Summary
Her er protokoller for isolering av cyanobacterial utgitt karbohydrat polymerer og isolering av deres exoproteomes er beskrevet. Begge prosedyrene legemliggjøre viktige skritt for å få polymerer eller proteiner med høy renhet grader som kan brukes for videre analyse eller programmer. De kan også enkelt tilpasses i henhold til spesifikke brukerbehov.
Abstract
Cyanobakterier kan aktivt skille ut et bredt spekter av biomolekyler inn i ekstracellulære miljø, slik som heteropolysaccharides og proteiner. Identifisering og karakterisering av disse biomolekyler kan forbedre kunnskapen om deres sekresjon trasé og bidra til å manipulere dem. Videre er noen av disse biomolekyler også interessante når det gjelder bioteknologisk applikasjoner. Beskrevet her er to protokoller for enkel og rask isolering av cyanobacterial utgitt karbohydrater polymerer og proteiner. Metoden for isolering av frigitte karbohydrat polymerer er basert på konvensjonelle nedbørs polysakkarider teknikker i vandige oppløsninger ved hjelp av organiske løsemidler. Denne metoden bevarer egenskapene til polymer og samtidig unngår tilstedeværelsen av forurensninger fra celle rusk og kultur medium. På slutten av prosessen, den lyofilisert polymer er klar til å brukes eller karakteriseres eller kan utsettes for ytterligere runder av rensing, avhengig av den endelige tiltenkte bruk. Når det gjelder isolering av cyanobacterial exoproteome, er teknikken basert på konsentrasjonen av celle-fri medium etter fjerning av de store forurensninger av sentrifugering og filtrering. Denne strategien gjør det mulig for pålitelig isolering av proteiner som når det ekstracellulære miljøet via membran transportører eller ytre membran blemmer. Disse proteinene kan senere identifiseres ved hjelp av standard masse massespektrometri teknikker. Protokollene som presenteres her kan brukes ikke bare til et bredt spekter av cyanobakterier, men også til andre bakterielle stammer. Videre disse prosedyrene kan lett skreddersys i henhold til den endelige bruken av produktene, renhet grad nødvendig, og bakteriell belastning.
Introduction
Cyanobakterier er allment anerkjent som produktive kilder av naturlige produkter med lovende bioteknologisk/biomedisinsk applikasjoner. Derfor, forståelse cyanobacterial sekresjon mekanismer og optimalisering av utvinning/utvinning metoder er avgjørende for å implementere cyanobakterier som effektive mikrobielle celle fabrikker.
Mange cyanobacterial stammer er i stand til å produsere ekstracellulære polymer stoffer (EPS), hovedsakelig dannet av heteropolysaccharides, som forblir knyttet til celleoverflaten eller slippes ut i mediet1. Disse frigitte karbohydrater polymerer har forskjellige funksjoner i forhold til de fra andre bakterier, som gjør dem egnet for et bredt spekter av applikasjoner (f. eks, antivirale midler2, immunostimulatory3, antioksidant4, metall-chelaterande5, emulgering6, og legemiddellevering agenter7,8). Metodikk for isolering av disse polymerer bidrar i stor grad ikke bare til økt utbytte, men også til økt renhet og de spesifikke fysiske egenskapene til polymer oppnådd9. Et stort flertall av disse metodene for isolering av polymerer stole på nedbør strategier fra kulturen medium som er lett oppnås på grunn av polymer sterke anioniske natur9,10. I tillegg kan fjerning av løsemidler som brukes i nedbørs trinnet raskt oppnås ved fordampning og/eller lyophilization. Avhengig av den forutsett anvendelse, ulike trinn kan kobles enten etter eller før polymer nedbør for å skreddersy det endelige produktet, som inkluderer Trekloredikksyre acid (TCA) behandling, filtrering, eller størrelse eksklusjon kromatografi (SEC) kolonne rensing10.
Cyanobakterier er også i stand til å skille ut et bredt spekter av proteiner gjennom stier avhengig av membran transportører (klassisk)11 eller mediert av blemmer (ikke-klassisk)12. Derfor analyse av cyanobacterial exoproteome utgjør et viktig verktøy, både for å forstå/manipulere cyanobacterial protein sekresjon mekanismer og forstå den spesifikke ekstracellulære funksjon av disse proteinene. Pålitelig isolering og analyse av exoproteomes krever konsentrasjonen av ekstracellulære miljø, siden overflod av utskilles proteiner er relativt lav. I tillegg kan andre fysiske eller kjemiske tiltak (f.eks. sentrifugering, filtrering eller protein nedbør) optimere kvaliteten på exoproteome, berike proteininnholdet13, og unngå tilstedeværelsen av forurensninger (f.eks. pigmenter, karbohydrater, etc.) 14 priser og priser , 15 eller overvekt av intracellulære proteiner i prøvene. Noen av disse trinnene kan imidlertid også begrense settet med proteiner som kan oppdages, noe som fører til en partisk analyse.
Dette arbeidet beskriver effektive protokoller for isolering av frigitte karbohydrat polymerer og exoproteomes fra cyanobakterier kultur medier. Disse protokollene kan enkelt tilpasses til studiet spesifikke mål og brukerbehov, og samtidig opprettholde de grunnleggende trinnene som presenteres her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cyanobacterial utgitt karbohydrat polymer isolasjon
-
Polymer isolering og fjerning av forurensninger
- Dyrke cyanobacterial belastning under standard forhold [f. eks, 30 ° c under en 12 h lys (50 μE m− 2s− 1)/12 h Dark regime, med orbital risting ved 150 RPM]. Mål vekst ved hjelp av standardprotokoller [f. eks optisk tetthet ved 730 NM (OD730nm), klorofyll a, tørr-vekt, etc.], og deretter måle produksjonen av frigitte polysakkarider i henhold til fenol-svovelsyre metode16.
- Overfør kulturen til dialyse membraner (12-14 av molekylvekt cut-off) og dialyze mot et minimum av 10 volumer med deionisert vann i 24 timer med kontinuerlig omrøring.
Merk: avhengig av kultur volumet til dialyze og medium sammensetning, kan det være nødvendig å skifte dialyse vann. - Sentrifuger kulturen på 15 000 x g i 15 min ved 4 ° c. Overfør supernatanten til et nytt hetteglass og kast pellet (celler).
- Sentrifuger igjen ved 20 000 x g for 15 min ved 4 ° c for å fjerne forurensninger som cellevegg rusk eller LIPOPOLYSACCHARIDES (LPS).
- Overfør supernatanten til et glass beger og kast pellet.
-
Nedbør av polymer
- Tilsett 2 bind med 96% etanol til supernatanten.
- Ruge suspensjonen ved 4 ° c, minst over natten.
- Polymer utvinning
- For små eller ikke synlige mengder av utløst polymer: sentrifuger suspensjonen ved 13 000 x g i 25 min ved 4 ° c. Kast supernatanten og resuspend pellet i 1 mL eller 2 mL autoklaveres deionisert vann. Overfør den vandige suspensjonen til et hetteglass.
FORSIKTIG: supernatanten skal kastes forsiktig, da det kan bli lett resuspendert. - For synlige/store mengder av utløst polymer: samle den igangsatte polymer med steril metall tang til et hetteglass. Klem polymer og kast overflødig etanol.
- For små eller ikke synlige mengder av utløst polymer: sentrifuger suspensjonen ved 13 000 x g i 25 min ved 4 ° c. Kast supernatanten og resuspend pellet i 1 mL eller 2 mL autoklaveres deionisert vann. Overfør den vandige suspensjonen til et hetteglass.
- Valgfritt: avhengig av graden av polymer rensing nødvendig, gjentar du nedbørs trinnet med 96% etanol etter blanding av polymerer i deionisert vann.
-
Lyophilization av polymer
- Oppbevar hetteglassene med den igangsatte polymer ved-80 ° c, minst over natten.
- Frys-tørr (lyophilize) i polymer i minst 48 h (ikke la suspensjonen tine før fryse-tørking).
- Oppbevar tørket polymer ved romtemperatur (RT) inntil videre bruk.
Merk: lagring av polymer i en desikator er tilrådelig, da det kan absorbere vann over tid.
2. Cyanobacterial exoproteome isolasjon
-
Middels konsentrasjon
- Dyrke cyanobakterier under standard forhold [f. eks, 30 ° c under en 12 h lys (50 μE m− 2s− 1)/12 h Dark regime, med orbital risting ved 150 RPM]. Overvåk cyanobacterium vekst ved hjelp av standard prosedyrer (f. eks, OD730nm, klorofyll a, tørr-vekt, etc.).
- Sentrifuger kulturene på 4 000 x g, for 10 min ved RT.
- Overfør supernatanten til en kolbe og kast celle pellet.
- Filtrer det dekantert mediet gjennom et filter i størrelse på 0,2 μm pore.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her for en kort tidsperiode, hvis mediet oppbevares ved 4 ° c. - Konsentrer mediet ca 500x (vurderer det opprinnelige volumet av filtrert medium), ved hjelp av sentrifugal konsentratorer med en nominell molekylvekt cut-off av 3 kDa. Sentrifugering skal betjenes med 4 000 x g (maks 1 t per sentrifugering runde) ved 15 ° c.
Advarsel: for de fleste konsentrat Brands må filterenheten skylles av sentrifugering med ultrarent vann før bruk. Når filteret er vått, ikke la det tørke ut. La det være nok væske på reservoaret når enheten ikke er i bruk.
Merk: det kan være nyttig å redusere sentrifugering temperatur til 4 ° c Hvis målet er å studere protein aktivitet, men det vil øke tiden som er nødvendig for prøve konsentrasjon. Protokollen kan stanses midlertidig mellom sentrifugering trinn for korte tidsperioder Hvis mediet oppbevares ved 4 ° c. - Skyll veggene i prøve reservoaret med konsentrert prøve og Overfør innholdet til et mikrosentrifugen rør.
- Utfør en ekstra vask trinn av filteret enheten prøve reservoaret med autoklaveres kultur medium for å sikre maksimal exoproteome utvinning.
Merk: for å kvantifisere prosentandelen av utvinningen, følg den spesifikke produsentens instruksjoner. - Oppbevar exoproteome prøvene ved-20 ° c inntil videre bruk.
Merk: tilsetning av protease hemmere anbefales for langtidslagring.
-
Analyse av exoproteome
- Kvantifisere proteininnholdet ved BCA protein analysen i 96-brønn plate i henhold til produsentens instruksjoner.
- Skill proteinene ved natrium natriumdodecylsulfat sulfat-polyakrylamid gel elektroforese (SDS-side), ved hjelp av standard farge protokoller (f. eks, Coomassie blå, sølv farging).
- Skjær ut band/gel områder av interesse og samle dem i ulike mikrosentrifugen rør som inneholder egnede volumer av ultra-rent vann.
- Fortsett med identifisering og analyse av proteiner ved masse massespektrometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skjematisk fremstilling av metoden beskrevet for å utvinne frigitte karbohydrat polymerer fra cyanobacterial kulturer er avbildet i figur 1. Igangsatte polymerer fra den moderate EPS-produsenten cyanobacterium Synechocystis Sp. PCC 6803 og den effektive EPS-produsenten CYANOTHECE Sp. CCY 0110 er vist i figur 2. I Figur 3, lyofilisert polymerer med ulike grader av forurensning er vist, fremhever viktigheten av sentrifugering trinnene for det endelige produktet renhet. Figur 4 viser isolasjons metoden for cyanobacterial exoproteome. Distinkte celle frie medium konsentrerte prøver (dvs. innhentet fra kulturer i ulike vekstfaser og fra en cyanobacterial stamme med lavere karotenoid produksjon) er vist i figur 5. Exoproteome prøver fra to morfologisk distinkte cyanobacterial stammer, encellede cyanobakterier Synechocystis Sp. PCC 6803 og trådformede cyanobakterier ANABAENA Sp. PCC 7120, ADSKILT av SDS-Page, vises i Figur 6.
Figur 1 : Arbeidsflyt for isolering av cyanobacterial utgitt karbohydrater polymerer. Starter fra cyanobacterial kultur og fjerning av forurensninger og slutter med polymer isolasjon og lyophilization. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Cyanobacterial polymerer etter nedbør. (A) polymer fra MODERAT EPS produsent Synechocystis sp. PCC 6803 på veggen av sentrifuge flasken etter nedbør og sentrifugering (piler). (B) polymer klumper fra den effektive EPS-produsenten CYANOTHECE Sp. CCY 0110 flytende i glass begeret etter nedbør. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Lyofilisert cyanobacterial polymerer. (A) tre uavhengige partier av polymerer isolert fra Synechocystis sp. PCC 6803: uten synlig forurensning (AI), og med pigmentering indikasjon på forurensning med karotenoider (alle) eller celle rusk (Aiii) . (B) lyofilisert polymer fra CYANOTHECE Sp. CCY 0110. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Arbeidsflyt for cyanobacterial exoproteome isolasjon. Fra cyanobacterial kultur til middels separasjon og konsentrasjon, slutter med exoproteome analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Mikrosentrifugen rør med konsentrerte celle frie medium prøver. (A) konsentrerte medium prøver fra Synechocystis sp. PCC 6803 vill-type, samlet på forskjellige OD730nm (0,5, 1 og 2). (B) konsentrert medium prøve fra Synechocystis ∆sigF, en mutant med nedsatt karotenoider produksjon15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Coomassie Blue-BEISET SDS-Page gels som viser proteiner akkumulert i cyanobacterial celle frie konsentrert medium. (A) Exoproteome fra encellede cyanobakterier SYNECHOCYSTIS Sp. PCC 6803 vill-type og ∆sigF mutant. (B) Exoproteome fra Synechocystis ∆sigF forurenset med høye nivåer av polysakkarider. (C) Exoproteome fra trådformede cyanobacterium ANABAENA Sp. PCC 7120. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For bedre å forstå bakteriell sekresjon mekanismer og studere frigitte produkter, er det av ekstrem viktighet å demonstrere effektiv isolasjon og analyse av biomolekyler stede i ekstracellulære bakterielle miljøet (for eksempel utgitt karbohydrater polymerer og proteiner).
Cyanobacterial ekstracellulære karbohydrat polymerer er svært komplekse, hovedsakelig på grunn av antall og andel av ulike monosakkarider som utgjør deres sammensetning1. Den konvensjonelle metoder som brukes for isolering av disse polymer stoffer stole på det enkle konseptet at disse sukker-rike stoffer er løselig i vandige løsninger og kan igangsettes ved tilsetning av organiske løsemidler (for eksempel aceton eller etanol)9 ,17,18. Dette skjer på grunn av utvinning av vannmolekyler fra polymerer hydration skjell, og effektiviteten av prosessen avhenger egentlig på polymer molekylvekt (mer effektiv på høyere molekylvekt fraksjoner), kjemisk struktur, og konsentrasjon9,18. I tillegg til nedbørs trinnet, inneholder metoden som er beskrevet her, de kritiske trinnene i dialyse og sentrifugering. Dialyse vil effektivt fjerne salter og andre forbindelser fra mediet, som kan vises etter lyophilization som pulver-lignende strukturer, mens de sentrifugering trinnene vil fjerne store forurensninger og celle rusk.
Svikt i disse trinnene kan føre til polymerer med høy forurensning nivåer og ulike egenskaper, avhengig av isolasjon batch. Noen forurensninger kan lett oppdages makroskopisk etter polymer lyophilization, siden de vil endre polymer pigmentering (vanligvis hvit eller lys brun). For eksempel, lyofilisert polymerer som er grønne eller oransje er generelt svært forurenset med celle rusk/klorofyll eller karotenoider. Dette er relatert til utilstrekkelig tid eller g Force i sentrifugering trinn. Men, noen cyanobacterial stammer kan frigi pigmenter og skiller ut proteiner som forblir naturlig forbundet med polymerer, og dette må vurderes ved analyse av det endelige produktet19. Ytterligere tiltak kan legges til ytterligere rense polymerer (for eksempel TCA behandlinger)10. Likevel, disse rensing trinnene kan også ha en negativ innvirkning på det endelige produktet, som fjerner proteiner og andre komponenter kan endre polymer egenskaper (f. eks, viskositet, hydrofobisiteten, etc.) 1 den andre , 20. Even gjenta nedbør/lyophilization trinnene kan negativt påvirke polymerer, hovedsakelig på grunn av fryse-tine sykluser som enkelt endrer sine fysikalsk egenskaper21. For å forbedre polymer gir, kan oppvarming behandlinger brukes til hele kulturer før nedbør. Dette ekstra trinnet frigjør polymer assosiert med celleoverflaten, men det kan også føre til depolymerisering. Oppsummert er det viktig å legge merke til at valget av protokollen vil påvirke både mengden og kvaliteten på isolerte polymerer9,20.
Når det gjelder cyanobacterial proteiner identifisert i ekstracellulære miljøet, viser de et bredt spekter av molekylære vekter og isoelectric punkter og kan være enten løselig eller membran-assosiert. Dette mangfoldet av fysikalsk egenskaper representerer et problem for valg av den mest egnede metoden for exoproteome isolasjon. Metoden som presenteres her avhenger sterkt av konsentrasjonen av biomolekyler i ekstracellulære miljøet. Denne metoden isolerer ikke bare proteiner som utskilles i mediet, men også proteiner tilstede i ytre membran blemmer (OMVs) og avledet fra cellelyse. Derfor bør sentrifugering trinn utføres forsiktig for å unngå celleforstyrrelser, men samtidig samle OMVs. I cyanobacterial stammer som er effektive OMVs produsenter, exoproteome preparater er vanligvis oransje på grunn av tilstedeværelsen av karotenoider forbundet med disse lipidic strukturer14,15. Denne funksjonen kan imidlertid variere betydelig avhengig av cyanobacterial belastning og vekstfase. For å vurdere bidrag av proteiner ved OMVs, ultracentrifugation trinn bør legges til prosedyren22. I tillegg kan proteiner som når ekstracellulære plass på grunn av cellelyse, oppdages ved å samle prøver i ulike vekstfaser og øke antall replikeres.
Som nevnt, ettersom mange cyanobacterial stammer produserer ekstracellulære karbohydrat polymerer (EPS), kan exoproteome preparater også ha EPS i komposisjonen. Filtreringstrinnet skal beholde mer komplekse og store LOO, men enklere EPS-fraksjoner kan til slutt passere gjennom. Følgelig kan forurensning med store mengder karbohydrater forstyrre exoproteome analyse. For eksempel kan dette forurensning forårsake en forsinkelse i protein separasjon i polyakrylamid gels, samt maskere mindre rikelig proteiner. Alternative protokoller har blitt foreslått for exoproteome isolasjon sikte på å fjerne forurensende biomolekyler tilstede i ekstracellulære medium, men de har vist å være svært selektiv, noe som kan føre til partisk exoproteome profiler13. På den annen side, kan en viss mengde proteiner være fanget i mer komplekse EPS fraksjoner hvis de sitter fast i filteret. I dette tilfellet kan det å analysere exoproteome preparater fra ulike vekstfaser/eksperimentelle forhold og analyse av proteinene i EPS-fraksjoner bidra til å identifisere de fanget proteinene.
Overall, protokollene beskrevet her legemliggjøre de avgjørende skritt for effektiv isolering av cyanobacterial utgitt karbohydrater polymerer og exoproteomes. Viktigst, de kan enkelt skreddersys i henhold til bestemte brukerbehov og inkluderer andre bakterielle stammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Fundo Europeu de Desenvolvimento regionale (FEDER) midler gjennom KONKURRER 2020-Operacional program for konkurranseevne og internasjonalisering (POCI), Portugal 2020, og av portugisiske midler gjennom FCT-Fundação para a Ciência e en Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino overlegen innen rammen av prosjektet POCI-01-0145-FEDER-028779 og Grant SFRH/BD/99715/2014 (CF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA - Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
References
- Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
- Kanekiyo, K., et al. Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme. Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).
- Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis. Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).
- Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).
- Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition. Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).
- Han, P. P., et al. Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).
- Leite, J. P., et al. Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins. Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).
- Estevinho, B. N., et al. Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12. Powder Technology. 343, 644-651 (2019).
- Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).
- Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).
- Costa, T. R., et al. Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).
- Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications. Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).
- Sergeyenko, T. V., Los, D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).
- Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
- Flores, C., et al. The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).
- Parikh, A., Madamwar, D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).
- Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides. Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).
- Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. Marine Glycobiology. , CRC Press. 343-358 (2016).
- Nguyen, A. T. B., et al. Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt. Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).
- Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup. International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).
- Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).
