competitieve Elisa's voor het meten van de omzet van het kraakbeenweefsel in de supernatant
Let op: dit kwantificeert C2M-.- Mantel een streptavidin-plaat met specifieke biotinyleerd assay target-peptide verdund 1:100 in test buffer (100 μL per put) gedurende 30 min bij 20 °c.
- Was 5 keer met een wasbuffer en voeg monster-supernatant samen met 100 μL peroxidase-gelabeld monoklonaal antilichaam tegen de test doelstelling-peptide verdund 1:100 in de test buffer (20 μL per put). Incuberen gedurende 20 uur bij 2 – 8 °C met schudden.
Opmerking: Het monstervolume wordt rechtstreeks uit de opgeslagen supernatant platen gehaald. Als de gemeten concentratie buiten het meetbereik van de test ligt, verdunt u het supernatant in een v-bodem verdunnings plaat in PBS of in een test buffer. - Was 5 keer met een standaard wasbuffer en incuberen met 15 minuten schudden in het donker bij 20 °C met TMB als peroxidase substraat (100 μL per put).
- Beëindig de reactie met de standaard stop oplossing, 0,1 M H2dus4 (100 μL per put).
- Lees de colorimetrische reactie bij een extinctie van 450 nm met een referentie-extinctie bij 650 nm op een standaard laboratorium plaat lezer.
- AGNx1
- Kwantificeer aggrecan afbraak door het meten van de release van de AGNx1 Neo-epitope. Deze indirecte competitieve ELISA richt zich op de aggrecan C-terminale peptide (NITEGE373) gegenereerd door adamts-4 en 5 decolleté. Het monoklonaal antilichaam herkent alle fragmenten met een blootgestelde NITEGE epitope. De experimentele Details van de test zijn elders gepubliceerd19.
- ProC2
- Quantify type II collageenvorming door het meten van de vrijgave van de profragment van type II collageen. Deze indirecte competitieve Elisa-test richt zich op de epitoop van het piibnp-propeptide (qdvrqpg) dat wordt gegenereerd door N-propeptidases tijdens het trimmen van nieuw gesynthetiseerd type II-collageen. De experimentele Details van de test zijn elders gepubliceerd16.
- C2M-
- Kwantificeer type II collageen degradatie door het meten van de release van het C2M-Neo-epitope fragment. Deze directe competitieve ELISA herkent de MMP-cleaved C-terminale peptide (KPPGRDGAAG1053). Deze test verschilt van AGNx1 en ProC2 omdat het het primaire antilichaam is dat peroxidase-gelabeld is en dus als detector wordt gebruikt. De experimentele Details van de test zijn elders gepubliceerd20.
5. histologische analyse
- Infiltratie, inbedding en snijden
- Plaats de gefixeerde explantaten (zie stap 3,2) in individueel gelabelde cassettes. Neem zowel een label in de cassette als de label cassettes op om de identificatie te garanderen.
- Breng de cassettes met explantaten over naar een tissue processor machine. Vervolgens infiltreren de explantaten met paraffine in een reeks van uitdroging en paraffine infiltratie stappen.
- Dehydraat met 96% ethanol voor 90 min zonder temperatuur aanpassing. Herhaal deze stap 3 keer.
- Wis de ethanol met tolueen voor 90 min zonder temperatuur aanpassing. Herhaal deze stap 2 keer.
- Wis de ethanol met tolueen gedurende 90 min bij 60 °C.
- Infiltreren met paraffinewas gedurende 30 minuten bij 60 °C.
- Infiltreren met paraffinewas voor 60 min bij 60 °C.
- Infiltreren met paraffinewas voor 90 min bij 60 °C.
- Voeg voor elke stap de oplossingen toe aan de monsterkamer met langzame pomp-out en pomp-in stromen onder 33 – 34 kPa. Voer het infiltratie proces uit in een druk-/vacuümcyclus met een maximaal vacuüm van − 65 tot − 70 kPa.
- Plaats de cassettes na het infiltratie op een verwarmingsblok om de explantaten voorzichtig uit de cassette te laten verwijderen. Integreer de geïnfiltreerde explantaten voorzichtig in afzonderlijke paraffineblokken. Met verwarmde Tang, plaats de explantaten met de oppervlakkige articulaire kraakbeen en subchondrale botten loodrecht op het snijoppervlak, zodat visualisatie van de verschillende kraakbeen lagen binnen elke preparaat sectie.
- Snijd 5 μm delen van gekoelde paraffineblokken met ingesloten explantaten op een microtoom. Breng de snij gedeelten over naar een koudwaterbad. Indien nodig kunnen secties worden gescheiden met behulp van een scalpel of een afdekglas.
- Gebruik een ongecoat glazen glijbaan voorzichtig, breng de secties over naar een warmwaterbad (50 °C), waar de secties ontvouwen. Til elke sectie op een gelabelde afdekplaat en plaats deze gedurende 30 minuten op een verwarmings plaatje.
- Plaats de glaasjes in een mandje en inbroed bij 60 °C gedurende 1 uur en houd ze vervolgens 's nachts bij 37 °C. Bewaar de glijbanen in gesloten recipiënten bij 4 °C tot de kleuring.
- Safranin O/snelle groene kleuring en visualisatie
- Leg de glaasjes in een mandje en inbroed de glaasjes bij 60 °C gedurende 1 uur.
- Bereid en filtreer alle reagentia met een 0,45 mm filter.
- Giet, ter voorbereiding op vlekken, de gefilterde reagentia in bekerglazen op een volume dat de oplossingen toelaat om de dia's volledig af te dekken bij het samenvoegen van de korf. De bekers gebruikten een volume van 250 mL om de dia's te bedekken.
- Deparaffiniseer de gesmolten glijbanen door de korf in tolueen gedurende 10 minuten tweemaal te subfuseren, 99% ethanol gedurende 2 minuten tweemaal, 96% ethanol gedurende 2 min tweemaal, en 70% ethanol voor 2 min tweemaal. Hydrateer vervolgens de glaasjes in water gedurende 2 min.
- Vlek de gedeparaffiniseerde en gehydrateerde glijbanen door de korf in de ijzer hematoxyline-oplossing van weigert (pH 1,5) gedurende 10 minuten in te voegen, een keer in 1% HCl te spoelen en met stromend kraanwater gedurende ongeveer 5 minuten af te wassen of totdat de overtollige kleur is weggespoeld.
- Vervolgens vlek in 0,05% snelle groene oplossing (pH: 5,75) gedurende 5 minuten, dip in 1% CH3COOH eenmaal, en vlek in 0,1% Safranin O (ph: 6,5) gedurende 20 min.
- Dehydraat en wis de dia's door tweemaal te dompelen in 70% ethanol, 96% ethanol voor 2 min tweemaal, 99% ethanol voor 2 min tweemaal en tolueen 2 min tweemaal.
- Monteer de ongecoate glaasjes met een harsachtige medium dat de histologie glaasjes bedekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Runderen met volledige diepte werden geïsoleerd, gekweekt en gedurende 3 weken behandeld (Figuur 1). Het kweekmedium werd met de toevoeging van de behandeling 3 keer per week veranderd. Eenmaal per week werd de metabolische activiteit gemeten met de resazurin-assay. Biomarkers van de ECM-omzet werden gemeten in het supernatant dat 3 keer per week werd geoogst uit de kweek plaat. Explants werden onderverdeeld in 4 groepen voor behandeling: 1) Oncostatin M en TNFα (O + T); 2) O + T + GM6001 (GM6001); 3) insuline als groei factor-1 (IGF-1); en 4) een controle zonder behandeling (w/o).
Metabolische activiteit.
Voor alle vier de groepen was de metabolische activiteit gedurende de 3 weken relatief stabiel (Figuur 2A). Er was een neiging voor IGF-1 te verhogen de metabole activiteit iets boven de w/o-groep en voor de O + T groepen te verminderen. De resazurinassay werd gebruikt om de activiteit van de chondrocyten in elke explant gemakkelijk te beoordelen en om de levensvatbaarheid van de cellen indirect te beoordelen zonder explantaten uit het experiment te extraheren. Als een explant tijdens het experiment een aanzienlijke daling van de metabolische activiteit vertoont, kan de explant worden uitgesloten van verdere analyse.
Katabole behandeling.
O + T werd 3 keer per week toegepast op de kweek putten om O + T-gemedieerde kraakbeen degradatie te onderzoeken (Figuur 3, Figuur 4). MMP-gemedieerde type II collageen degradatie en aggrecanase-gemedieerde aggrecan afbraak werden beoordeeld door C2M-en AGNx1 Elisa's. O + T verhoogde collageenafbraak van type II van dagen 7-21 (Figuur 3a) en aggrecan-degradatie van dagen 3-14 (Figuur 4A) ten opzichte van de w/o-groep. Bij het toevoegen van GM6001 (een breedspectrum MMP-remmer) in combinatie met O + T-behandeling, werd de O + T-gemedieerde C2M-afgifte geblokkeerd (Figuur 3a, B). Een verminderde AGNx1 release werd waargenomen bij het toevoegen van GM6001 op dagen 3-7, maar de AGNx1 release pieken op dag 10 op vergelijkbare niveaus aan de O + T groep (Figuur 4A), wat aangeeft dat de GM6001 alleen vermindert aggrecan degradatie in beperkte mate. Dit patroon in AGNx1 en C2M-release is het algemene beeld waargenomen in het runderkraak been model gestimuleerd met O + T. Ten eerste wordt AGNx1 vrijgegeven van ongeveer dag 3 en pieken op dagen 10-14, wat een vroegtijdige afbraak van aggrecan vertegenwoordigt. Vervolgens wordt na 2 weken van kweek met O + T, type II collageenafbraak waargenomen zoals gemeten door de C2M-biomarker.
Anabole behandeling.
Om te onderzoeken hoe anabole stimulatie de omzet van het kraakbeen-ECM moduleert, insuline zoals groei factor-1 (IGF-1) werd toegepast 3 keer per week aan runderen volledige diepte explanten. Het effect van IGF-1 op het kraakbeen explantaten werd vooral waargenomen op metingen van type II collageenvorming, beoordeeld door ProC2, zoals verwacht voor anabole stimuli (Figuur 5). Dag 0 in dit model toont altijd hoge ProC2 metingen, misschien als reactie op de extractie van monsters. Deze hoge niveaus dalen aanzienlijk en niveau uit vanaf dagen 7-21. Bij de behandeling met IGF-1, de ProC2 niveaus minder dan die waargenomen in de w/o-groep verlagen, wat aangeeft dat IGF-1 stimuleert type II collageenvorming vanaf dag 7 (Figuur 5B). De ProC2 grafieken tonen ook de biologische variatie van koeien. In deze experimenten werden explantaten van twee koeien gebruikt met 6 explantaten per koe per groep. De eerste koe had dikker kraakbeen en genereerde grotere Explants, resulterend in hogere ProC2 spiegels bij aanvang, terwijl de tweede koe kleiner was met dunner kraakbeen, wat resulteerde in lagere ProC2 niveaus bij Baseline. Voor de w/o-, IGF-1-en o + T-groepen vertegenwoordigen de afgebeelde ProC2 niveaus het gemiddelde van de explantaten van beide koeien, maar GM6001 werd alleen gemeten in de tweede koe met dunnere explantaten. Zo begon de GM6001 groep met lagere ProC2 niveaus op dag 0, wat duidelijk is in het ProC2 gebied onder de curve (AUC) (Figuur 5C). Normalisatie van de ProC2 waarden naar de dag 0 niveaus houdt rekening met de biologische variantie, waardoor de effectiviteit van de behandeling wordt getoond (Figuur 5B, D).
Safranin O en snelle groene histologische kleuringen werden uitgevoerd om de Proteoglycaan-inhoud en de kraakbeen structuur van de explant gedurende het experiment te visualiseren (Figuur 6). Op de dagen 0, 7, 14 en 21 werden explantaten uit de w/o-, IGF-1-en o + T-groep gefixeerd voor histologische kleuring (Figuur 6). De w/o en de IGF-1 groep leek te hebben vergelijkbare Safranin O kleuring intensiteit aan de dag 0 explant tijdens het experiment, die correleert met biomarker resultaten waaruit blijkt dat geen van de twee groepen toegenomen AGNx1 release (Figuur 4). Behandeling met O + T resulteerde in substantieel verlies van Proteoglycaan op dag 7 en volledig verlies op dag 21. Bovendien neemt de snelle groene kleurings intensiteit af van dagen 14-21, wat duidt op een collageen verlies in uitlijning met de C2M-resultaten.
Figuur 1: Schematisch overzicht van de runderkraakbeen methode.
Op dag − 1 werden boviene femorale condylen geïsoleerd van de Hind tibiofemorale verbinding. De volledige diepte kraakbeen explantaten werden uit de condylen vrijgegeven met een scalpel en een biopsie Puncher. De uitgepakte explantaten werden gewassen en overgebracht naar een steriel 96 goed cultuur plaatje. Op dag 0, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19 en 21 werd het supernatant geoogst van de kweek plaat, overgebracht naar een opslag plaat, en bewaard bij − 20 °C, zoals geïllustreerd in gemiddelde verandering stap 1. De opgeslagen supernatant werd later ontdooid voor het meten van de weefsel omzet biomarkers door specifieke ELISA-assays. Bij middelgrote verandering stap 2 werd na het verwijderen van het supernatant een nieuw kweek medium met de verschillende behandelingen of geen behandeling voor controle-explantaten toegepast. Op dag 0, 7, 14 en 21 werden de explantaten geïnincubeerd met 10% resazurin oplossing voor 3 h na het oogsten van het supernatant. De 10% resazurin supernatant werd overgebracht naar een zwarte 96-put plaat waar de colorimetrische reactie werd gemeten. De kweek putten werden 3 keer gewassen voordat nieuwe kweekmedium met of zonder behandeling werd toegevoegd aan de explantaten zoals getoond in middelgrote verandering stap 2. Op dag 21, na de oogst van supernatant en resazurin meting, werden de explantaten gefixeerd door incubatie met formaldehyde voor 2 h. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: metabolische activiteit gemeten door resazurin.
De volledige diepte kraakbeen explantaten van runderen werden gedurende 3 weken geïsoleerd en gekweekt. Cultuurmedium werd veranderd met de toevoeging van nieuwe behandeling 3 keer per week (n = 12 explantaten van 2 koeien). De behandeling bestond uit IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL], en O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. Een controlegroep zonder behandeling (w/o) werd opgenomen. Voor de w/o-, IGF-1-en O + T-groep worden de gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde (SEM) van 12 replicaten van 2 koeien (6 replicaten per koe) weergegeven. Voor de GM6001 groep worden de gemiddelde en SEM van 6 duplo's van 1 koe getoond. A) metabolische activiteit, gemeten door resazurin. B) oppervlakte onder de curve (AUC) voor dagen 0-21 voor metabolische activiteiten grafieken zoals weergegeven ondera). p > 0,0001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: type II collageenafbraak gemeten door C2M-.
De volledige diepte kraakbeen explantaten van runderen werden gedurende 3 weken geïsoleerd en gekweekt. Cultuurmedium werd veranderd met de toevoeging van nieuwe behandeling 3 keer per week. De behandeling bestond uit IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL], en O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. Een controlegroep zonder behandeling (w/o) werd opgenomen. Voor de w/o-, IGF-1-en O + T-groepen worden de gemiddelde en SEM van 12 replicaten van 2 koeien (6 replicaten per koe) getoond. Voor de GM6001 groep worden de gemiddelde en SEM van 6 duplo's van 1 koe getoond. A) C2M-metingen. Statistisch significantieniveau van w/o werd berekend door herhaalde maatregelen (RM) in twee richtingen ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Sidak. B) de AUC voor dagen 0-21 voor C2M-grafieken weergegeven ondera). De statistische significantie werd berekend door de Kruskal-Wallis test met Dunn's meervoudige vergelijkingstest. p > 0,0001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Aggrecan afbraak gemeten door AGNx1.
De volledige diepte kraakbeen explantaten van runderen werden gedurende 3 weken geïsoleerd en gekweekt. Cultuurmedium werd veranderd met toevoeging van nieuwe behandeling 3 keer per week. De behandeling bestond uit IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL], en O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. Een controlegroep zonder behandeling (w/o) werd opgenomen. Voor de w/o-, IGF-1-en O + T-groep worden de gemiddelde en SEM van 12 replicaten van 2 koeien (6 replicaten per koe) weergegeven. Voor de GM6001 groep worden de gemiddelde en SEM van 6 duplo's van 1 koe getoond. A) AGNx1 metingen. Statistisch significantieniveau van w/o werd berekend door RM twee-weg ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Sidak. B) de AUC voor dagen 0-21 voor AGNx1 grafieken weergegeven ondera). De statistische significantie werd berekend door de Kruskal-Wallis test met Dunn's meervoudige vergelijkingstest. * *p > 0,01, * * *p > 0,001, * * * *p > 0,0001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: type II collageenvorming gemeten door ProC2.
De volledige diepte kraakbeen explantaten van runderen werden gedurende 3 weken geïsoleerd en gekweekt. Cultuurmedium werd veranderd met de toevoeging van nieuwe behandeling 3 keer per week. De behandeling bestond uit IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL], en O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. Een controlegroep zonder behandeling (w/o) werd opgenomen. Voor de w/o-, IGF-1-en O + T-groep worden de gemiddelde en SEM van 12 replicaten van 2 koeien (6 replicaten per koe) weergegeven. Voor de GM6001 groep, de gemiddelde en SEM van 6 repliceert van 1 koe re weergegeven. A) ProC2 metingen van dagen 0-21. B) ProC2 waarden genormaliseerd tot dag 0 metingen voor elke afzonderlijke explant. De ProC2 resultaten profiteren vaak van dag 0 normalisatie om het behandelingseffect te achterhalen dat kan worden vermomd door de hoge biomarkerspiegels op dag 0. In A en Bwerd het statistisch significantieniveau berekend door RM twee richtings-ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van sidak. C) de AUC voor dagen 0-21 voor ProC2 grafieken weergegeven ondera). (D) AUC voor dagen 0-21 voor dag 0 genormaliseerde ProC2 grafieken weergegeven in (B). In C en Dwerd de statistische significantie berekend door de Kruskal-Wallis test met dunn's meervoudige vergelijkingstest. * *p > 0,01, * * *p > 0,001, * * * *p > 0,0001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: histologische visualisatie van Proteoglycaan-gehalte door Safranin O/snelle groene kleuring.
De volledige diepte kraakbeen explantaten van runderen werden gedurende 3 weken geïsoleerd en gekweekt. Cultuurmedium werd veranderd met de toevoeging van nieuwe behandeling 3 keer per week. De behandeling bestond uit IGF-1 [100 ng/mL] en OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL]. Een controlegroep zonder behandeling (w/o) werd opgenomen. Op dag 0, 7, 14 en 21 werden explantaten gefixeerd, geïnfiltreerd met paraffine, ingebed in paraffine, gesneden, geplaatst op afdekplaten, en gekleurd met HEMA oxylin, Safranine O en snel groen. Voor elke behandelingsgroep en elk tijdpunt wordt een representatieve explant getoond. De schaalbalk die wordt weergegeven in het basislijn monster (dag 0) vertegenwoordigt 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol dat hier wordt gepresenteerd voor de profilering van de omzet van kraakbeenweefsel in runderkraakbeen explanten kan worden gebruikt voor het karakteriseren van behandelingseffecten van vele soorten geneesmiddelen, waaronder remmers van inflammatoire intracellulaire trajecten, remmers van Proteolytische enzymen, of anabole groeifactoren.
Twee verschillende opstellingen werden beschreven in dit Protocol: een anabole Setup waar explantaten werden gestimuleerd met insuline-achtige groeifactor 1 (IGF-1), en een katabole Setup bestaande uit stimulatie met TNF-alpha en oncostatin M, waarin weefsel omzet kan worden geremd met behulp van een breedspectrum MMP-remmer. De belangrijkste output in deze methode is de kwantificering van neo-epitope biomarkers direct in het geconditioneerde medium, dat gedurende de hele cultuur periode wordt geoogst. Verschillende biomarkers kunnen worden gemeten in de supernatant, waardoor gelijktijdige profilering van verschillende katabole en anabole processen in hetzelfde monster. Histologische kleuring met Safranin O/Fast Green werd gebruikt om de bevindingen van de biomarkeranalyse te valideren. Oncostatin M, TNF-alpha, en IGF-1 werden gebruikt om het protocol te beschrijven; echter, de methode is niet beperkt tot specifieke cytokine stimulatoren en deze kunnen gemakkelijk worden uitgewisseld voor anderen afhankelijk van de hypothese of de test behandeling.
Interpretatie van biomarkeroutput is een tijdelijke oefening als gevolg van de dynamische veranderingen in chondrocyten functie en expressie profielen met anabole of katabole stimulatie na verloop van tijd. In onbehandelde explanten neemt de collageenvorming van type II gemeten door de biomarker ProC2 snel af binnen de eerste 7-10 dagen. Stimulatie met IGF-1 of soortgelijke groeifactoren onderhoudt ProC2 release in het geconditioneerde medium op een niveau vergelijkbaar met Baseline; Dus, de daling is meer geleidelijke, en de vrijlating wordt verhoogd ten opzichte van onbehandelde Explants. In een katabolische opstelling induceren pro-inflammatoire cytokines een verhoogde expressie van proteasen door de chondrocyten in dagen 0-14; Dit bestaat voornamelijk uit aggrecanases. Dit veroorzaakt een initiële grote toename van aggrecanase afkomstige eiwit fragmenten, met inbegrip van AGNx1. In de latere stadia van de cultuur, chondrocyten Express meer mmps, die de vrijlating van MMP gegenereerde markers, zoals C2M-, rond dag 14 en verder. Dus, om het effect van een behandeling te profiel, is het belangrijk om biomarkers in het juiste tijdsinterval te meten.
Zoals beschreven, zal de behandeling met inflammatoire cytokines zoals de O + T-cocktail de afbraak van kraakbeen weefsel na verloop van tijd veroorzaken. De totale pool van ECM wordt beperkt door de grootte van de explant en moet worden overwogen bij het analyseren van het biomarkerprofiel. Dientengevolge, na de initiële toename van de biomarkerafgifte, kunnen de niveaus afnemen met de tijd gewoon als gevolg van de vermindering van de resterende hoeveelheid van de explant ECM.
Voorheen werd OA voornamelijk beschouwd als een ziekte van het articulaire kraakbeen. Uit recente studies blijkt echter dat OA moet worden gezien als een ziekte van het gehele gewricht, waar vroege ziektegerelateerde veranderingen in de individuele gezamenlijke compartimenten, synovium, bot en kraakbeen, parallel optreden, en na verloop van tijd resulteren in gewrichts mislukking12 ,21. Het is daarom belangrijk om te erkennen dat in dit modelsysteem het kraakbeen geïsoleerd is van de rest van het gewricht (en organisme), waardoor de invloed van weefsel interactie-effecten en systemische factoren die de homeostase van het weefsel kunnen reguleren, wordt beperkt. In plaats daarvan is het een vereenvoudigde single-weefselcultuur waar experimenteel gecontroleerde omstandigheden kunnen worden gedifferentieerd om pathologische of Interventionele veranderingen in het weefsel te detecteren met behulp van biochemische technieken, Biomarkers of histologische visualisatie. Als gevolg van de architectuur van kraakbeen, variatie in het aantal cellen, matrix samenstelling, en hoeveelheid variatie wordt verwacht zowel tussen explantaten en tussen weefsel bronnen. Omdat de relatieve grootte van de uitvoer van de biomarker kan verschillen tussen experimenten, is het raadzaam om gegevenssets te normaliseren voor een betere vergelijking.
Om de minst mogelijke variatie en de beste resultaten te garanderen, is het belangrijk om kraakbeen te gebruiken van knieën die zo vers mogelijk zijn, bij voorkeur tussen 1 en 24 h na het slaaien. Isolatie van kraakbeenweefsel moet op homogene wijze gebeuren, waarbij explantaten ruwweg dezelfde dikte hebben. Explants moeten worden geïsoleerd uit gebieden van dik kraakbeen, het vermijden van de gebieden die het dichtst bij het midden. Het weefsel moet altijd vochtig zijn om celdood en matrix ontleding te voorkomen. De lengte van het experiment3, de tijd tussen de gemiddelde veranderingen, de timing van cytokine stimulatie en behandelingsintervallen kunnen worden aangepast aan de hypothetische werkingswijze van de individuele verbinding of het mechanisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CST, ACBJ en MK zijn medewerkers van de Noordse biowetenschappen. ACBJ en MK bezit aandelen in de Noordse biowetenschappen. De overige auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken de technische staf van de Nordic Bioscience voor laboratorium ondersteuning, evenals de Deense Research Foundation voor algemene ondersteuning van ons onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45% Iron(III) chloride solution | Sigma-Aldrich | 12322 | |
| Acetic acid | Merck | 1.00056.2500 | |
| Alamar Blue | Life tech Invitrogen | DAL1100 | |
| Biopsy processing cassettes – green | IHCWORLD | BC-0109G | |
| Biopsy punch W/Plunger (3 mm) | Scandidat | MTP-33-32 | |
| Bovine cartilage (Bovine knees) | Local slaughterhouse | ||
| C2M | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Corning 96-well plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Cover Glass Ø 13 mm | VWR | 631-0150P | |
| DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES | Gibco | 31331-028 | |
| Ethanol ≥96% | VWR | 83804.36 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | 83813.36 | |
| exAGNx1 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| exPRO-C2 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Formaldehyde solution 4% | Merck | 1004965000 | |
| GM6001 | Sigma-Aldrich | M5939-5MG | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 30721-M | |
| IGF-1 | Sigma-Aldrich | I3769-50UG | |
| Oncostatin M | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Pertex (mounting medium for light microscopy) | HistoLab | 811 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S2255 | |
| Sterile Standard Scalpels | Integra Miltex | 12-460-451 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 30743 | |
| SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides | Thermo scientific | J1800AMNT | |
| TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA-100 | |
| Toluene | Merck | 1.08327.2500 | |
| Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax | TPP | 99955 |
References
- Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).
- Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. Targets, models and challenges in osteoarthritis research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).
- Reker, D., et al. Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18). Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).
- Kjelgaard-Petersen, C., et al. Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis. Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).
- Henriksen, K., et al. A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts. Bone. 51 (3), 353-361 (2012).
- Gigout, A., et al. Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).
- Reker, D., et al. Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).
- Karsdal, M. A. Introduction. Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , Academic Press. New York. (2016).
- Heinegård, D., Saxne, T. The role of the cartilage matrix in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).
- Karsdal, M. A., et al. Osteoarthritis– a case for personalized health care? Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).
- Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet? Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Goldring, M. B., Goldring, S. R.
- Karsdal, M. A., et al. The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments? Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).
- Genovese, F., Karsdal, M. A. Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers. Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).
- Gudmann, N. S., et al. Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes. International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).
- Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. Unloading results in rapid loss of TGFβ signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGFβ signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype? Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).
- Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).
- Wang, B., et al. Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments. BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).
- Bay-Jensen, A. C., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM—Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis. Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).
- Lories, R. J., Luyten, F. P.
