Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר בידוד ו-culturing של הסחוס לאקצמחים מן הברכיים של הפרה. שיטה זו מספקת כלי קל ונגיש כדי לתאר שינויי רקמה בתגובה גירויים ביולוגיים או רומן therapeutics מיקוד המפרק.
Abstract
לשעבר מערכות תרבות vivo לכסות מגוון רחב של ניסויים המוקדש ללמוד רקמות ותפקוד הסלולר בסביבה מקורית. סחוס הוא רקמה ייחודית חשוב לתפקוד הנכון של משותפת אמתחת והוא היווה על ידי מטריקס מסחטות צפופה (ecm), עשיר פרוטאוגליקן וקולגן סוג II. כונדרוציטים הם סוג התא היחיד הנמצא בתוך הסחוס הם נפוצים יחסית נמוך במספר. גירויים חיצוניים שהשתנו ואיתות סלולרי יכולים להוביל לשינויים בקומפוזיציה ובהתדרדרות של ECM, שהם סימנים פתולוגיים חשובים במחלות כגון אוסטיאוארתריטיס (OA) ודלקת מפרקים שגרונית.
Vivo לשעבר הסחוס מודלים לאפשר 1) הפרופילים של כchondrocyte שינויים בתיווך של מחזור רקמות הסחוס, 2) מדמיין את הרכב ECM הסחוס, ו 3) כchondrocyte הסידור מחדש ישירות ברקמה. יצירת פרופילים של שינויים אלה בתגובה לגירויים או טיפולים הם בעלי חשיבות גבוהה בהיבטים שונים של ביולוגיה של הסחוס, ומשלימים את הניסויים במבחנה בתוך כונדרוציטים מבודדים, או מודלים מורכבים יותר בבעלי חיים בהם התנאים הניסיוניים קשה יותר לשלוט בהם
Explants סחוס להציג שיטה בקלות ונגיש עבור הערכת שיפוץ רקמות ב ECM הסחוס בהגדרות לשליטה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול עבור בידוד ו culturing חיות הסחוס הפרה החיה. השיטה משתמשת ברקמה מן הברך הפרה, אשר נגיש בקלות מן הבוצ המקומי. ניתן לנתח הן את האקסוצמחים והן את אמצעי התרבות הממוזג כדי לחקור מחזור רקמות, הרכב ECM, ותפקוד כchondrocyte, ובכך ליצור פרופילים של אפנון ECM.
Introduction
כונדרוציטים לייצר ולתחזק את מטריצת הסחוס. כדי ללמוד את הביולוגיה של כונדרוציטים וכיצד הם ו-ecm המקיפים מגיבים לגירויים חיצוניים, חשוב לחקור אותם בסביבתם הטבעית1,2. לימוד מחזור רקמות הסחוס חשוב להגדיל את ההבנה של המנגנונים הבסיסיים במחלות משותפות כגון OA, מחלה שאין כרגע מחלה שינוי הטיפול. כתוצאה מכך, יש צורך משמעותי במודלים תרגום2.
האפיון vivo Ex של השפעות התאים והרקמה הוא חיוני כדי להשלים מודלים קדם קליניים אחרים, הן בתוך מבחנה, כגון תרבויות מונאולייר כונדרוגיה, ובvivo, כגון מודלים OA המושרה או מודל דלקת מפרקים אוטואימונית המושרה (CIA ). מחקרים רבים הדגישו את ההבדלים בין כיצד תאים להתנהג בתרבויות 2d מונאולייר ומבנים תלת-ממדיים או ברקמה הטבעית שלהם3,4. תאים רבים בשכבות דו-ממדיות לאמץ מורפולוגיות לא טבעיות, כולל הבדלים של קוטביות התא והחזקה רקמות, וכתוצאה מכך הן הבדלים חזותיים ופונקציונליים בתאים בתוך רקמות יליד5. ההבדלים גם ברור בפונקציונליות של התאים, אשר עשוי לנוע ביטוי חלבון, המוביל דפוסי בידול עמוק שונה, מכונות רגולציה, ופונקציונליות תא5,6,7 ,8.
ECM הסחוס מורכב בעיקר מסוג II קולגן מתן מסגרת מטריצה, וצובר, פרוטנוגליקן המסייע לשמור על הנוזלים בתוך הרקמה. מולקולות אחרות של מטריקס כגון קולגן סוג IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronectin, הסחוס oligomeric חלבון (COMP), biglycan, קישוט, ו perlecan הם גם הנוכחי9.
בעוד זה של OA נשאר ברור10,11, התחלתה של המחלה הוא האמין להיגרם על ידי חוסר איזון במחזור רקמות ותהליכי תיקון12,13. השפלה של הסחוס הפרקולארית הוא סימן ההיכר של OA. הסחוס-תושב כונדרוציטים או תאים ברקמות הסובבות להגדיל את שחרורם של ציטוקינים, עירור הייצור הגבוה של פרוטטינוסים כגון מטריקס מטאלוסים (MMPs) ו-מוספים, אשר להגדיל את השפלה של ECM הסחוס 14. השפלה זו גורמת לשחרורו של שברי חלבון ייחודיים קטנים המכונים ניאו-אפיסקופים, שניתן לכמת בסרום, בשתן או בתרבות בינונית-15. עם היווצרות והתבגרות של קולגן, שברים שנקרא גם profragments הם שוחרר; אלה ניתן לכמת כמדד של ייצור מטריקס16.
מטרת פרוטוקול זה היא להקים מודל הסחוס vivo ex כדי להשוות את ההשפעה של גירוי ו/או טיפול בסמים על מחזור רקמות ECM. מחזור סחוס הוא הפרופיל על ידי מדידת מטריקס-נגזר בסמנים ניאו-אפירופה באופן ישיר במדיום התרבות הממוזגת באמצעות אליסה: AGNx1 (המשקף פעילות צובר), C2M (המשקף פעילות MMP מטריצה), ו ProC2 (המשקף סוג II קולגן מבנה). הממצאים יכולים להיות מאומת על ידי כתמים היסטולוגית של ECM, אשר גם לדמיין את הארגון של כונדרוציטים ב explants בודדים. הפרוטוקול המתואר ניתן להשתמש כדי לבדוק את ההשפעה של טיפולים חדשניים על הפונקציה כchondrocyte ומחזור ECM הסחוס. מספר מחקרים השתמשו explants הסחוס לתאר תהליכים ביולוגיים או את ההשפעה של התערבות על explants האתגר cytokine באמצעות היסטולוגית כמותית או אימונוהיסטויוכימיים גישות, mRNA, ביטוי חלבון, או פרוטאומניקס2 ,17,18. עם זאת, פרוטוקולים אלה נמצאים מחוץ לטווח של כתב היד הנוכחי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בידוד רקמות
- לחיזוי רקמות
- לבצע את כל הרקמות לחיזוי המקטע מחוץ מכסה הזרימה למינארי בסביבה אספטי.
- מתוך המטבחיים המקומי, לקבל מפרק הברך החדש של השור מוסרי המפרק מעגלים בין 1.5 ו 2 שנים של גיל.
- בעדינות לנתח את הברך העגל על ידי הסרת הבשר העודף, חשיפת הקונדיקלס, מניסקוס, הגידים, ו קרום אמתחת. חותכים את הגידים ואת קרום אמתחת, לאפשר את המפרק לפירוק. להסיר את המנסקוס. כדי לחשוף את הירך
- לבודד explants מאזור הנושאת העומס של condyles הירך באמצעות אגרופן ביופסיה 3 מ"מ ולשחרר אותם מן המשטח הפרקיות חיתוך עם אזמל מקביל וקרוב לעצם subchondral ככל האפשר. המבנה הקשה של העצם הsubchondral צריך להבטיח כי explants אינם מכילים מטריצה מסויד. שואפים לאקסוצמחים בגובה אחיד.
- מיד לאחסן ולערבב את האקסוצמחים ב-DMEM/F12-גלוטמקס + 1% P/S תרבות בינונית בצינור 50 mL או צלחת פטרי. אין לערבב הרחבות של ברכיים פרה שונים, אבל לשמור בנפרד עבור כל מחקר.
- רקמת רקמה
- להעביר את הexplants לצלחת 96-באר סטרילי במכסה זרם למינארי.
- שטוף את האקסוצמחים 3 פעמים במדיום התרבות או PBS ותרבות אותם ב-200 μL של התרבות בינונית לכל הטוב עד תחילת הניסוי. השתמש בתקופה כשלון של 1 יום כדי לסנכרן פעילות תאית ביופסיה ושחרור בסמנים פסיבי.
- תרבות האקסוצמחים עד 10 שבועות בחממה 37 ° c עם 5% CO2. מניחים את כל המשכפלת בתוך כל קבוצה באלכסון בלוח התרבות כדי למזער את הווריאציה הנגרמת על ידי אידוי. כדי למנוע התאיידות נוספת של סופרנטאנט, הוסיפו את ה-PBS לבארות החיצוניות של לוחית התרבות.
2. הסחוס לחקור את הטיפול והערכה של פעילות מטבולית
- שינוי בינוני בתרבות וטיפול
- לשנות את מדיום התרבות כל 2-3 ימים במכסה של זרם למינארי.
- אם מיישמים טיפולים כלשהם, הכינו אותם לפני שינוי המדיום. הכינו את הטיפולים לריכוז המבוקש של בארות ההסבר באמצעות דילול במדיום התרבותי.
- להסיר בעדינות את הסופרנטאנט מכל באר ולהעביר אותו לצלחת חדשה 96 היטב. לאחסן את הסופרנטנט עם איטום על-גבי 20 ° צ' לניתוח ביוסיבי של מחזור רקמות וביטוי חלבון.
- מיד להוסיף 200 μL של מדיום תרבות טרייה או טיפול לכל טוב. אל תתנו לאקסוצמחים להתייבש במהלך השינוי הבינוני ולהבטיח כי כל האקסוצמחים הם שקוע לחלוטין במדיום החדש.
- מכתים מחדש
- מדידת פעילות מטבולית פעם בשבוע כמדידה עקיפה של הכדאיות בתאים. הבדיקה resazurin היא דרך קלה להעריך אם הפעילות המטבולית של האקסוצמחים מתדרדר לחקור בודדים בשל מוות תאים או שינויים סלולריים. Explants בינוני בתרבות בלבד יש resazurin יציב יחסית לקרוא במהלך תקופת הניסוי.
- הפוך פתרון בינוני תרבותי עם 10% resazurin.
- לקצור את סופרנטנט כפי שמתואר בשלב 2.1.3.
- לטבול את explants ב 10% resazurin פתרון עבור 3 h ב 37 ° צ' או עד הסופרנטנמלים להפוך סגול. כלול 4 בארות ללא explants כפקדי רקע.
- העבר את השליטה הממוזגת והרקע resazurin לצלחת microtiter שחור ולמדוד פלואורסצנט ב 540 הריגוש ננומטר/590 ננומטר פליטה.
- לשטוף ביסודיות 3 פעמים בתוך התרבות בינונית או PBS ולהטביע את explants בינונית לשטוף עבור 5-10 דקות כדי לאפשר resazurin כדי לנטרל לחלוטין את. הוסיפו מדיום תרבות או טיפולים חדשים במידה ונעשה בהם שימוש.
3. הפסקת הסיום, קיבוע והאחסון לדוגמה
- הפסקת תקופת הקולטיורינג
- מדוד את פעילות חילוף החומרים כמתואר בשלב 2.2. הוסף 200 μL של PBS לכל טוב.
- קיבוע ואחסון
- להסיר את ה-PBS, להוסיף 200 μL של פורמלדהיד לכל טוב, ולהשאיר 2 h בטמפרטורת החדר.
- להיפטר פורמלדהיד ולהוסיף 200 μL של PBS לכל טוב. לכסות את הצלחת עם איטום קלטת, ולאחסן ב 4 ° c עבור ניתוח היסטכימית. אנו ממליצים לבצע אנליזה היסטכימית בתוך 3 חודשים.
4. ביוסמנים למחזור רקמות (אליסה)
- אליאס תחרותי
- מעיל streptavidin-צלחת עם מטרה מיוחדת ביוטילת היעד-פפטיד מדולל 1:100 במאגר הסגולי (100 μL לכל טוב) עבור 30 דקות ב 20 ° c.
- לשטוף 5 פעמים עם מאגר כביסה רגיל ולהוסיף לדוגמה-supernatant (20 μL לכל טוב) יחד עם נוגדן חד שבטיים העיקרי נגד היעד-פפטיד מדולל 1:93.3 עבור ProC2 ו 1:100 במאגר הקבוע עבור AGNx1 (100 μL לכל טוב) ו דגירה עבור 2 h ב 20 ° c עם טלטול עבור ProC2 ו-3 h ב -20 ° c עבור AGNx1.
הערה: עוצמת הדגימה מתבצעת ישירות מלוחות הסופרנטאנט המאוחסנים. אם הריכוז הנמדד מחוץ לטווח המדידה, מדלל את הסופרנטנט בצלחת דילול בעלת התחתית ב-PBS או במאגר התקשוב. - לשטוף 5 פעמים עם מאגר כביסה רגיל הדגירה עם peroxidase-משני המסומנים נוגדן מדולל 1:100 במאגר משנה (100 μL לכל טוב) עבור 1 h ב 20 ° c.
- לשטוף 5 פעמים עם מאגר כביסה רגיל מקרין עם טלטול עבור 15 דקות בחושך ב 20 ° c עם טטרמתילבנזיל (TMB) כמצע peroxidase (100 μL לכל טוב).
- סיים את התגובה עם פתרון עצירה סטנדרטית, 0.1 M H2SO4 (100 μl לכל טוב).
- קרא את תגובת הצביעה ב-450 בספיגת ננומטר באמצעות ספיגת התייחסות ב-650 nm בקורא לוחית מעבדה סטנדרטי.
- מדידת מחזור רקמות הסחוס ב-סופרנטנט תחרותי
הערה: הדבר מכמת את C2M.- מעיל streptavidin-צלחת עם מטרה מיוחדת ביולוגית היעד-פפטיד מדולל 1:100 בתוך מאגר הנתון (100 μL לכל טוב) עבור 30 דקות ב 20 ° c.
- לשטוף 5 פעמים עם מאגר כביסה ולהוסיף לדוגמה-supernatant יחד עם 100 μL של נוגדן חד שבטיים peroxidase נגד היעד מטרה-פפטיד מדולל 1:100 במאגר הטיפול (20 μL לכל טוב). דגירה של 20 h ב 2 – 8 ° צ' עם רעד.
הערה: עוצמת הדגימה מתבצעת ישירות מלוחות הסופרנטאנט המאוחסנים. אם הריכוז הנמדד מחוץ לטווח המדידה, מדלל את הסופרנטנט בצלחת דילול בעלת התחתית ב-PBS או במאגר התקשוב. - לשטוף 5 פעמים עם מאגר כביסה רגיל הדגירה עם טלטול עבור 15 דקות בחושך על 20 ° צ' עם TMB כמו מצע peroxidase (100 μL לכל טוב).
- סיים את התגובה עם פתרון עצירה סטנדרטית, 0.1 M H2SO4 (100 μl לכל טוב).
- קראו את תגובת הצביעה ב-450 בספיגת ננומטר עם ספיגת הפניות ב-650 nm בקורא לוחית מעבדה סטנדרטית.
- AGNx1
- מודד מדידת שחרור על ידי מדידה של שחרורו של AGNx1 ניאו-אפירופה. זו מטרה מתחרה עקיפה מטרות ה-מסופים (NITEGE373) שנוצרו על ידי adamts-4 ו-5 מחשוף. הנוגדן החד-שבטיים מזהה את כל הקטעים עם אפיבגיה חשופה. הפרטים הניסיוניים של המנה פורסמו במקומות אחרים19.
- ProC2
- מכמת סוג II היווצרות קולגן על ידי מדידת שחרורו של profragment של קולגן סוג II. זו שיטת ה-דיאגנוסטיקה התחרותית בעקיפין מטרות האפיפיטיות של הפרופפטיד של PIIBNP (QDVRQPG) שנוצר על ידי N-propep, במהלך קיצוץ של קולגן מסונתז סוג II החדש. הפרטים הניסיוניים של המנה פורסמו במקומות אחרים16.
- C2M
- מכמת סוג II השפלה קולגן על ידי מדידת שחרורו של רסיס ניאו אפירופה C2M. זו אליסה תחרותי ישירה מזהה את הפפטיד C-מסוף של MMP (KPPGRDGAAG1053). השיקול הזה שונה מ AGNx1 ו ProC2 כפי שהוא הנוגדן העיקרי כי הוא peroxidase מתויג וכך, משמש גלאי. הפרטים הניסיוניים של המנה פורסמו במקומות אחרים20.
5. ניתוח היסטולוגית
- הסתננות, הטבעה וגזירה
- מניחים את האקסוצמחים המתויגים (ראו שלב 3.2) לקלטות המסומנות באופן אינדיבידואלי. כלול גם תווית בתוך קלטות הקלטת והתווית כדי להבטיח זיהוי.
- העבר את הקלטות המכילות הרחבות למכונת מעבד רקמות. לאחר מכן לחדור את explants עם פרפין בסדרה של התייבשות ו הסתננות שלבים החדירה.
- מייבשים עם 96% אתנול עבור 90 דקות עם התאמת טמפרטורה. חזור על שלב זה 3 פעמים.
- נקה את אתנול עם טולואן עבור 90 דקות ללא התאמת טמפרטורה. חזור על שלב זה 2 פעמים.
- נקה את אתנול עם טולואן עבור 90 דקות ב 60 ° c.
- לחדור עם פרפין שעווה עבור 30 דקות ב 60 ° c.
- לחדור עם פרפין שעווה עבור 60 דקות ב 60 ° c.
- לחדור עם פרפין שעווה עבור 90 דקות ב 60 ° c.
- עבור כל שלב, להוסיף את הפתרונות לתוך התא לדוגמה עם המשאבה איטית-out ו-משאבה זורם תחת 33-34 kPa. הפעל את תהליך החדירה בתוך לחץ/מחזור ואקום עם ואקום מקסימלית של-65 עד 70 kPa.
- בעקבות חדירה, למקם את הקלטות על בלוק החימום כדי לאפשר הסרה זהירה של explants מתוך הקלטת. להטביע בעדינות את הצמחים החדרו לתוך גושי פרפין בודדים. עם מלקחיים מחומם, המקום explants עם הסחוס שטחי שטחית הצדדים subchondral עצם בניצב על פני השטח חיתוך, להבטיח ויזואליזציה של שכבות הסחוס שונים בתוך כל מקטע הדגימה.
- גזור 5 יקרומטר סעיפים של מקורר פרפין בלוקים עם explants מוטבעים על מיקרוטומה. העבירו את הקטעים החתוכים לאמבט מים קרים. במקרה הצורך, ניתן להפריד בין מקטעים באמצעות אזמל או כיסוי זכוכית.
- באמצעות שקופית זכוכית בלתי מצופה, העבירו את הסעיפים לאמבט מים חמים (50 ° c), שם מתגלמים הסעיפים. הרם כל קטע אל שקופית כיסוי עם תווית ומקום על צלחת חמה במשך 30 דקות.
- מניחים את השקופיות בסל ו-הדגירה ב 60 ° c עבור 1 h ולאחר מכן לשמור אותם לילה ב 37 ° c. להלן, אחסן שקופיות במכלים סגורים ב-4 ° צ' עד לצביעת.
- מכתים ויזואליזציה של ירוק Safranin O/מהיר
- מניחים את השקופיות כדי להיות מוכתם בסל ו מוד, את השקופיות ב 60 ° c עבור 1 h.
- להכין ולסנן את כל ריאגנטים עם פילטר 0.45 מ"מ.
- כהכנה לצביעת, יוצקים את הריאגנטים המסונן בספלים לאמצעי אחסון המאפשר לפתרונות לכסות את השקופיות לחלוטין בעת מיזוג הסל. הספלים בשימוש נדרש נפח של 250 mL כדי לכסות את השקופיות.
- מיזוג השקופיות מומסת על ידי שוקע הסל ב טולואן עבור 10 דקות פעמיים, 99% אתנול עבור 2 דקות פעמיים, 96% אתנול עבור 2 דקות פעמיים, ו 70% אתנול עבור 2 דקות פעמיים. ואז, מימה את השקופיות במים עבור 2 דקות.
- הכתם את מגלשות הגופות והנוזלים באמצעות מיזוג הסל בתמיסת המטאוקסילין של וייגרט (pH 1.5) במשך 10 דקות, טבול ב-1% HCl פעם אחת, ושטוף עם מי ברז זורמים למשך כ -5 דקות או עד ששטף את הצבע העודף.
- הבא, כתם ב 0.05% הפתרון הירוק מהיר (pH: 5.75) עבור 5 דקות, לטבול ב 1% CH3cooh פעם, והכתם ב 0.1% Safranin O (pH: 6.5) עבור 20 דקות.
- מייבשים ולנקות את השקופיות על ידי לטבול פעמיים ב 70% אתנול, 96% אתנול עבור 2 דקות פעמיים, 99% אתנול עבור 2 דקות פעמיים, ו טולואן 2 דקות פעמיים.
- הר מגלשות זכוכית ללא ציפוי עם מדיום שרף המכסה את שקופיות היסטולוגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הרחבות של שור עומק מלא היו מבודדים, מתורבתים ומטופלים במשך 3 שבועות (איור 1). המדיום התרבותי השתנה עם תוספת טיפול 3 פעמים בשבוע. פעם בשבוע, פעילות מטבולית נמדדה על ידי שיטת resazurin. ביוארקרס של מחזור ECM נמדדו על הסופרנטנט שנקטפו מלוח התרבות 3 פעמים בשבוע. Explants חולקו 4 קבוצות לטיפול: 1. אונסטטין M ו-TNFα (O + T); 2) + T + GM6001 (GM6001); 3) אינסולין כמו פקטור גדילה -1 (IGF-1); ו-4) שליטה ללא טיפול (w/o).
. פעילות מטבולית
עבור כל ארבע הקבוצות, פעילות חילוף החומרים היה יציב יחסית לאורך 3 שבועות (איור 2א). הייתה נטייה IGF-1 להגדיל את פעילות מטבולית מעט מעל קבוצת w/o ועבור קבוצות O + T כדי להקטין אותו. שיטת הפעולה resazurin שימש בקלות להעריך את הפעילות של כונדרוציטים בכל ההסבר וכלה בעקיפין להעריך את הכדאיות של התא מבלי לחלץ הרחבות מהניסוי. אם ההסבר מראה ירידה משמעותית בפעילות המטבולית במהלך הניסוי, ניתן להוציא את ההסבר מניתוח נוסף.
. טיפול Catabolic
O + T הוחל 3 פעמים בשבוע כדי בארות התרבות לחקור את השפלה הסחוס O + T-תיווך (איור 3, איור 4). MMP-מתווכת סוג II השפלה קולגן וצובר-בתיווך צובר השפלה העריכו על ידי C2M ו AGNx1 אליאס. O + T מוגברת סוג II השפלה קולגן מימים 7-21 (איור 3a) ו-צובר השפלה מימים 3-14 (איור 4א) לעומת קבוצת w/o. בעת הוספת GM6001 (הספקטרום הרחב MMP-מעכב) בשילוב עם טיפול O + T, השחרור O + T-תיווך C2M נחסם (איור 3א, ב). שחרור AGNx1 ירידה נצפתה בעת הוספת GM6001 בימים 3-7, אבל הפסגות שחרור AGNx1 ביום 10 ברמות דומות לקבוצת O + T (איור 4א), המציין את GM6001 רק פוחתת השפלה במידה מוגבלת. דפוס זה ב AGNx1 ו C2M לשחרר הוא התמונה הכללית נצפתה במודל הסחוס השור מגורה עם O + T. ראשית, AGNx1 משתחרר מיום 3 ופסגות בימים 10-14, המייצג השפלה מוקדמת של הצובר. הבא, לאחר 2 שבועות של culturing עם O + T, השפלה קולגן סוג II נצפתה כפי שנמדד על ידי C2M הסמנים.
. טיפול אנבוליים
כדי לחקור כיצד גירוי אנבוליים מודולים את מחזור ECM הסחוס, אינסולין כמו צמיחה פקטור -1 (IGF-1) הוחל 3 פעמים שבועי כדי הפרה עומק מלא של השור. ההשפעה של IGF-1 על האקסוצמחים הסחוס נצפתה בעיקר על המידות של היווצרות קולגן סוג II, המשוער על ידי ProC2, כצפוי גירויים אנבוליים (איור 5). יום 0 במודל זה תמיד מציג מדידות ProC2 גבוהות, אולי כתגובה להפקת דגימות. רמות גבוהות אלה מפחיתים באופן משמעותי וגבוהות מימים 7-21. כאשר מטפלים עם IGF-1, רמות ProC2 ירידה פחות מאלה שנצפו בקבוצה w/o, המציינת כי IGF-1 מעוררת היווצרות קולגן סוג II מיום 7 (איור 5ב). הגרפים של ProC2 מציגים גם את הווריאציה הביולוגית של פרות. Explants משתי פרות שימשו ניסויים אלה עם 6 explants לכל פרה לכל קבוצה. הפרה הראשונה היה סחוס עבה יותר שנוצר explants גדולים, וכתוצאה מכך רמות ProC2 גבוהה יותר בבסיס, בעוד הפרה השנייה היה קטן יותר עם סחוס דק יותר, וכתוצאה מכך רמות ProC2 נמוכות יותר בבסיס. עבור w/o, IGF-1, ו-O + T קבוצות, רמות ProC2 מתואר מייצגים את הממוצע של explants משתי הפרות, אבל GM6001 נמדד רק בפרה השנייה עם הרחבות דק יותר. לפיכך, הקבוצה GM6001 החלה עם רמות ProC2 נמוכות יותר ביום 0, אשר ניכרת באזור ProC2 תחת העקומה () (איור 5ג). נורמליזציה של ערכי ProC2 ליום 0 הרמות מקבלת את השונות הביולוגית בחשבון, ובכך מראה את יעילות הטיפול (איור 5ב, ד).
Safranin O ו-מהיר גרין היסטולוגית stainings בוצעו כדי להמחיש את התוכן פרוטאוגליקן ומבנה הסחוס של ההסבר לאורך כל הניסוי (איור 6). בימים 0, 7, 14, ו -21, explants מן w/o, IGF-1, ו-O + T הקבוצה היו מקובעים לצביעת היסטולוגית (איור 6). W/o ו IGF-1 הקבוצה הופיעו בעוצמה דומה Safranin O כתמים ליום 0 לחקור לאורך כל הניסוי, אשר מתואם עם תוצאות ביואריקר מראה כי אף אחת משתי הקבוצות גדל AGNx1 release (איור 4). הטיפול עם O + T הביא פרוטאוגליל משמעותי הפסד תוכן ביום 7 והפסד מוחלט ביום 21. יתר על כן, עוצמת מכתים ירוק מהיר פוחתת מימים 14-21, המציין אובדן קולגן ביישור עם תוצאות C2M.
איור 1: סקירה סכמטית של שיטת הסחוס של השור.
ביום-1 הייתה מבודדת הירך של שור שהיה מבודד ממקום המוסר האחוריות. עומק מלא הסחוס לפני שוחררו מתוך condyles עם בלוטה אזמל וביופסיה. האקסוצמחים שחולצו נשטפו והועברו לצלחת התרבות 96 היטב סטרילי. ביום 0, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19, 21, הסופרנטאנט נקצרו מלוח התרבות, הועבר לצלחת אחסון, ושמרו על 20 ° c, כפי שמודגם בשלב השינוי הבינוני 1. Supernatant מאוחסן מאוחר יותר הופקרה עבור מדידה של מחזור רקמות ביורים על ידי מסוים אליסה assays. בשלב שינוי בינוני 2, לאחר הסרת הסופרנטאנט, בינונית תרבותית חדשה המכילה את הטיפולים השונים או לא הוחל טיפול בהסרת שליטה. ביום 0, 7, 14, ו 21, האקסוצמחים היו מודבטים עם 10% resazurin פתרון עבור 3 h לאחר איסוף הסופרנטאנט. 10% resazurin supernatant הועברה צלחת שחורה 96-באר שבו התגובה הצביעה נמדד. בארות התרבות נשטפו 3 פעמים לפני בינוני תרבות חדש עם או בלי טיפול התווסף האקסוצמחים כפי שמוצג בשלב שינוי בינוני 2. ביום 21, לאחר הקציר של סופרנטאנט מדידה resazurin, explants היו מקובעים על ידי דגירה עם פורמלדהיד עבור 2 h. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פעילות מטבולית הנמדדת על ידי resazurin.
שור הסחוס עומק מלא הידרוצמחים היו מבודדים ומתורבתים במשך 3 שבועות. בינוני התרבות שונה עם תוספת של טיפול חדש 3 פעמים בשבוע (n = 12 explants מ 2 פרות). הטיפול כללה IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL], ו O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. קבוצת שליטה ללא טיפול (w/o) נכללה. עבור w/o, IGF-1, ו-O + T הקבוצה, שגיאה ממוצע וסטנדרטי של ממוצע (SEM) של 12 משכפל מ 2 פרות (6 שכפול לכל פרה) מוצגים. עבור הקבוצה GM6001, הממוצע ו-SEM של 6 משכפל מ 1 פרה מוצגים. (א) פעילות מטבוליתהנמדדתעל ידי resazurin. (ב) אזור מתחת לעקומה (ב) במשך ימים 0-21 עבור גרפים של פעילות מטבולית המוצגת ב (א). p > 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השפלה קולגן סוג II נמדד על ידי C2M.
שור הסחוס עומק מלא הידרוצמחים היו מבודדים ומתורבתים במשך 3 שבועות. בינוני התרבות שונה עם תוספת של טיפול חדש 3 פעמים בשבוע. הטיפול כללה IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL], ו O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. קבוצת שליטה ללא טיפול (w/o) נכללה. עבור w/o, IGF-1, ו-O + T קבוצות, ממוצע ו-SEM של 12 משכפל מ 2 פרות (6 משכפל לכל פרה) מוצגים. עבור הקבוצה GM6001, הממוצע ו-SEM של 6 משכפל מ 1 פרה מוצגים. (א) C2M מדידות. רמת המובהקות הסטטיסטית של w/o חושבה על ידי מדדים חוזרים (RM) שתי כיוון ANOVA עם מבחן השוואה מרובה של Sidak. (ב) אוק לימים 0-21 עבור C2M גרפים המוצגים ב (א). משמעות סטטיסטית חושבה על ידי מבחן קרוקל-ווליס עם מבחן ההשוואה המרובים של דאן. p > 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: צובר השפלה נמדדת על ידי AGNx1.
שור הסחוס עומק מלא הידרוצמחים היו מבודדים ומתורבתים במשך 3 שבועות. בינוני התרבות השתנה עם תוספת של טיפול חדש 3 פעמים בשבוע. הטיפול כללה IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL], ו O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. קבוצת שליטה ללא טיפול (w/o) נכללה. עבור w/o, IGF-1, ו-O + T הקבוצה, ממוצע ו-SEM של 12 משכפל מ 2 פרות (6 משכפל לכל פרה) מוצגים. עבור הקבוצה GM6001, הממוצע ו-SEM של 6 משכפל מ 1 פרה מוצגים. (א) AGNx1 מדידות. רמת המובהקות הסטטיסטית של w/o חושבה על-ידי ANOVA 2-way של RM עם מבחן השוואה מרובה של Sidak. (ב) אוק לימים 0-21 עבור AGNx1 גרפים המוצגים ב (א). משמעות סטטיסטית חושבה על ידי מבחן קרוקל-ווליס עם מבחן ההשוואה המרובים של דאן. * *p > 0.01, * * *p > 0.001, * * * *p > 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: היווצרות קולגן סוג II נמדד על ידי ProC2.
שור הסחוס עומק מלא הידרוצמחים היו מבודדים ומתורבתים במשך 3 שבועות. בינוני התרבות שונה עם תוספת של טיפול חדש 3 פעמים בשבוע. הטיפול כללה IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL], ו O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. קבוצת שליטה ללא טיפול (w/o) נכללה. עבור w/o, IGF-1, ו-O + T הקבוצה, ממוצע ו-SEM של 12 משכפל מ 2 פרות (6 משכפל לכל פרה) מוצגים. עבור הקבוצה GM6001, ממוצע ו-SEM של 6 משכפל מ 1 פרה מחדש הראו. (א) ProC2 מדידות מימים 0-21. (ב) ProC2 ערכים המנורמלות ליום 0 עבור כל מארב בודד. התוצאות ProC2 לעתים קרובות להפיק תועלת מיום 0 נורמליזציה לחשוף את אפקט הטיפול שעשוי להיות מוסווה על ידי רמות ביואריקר גבוה ביום 0. ב- A ו- B, רמת המובהקות הסטטיסטית חושבה על-ידי ANOVA 2-way של RM עם מבחן השוואה מרובה של sidak. (ג) אוק לימים 0-21 עבור ProC2 גרפים המוצגים ב (א). (ד) אוק לימים 0-21 ליום 0 ProC2 גרפים מנורמל המוצגים ב (ב). בדו - ממד, החשיבות הסטטיסטית חושבה על ידי מבחן קרוקאל-ווליס עם מבחן ההשוואה המרובים של דאן. * *p > 0.01, * * *p > 0.001, * * * *p > 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: הדמיה היסטולוגית לתוכן פרוטאוגליל על ידי Safranin O/מהיר ירוק כתמים.
שור הסחוס עומק מלא הידרוצמחים היו מבודדים ומתורבתים במשך 3 שבועות. בינוני התרבות שונה עם תוספת של טיפול חדש 3 פעמים בשבוע. הטיפול כללה IGF-1 [100 ng/mL] ו-OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL]. קבוצת שליטה ללא טיפול (w/o) נכללה. ביום 0, 7, 14, ו 21, explants היו מקובעים, חדרו עם פרפין, מוטבע פרפין, חתוכים, הניח על שקופיות כיסוי, ומוכתם עם המטאוקסילין, Safranin O, ו-Fast Green. לכל קבוצת טיפולים ולכל נקודת זמן, מוצג ההסבר הנציג. Scalebar המוצג במדגם הבסיסי (יום 0) מייצג 200 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המוצג כאן עבור הפרופיל של מחזור רקמות הסחוס בתוך הסחוס בתאי הפרה יכול לשמש לאפיון השפעות הטיפול של סוגים רבים של תרופות, כולל מעכבי של מסלולים תאיים, מעכבי של אנזימים פרוטנוגד חרדה, או גורמי גדילה אנבוליים.
שני הכיוונונים שונים תוארו בפרוטוקול זה: התקנה אנבוליים שבו explants היו מגורה עם מקדם צמיחה כמו אינסולין 1 (IGF-1), ו catabolic ההתקנה הכוללת גירוי עם TNF אלפא ו אונסטטין M, שבו מחזור רקמות יכול להיות עכבות באמצעות מעכבי MMP רחב ספקטרום. התפוקה העיקרית בשיטה זו היא כימות הסמנים הניאו-אפיטטים ישירות במדיום הממוזג, הנקצרו לאורך כל תקופת התרבות. מספר סמנים ניתן למדוד ב-supernatant, המאפשר פרופיל סימולטני של תהליכים catabolic שונים ואנבוליים באותה דוגמית. מכתים היסטולוגית עם Safranin O/מהיר גרין שימש כדי לאמת את הממצאים מהניתוח ביוארקר. אונסטטין M, TNF-alpha, ו IGF-1 שימשו כדי לתאר את הפרוטוקול; עם זאת, השיטה אינה מוגבלת לגירוי מסוים בציטוקין, וניתן להחליף אותן בקלות לאחרים בהתאם להשערה או לטיפול במבחן.
פרשנות של פלט ביוארקר הוא תרגיל זמני עקב שינויים דינאמיים בפונקציה כchondrocyte ופרופילי ביטוי עם גירוי אנבוליים או catabolic לאורך זמן. ב explants מטופל, סוג II היווצרות קולגן נמדד על ידי ProC2 בסמנים במהירות פוחתת בתוך הראשון 7-10 ימים. גירוי עם IGF-1 או גורמי גדילה דומים שומר ProC2 release במדיום הממוזג ברמה דומה לבסיס; לפיכך, הירידה היא הדרגתית יותר, והשחרור הוא גדל יחסית האקסוצמחים לא מטופלות. בכיוונון catabolic, ציטוקינים פרו דלקתיים לגרום לביטוי מוגבר של הפרוטסים על ידי כchondrocyte בימים 0-14; זה מורכב בעיקר של מצביסים. זה גורם לעלייה גדולה הראשונית של שברי חלבון נגזרות, כולל AGNx1. בשלבים מאוחרים יותר של התרבות, כונדרוציטים לבטא MMPs יותר, אשר מסיע את שחרורו של הסמנים מיוצר MMPS, כגון C2M, בסביבות יום 14 ואילך. כך, על מנת לפרופיל את ההשפעה של טיפול, חשוב למדוד סמנים בתוך מרווח הזמן הנכון.
כפי שמתואר, טיפול עם ציטוקינים דלקתיים כגון קוקטייל O + T יגרום השפלה רקמת הסחוס לאורך זמן. המאגר הכולל של ECM מוגבל על-ידי גודל ההסבר ויש להתייחס אליו בעת ניתוח פרופיל הסמנים. כתוצאה מכך, לאחר העלייה הראשונית בשחרור ביוארקר, הרמות עשויות להצטמצם עם הזמן פשוט בשל הפחתת הכמות הנותרת של ECM.
בעבר, OA נחשב בעיקר מחלה של הסחוס העיקרי. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה עולה כי OA צריך להיות מוצג כמחלה של המפרק כולו, שם שינויים מוקדמים הקשורים המחלה בתאים משותפים בודדים, synovium, עצם, סחוס, מתרחשים במקביל, ולאורך זמן התוצאה כישלון משותף12 ,21. לכן חשוב להכיר כי במערכת מודל זו, הסחוס מבודד משאר המפרק (ואורגניזם), הגבלת ההשפעה של השפעות אינטראקציה רקמות וגורמים מערכתית שעשויים לווסת הומאוסטזיס של הרקמה. במקום זאת, זוהי תרבות רקמה אחת פשוטה, שבה תנאים שבשליטת ניסויים יכולים להיות מאופטים כדי לזהות שינויים פתולוגיים או התערבותית ברקמה באמצעות טכניקות ביוכימיות, סמנים, או הדמיה היסטולוגית. בשל הארכיטקטורה של סחוס, וריאציה בתא מספר, הרכב מטריצה, וריאציה הסכום צפוי הן בין explants בין מקורות הרקמה. מכיוון שההיקף היחסי של התפוקה הביוארינקר עשוי להיות שונה בין ניסויים, מומלץ לנרמל ערכות נתונים להשוואה טובה יותר.
כדי להבטיח את הווריאציה הקטנה ביותר והתוצאות הטובות ביותר, חשוב להשתמש בסחוס מברכיים כי הם טריים ככל האפשר, רצוי בין 1 ל -24 שעות לאחר שוחט. בידוד של רקמת סחוס צריך להיעשות בצורה הומוגנית עם explants להיות בערך בעובי זהה. Explants צריך להיות מבודד מאזורים של סחוס סמיך, הימנעות האזורים הקרובים ביותר לאמצע. הרקמה תמיד צריכה להיות לחה כדי להימנע ממוות תאים ופירוק מטריצה. אורך הניסוי3, הזמן בין שינויים בינוניים, תזמון גירוי cy, ומרווחי הטיפול ניתן לכוונן כדי להתאים את המצב המשומן של פעולה של מתחם או מנגנון הפרט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CST, ACBJ ו MK הם עובדים של Bioscience הנורדי. ל-ACBJ ולח יש מניות בביומדע הנורדי. לשאר הסופרים אין מה לגלות.
Acknowledgments
המחברים מודים לצוות הטכני ב-נורדי Bioscience לתמיכה במעבדות, וכן בקרן המחקר הדנית לתמיכה כללית במחקר שלנו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45% Iron(III) chloride solution | Sigma-Aldrich | 12322 | |
| Acetic acid | Merck | 1.00056.2500 | |
| Alamar Blue | Life tech Invitrogen | DAL1100 | |
| Biopsy processing cassettes – green | IHCWORLD | BC-0109G | |
| Biopsy punch W/Plunger (3 mm) | Scandidat | MTP-33-32 | |
| Bovine cartilage (Bovine knees) | Local slaughterhouse | ||
| C2M | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Corning 96-well plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Cover Glass Ø 13 mm | VWR | 631-0150P | |
| DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES | Gibco | 31331-028 | |
| Ethanol ≥96% | VWR | 83804.36 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | 83813.36 | |
| exAGNx1 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| exPRO-C2 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Formaldehyde solution 4% | Merck | 1004965000 | |
| GM6001 | Sigma-Aldrich | M5939-5MG | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 30721-M | |
| IGF-1 | Sigma-Aldrich | I3769-50UG | |
| Oncostatin M | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Pertex (mounting medium for light microscopy) | HistoLab | 811 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S2255 | |
| Sterile Standard Scalpels | Integra Miltex | 12-460-451 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 30743 | |
| SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides | Thermo scientific | J1800AMNT | |
| TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA-100 | |
| Toluene | Merck | 1.08327.2500 | |
| Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax | TPP | 99955 |
References
- Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).
- Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. Targets, models and challenges in osteoarthritis research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).
- Reker, D., et al. Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18). Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).
- Kjelgaard-Petersen, C., et al. Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis. Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).
- Henriksen, K., et al. A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts. Bone. 51 (3), 353-361 (2012).
- Gigout, A., et al. Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).
- Reker, D., et al. Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).
- Karsdal, M. A. Introduction. Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , Academic Press. New York. (2016).
- Heinegård, D., Saxne, T. The role of the cartilage matrix in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).
- Karsdal, M. A., et al. Osteoarthritis– a case for personalized health care? Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).
- Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet? Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Goldring, M. B., Goldring, S. R.
- Karsdal, M. A., et al. The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments? Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).
- Genovese, F., Karsdal, M. A. Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers. Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).
- Gudmann, N. S., et al. Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes. International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).
- Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. Unloading results in rapid loss of TGFβ signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGFβ signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype? Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).
- Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).
- Wang, B., et al. Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments. BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).
- Bay-Jensen, A. C., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM—Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis. Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).
- Lories, R. J., Luyten, F. P.
