Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En Mikrofluidic-platform med flere lag til overledning af forlænget celle frit genekspression

Published: October 6, 2019 doi: 10.3791/59655
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 2, 3, 1,2
1Institute for Complex Molecular Systems, Department of Biomedical Engineering, Computational Biology Group, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Molecules and Materials, Radboud University, 3Institute of Bioengineering, School of Engineering École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

Summary

Fremstillingsprocessen af en PDMS-baseret, flerlags, mikrofluidisk enhed, der tillader in vitro transkription og oversættelse (ivtt) reaktioner, der skal udføres over længere perioder er beskrevet. Desuden gives der en omfattende oversigt over den hardware og software, der kræves for at automatisere og vedligeholde disse reaktioner for længerevarende varigheder.

Abstract

Begrænsningerne af celle-baseret syntetisk biologi bliver stadig tydeligere, da forskerne har til formål at udvikle større og mere komplekse syntetiske genetiske regulerende kredsløb. Analysen af syntetiske genetiske reguleringsnetværk in vivo er tidskrævende og lider under manglende miljøkontrol, med eksogene syntetiske komponenter, der interagerer med værts processer, hvilket resulterer i uønsket adfærd. For at overvinde disse problemer, celle-fri karakterisering af nye kredsløb er ved at blive mere udbredt. In vitro transskription og oversættelse (IVTT) blandinger tillader regulering af forsøgs miljøet og kan optimeres for hvert unikt system. Protokollerne præsenteres her detaljer fremstilling af en flerlags mikrofluidisk enhed, der kan udnyttes til at opretholde ivtt reaktioner for længerevarende varigheder. I modsætning til batch reaktioner, hvor ressourcer er opbrugt over tid og (af-) produkter akkumuleres, brugen af mikrofluidisk enheder giver mulighed for genopfyldning af ressourcer samt fjernelse af reaktionsprodukter. På denne måde er det cellulære miljø emuleret ved at opretholde en out-of-ligevægt miljø, hvor den dynamiske opførsel af genkredsløb kan undersøges i længere tid. For fuldt ud at udnytte den flerlags mikrofluidisk enhed, hardware og software er blevet integreret for at automatisere ivtt reaktioner. Ved at kombinere ivtt reaktioner med den mikrofluidisk platform præsenteret her, bliver det muligt at omfattende analysere komplekse netværk adfærd, fremme vores forståelse af de mekanismer, der regulerer cellulære processer.

Introduction

Celler er i stand til at fornemme og reagere på deres omgivelser ved hjælp af komplekse dynamiske regulerende netværk1,2. Feltet af syntetisk biologi udnytter vores viden om de naturligt forekommende komponenter, der omfatter disse netværk til ingeniør biologiske systemer, som kan udvide funktionaliteten af cellerne3,4. Omvendt er det også muligt at fremme vores forståelse af de naturlige netværk, der styrer livet ved at designe forenklede, syntetiske analoger af eksisterende kredsløb eller ved fremad-Engineering biologiske systemer, som udviser naturligt forekommende adfærd. De Novo engineering af sådanne biologiske systemer udføres på en bottom-up mode, hvor nye genetiske kredsløb eller signalveje er konstrueret på en rationel måde, ved hjælp af veldefinerede dele5,6. Kombinationen af den rationelle udformning af netværk med udformningen af biologisk relevante systemer gør det muligt dybdegående karakterisering og undersøgelse af biologiske reguleringssystemer med forskellige niveauer af abstraktion7.

De pioner værker af Elowitz og Leibler8 og Gardner et al.9 var de første til at demonstrere den vellykkede indførelse af syntetiske genetiske netværk i cellulære værter. I det følgende årti har talrige forskere fortsat med at bygge videre på disse første succeser på trods af fremkomsten af flere begrænsninger med hensyn til indførelsen af syntetiske kredsløb i cellerne7,10,11 ,12. Ideelt set bør indførelsen af syntetiske kredsløb i cellulære værter ske i en modulær måde. Desværre gør kompleksiteten af det cellulære miljø dette særligt udfordrende, med funktionen af mange dele og netværk er meget kontekstafhængige12,13,14. Som et resultat, netværk ofte oplever uønskede interaktioner med indfødte vært der som kan påvirke funktionen af syntetisk kredsløb. På samme måde kan komponenter i det udefrakommende netværk hæmme værts processerne, konkurrere om fælles ressourcer inden for værten og påvirke vækst kinetikken15,16,17. Med henblik på rationelt at udforme og forudsige adfærden af syntetiske net i et in vivo-miljø kræves der derfor en omfattende model af alle værts-og kredsløbs specifikke dynamikker18.

Et levedygtigt alternativ til brugen af cellulære værter til karakterisering af syntetiske net er anvendelsen af in vitro transkription og oversættelse (IVTT) teknologier. Som en test for syntetiske net udføres der reaktioner i opløsninger, som omfatter alle de komponenter, der er nødvendige for at muliggøre genekspression19,20,21. På denne måde skabes et biologisk relevant, omend kunstigt, miljø, inden for hvilket syntetiske net kan testes22,23,24,25,26, 27,28. En stor fordel ved at bruge IVTT løsninger er evnen til at udføre reaktioner under bruger-specificerede betingelser, med forskerne i stand til at tune den præcise sammensætning af hver reaktion2. Desuden, den celle-fri tilgang muliggør High-gennemløb afprøvning af syntetiske netværk, da det fjerner behovet for at udføre tidskrævende cellulære kloning trin. Som et resultat, varigheden af successive design-build-testcyklusser er væsentligt reduceret29,30,31,32. Design cyklussen kan accelereres yderligere ved at anvende celle frie kloningsteknikker såsom Gibson assembly til hurtigt at konstruere nye netværk, og ved at opbygge netværk fra lineære DNA-skabeloner, som-i modsætning til plasmider kræves til in vivo test- kan forstærkes via polymerase kædereaktioner (PCR)33,34.

Batch reaktioner er den enkleste metode, hvormed IVTT reaktioner kan udføres, kræver et enkelt reaktions fartøj, hvori alle reaktions komponenterne kombineres35. Sådanne reaktioner er tilstrækkelige til protein ekspression og grundlæggende kredsløb test endnu vise sig utilstrækkelige, når de forsøger at studere den langsigtede dynamiske opførsel af et netværk. I løbet af en batch reaktion er reagenserne enten udtømte eller underkastes nedbrydning, hvilket resulterer i et kontinuerligt fald i transskription og oversættelses rater. Endvidere, som reaktioner fremskridt biprodukter ophobes, der kan forstyrre-eller helt hæmme-den korrekte funktion af netværket. I sidste ende begrænser brugen af batch reaktorer den dynamiske adfærd, der kan iagttages, idet negativ regulering er særligt udfordrende at implementere5,36.

Alsidigheden af ivtt-systemer muliggør flere alternative metoder, som forlængede ivtt-reaktioner kan udføres, lige fra kontinuerlig flow til dråbe baserede metoder samt enklere dialyse tilgange2,30, 37,38,39,40. Anvendelsen af mikrofluidisk-enheder giver brugerne øget kontrol over deres reaktioner og samtidig øge gennemløb og minimere omkostningerne35,41,42, med hver specifik tilgang, der har sin egne fordele. Brugen af kontinuerlig flow kan nemt optimeres for at øge ekspression udbytter dog, den manglende evne til effektivt at fjerne specifikke reaktionsprodukter gør studiet af dynamisk opførsel ikke-triviel39. Mens anvender dråbe baserede mikrofluidisk systemer giver høj gennemløb screening af nye netværk, vanskeligheden ved at levere friske reagenser til reaktionen resulterer i dråberne ligner små volumen batch reaktioner43. Dialyse baserede reaktorer tillader indførelse af friske reagenser samt fjernelse af nogle reaktionsprodukter men, RNA molekyler og større proteiner ophobes i reaktoren, at være for stor til at sprede gennem membranen porer. Desuden kræves store mængder reagenser for at opretholde disse reaktioner i længere perioder30,44. I 2013 præsenterede maerkl et al. en multi-lags mikrofluidisk-anordning designet specielt til at udføre forlængede ivtt-reaktioner36,45. Brugen af flerlags mikrofluidiske enheder giver mulighed for direkte kontrol over væskestrømmen, hvilket giver mulighed for omdirigering af flow samt isolering af væske i specifikke områder af enheden46,47. Disse isolerede regioner kan fungere som uafhængige nanoliter-skala reaktions kamre, hvor IVTT reaktioner kan udføres. I løbet af en enkelt IVTT-reaktion anvendes periodiske injektioner af friske reagenser i reaktoren til genopfyldning af IVTT-komponenter og DNA-skabeloner. Samtidig forskydes en tilsvarende mængde af den gamle reaktions opløsning, hvorved reaktionsprodukter fjernes. På denne måde opretholdes en out-of-ligevægt miljø, hvor de basale transkription og oversættelse satser forblive i Steady-State, forlænge levetiden af IVTT reaktioner og giver rig dynamisk adfærd at forekomme. Ved at anvende denne fremgangsmåde, forskerne er i stand til at undersøge de kinetiske rater af de enkelte processer, der opstår inden for et bestemt kredsløb, medvirken i frem-engineering af nye genetiske netværk. For eksempel, niederholtmeyer et al. implementeret denne fremgangsmåde til at karakterisere forskellige elementer af en genetisk ring oscillator, fastsættelse af kinetiske satser heraf36. I yderligere undersøgelser viste Yelleswarapu et al., at de kinetiske rater af Sigma faktor 28 (σ28) bestemt under batch betingelser ikke var tilstrækkelige til at beskrive adfærden af en σ28-baseret oscillator, og at tilføjelsen af flow-baserede data forbedrede model forudsigelser af netværkets opførsel22.

Formålet med dette manuskript er at fremlægge en komplet protokol til fremstilling af flerlags mikrofluidiske enheder, der kan udføre langvarige IVTT-reaktioner. Desuden vil dette manuskript beskrive al den hardware og software, der kræves for at udføre forlængede IVTT-reaktioner. Aktivering af den mikrofluidisk enhed-nødvendig for at kontrollere strømmen af væsker deri-opnås ved hjælp af en serie af pneumatiske ventiler, der tilsluttes direkte til de mikrofluidisk enheder via længder af slanger. Til gengæld styres pneumatiske ventiler via en specialbygget virtuel kontrol grænseflade. Væskestrømmen i de mikrofluidiske anordninger opnås ved hjælp af kontinuerligt tryk, som leveres af et kommercielt tilgængeligt tryk reguleringssystem. IVTT-reaktioner udføres typisk mellem 29 °C og 37 °C, og en mikroskop inkubator anvendes til at regulere temperaturen under reaktionerne. Imidlertid nedbrydes funktionaliteten af IVTT-blandingen gradvist, når den opbevares over 4 °C. Som sådan vil dette manuskript ekspandere på off-chip kølesystemet bruges til at køle ivtt blandingen før injektion i mikrofluidisk enhed. Afslutningsvis giver dette manuskript et omfattende overblik over de procedurer, der er nødvendige for at kunne udføre længerevarende IVTT-reaktioner ved hjælp af en mikrofluidisk strømnings reaktor, således at andre forskere vil være i stand til at replikere denne teknologi med relative Lethed.

Protocol

1. fremstilling af wafer

Bemærk: vores protokoller er specifikke for 40 XT positive fotoresist og SU8 3050 negative fotoresist anvendes under denne forskning. Alternative fotoresist kan anvendes, men de specifikke spin hastigheder, bagnings temperaturer og bagetider vil variere. Det mikrofluidisk-enheds design, der leveres af niederholtmeyer et al.36 , er forbundet i tabellen over materialer.

  1. Placer to rene siliciumskiver (diameter 100 mm, < 1-0-0 > orienteret, 525 μm tykkelse) i en forvarmet ovn, der er indstillet til 250 °C, og lad waferne dehydrere natten over (~ 16 timer).
    Bemærk: det er også muligt at prime waferne ved hjælp af HMDS dampe deposition; Dette er dog ikke nødvendigt, hvis waferne er tilstrækkeligt dehydrerede.
  2. Fjern en silicium wafer fra ovnen og lad den køle af til stuetemperatur, før du fortsætter med spin belægningen. Påfør 3-4 ml af 40 XT fotoresist til midten af waferen.
  3. For at få en funktions højde på 25 μm skal du anvende følgende spin-protokol: spin for 20 s ved 500 rpm (110 rpm/s), Øg centrifugeringshastigheden til 3100 rpm (300 RPM/s) og hold her i 30 s, og decelerere wafer til 0 RPM med en deceleration på 200 rpm/s. ved hjælp af en mikrofibervæv Fjern forsigtigt enhver kant beading, som kan være forekommet under spin belægningen.
  4. Blød bage med to separate kogeplader indstillet til 70 °C og 120 °C på følgende måde: Lad waferen sidde ved 70 °C i 30 s. Derefter overføres waferen til 120 °C-kogepladen, og den kan hvile her i 3,5 min, før waferen returneres til 70 °C-kogepladen for yderligere 30 s. Fjern waferen fra kogepladen og – undgå pludselige temperaturchok – lad den køle af ved stuetemperatur.
  5. Placer strømnings laget Mask (emulsion side ned) på fotoresist-filmen og Udsæt waferen ved hjælp af en UV-lampe, indtil der opnås en total eksponering på 200 MJ/cm2 .
  6. Efter eksponering bage med to kogeplader (70 °C og 105 °C) på følgende måde: Lad waferen sidde ved 70 °C i 20 s, før waferen overføres til 105 °C-kogepladen, og efterlade den her til 40 s. Endelig returneres wafer til 70 ° c kogepladen for yderligere 20 s for at fuldføre post-Exposure bage.
  7. Lad waferen afkøle til stuetemperatur på en stak mikrofibervæv. Udvikle wafer ved at overføre det til en Petri skål fyldt med 726 MIF fotoresist udvikler til at starte udviklingsprocessen. Udviklingen accelereres, når den udføres på en stationære Shaker, og hele waferen er nedsænket i udvikleren.
  8. Skyl waferen med demineraliseret vand og brug et stereomikroskop til at kontrollere wafer-overfladen for alle fotoresist rester. Hvis fotoresist rester kan ses, derefter returnere wafer til udvikleren.
  9. Reflow den positive fotoresist ved at placere waferen på en kogeplade sat til 110 °c i 25 min. Denne proces vil resultere i afrundede funktioner samt udglødning eventuelle revner, der kan have optrådt under fremstillingsprocessen. Fortsæt med at silanize waferen som beskrevet i trin 1,17.
  10. Fjern den anden siliciumwafer fra ovnen, så den afkøles til stuetemperatur, før du fortsætter med spin belægningen. Påfør 5 ml SU8 3050 fotoresist til midten af waferen.
  11. For at få en funktions højde på 30 μm skal du anvende følgende spin-protokol: spin for 20 s ved 500 rpm (110 rpm/s), Øg centrifugeringshastigheden til 4.000 rpm (330 rpm/s) og hold her for 42 s, og decelerere wafer til 0 RPM med en deceleration på 200 rpm/s. ved hjælp af en mikrofibervæv Fjern forsigtigt enhver kant beading, som kan være forekommet under spin belægningen.
  12. Blød bages med to separate kogeplader (65 °C og 95 °C) på følgende måde: Lad waferen sidde ved 65 °C i 30 s. Derefter overføres waferen til 95 °C-kogepladen, og den kan hvile her i 14 minutter, før waferen returneres til 65 °C-kogepladen for yderligere 30 s. Fjern waferen fra kogepladen, og lad den køle af ved stuetemperatur.
  13. Mål intensiteten af UV-lampen før eksponering og bruge denne til at bestemme eksponeringen varighed kræves for at opnå en samlet eksponering dosering af 260 mJ/cm2. Anbring Mask (emulsion side ned) på fotoresist-filmen, og Placer waferen under UV-lyskilden. Udsæt waferen ved hjælp af en UV-lampe, indtil der opnås en total eksponering på 260 mJ/cm2 .
  14. Efter eksponering bage med to kogeplader (65 °C og 95 °C) på følgende måde: Lad waferen sidde ved 65 °C for 60 s, før waferen overføres til 95 °C-kogepladen, og efterlade den her i 4,5 min. returner waferen til 65 °C-kogepladen i yderligere 30 s for at fuldføre post-eksponering bage.
  15. Lad waferen afkøle til stuetemperatur på en stak mikrofibervæv. Udvikle wafer ved at overføre den til en Petri skål fyldt med mrDev-600 photodeveloper at starte udviklingsprocessen. Udviklingen accelereres, når den udføres på en stationære Shaker, og hele waferen er nedsænket i udvikleren.
  16. Waferen skylles med isopropanol, og der anvendes et stereomikroskop til at kontrollere wafer-overfladen for alle fotoresist rester. Hvis fotoresist rester kan ses, derefter returnere wafer til udvikleren. Når det er fuldt udviklet, hård bage fotoresist ved at placere wafer på en varm plade sat til 150 °c i 1 time.
  17. Silanize begge wafere at forhindre adhæsion af PDMS under Soft-litografi processer. For at udføre silanization, pipet 2-3 dråber (pr wafer) af silan i et lille hætteglas. Placer dette hætteglas sammen med waferne i en ekssikkator og træk vakuum i 5-10 min. Forsegl ekssikkator og lad waferne være under vakuum i en periode på 12 – 16 timer.
    Forsigtig: silan er giftigt og må ikke inhaleres. Vær forsigtig med at arbejde i en Røghætte og til at bære nitrilhandsker, når du håndterer SILANE. Dette omfatter placering af vakuumpumpen i røghætten, når der trækkes vakuum på desiccator.
  18. Frigør vakuum fra ekssikkator og fjern de silaniserede wafere. Skyl med vand og brug en damp af N2 til at tørre waferne. På dette tidspunkt wafere kan placeres i opbevaring indtil det kræves.

2. mikrofluidic enhed fabrikation

Bemærk: Soft-litografi proces, der anvendes til at fabrikere PDMS baserede flerlags mikrofluidisk enheder kan opdeles i tre forskellige trin: 1) PDMS forberedelse af både flow og kontrol lag, 2) justering og binding af de to PDMS lag, 3) den færdiggørelse af enheden.

  1. PDMS forberedelse
    1. Forbered to PDMS forløber løsninger ved at kombinere base og hærde midler i en plastikbæger og ved hjælp af en blande stang til at røre de to komponenter, indtil fuldt blandet. Kontrol laget kræver 20 g basis agent og 1 g Hærdningsmiddel (20:1 ratio). Gennemstrømnings laget kræver 40 g af basis agenten og 8 g af hærdnings midlet (5:1 ratio). Degas løsningerne i en desiccator.
    2. Placer strømnings laget wafer i en Petri skål og hæld 5:1 ratio PDMS blandingen over waferen. Degas PDMS for 30 min at fjerne luftbobler.
    3. Spin coat Control Layer wafer (tilberedt ved hjælp af den negative SU8 3050photoresist) med 20:1 ratio PDMS. Hæld 5-10 mL af PDM'ER på midten af waferen, og Kør følgende spin-protokol (Bevar den venstre over PDMS til senere brug): spin ved 500 rpm for 15 s (100rpm/s), Øg spin hastigheden til 1450 rpm (300 RPM/s) for 45 s og derefter decelerere waferen til 0 RPM (200 rpm/s).
    4. For at sikre en homogen PDMS-folie tykkelse skal PDMS-coatede wafer placeres på en plan overflade i en lukket Petri skål (for at undgå støvforurening). Lad waferen sidde i 30 min.
    5. Fjern strømnings laget fra ekssikkator og Placer både flow-og kontrollag i en ovn (80 °c). Helbrede begge lag for 28-30 min og fjerne, når PDMS er støbejern nok til at manipulere, mens de resterende lidt klæbrig. Fortsæt straks med justeringsprocessen.
  2. Justering og binding
    1. Brug en skalpel til at fjerne hver af de fire enheder fra PDMS på flowlayer wafer. Ved fjernelse af PDMS lag fra silicium wafer, straks dække funktionen side med Scotch tape for at undgå støv partikelforurening.
    2. Nogenlunde justere flow laget blokke på kontrol laget af øjet, placere funktionen side af enheden i kontakt med kontrollag PDMS. Derefter foretage fine justeringer af positionen af hver af flow laget blokke for at justere kanalerne i flow laget med kontrol lag kanaler, ved hjælp af et stereomikroskop til støtte i visualisering af justeringer.
    3. Påfør Tryk for at fjerne luftlommer mellem de to PDMS lag. Hæld den resterende 20:1 ratio PDMS gemt tidligere omkring de justerede flow lag blokke. Placer 100 g vægte på hver af enhederne for at sikre tilstrækkelig kontakt under bindingsprocessen.
    4. Returner de justerede enheder (inklusive vægte) til 80 °C ovnen og lad dem binde i mindst 1,5 h og ikke længere end 6 timer.
  3. Afslutning af enheden
    1. Fjern waferen fra ovnen og udtræk hver af de enkelte enheder fra kontrollag wafer, der dækker funktionen side af hver enhed med Scotch tape.
    2. Iterativt punch et enkelt hul for hver af de 9 flow lag indløb, 24 Control Layer kanal indløb, og den enkelte flow Layer Outlet af hver enhed. Punch enheden med funktionen side opad, ved hjælp af et kamera for at sikre huller er udstanset inden for funktionen grænser.
    3. For hver enhed rengøres et enkelt mikroskop-dias med isopropanol og acetone, og slidene tørres under en strøm af N2. Placer derefter mikroskop slidene på en kogeplade indstillet til 150 °C i 15 minutter.
    4. Brug oxygen plasma-foraskning til at binde PDMS-enhederne til glas diasene, og Anvend en strøm af 50 W til 45 s. Sørg for, at enhedens side vender opad, når du går ned. Når du er færdig, skal du placere enhedens funktion side ned på glaspladen og anvende Tryk for at fjerne fanget gas mellem overfladerne.
    5. Anbring de bundne anordninger på en kogeplade, der er indstillet til 110 °C i 1 h. vægte kan placeres oven på enhederne for at forbedre enhedens vedhæftning.

3. opsætning af hardware

Bemærk: for at opnå kontrol over de mikrofluidisk chips skal mange stykker hardware installeres og forbindes med hinanden. Der kræves tre særskilte grupper af hardware: 1) pneumatisk kontrolsystem til kontrol kanalerne, 2) en pneumatisk trykregulator til kontrol af strømmen af reaktions reagenserne i enheden og 3) et kølesystem til afkøling af IVTT-reaktions opløsningen før injektion i mikrofluidisk-enheden. Der findes en oversigt over hardware opsætningen i figur 1. Det skal bemærkes, at de protokoller, der gives her forsøge at være så generelt som muligt, men visse specifikke stykker af udstyr, der anvendes i hele vores forskning er refereret. Al hardware kan erstattes af alternativer i stand til at udføre den samme funktion. I sådanne tilfælde kan protokollerne her bruges til at skitsere de generelle trin, der er nødvendige for at opsætte systemet og kravene til hver af komponenterne. Alternative hardware opsætninger præsenteres af Brower et al.48 og White og Streets49.

  1. Pneumatisk kontrolsystem (Se figur 2)
    1. Opret en TCP-forbindelse mellem fieldbus-controlleren og bruger arbejdsstationen ved hjælp af producentens protokol. Brug Control software (leveres som supplerende filer) til at komponere MODBUS kommandoer, som sendes via TCP-forbindelse til controller, og aktivere magnetventiler.
    2. Udvid fieldbus-controlleren med otte 4-kanals digitale output moduler, en for hver magnetventil, der anvendes. Hver magnetventil præsiderer over en tilslutningsstift. Tilslut den positive ledning til en af de fire positive udgange på et af de digitale output moduler, mens den negative ledning forbindes til en af jord portene på de digitale output moduler.
      Bemærk: for at få systemet til at fungere korrekt skal magnetventiler tilsluttes systematisk, og den første magnet forbindes til den første udgangsport, den anden magnet til den anden udgangsport og så videre. I vores system anvendes to ventilsystemer med henholdsvis 8 og 22 magnetventiler. Output porte 1-8 Tilslut til 8-ventil array, og output-porte 9-30 Tilslut til 22-ventil array.
    3. Forbind begge ventilsystemer til en trykluft kilde ved hjælp af 1/4 "slange. Brug trykregulatorer til at indstille trykket af 22-ventil array til 3 bar, og 8-ventil array til 1 bar.
  2. Regulering af strømnings tryk (Se figur 3)
    Bemærk: for at flyde væsker gennemstrømnings laget på den mikrofluidiske enhed anvendes der en kommercielt tilgængelig 4-Ports trykregulator. Udgangstrykket for hver port reguleres via software, der leveres med trykregulatoren. Tilslut trykregulatoren til en computer ved hjælp af det medfølgende USB-stik.
    1. Tilslut trykregulatoren til en trykluft kilde for at sikre, at det medfølgende tryk ikke overskrider det maksimale tryk, der tillades af regulatoren.
    2. Tilslut en mandlig luer til 3/32 "Barb Connector til hver af de fire kvindelige luer Lock output porte af trykregulatoren. Tilslut en længde af bløde slanger (OD: 3 mm, ID: 1 mm, L: 10 cm) til modhager.
    3. Tilslut en anden mandlig luer til 3/32 "Barb Connector til den åbne ende af den bløde slange og fastgør dette til væskereservoir stikket porte.
    4. Brug den medfølgende software til at indstille det ønskede tryk på hver stikkontakt af strømningsregulatoren, og pres de reagenser, der er lagret i reservoirer, for at resultere i, at reagenserne strømmer ind i mikrofluidisk-enheden. Tilslutningen af reservoirer til mikrofluidisk-anordningen vil blive drøftet i afsnit 4,2.
  3. Opsætning af off-chip køling (Se figur 4)
    1. Brug PVC slange (OD: 10 mm, ID: 6 mm) til at forbinde vand-køling system til kold-plade vandblok ved hjælp af kompressionsfittings. Fyld væskebeholderen på vand kølings systemet med en kølervæske, og VIP forsigtigt enheden for at fortrænge enhver fanget luft og kontinuerligt tilføje kølevæske til reservoiret for at sikre, at den forbliver fuld. Når al gassen fjernes fra systemet, fyldes reservoiret til ca. 90-95% af den maksimale mængde.
    2. Coil PTFE Tubing (OD: 0,042 ", ID: 0,022") på den kolde ansigt af Peltier element og fastgør dette med tape. Sørg for, at den ene ende af PTFE-slangen er sluttet til reservoirerne i strømnings lags trykregulerings systemet (som beskrevet i punkt 4,3). Den anden ende af PTFE-slangen må ikke rage mere end 1 cm fra Peltier-overfladen. Indsæt en 5 – 10 cm længde på PEEK Tubing (OD: 0,794 mm, ID: 0,127 mm) i den fremspringende enden af PTFE-slangen. Fyldningen af slangen og tilslutningen til mikrofluidic-anordningen forklares yderligere i punkt 4,3.
    3. Placer det varme ansigt af Peltier-elementet på den kolde plade på vand blokken, og Anvend tilstrækkelig termisk forbindelse til de to ansigter. Sørg for, at slangen, Peltier-elementet og køle blokken er i direkte kontakt med hinanden på alle tidspunkter.
    4. Tilslut Peltier-elementet til temperaturregulatoren (via et serielt busstik), således at den spænding, der leveres til Peltier, kan reguleres. Placer en termistor på Peltier-overfladen, og Tilslut output til temperaturregulatoren. Efter at have tændt for vandkøleren, tilpasses den spænding, der leveres til Peltier, indtil temperaturen er stabil ved 4 °C.
      Bemærk: med denne opsætning styres Peltier-temperaturen manuelt ved at tilpasse den medfølgende spænding, mens termistor kun tjener til at overvåge temperaturen.

4. forberedelse af et eksperiment

Bemærk: før et forsøg påbegyndes, skal den mikrofluidiske anordning forberedes, og reaktions reagenserne skal indsættes i den korrekte slange til injektion i anordningen. Dette afsnit vil diskutere: 1) tilslutning af kontrol kanal slanger til enheden, 2) tilslutning af ukølede tilstrømning reagenser til enheden, og 3) tilslutning af afkølede tilstrømning reagenser til enheden.

  1. Tilslutning af styre kanalens slange
    1. For hver af kontrol kanalerne på den mikrofluidisk enhed, skæres en længde af slanger (OD: 0,06 ", id: 0,02"). I den ene ende indsættes PIN-koden på en 23 G, 1/2 "luer stub og i den anden indsætte en tilslutningsstift af rustfrit stål (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm).
    2. luer stub til en mandlig luer til 3/32 Barb nylon Connector. Indsæt modhager af konnektoren i en længde af polyurethan slange (OD: 4 mm, ID: 2,5 mm). Indsæt denne polyurethanslange direkte i en af Magnetventilerne.
    3. Fastgør en 23 G, 1/2 "luer stub til en sprøjte og Indsæt dette i et kort (3-4 cm) stykke slange (OD: 0,06", ID: 0,02 "). Placer den åbne ende af slangen i et reservoir af ultrarent vand, og fyld sprøjten med ultrarent vand.
    4. Nummer hver kontrol kanal for den mikrofluidisk enhed som vist i figur 5. For hver kanal (bortset fra kontrol kanalerne 1 til 3, som ikke er fyldt med vand) skal du finde den tilsvarende slange (forbundet til Magnetventilerne) og indsætte en metalstift i den åbne ende af slangen, der er fastgjort til sprøjten. Injicer vandet i kontrol kanalens slange, indtil halvdelen af længden er fyldt.
    5. Frakobl slangen fra sprøjten og sæt den rustfri stål forbindelses stift i det tilsvarende hul på den mikrofluidisk enhed. Gentag for alle kontrol kanaler.
    6. Brug betjenings grænsefladen til at åbne alle magnetventiler. Dette vil under tryk væsken i kontrolkanalen slange, tvinger det ind i mikrofluidisk enhed og lukke alle membranbaserede ventiler i enheden. Et eksempel på åbne og lukkede membraner i anordningen er angivet i figur 6.
  2. Tilslutning af ukølede reagenser til enheden
    1. For hver af de ukølede reagenser skæres en slange længde (OD: 0,06 ", id: 0,02") for at forbinde reservoiret til mikrofluidisk enhedens indløb.
    2. Tag den ene ende af slangen og Indsæt den i reservoiret, så slangen når bunden af reservoiret. Reservoir slange stikkontakten skal strammes således, at der opnås en lufttæt forsegling. Indsæt en tilslutningsstift af rustfrit stål (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm) ind i den åbne ende af slangen.
    3. Fastgør en 23 G, 1/2 "luer stub til enden af en lille (1 mL) sprøjte. Tilsæt en kort længde af slanger (OD: 0,06 ", ID: 0,02") til luer stub. Når du placerer enden af slangen i den ønskede reagens opløsning, skal du fylde sprøjten med reagenset.
    4. Sæt den rustfri stålstik i polyurethan slangen, som er sluttet til sprøjten, og fyld slangen med reagenset. Ved brug af små reaktions volumener vil reagenset ikke trænge ind i reservoiret, og slangen vil i sig selv fungere som reservoir. Frakobl sprøjten, og sæt forbindelses nålen ind i et af strømnings lags indløbs hullerne på den mikrofluidisk-enhed.
    5. Pres hver af reservoirerne med trykregulator softwaren for at tvinge reagenserne ind i den mikrofluidiske enhed.
  3. Tilslutning af afkølede væsker til mikrofluidisk-enheden
    1. Sørg for, at vandkøleren og Peltier-elementet er tændt, og at overfladetemperaturen på Peltier er indstillet til 4 °C. Monter køle opsætningen så tæt på den mikrofluidiske enhed som muligt, og Minimer den ukølede volumen mellem Peltier og enhedens indløb.
    2. Tilslut den åbne ende af PTFE-slangen til slanger, der er forbundet med en af væske reservoirer (som beskrevet i afsnit 4,2) ved hjælp af en stik stift af rustfrit stål (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm).
    3. Tilslut en lille sprøjte (1 mL) til en luer stub (23 G, 1/2 ") med en kort slange længde (OD: 0,06", ID: 0,02 "), der er fastgjort til enden. Fyld sprøjten med det til-be-afkølede reagens (her, IVTT-reaktions opløsningen).
    4. Tilslut kig slangen til sprøjten via bindevæv og anvende konstant tryk på sprøjten, tvinger reagenset gennem PEEK slange og ind i PTFE slange. Tag Peek-slangen ud af sprøjten, og sæt den direkte ind i en af strømnings kanalens indløb på mikrofluidisk-enheden. Når trykket påføres via trykregulator softwaren, vil det afkølede reagens blive tvunget ind i mikrofluidisk-enheden.

5. eksperimenter

Bemærk: før du udfører eksperimenter, skal alle de hardware-og slangetilslutninger, der er beskrevet i afsnit 3 og 4 i protokollerne, udfyldes, og alle reagenserne skal tilsluttes enheden. Den eksperimentelle procedure kan derefter opdeles i fire særskilte dele: 1) indlæsningen af mikrofluidisk-anordningen, 2) klargøring af mikroskopet, 3) kalibreringen af anordningen og 4) udførelse af eksperimentet. Den brugerdefinerede virtuelle kontrol grænseflade (Se figur 7), der anvendes i hele denne forskning, leveres som en supplerende ressource via materialelisten)

  1. Indlæsning af mikrofluidisk-enheden
    1. Placer den mikrofluidisk enhed, med alle kontrol og flow lag slange fastgjort i mikroskopet scenen og lukke eventuelle åbninger på inkubator. Indstil den omgivende temperatur for inkubator til 29 °C. Sørg for, at kølesystemet er tændt og indstillet til 4 °C, inden eksperimentet påbegyndes.
    2. Sørg for, at alle flow-og kontrol kanalerne er under tryk. Indstil trykket af kontrol kanalerne 1-3 ved 1 bar, og tryk på kontrol kanalerne 9-29 på 3 bar. Reagenserne kræver et tryk på mellem 20 og 100 mbar, der skal påføres væske reservoirer ved hjælp af trykregulator softwaren.
    3. Fjern luft fra den mikrofluidiske enhed ved hjælp af et af reagenserne. Luk enhedens udløb (tryk på Control Channel 29) og tryk samtidigt på kontrol kanalerne 1-3 og 15-28. Tryk derefter selektivt på multiplexens betjenings kanaler for at lade den valgte reagens flyde ind i enheden. Brug mikroskopet til at overvåge fjernelsen af luft.
      Bemærk: i tilfælde af, at reagenserne ikke indlæses korrekt i enheden, eller at luftboblerne ikke fjernes, kan trykket øges til 350 mbar.
    4. Sørg for, at alle reagenser flyder korrekt, uden at indføre luft-ved hjælp af skylle funktionen i kontrol softwaren. Overvågningen af væskestrømmen kan forenkles ved først at indlæse en fluoroforet og overvåge dens forskydning ved individuelle reagenser.
  2. Klargøring af mikroskopet
    1. Brug mikroskopet, Find eventuelle punkter af interesse (et enkelt punkt i hver reaktor er tilstrækkelig) inden for mikrofluidisk enhed, og opbevar koordinaterne deraf. Disse punkter vil blive afbildet under kalibrering og eksperimentelle processer.
      Bemærk: under kalibrerings-og eksperimentelle procedurer, der indgår i styringssoftwaren, instrueres mikroskopet om periodisk optagelse af billeder ved de tidligere lagrede koordinater. For at opnå dette kommunikerer kontrol softwaren med mikroskop-softwaren og informerer den om optagelse af nye billeder. Denne kommunikation er unik for hvert mikroskop setup, og som sådan er denne funktionalitet blevet ændret inden for den medfølgende software grænseflade. Forudsat er en dummy eksekverbar, som kan ændres af slutbrugeren for kompatibilitet med deres eget mikroskop system.
  3. Kalibrering af mikrofluidisk-enheden
    1. Bestem den væskemængde, der er forskudt fra hver reaktor under et enkelt tilstrømnings trin (pumpe sekvens fra Peristaltisk aktiverings kontrol kanaler 15-17, bestående af 6 MODBUS-kommandoer udført sekventielt) ved udførelse af kalibrerings protokollen leveres i softwarepakken.
    2. Indstil følgende datafelter i kontrol softwaren: Elueringsbuffer kanalen, Fluorophore kanalen, antallet af fortyndings cyklusser (standard er 10 fortyndinger), antal trin i indløbet (standard er 15 trin), antal blandings cyklusser (standard er 4 cyklusser) og tid mellem blandings cyklusser (standard er 0 sekunder). Start kalibreringen ved at trykke på Udfør kalibrerings eksperiment.
      Bemærk: under kalibreringsprocessen fyldes alle reaktorer med en fluoroforet, og der optages billeder. Efterfølgende udføres en række fortyndinger, hvor en eluering måles i reaktorerne (baseret på det fastsatte antal indtræknings trin), hvorved fluorophore forgår. Efter grundig blanding tages der nye billeder. Denne proces gentages for det indstillede antal fortyndings cyklusser.
    3. Når kalibreringen er afsluttet, skal du følge de trin, der er beskrevet af kontrol softwaren, og afslutte analysen af kalibrerings eksperimentet.
      Bemærk: analysen vil give brugerne opdaterings forholdet for hver reaktor baseret på det fluorescens fald, som er registreret i hver fortyndings cyklus. Denne værdi angiver den del af reaktor volumenet, der er forskudt af det indstillede antal indtræktrin. Til gengæld vil denne værdi blive brugt under eksperimenter til at bestemme, hvor mange indtræg trin der kræves for at fortrænge en bestemt reaktor volumen.
  4. Udførelse af eksperimentet
    1. Indstil de påkrævede værdier for det ønskede eksperiment i den virtuelle kontrol grænseflade. Kritisk er opdaterings fraktionen [%] , som bestemmer den reaktor volumen, der forskydes pr. eksperimentel cyklus, og som skal indstilles til mellem 15 og 40%.
      Bemærk: den specifikke forsøgsprotokol afgør, hvilke felter i kontrol grænsefladen der skal indstilles før forsøget påbegyndes. Nogle mindre kodning vil være forpligtet til at tilpasse kontrol interface til nye eksperimenter.
    2. Start forsøgsprotokollen ved at trykke på knappen Udfør eksperiment i betjenings grænsefladen.
      Bemærk: uændret, den medfølgende software indleder et simpelt protein udtryk. Reaktorer 1 og 8 udnyttes som kontrol, mens reaktorer 2-7 hus identiske eksperimenter. Her består 75% af reaktor volumenet af ivtt-opløsning, og 25% er enten ultrarent vand eller en 2,5 nm lineær DNA-opløsning. Fortyndinger sker hver 15 minutter, med 30% af reaktoren volumen fordrevet pr fortynding. Billeder optages i slutningen af hver fortyndings cyklus.

6. data analyse

Bemærk: scripts er blevet leveret til analyse af billederne (Se supplerende filer eller tabel over materialer), gør brug af ' bfopen ' analysepakke, som er nødvendig for gennemgang af '. ND2' filer (leveret af vores mikroskop opsætning).

  1. Kør analyse scriptet 'Calibrationscript. m' og når du har bedt om at vælge den ønskede '. ND2' fil. Der vil blive vist et enkelt reaktor billede, hvormed den korrekte billed intensitet kan bestemmes. Brug skyderen til at optimere billed intensiteten, så kanterne på den mikrofluidiske kanal er tydeligt synlige.
  2. Et billede af reaktoren vil blive vist. Inden for dette billede skal du vælge et område inden for reaktor kanalen, som fluorescens intensiteten skal bestemmes for.
    Bemærk: hver reaktors fluorescens intensitet bestemmes for hvert indspillet billede med de resultater, der vises i et enkelt plot, hvilket gør det muligt at visualisere resultaterne.

Representative Results

For at demonstrere effektiviteten af den flerlags mikrofluidisk-platform til ledning af ivtt-eksperimenter blev den beskrevne opsætning brugt til at udtrykke degfp-proteinet. Eksperimentet blev udført i en kommercielt tilgængelig30 ivtt-reaktionsblanding-bestående af al den nødvendige transskription og oversættelses-der-suppleret med reaktions substrater og DNA-skabeloner. Forsøgene blev udført ved en temperatur på 29 °C; en temperatur, der blev fundet optimal for IVTT-ekspression af proteiner.

Den mikrofluidisk enhed besidder ni unikke indløb, hvoraf fire blev udnyttet i løbet af dette eksperiment. Den første indeholdt den kommercielt fremstillede IVTT-reaktionsblanding. Ivtt-reaktionsblandingen rummer alle de komponenter, der kræves for at kunne udtrykke proteiner men, renset Gams blev føjet til reaktionsblandingen-i en endelig koncentration på 1,3 μM-før lastning i mikrofluidisk enhed. Tilføjelsen af GamS-proteinet tjener til at minimere nedbrydningen af lineære DNA-arter, når de udfører forsøgene. Det er afgørende, at ivtt-blandingen sprøjtes ind i polytetrafluorethylen (PTFE) slange, der er oprullet på et Peltier-element med en overfladetemperatur på 4 °c for at afkøle opløsningen forud for injektionen heraf i den mikrofluidiske anordning. nedbrydningen af reaktions opløsningen, inden den anvendes. Mikro-bore Polyether også ether keton (Peek) slanger blev brugt til at forbinde PTFE slange forlader Peltier element overflade med mikrofluidisk enhed, reducere mængden af ivtt reaktionsblandingen ikke bliver afkølet. Den anden løsning indsat i enheden indeholdt den lineære DNA-skabelon kodning for degfp-opløst i ultrarent vand-i en koncentration på 10 nm. Den tredje opløsning, ultrarent vand, tjente flere formål under forsøgsprocedurerne. Primært blev det ultrarent vand brugt til at sikre, at den fordrevne mængde pr. fortynding var lige for alle reaktorer, der fungerer som en erstatning for DNA i kontrol reaktionerne. Desuden blev ultrarent vand også brugt til at fortynde fluoroforet under enhedens kalibrering og til at skylle enhedens døde volumen, når der skiftes mellem reagenser. Den endelige løsning indsat i enheden var en renset FITC-dextran opløsning (25 μM), der kræves for at udføre den indledende kalibrering af enheden. DNA-, vand-og fluoroforet-opløsninger blev injiceret i slanger (0,02 "id, 0,06" OD), som efterfølgende kunne indsættes i en af de indfødtes kanaler i den mikrofluidisk enhed som pr. afsnit 4,2 i protokollerne. Disse opløsninger blev således opbevaret ved 29 °C for alle forsøgene.

Aktivering af betjenings kanalerne på den mikrofluidisk enhed opnås via Custom Control software, hvor hver af kontrol kanalerne kan aktiveres individuelt. Udførelsen af forlængede IVTT-reaktioner kan ikke opnås via denne manuelle proces og kræver brug af automatiserede protokoller, der er indbygget i kontrol softwaren. Ved klargøring af en mikrofluidisk-enhed til eksperimenter, kan lignende automatiserede protokoller udnyttes til at udføre en række nyttige processer: skylningen af enhedens døde volumen med en ny reagens, blanding af reagenser i ring reaktoren, og lastning af en ny reagens i reaktoren, samtidig med at en tilsvarende mængde af den aktuelle opløsning forskønningen. Desuden er to komplekse proces til rådighed: ledning af en anordning kalibrering, og udførelsen af en langvarig celle-fri protein udtryk. Alle de førnævnte processer kan nemt udføres fra de vigtigste interface, sammen med evnen til at konfigurere flere parametre til at variere specifikke proces indstillinger såsom tilstrømning Channel, tilstrømning volumen, og blanding varighed.

På grund af udsving i tryk og ufuldkommenheder under fabrikation af mikrofluidisk-udstyr kan mængden af væske, der er forskudt under en enkelt injektions cyklus, variere mellem enhederne. Forud for udførelse af IVTT-eksperimenter blev den fordrevne reaktor volumen pr. injektions cyklus (opfrisknings fraktion) bestemt. Denne kalibrering kræver påfyldning af alle otte reaktorer med en fluorescerende referenceopløsning. I dette tilfælde blev der anvendt en oprenset FITC-dextran-opløsning (25 μM). Efterfølgende fortyndes reaktorerne 10 gange med ultrarent vand. Ved at måle faldet i fluorescens pr. fortyndings cyklus for hver reaktor blev mængden af væske, der blev forskudt under en enkelt injektions cyklus, bestemt. I kontrol softwaren blev denne værdi ( opdaterings forholdet) registreret til brug under ivtt-eksperimentet. Det er afgørende, at opdaterings forholdet bestemmes og lagres for hver enkelt reaktor, for at der tages højde for variationer i strømningshastigheden på tværs af enheden samt uoverensstemmelser i de enkelte reaktor volumener. Sekvensen af påfyldning og fortynding af reaktorerne blev udført automatisk ved hjælp af Udfør kalibrerings programmet, som udgør en del af kontrol softwaren. Resultaterne af kalibrerings eksperimentet er vist i figur 8.

Den mest komplekse forprogrammerede proces udfører et langvarig IVTT-eksperiment, der giver brugerne mulighed for at starte eksperimentet og efterfølgende lade det fungere uden opsyn, indtil det er færdigt. Under hele eksperimentet blev reaktorer 1 og 5 anvendt som tomme, og der blev kun tilsat vand til reaktorerne under fortyndinger. Reaktorer 2 og 6 blev udnyttet som negative kontroller og indeholdt kun ivtt reaktions opløsning og ultrarent vand. De resterende reaktorer (3, 4, 7 og 8) indeholdt IVTT reaktions opløsninger og 2,5 nM lineær DNA-kodning for deGFP-genet. Initialiseringen af reaktorerne opnås ved fuldt ud at fylde alle reaktorerne (med undtagelse af 1 og 5) med ivtt-reaktions opløsningen, før 25% af reaktor volumenet blev fordrevet med ultrarent vand. Herefter blev den periodiske injektion af reagenser i reaktorerne initieret. Forsøget blev udført således, at nye reagenser blev injiceret i reaktorerne hver 14,7 minutter, med 30% af reaktoren volumen forskydes under hver fortynding cyklus. Sammensætningen af hver injektion var sådan, at 75% af den injicerede væske bestod af frisk ivtt-opløsning, mens de resterende 25% bestod af enten DNA eller ultrarent vand. Efter hver injektion af nye reagenser blev reaktorerne kontinuerligt blandet, hvorefter et fluorescens billede af hver reaktor blev indspillet ved hjælp af mikroskopet. Reaktionen blev efterfølgende tilladt at køre kontinuerligt i 68 cyklusser, hvilket resulterede i en eksperimentel varighed på 16,5 h. Resultaterne af dette eksperiment er anført i figur 9.

Ved længerevarende IVTT eksperimenter er der to hovedårsager til svigt af en reaktion; indførelsen af luft i mikrofluidic-anordningen eller nedbrydningen af IVTT-reaktions opløsningen. Forekomsten af luft inden for mikrofluidisk-anordningen er oftest det direkte resultat af små luftbobler, der findes i tilstrømning-løsningerne, som efterfølgende injiceres i mikrofluidisk-enheden. Ved indtastning af enheden hæmmer tilstedeværelsen af luft den korrekte strøm af væsker, hvorved Reaktionerne ikke længere periodisk opdateres, hvilket fører til dannelsen af batch reaktioner inden for reaktor ringene. I nogle tilfælde fjernes luften langsomt fra anordningen ved gentagen skylning af reagenser, hvorefter reaktionen fortsætter efter hensigten (som vist i figur 9). I andre tilfælde er luften stadig fanget og kan kun fjernes ved at afbryde forsøget og efterfølgende anvende kontinuerligt (højt) Tryk på strømnings laget af den mikrofluidiske anordning, svarende til den påfyldningsproces, der er beskrevet i punkt 5,1 i protokollerne. Under vores eksperimenter lagres celle lysatet i PTFE-slanger på et Peltier-element, der afkøles til 4 °C. Begge foranstaltninger er med til at begrænse nedbrydningen af IVTT-reaktions opløsningen over tid, idet den inaktive PTFE-slange sikrer begrænset interaktion mellem slangen og reaktions opløsningen og de kolde temperaturer, som bevarer den funktionelle (BIO) molekylære der kræves for at udføre ivtt. Skulle nedbrydningen af reaktions opløsningen forekomme-som følge af utilstrækkelig afkøling eller uønsket interaktion mellem reaktions opløsningen og opbevarings miljøet-vil dette udstille sig eksperimentelt som en gradvis reduktion af protein udtryk over tid. Når den er nedbrudt, kan IVTT-reaktions opløsningen ikke gendannes, og der bør forberedes et nyt eksperiment.

Figure 1
Figur 1. Hardware opsætningen kræves for at udføre kontinuerlige IVTT-reaktioner. A) skematisk af hardware opsætningen. B) fotografi af den opsætning, der anvendes i hele dette manuskript. Implementeringen af en flerlags mikrofluidisk-enhed til kontinuerlige ivtt-reaktioner kræver en omfattende hardware opsætning for at regulere flow trykket, aktuere kontrol kanaler, varme og kølige reaktioner og reagenser, opbevare væsker og afbilde enheden under Eksperimenter. Forsøgene udføres ved temperaturer på 30 °C, hvilket opnås ved at placere mikroskopet i en inkubator, der er indstillet til denne temperatur. For at undgå forringelse af ivtt-reaktions opløsningen opbevares den i PTFE-slanger, der er oprullet over det kolde ansigt af et Peltier-element. Temperaturen af Peltier-elementet er indstillet til 4 °C, med en vandkøler og vandblok, der bruges til at opretholde denne temperatur. Reagenser, der ikke kræver afkøling, opbevares i væske reservoirer uden for mikroskop inkubator. Der påføres konstant tryk på disse reservoirer af en computerstyret trykregulator. På denne måde, væsker er tvunget gennem udløbet slanger af reservoirer, som tilsluttes direkte til de tilløbs kanaler af mikrofluidisk enhed. Hver af de kontrol kanaler af mikrofluidisk enhed er forbundet til en pneumatisk ventil. Hele ventilsystemet er under konstant tryk. Åbning af ventilen, giver mulighed for indstilling af væsken i slangen forbinder pneumatisk ventil til kontrolkanalen af mikrofluidisk enhed, således at åbne og lukke PDMS membraner fundet i mikrofluidisk enhed. Pneumatiske ventiler åbnes og lukkes via en brugergrænseflade, der viser en fieldbus-controller (ikke vist) for at åbne og lukke specifikke pneumatiske ventiler. Figur tilpasset fra Yelleswarapu et al.22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Oversigt over opsætningen af pneumatisk ventil og kontrol kanal tilslutningen. En 8-ventil array er vist med tre kontrol kanaltilslutninger monteret på ventiler 1, 2 og 3. Trykluft kan leveres til ventilsystemet via 1/4 "slange. For aktivering af kontrol kanaler anvendes to tryk: 1 bar for de nedre tryk kontrol kanaler (1, 2 og 3) og 3 bar for de højere tryk kontrol kanaler (9 til 30, ikke vist her). Slangen kan fyldes med ultrarent vand og indsættes i en af kontrol kanalens indløb ved hjælp af en stik stift af rustfrit stål. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Oversigt over det kommercielle flow trykregulator og reservoir system. En kommercielt tilgængelig trykregulator bruges til at injicere væsker ind i strømnings laget af den flerlags mikrofluidisk-enhed. Tilslutning af trykregulator til en computer giver mulighed for graduering af det tryk, der anvendes til at udføre de flydende injektioner. Reagenserne kan opbevares i et væskereservoir, som er direkte forbundet med trykregulatoren. Anvendelsen af tryk på reservoiret tvinger væsken ud af reservoiret via stikkontakten. Denne stikkontakt slange kan tilsluttes direkte til en af de flydende indløb af mikrofluidisk enhed ved hjælp af en rustfri stålstik pin. I tilfælde af, at reagens volumenet ikke kan nå væskebeholderen, fungerer udløbs slangen som et reservoir for reagenset. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Oversigt over kølesystemet, der anvendes til afkøling af reaktions reagenser. (Venstre) isoleret køling setup og (højre) køling setup placeret i mikroskopet og forbundet til mikrofluidisk enhed. Et Peltier-element bruges til at afkøle ivtt-reaktions opløsningen før injektion i mikrofluidisk-enheden. Reagenset opbevares i PTFE-slanger, der er oprullet over det kolde ansigt i Peltier-elementet. En længde af Peek slange bruges til at overføre den afkølede væske til mikrofluidisk enhed, med den lille indre diameter (0,005 ") minimering af reagens volumen ikke længere bliver afkølet. Ved siden af den oprullet PTFE slange, en termistor er placeret, giver mulighed for real-time temperaturovervågning på overfladen af Peltier element. Den spænding, der påføres Peltier, indstilles således, at overfladetemperaturen i Peltier forbliver mellem 0 °C og 4 °C. For at fjerne overskydende varme produceret af Peltier element, er den varme-ansigtet af Peltier placeret mod en vandkølet blok, med tilsætning af silikone gratis kølemiddel fedt sikrer optimal varmeoverførsel mellem de to ansigter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Oversigt over det mikrofluidiske enheds design. Den mikrofluidiske strømnings reaktor til kontinuerlige IVTT-reaktioner består af otte reaktor ringe, hver med en volumen på 10,7 nl. Ni indløb giver mulighed for tilstrømning af ni unikke reaktions løsninger i enheden. 24 kontrol kanaler regulerer strømmen af væsker i enheden. Kontrol kanalerne 9 til 14 danner en multiplexer. Disse kontrol kanaler bør under tryk på alle tidspunkter for at hæmme væskestrømmen ind i enheden. Depressering af to kontrol kanaler giver samtidig mulighed for at tilløbe en enkelt reagens. Kontrol kanalerne 15, 16 og 17 bruges til at pumpe reagenserne ind i enheden på en kontrolleret måde. Kontroller kanalerne 18 til 25 hver styrer indløbet på en af de otte reaktorer, som findes i enheden. Control Channel 26 kan lukke skylle kanalen og dermed tvinge væske ind i reaktorerne. Kontrol kanal 27 hjælpemidler til homogen påfyldning af reaktorerne. Kontrol kanalerne 28 og 29 regulerer henholdsvis ring reaktorens udtag og den eneste stikkontakt. Endelig anvendes kontrol kanalerne 1, 2 og 3 til Peristaltisk pumpning af væsken i ring reaktorerne, hvilket resulterer i blanding af reagenserne. Designet af denne mikrofluidisk-enhed og figuren er begge tilpasset fra neiderholtmeyer et al.29. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Membranbaseret ventil i mikrofluidic-anordningen. A) flow kanal inden for mikrofluidisk-enheden. To kontrol kanaler kan ses i baggrunden. Disse kanaler er ikke under tryk, og som sådan ventilerne er åbne (væske kan flyde). B) de to kontrol kanaler, der skærer flow lags kanalerne, er blevet trykket ned og lukker ventilerne (dvs. væskestrømmen hæmmes). Ved tryk justering af kontrol kanalerne afbøjes den tynde PDMS-membran, der adskiller flow-og kontrollag kanalerne opad (kontrol laget ligger under strømnings laget), som lukker flow lags kanalen. Afrunding af flow Layer Channel er afgørende for at sikre, at den deflekerede membran lukker flow kanalen helt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7. Brugergrænseflade, der bruges til at styre mikrofluidisk-enheden. I hele denne forskning, en brugerdefineret kontrol interface er blevet brugt til at styre strømmen af væsker inden for mikrofluidisk enheder. Interfacet giver brugerne mulighed for individuelt at aktivere hver af kontrol kanalerne (nummereret 1-3 og 9-29), eller at udføre udførlige protokoller, der resulterer i træk og lastning af reagenser, kalibrering af mikrofluidisk enhed, og udførelsen af Eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8. Resultaterne af et kalibrerings eksperiment. Under et kalibrerings eksperiment fyldes reaktorerne med en fluoroforet (25 μM FITC-dextran), hvorefter fluorescens intensitet registreres. Derefter følger en række fortyndinger, hvor der anvendes et fast antal indfatninger (15) til at injicere ultrarent vand ind i reaktorerne. Efter hver fortynding blandes reagenserne, og fluorescensen måles. Faldet i fluorescens intensitet pr. fortynding viser mængden af den reaktor ring, der er fordrevet for det fastsatte antal indfatningen. en værdi, der kaldes opdaterings forholdet. a) den gennemsnitlige intensitet og standardafvigelsen for alle otte reaktorer er vist med rødt med de individuelle intensitets spor vist i gråt. B) det gennemsnitlige opdaterings forhold og standardafvigelsen vises for hvert fortyndings trin med rødt. De individuelle opdaterings forhold for hver enkelt reaktor er vist med gråt. Det kan ses, at syv af de otte reaktorer udviser en meget lignende opførsel, men en reaktor viser udsving i opdaterings forholdet efter den syvende fortyndings cyklus. Dette fremhæver behovet for unikke opdaterings forhold for hver af reaktorerne, i modsætning til at bruge et gennemsnitligt opdaterings forhold for injektion af reagenser i reaktorerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9. Resultater af et IVTT-eksperiment, som udtrykker deGFP-proteinet. En forlænget IVTT-reaktion blev initieret således, at 30% af reaktor volumenet er forskudt hver 14,6 minutter. Reaktionen fik lov til at køre i mere end 16 timer, før den blev afsluttet. To reaktorer af mikrofluidisk-anordningen blev brugt som blanktegn, og kun ultrarent vand blev fløjet gennem reaktorerne under hele forsøget (reaktorer 1 og 5). Alle de andre reaktorer bestod af 75% ivtt reaktions opløsning og 25% af enten ultrarent vand (reaktorer 2 og 6) eller 2,5 nm lineære DNA-skabeloner, som koder for udtryk af degfp (reaktorer 3, 4, 7 og 8). I alle fire reaktorer, hvor DNA blev tilføjet, er der et klart deGFP-udtryk. Tre af de fire reaktorer giver samme fluorescens intensitet, idet en reaktor udviser lavere fluorescens signal. Dette kan være forårsaget af en skævhed i flow resulterer i mindre DNA ind i reaktoren, eller på grund af variationer i reaktoren dimensioner. Efter 14 timer ses en pludselig stigning i signalet fra reaktorerne, der indeholder DNA. Dette er forårsaget af en luftboble ind i strømnings laget af mikrofluidisk enhed, formentlig stammer fra en af de tilstrømning løsninger. Den diffusering af luft i mikrofluidic anordning begrænser strømmen af væsker gennem kanalerne betydeligt, hvorved ingen friske reagenser kan tilsættes eller fjernes fra reaktorerne, indtil luften er passeret. Ved genoptagelse af strømmen vender eksperimentet tilbage til sin tidligere fluorescens intensitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende filer. Venligst klik her for at downloade disse filer. 

Discussion

En PDMS-baseret flerlags mikrofluidisk-enhed er blevet præsenteret, og dens evne til at opretholde ivtt-reaktioner i længere perioder er blevet påvist. Selvom velegnet til dette specifikke eksempel, denne teknologi kan tænkes bruges til mange andre applikationer. Den ekstra kontrol over fluid flow-parret med evnen til kontinuerligt at genopbygge reaktions reagenser, mens du fjerner (ved) produkter-er ideel til kontinuerlige syntese reaktioner, undersøgelse af forskellige dynamiske adfærd, og den samtidige overledning af flere variationer af en enkelt reaktion.

På trods af den relativt ligetil fabrikationsproces af PDMS-baserede enheder kræver brugen heraf en omfattende hardware opsætning. Bestående af ventilsystemer, trykregulatorer, tryk pumper, inkubatorer og køleenheder er overgangen fra fabrikation til brug ikke elementær og kræver en betydelig initialinvestering. Desuden kræver evnen til konsekvent at oprette og udføre vellykkede eksperimenter med disse anordninger en betydelig tidsinvestering; et punkt, som dette manuskript har til formål at løse. Men når du er på plads, kan hele opsætningen ændres til en række formål. Desuden består hardware opsætningen af talrige modulære elementer, som hver kan udvides, så det er muligt at arbejde med mere komplekse mikrofluidiske enheds designs. Derudover muliggør det modulære design udskiftning af hardwarekomponenter ved tilsvarende fungerende alternativer, således at brugerne ikke er begrænset til den specifikke opsætning, der er beskrevet her48,49.

Variabilitet mellem de enkelte enheder og under de ydre forhold (f. eks. trykudsving) kan resultere i unøjagtigheder, når de udfører eksperimenter ved hjælp af disse enheder. For at løse dette problem skal der udføres en kalibrering af systemet før hvert eksperiment, hvilket giver et unikt opdaterings forhold for hver af reaktorerne. Mens kalibreringen adresserer enheden-til-enhed og eksperiment-til-eksperiment variationer, er det en tidskrævende proces og ikke fejlfri. Væsker med forskellige viskositeter vil ikke flyde med samme hastighed, når de udsættes for identisk tryk, og som sådan udfører kalibreringen med flere reagenser, kan ikke give identiske opdaterings forhold. Denne effekt dæmpes ved at anvende tre kontrol kanaler til Peristaltisk at pumpe reagenserne ind i den mikrofluidiske enhed i modsætning til regulering af strømmen ved at variere det medfølgende tryk. Som en sidste udvej i tilfælde, hvor forskellen i viskositet er meget stor, kan der implementeres et unikt opdaterings forhold for hver enkelt reagens ved at udføre flere kalibrerings eksperimenter.

Brugen af en peristaltisk pumpe til injektion af reagenser i den mikrofluidiske anordning dæmper virkningerne af at anvende opløsninger med varierende viskositeter, men det skaber også et sekundært problem. Ved hjælp af diskrete trin til pumpning af væsker ind i den mikrofluidiske anordning, betyder, at opløsningen af injektioner i en enkelt reaktor, er begrænset af den mængde, der injiceres, når du udfører en enkelt pumpe cyklus. Inden for vores forskning er denne værdi-bestemt under kalibreringen-omtrent lig med 1%, hvilket indikerer, at en enkelt pumpe cyklus forflytter ca. 1% af reaktor volumenet (ca. 0,1 nL). Som sådan kræver forskydningen af 30% af reaktor volumenet udførelse af 30 pumpe cyklusser med 23 pumpe cyklusser af ivtt-reaktions opløsningen, og der tilsættes kun 7 pumpe cyklusser af DNA eller ultrarent vand. Selv om de er tilstrækkelige til vores forskning, kan alternative forsøgsprotokoller støde på problemer, når de forsøger at tilføje et større antal unikke reagenser, bruge en lavere opdaterings fraktioneller tilføje mindre volumener af en enkelt reagens til en reaktor. I sådanne tilfælde kan mikrofluidic enhedens design tilpasses til at give reaktorer med en større volumen. Et eksempel på en sådan er rapporteret i Niederholtmeyer et al.36.

Det er afgørende, at anordningen, der er skitseret i dette manuskript, gør det muligt at opretholdes reaktioner ved længerevarende varigheder, hvilket resulterer i transkription og oversættelses rater i steady state. Ved periodisk indsprøjtning nye reagenser i reaktorerne-og fjerne reaktion (af) produkter-Reaktionerne er vedvarende og komplekse dynamiske adfærd kan overvåges. På denne måde er der skabt en platform, som-til en vis grad-efterligner det cellulære miljø. Endvidere, denne platform muliggør udforskning af systemets dynamik, ved at tilpasse perioden mellem injektioner og den specifikke sammensætning af injektionerne. Som følge heraf er disse flerlags mikrofluidiske enheder et effektivt værktøj til karakterisering og optimering af nye syntetiske net, der udviser kompleks dynamisk adfærd.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af det europæiske forskningsråd, ERC (projekt n. 677313 BioCircuit), et NWO-VIDI-stipendium fra den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO, 723.016.003), støtte fra ministeriet for uddannelse, kultur og videnskab (Gravity programmer, 024.001.035 & 024.003.013), Human Frontier Science program Grant RGP0032/2015, det Europæiske Forskningsråd under den Europæiske Unions Horizon 2020 forsknings-og innovationsprogram Grant 723106, og en schweizisk National Science Foundation Grant 200021_182019.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Acetone VWR 20063.365
AZ 40 XT Merck KGaA (Darmstadt, Germany) - Positive Photoresist
AZ 726 MIF Developer Merck KGaA (Darmstadt, Germany) - Developer Positive Photoresist
Isopropanol Merck KGaA (Darmstadt, Germany) 109634
Microscope slides VWR ECN 631-1550
mr Dev 600 Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany) - Developer Negative Photoresist
Silicon Free Heat Sink Grease Circuit Works CW7270 Thermal Compound
Silicon wafers Silicon Materials - <1-0-0> orientation, 100 mm diameter, 525 µm thickness
SU-8 3050 Microchem Corp. (Newton, MA) - Negative Photoresist
Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS) The Dow Chemical Company 01317318
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931-10G
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
4 channel digital input/output module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-504 8x
Camera lens The Imaging Source -
Compression fitting Koolance, Inc. FIT-V06X10 Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x
Controller end module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-600
Device connecting tubing Saint-Gobain Performance Plastics AAD04103 0.02" ID, 0.06" OD, Tygon Tubing (ND-100-80)
Device connector pins Unimed SA (Lausanne, Switserland) 200.010-A AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L
Ethernet Controller WAGO Kontakttechnik GmbH 750-881
Female bus connector Encitech DTCK15-DBS-K 15 pole female bus connector
Fluid reservoirs Fluigent Fluiwell-4C
Fluigent pressure system Fluigent MFCS-EZ 0 - 345 mbar
Hg short arc lamp Advanced Radiation Corporation - 350W
Hot plate Torrey Pines Scientific HP61
Inverted microscope Nikon Instruments Eclipse Ti-E
LabVIEW Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Liquid coolant Koolance, Inc. LIQ-705CL-B
Luer stubs Instech Laboratories, Inc. LS23
Male Luer to barb connectors Cole Parmer 45505-32 3/32" ID
Matlab Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Microcamera The Imaging Source DMK 42AUC03
Microscope camera Hamamatsu Photonics OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)
Orbital shaker Cole Parmer EW-513000-05
Oven Thermo Scientific Heraeus T6P 50045757
Oxygen plasma asher Quorum Technologies K1050X
PDMS puncher SYNEO Accu-Pucnh MP10
PEEK tubing Trajan 1301005001-5F 0.005" ID, 1/32" OD, Red
Peltier element European Thermodynamics APH-127-10-25-S
Peltier temperature controller Warner Instruments CL-100
Photomask CAD/Art Services, Inc. -
Photomask Design Maerkl Lab, EPFL https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ
Pneumatic valve array FESTO - 1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.
Power adapter Koolance, Inc. ADT-EX004S 110/220V AC Power Adapter
PTFE tubing Cole Parmer 06417-21 #24 AWG Thin Wall PTFE
Punching pin SYNEO CR0320245N21R4 OD: 0.032" (0.8128 mm), ID: 0.024" (0.6090 mm)
PVC Tubing Koolance, Inc. HOS-06CL 6 mm ID, 10 mm OD
Single edge blades GEM Scientific -
Soft tubing Fluigent - Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)
Spin coater Laurell Technologies Corporation WS-650MZ-23NPPB
Stereo microscope Olympus Corporation SZ61
Thermistor cable Warner Instruments TA-29 Cable with bead thermistor
UV exposure system ABM, USA - Near UV Exposure System, 350W
Vacuum pump Vacuumbrand GmbH MD1C
Water cooled cold plate block Koolance, Inc. PLT-UN40F
Water cooler Koolance, Inc. EX2-755
Weighing scales Sartorius M-prove

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Roekel, H. W. H., et al. Programmable chemical reaction networks: emulating regulatory functions in living cells using a bottom-up approach. Chemical Society Reviews. 44, 7465-7483 (2015).
  2. Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics. Lab on a Chip. , (2017).
  3. Del Vecchio, D., Sontag, E. D. Dynamics and control of synthetic bio-molecular networks. Proceedings of the American Control Conference. , 1577-1588 (2007).
  4. Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 410-422 (2009).
  5. Padirac, A., Fujii, T., Rondelez, Y. Bottom-up construction of in vitro switchable memories. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E3212-E3220 (2012).
  6. Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. 439, 856-860 (2006).
  7. Genot, A. J., Fujii, T., Rondelez, Y. In vitro regulatory models for systems biology. Biotechnology Advances. 31, 789-796 (2013).
  8. Elowitz, M. B., Leibler, S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature. 403, 335-338 (2000).
  9. Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403, 339-342 (2000).
  10. Montagne, K., Plasson, R., Sakai, Y., Fujii, T., Rondelez, Y. Programming an in vitro DNA oscillator using a molecular networking strategy. Molecular Systems Biology. 7, 466-466 (2014).
  11. Khalil, A. S., Collins, J. J. Synthetic biology: applications come of age. Nature Reviews Genetics. 11, 367-379 (2010).
  12. Hockenberry, A. J., Jewett, M. C. Synthetic in vitro circuits. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 253-259 (2012).
  13. Del Vecchio, D. Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits. Trends in Biotechnology. 33, 111-119 (2015).
  14. Cardinale, S., Arkin, A. P. Contextualizing context for synthetic biology - identifying causes of failure of synthetic biological systems. Biotechnology Journal. 7, 856-866 (2012).
  15. Venturelli, O. S., et al. Programming mRNA decay to modulate synthetic circuit resource allocation. Nature Communications. 8, 1-11 (2017).
  16. Scott, M., Mateescu, E. M., Zhang, Z., Hwa, T. Interdependence of cell growth and gene expression: origins and consequences. Science. 330, 1099-1103 (2010).
  17. Borkowski, O., Ceroni, F., Stan, G. B., Ellis, T. Overloaded and stressed: whole-cell considerations for bacterial synthetic biology. Current Opinion in Microbiology. 33, 123-130 (2016).
  18. Liao, C., Blanchard, A. E., Lu, T. An integrative circuit-host modelling framework for predicting synthetic gene network behaviours. Nature Microbiology. , (2017).
  19. Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).
  20. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19, 751-755 (2001).
  21. Oberholzer, T., Nierhaus, K. H., Luisi, P. L. Protein expression in liposomes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 261, 238-241 (1999).
  22. Yelleswarapu, M., et al. Sigma factor-mediated tuning of bacterial cell-free synthetic genetic oscillators. ACS Synthetic Biology. 7, (2018).
  23. Karig, D. K., Iyer, S., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Expression optimization and synthetic gene networks in cell-free systems. Nucleic Acids Research. 40, 3763-3774 (2012).
  24. Dunlop, M. J., et al. Distinct timescales of RNA regulators enable the construction of a genetic pulse generator. Biotechnology and Bioengineering. , (2019).
  25. Yoshiyama, T., Ichii, T., Yomo, T., Ichihashi, N. Automated in vitro evolution of a translation-coupled RNA replication system in a droplet flow reactor. Scientific Reports. 8, 1-8 (2018).
  26. Iyer, S., Karig, D. K., Norred, S. E., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Multi-input regulation and logic with T7 promoters in cells and cell-free systems. PLoS ONE. 8, 1-12 (2013).
  27. de los Santos, E. L. C., Meyerowitz, J. T., Mayo, S. L., Murray, R. M. Engineering Transcriptional Regulator Effector Specificity Using Computational Design and In vitro Rapid Prototyping: Developing a Vanillin Sensor. ACS Synthetic Biology. 5, 287-295 (2016).
  28. Guo, S., Murray, R. M. Construct functional feedforward loop biological circuits in a cell-free system and in cells. ACS Synthetic Biology. , (2019).
  29. Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9, (2017).
  30. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The all E. coli TX-TL toolbox 2.0: A platform for cell-free synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5, 344-355 (2016).
  31. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  32. Lee, J. W., et al. Creating single-copy genetic circuits. Molecular Cell. 63, 329-336 (2016).
  33. Gibson, D. G., et al. Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of a mycoplasma genitalium genome. Science. 319, 1215-1220 (2008).
  34. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3, 387-397 (2014).
  35. Georgi, V., et al. On-chip automation of cell-free protein synthesis: new opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip. 16, 269-281 (2016).
  36. Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15985-15990 (2013).
  37. Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242, 1162-1164 (1988).
  38. Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345, 829-832 (2014).
  39. Timm, A. C., Shankles, P. G., Foster, C. M., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Toward microfluidic reactors for cell-free protein synthesis at the point-of-care. Small. 12, 810-817 (2016).
  40. Doktycz, M. J., Foster, C. M., Retterer, S. T., Timm, A. C., Shankles, P. G. Characterization of extended channel bioreactors for continuous-flow protein production. Journal of Vacuum Science & Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 33, 06FM02 (2015).
  41. Khnouf, R., Beebe, D. J., Fan, Z. H. Cell-free protein expression in a microchannel array with passive pumping. Lab on a chip. 9, 56-61 (2009).
  42. Siuti, P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. Continuous protein production in nanoporous, picolitre volume containers. Lab on a Chip. 11, 3523-3529 (2011).
  43. Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16, 2168-2187 (2016).
  44. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: Application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synthetic Biology. 1, 29-41 (2012).
  45. Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, 1-18 (2015).
  46. Galas, J., Haghiri-Gosnet, A. -M., Estévez-Torres, A. A nanoliter-scale open chemical reactor. Lab on a Chip. 13, 415-423 (2013).
  47. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288, 113-116 (2004).
  48. Brower, K., et al. An open-source, programmable pneumatic setup for operation and automated control of single- and multi-layer microfluidic devices. HardwareX. 3, 117-134 (2018).
  49. White, J. A., Streets, A. M. Controller for microfluidic large-scale integration. HardwareX. 3, 135-145 (2018).

Tags

Bioteknik Microfluidics in vitro transskription og oversættelse syntetisk biologi langvarige reaktioner mikro-reaktorer protein udtryk
En Mikrofluidic-platform med flere lag til overledning af forlænget celle frit genekspression
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van der Linden, A. J., Yelleswarapu, … More

van der Linden, A. J., Yelleswarapu, M., Pieters, P. A., Swank, Z., Huck, W. T. S., Maerkl, S. J., de Greef, T. F. A. A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression. J. Vis. Exp. (152), e59655, doi:10.3791/59655 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter