Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En flerlags Mikrovæskebasert plattform for gjennomføring av langvarig Cell-gratis Gene Expression

Published: October 6, 2019 doi: 10.3791/59655
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 2, 3, 1,2
1Institute for Complex Molecular Systems, Department of Biomedical Engineering, Computational Biology Group, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Molecules and Materials, Radboud University, 3Institute of Bioengineering, School of Engineering École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

Summary

Det fabrikasjon forarbeide av en PDMS-basert, flerlags, mikrovæskebasert apparat det innrømmer inne vitro transkripsjon og oversettelse (IVTT) reaksjonene å bli utført over lengre perioder er beskrevet. Videre er det gitt en omfattende oversikt over maskinvare og programvare som kreves for å automatisere og vedlikeholde disse reaksjonene for langvarig varighet.

Abstract

Begrensningene til cellebasert syntetisk biologi blir stadig tydeligere ettersom forskerne tar sikte på å utvikle større og mer komplekse, syntetiske, genetiske regulerings kretser. Analysen av syntetiske genetiske regulatoriske nettverk in vivo er tidkrevende og lider av en mangel på miljøkontroll, med eksogene syntetiske komponenter i samspill med verts prosesser som resulterer i uønsket atferd. For å overvinne disse problemene, celle-fri karakterisering av romanen kretser blir mer utbredt. In vitro transkripsjon og oversettelse (IVTT) blandinger tillate regulering av eksperimentell miljø og kan optimaliseres for hvert unikt system. Protokollene presenteres her detalj fabrikasjon av en flerlags mikrovæskebasert enhet som kan utnyttes til å opprettholde IVTT reaksjoner for langvarig varighet. I motsetning til de satsvise reaksjonene, der ressursene tømmes over tid og (ved-) produkter akkumuleres, tillater bruk av mikrovæskebasert enheter påfyll av ressurser, samt fjerning av reaksjons produkter. På denne måten er det cellulære miljøet emulert ved å opprettholde en ut-av-likevekt miljø der den dynamiske atferden til genet kretser kan undersøkes over lengre perioder. For å fullt ut utnytte flerlags mikrovæskebasert enhet, maskinvare og programvare har blitt integrert for å automatisere IVTT reaksjoner. Ved å kombinere IVTT reaksjoner med mikrovæskebasert plattformen presenteres her, blir det mulig å grundig analysere komplekse nettverk atferd, fremme vår forståelse av mekanismene som regulerer cellulære prosesser.

Introduction

Celler er i stand til å fornemme og reagere på sine omgivelser ved hjelp av komplekse dynamiske regulatoriske nettverk1,2. Feltet av syntetisk biologi utnytter vår kunnskap om de naturlig forekommende komponentene som består av disse nettverkene til ingeniør biologiske systemer som kan utvide funksjonaliteten til cellene3,4. Omvendt er det også mulig å videreutvikle vår forståelse av de naturlige nettverkene som styrer livet ved å designe forenklede, syntetiske analoger av eksisterende kretser eller ved Forward-engineering biologiske systemer som viser naturlig forekommende atferd. De Novo engineering av slike biologiske systemer er utført i en nedenfra og opp mote der romanen genetiske kretser eller signalering trasé er konstruert på en rasjonell måte, ved hjelp av veldefinerte deler5,6. Kombinere rasjonell utforming av nettverk med utformingen av biologisk relevante systemer gjør det i dybden karakterisering og studier av biologiske regulatoriske systemer med ulike nivåer av abstraksjon7.

De banebrytende verkene til Elowitz og Leibler8 og Gardner et al.9 var de første til å demonstrere vellykket innføring av syntetiske genetiske nettverk i mobilnettet verter. I det følgende tiåret har mange forskere fortsatt å bygge på disse innledende suksesser til tross for fremveksten av flere begrensninger i forbindelse med innføringen av syntetiske kretser i cellene7,10,11 ,12. Ideelt sett bør innføringen av syntetiske kretser i cellulære verter forekomme i en modulær måte. Dessverre gjør kompleksiteten i mobilnettet miljøet dette spesielt utfordrende, med funksjon av mange deler og nettverk blir svært sammenheng avhengig12,13,14. Som et resultat, nettverk ofte opplever uønsket interaksjon med native Host støpejernskomponenter som kan påvirke funksjonen av syntetisk krets. På samme måte kan komponenter i eksogene nettverk hemme verts prosesser, konkurrere om delte ressurser i verten og påvirke veksten Kinetics15,16,17. Følgelig, for å rasjonelt designe og forutsi atferden til syntetiske nettverk i et in vivo-miljø, kreves en omfattende modell av alle verts-og krets-spesifikk dynamikk18.

Et levedyktig alternativ til bruk av mobilnettet verter for karakterisering av syntetiske nettverk er anvendelsen av in vitro transkripsjon og oversettelse (IVTT) teknologier. Opptrer som en MontenegroGenericName for syntetiske nettverk, er reaksjoner utføres i løsninger som omfatter alle komponentene som kreves for å aktivere genuttrykk19,20,21. På denne måten, en biologisk relevant, om enn kunstig, miljø er opprettet innenfor hvilke syntetiske nettverk kan testes22,23,24,25,26, 27,28. En stor fordel med å bruke IVTT løsninger er evnen til å utføre reaksjoner under brukerdefinerte forhold, med forskere i stand til å tune den presise sammensetningen av hver reaksjon2. Videre gir celle fri tilnærming høy gjennomstrømming testing av syntetiske nettverk, siden det fjerner behovet for å utføre tidkrevende cellulære kloning trinn. Som et resultat, er varigheten av påfølgende design-Build-testsykluser betydelig redusert29,30,31,32. Utformingen syklusen kan bli ytterligere akselerert ved å utnytte celle-fri kloning teknikker som Gibson forsamlingen til raskt ingeniør romanen nettverk, og ved å konstruere nettverk fra lineære DNA maler som-i motsetning til plasmider kreves for in vivo testing- kan forsterkes via polymerase kjedereaksjoner (PCR)33,34.

Batch reaksjoner er den enkleste metoden som IVTT reaksjoner kan utføres, som krever et enkelt reaksjons fartøy hvor alle reaksjons komponentene er kombinert35. Slike reaksjoner er tilstrekkelig for protein uttrykk og grunnleggende krets testing men beviser utilstrekkelig når du prøver å studere den langsiktige dynamiske atferden til et nettverk. I løpet av en satsvis reaksjon, reagenser er enten utarmet eller gjennomgå degradering som resulterer i en kontinuerlig reduksjon av transkripsjon og oversettelse priser. Videre, som reaksjoner fremgang biprodukter akkumuleres som kan forstyrre-eller fullstendig hemme-riktig funksjon av nettverket. Til syvende og sist, bruk av batch reaktorer begrenser den dynamiske atferden som kan observeres, med negativ regulering er spesielt utfordrende å implementere5,36.

Allsidigheten til IVTT systemer muliggjør flere alternative metoder der forlenget IVTT reaksjoner kan utføres, alt fra kontinuerlig strømning til dråpe BAS ert metoder, samt enklere dialyse tilnærminger2,30, 37,38,39,40. Anvendelsen av mikrovæskebasert anordninger tilbyder brukernes forhøyet kontroll med deres reaksjonene stund i tiltagende det produksjon og minimere omkostningene35,41,42, med hver spesifikk adgang har dens egne fordeler. Bruk av kontinuerlig flyt kan enkelt optimaliseres for å øke uttrykket gir imidlertid, manglende evne til å effektivt fjerne konkrete reaksjons produkter gjør studiet av dynamisk atferd ikke-triviell39. Mens ansette dråpe BAS ert mikrovæskebasert systemer tillater høy gjennomstrømming screening av romanen nettverk, vanskeligheten med å forsyne friske reagenser til reaksjonen resulterer i dråper som ligner små volum satsvise reaksjoner43. Dialyse baserte reaktorer tillate innføring av friske reagenser, samt fjerning av noen reaksjons produkter imidlertid, RNA molekyler og større proteiner akkumuleres i reaktoren, blir for stor til å spre gjennom membranen porene. I tillegg er det nødvendig med store mengder reagenser for å opprettholde disse reaksjonene i lengre perioder30,44. I 2013, Maerkl et al. presentert en multi-lagdelt mikrovæskebasert enhet designet spesielt for å gjennomføre langvarig IVTT reaksjoner36,45. Bruk av flerlags mikrovæskebasert enheter tillater direkte kontroll over Fluid Flow, slik at for omdirigering av flyt samt isolering av væske i bestemte regioner av enheten46,47. Disse isolerte regioner kan fungere som uavhengige nanoliter-skala reaksjons kamre hvor IVTT reaksjoner kan utføres. I løpet av en enkelt IVTT-reaksjon brukes periodiske injeksjoner av friske reagenser i reaktoren til å etterfylle IVTT-komponenter og DNA-maler. Samtidig er et likt volum av den gamle reaksjons løsningen forskjøvet, og fjerner reaksjons produkter. På denne måten er en ut-av-likevekt miljøet opprettholdes der basal transkripsjon og oversettelsen priser forblir i steady-state, forlenge levetiden til IVTT reaksjoner og tillater rik dynamisk atferd oppstår. Ved å anvende denne tilnærmingen, forskere er i stand til å undersøke kinetisk utbredelsen av de enkelte prosessene som forekommer i en bestemt krets, hjelpe i frem-engineering av romanen genetiske nettverk. For eksempel, Niederholtmeyer et al. implementert denne tilnærmingen til å karakterisere ulike elementer av en genetisk ring Oscillator, bestemme kinetisk priser derav36. I videre studier, Yelleswarapu et al. viste at kinetisk utbredelsen av Sigma faktor 28 (σ28) bestemmes under batch forhold var utilstrekkelig for å beskrive atferden til en σ28-basert Oscillator, og at tillegg av Flow-baserte data forbedret modell spådommer av nettverket oppførsel22.

Målet med dette manuskriptet er å presentere en komplett protokoll for fabrikasjon av flerlags mikrovæskebasert enheter i stand til å utføre langsiktige IVTT reaksjoner. I tillegg vil dette manuskriptet beskrive all maskinvare og programvare som kreves for å utføre langvarige IVTT reaksjoner. Aktivering av mikrovæskebasert enhet-nødvendig for å kontrollere flyten av væsker deri-oppnås ved hjelp av en serie av pneumatiske ventiler som kobles direkte til mikrovæskebasert enheter via lengder på slangen. De pneumatiske ventilene styres i sin tur via et spesialbygd, virtuelt kontroll grensesnitt. Fluid Flow innenfor mikrovæskebasert enheter oppnås ved hjelp av kontinuerlig trykk som er levert av et kommersielt tilgjengelig trykk reguleringssystem. IVTT reaksjoner utføres vanligvis mellom 29 ° c og 37 ° c, og en inkubator for mikroskop brukes til å regulere temperaturen under reaksjonene. Funksjonaliteten til IVTT-blandingen blir imidlertid gradvis dårligere når den oppbevares over 4 ° c. Som sådan vil dette manuskriptet utvides på off-chip kjølesystemet brukes til å kjøle IVTT blandingen før injeksjon i mikrovæskebasert enheten. Som konklusjon, dette manuskriptet gir en omfattende oversikt over prosedyrene som kreves for å kunne utføre langvarige IVTT reaksjoner ved hjelp av en mikrovæskebasert strømnings reaktor slik at andre forskere vil være i stand til å gjenskape denne teknologien med relative Letthet.

Protocol

1. wafer forberedelse

Merk: våre protokoller er spesifikke for 40 XT positive photoresist og SU8 3050 negative photoresist som brukes under denne forskningen. Alternative photoresists kan brukes, men de spesifikke spin-hastighetene, bake temperaturene og Baker tidene vil variere. Den mikrovæskebasert enheten design levert av Niederholtmeyer et al.36 er knyttet i tabellen av materialer.

  1. Plasser to rene silisium wafere (100 mm diameter, < 1-0-0 > orientert, 525 μm tykkelse) i en forvarmet ovn satt til 250 ° c og la wafere til tørke over natten (~ 16 h).
    Merk: det er også mulig å prime wafere ved hjelp av HMDS damp deponering; Dette er imidlertid ikke nødvendig hvis wafere er tilstrekkelig dehydrert.
  2. Fjern en silisium kjeks fra ovnen og la den avkjøles til romtemperatur før du fortsetter med spin-belegget. Påfør 3-4 mL av 40 XT-photoresist til midten av platen.
  3. For å få en funksjons høyde på 25 μm bruker du følgende spin-protokoll: spinn for 20 s ved 500 RPM (110 RPM/s), Øk spin-hastigheten til 3100 RPM (300 RPM/s) og hold her i 30 s, og avta platen til 0 RPM med en retardasjon av 200 RPM/s. bruke en mikrofiber vev nøye fjerne eventuelle kant beading som kan ha oppstått under spin belegg.
  4. Myk stek med to separate kokeplater satt til 70 ° c og 120 ° c på følgende måte: la platen sitte ved 70 ° c i 30 s. Overfør deretter platen til 120 ° c kokesonen og la den hvile her i 3,5 min før du returnerer platen til 70 ° c kokesonen for en annen 30 s. Fjern platen fra kokesonen og – unngå plutselige temperatursjokk – la den avkjøles til romtemperatur.
  5. Plasser Flow Layer photomask (emulsjon side ned) på den photoresist filmen og utsett platen med en UV-lampe inntil det oppnås en total eksponering på 200 mJ/cm2 .
  6. Etter eksponering bake ved hjelp av to varmeplater (70 ° c og 105 ° c) på følgende måte: la platen sitte ved 70 ° c i 20 s før du overfører platen til den 105 ° c kokesonen og etterlater den her for 40 s. Til slutt tilbake platen til 70 ° c kokesonen for ytterligere 20 s for å fullføre etter eksponering bake.
  7. La platen avkjøles til romtemperatur på en stabel med mikrofiber vev. Utvikle kjeks ved å overføre den til en Petri parabol fylt med 726 MIF photoresist utbygger å starte utviklingsprosessen. Utviklingen er akselerert når den utføres på en stasjonære shaker og hele kjeks er nedsenket i utbygger.
  8. Skyll wafer med demineralisert vann og bruk et stereo mikroskop for å kontrollere wafer overflaten for eventuelle photoresist rester. Hvis photoresist rester kan sees, og deretter returnere wafer til utbygger.
  9. Tilpass flyten til den positive photoresist ved å plassere platen på en kokeplate satt til 110 ° c i 25 min. Denne forarbeide ville gir seg utslag i avrundet vise egenskaper likeledes idet annealing alle sprekk det kanskje ha opptrådte under fabrikasjon forarbeide. Fortsett med å silanize platen som beskrevet i trinn 1,17.
  10. Fjern den andre silisium platen fra ovnen, slik at den avkjøles til romtemperatur før du fortsetter med spin-belegget. Påfør 5 mL SU8 3050 photoresist til midten av platen.
  11. For å oppnå en funksjons høyde på 30 μm gjelder følgende spin-protokoll: spinn for 20 s ved 500 RPM (110 RPM/s), Øk spin-hastigheten til 4 000 RPM (330 RPM/s) og hold her for 42 s, og avta platen til 0 RPM med en retardasjon av 200 RPM/s. bruke en mikrofiber vev nøye fjerne eventuelle kant beading som kan ha oppstått under spin belegg.
  12. Myk stek med to separate kokeplater (65 ° c og 95 ° c) på følgende måte: la platen sitte ved 65 ° c i 30 s. Overfør deretter platen til 95 ° c kokesonen og la den hvile her i 14 min før du returnerer platen til 65 ° c kokesonen for en annen 30 s. Fjern platen fra kokesonen og la den avkjøles til romtemperatur.
  13. Mål intensiteten av UV-lampen før eksponering og bruke denne til å bestemme eksponeringen varighet som kreves for å oppnå en total eksponering dosering av 260 mJ/cm2. Plasser photomask (emulsjon side ned) på den photoresist filmen, og Plasser platen under UV-lyskilde. Utsett platen med en UV-lampe inntil det oppnås en total eksponering på 260 mJ/cm2 .
  14. Etter eksponering bake ved hjelp av to varmeplater (65 ° c og 95 ° c) på følgende måte: la platen sitte ved 65 ° c for 60 s før du overfører platen til den 95 ° c kokesonen og etterlater den her for 4,5 min. Returner platen til den 65 ° c kokesonen for ytterligere 30 s å fullføre etter eksponering bake.
  15. La platen avkjøles til romtemperatur på en stabel med mikrofiber vev. Utvikle kjeks ved å overføre den til en Petri parabol fylt med mrDev-600 fotoleder å starte utviklingsprosessen. Utviklingen er akselerert når den utføres på en stasjonære shaker og hele kjeks er nedsenket i utbygger.
  16. Skyll wafer med isopropanol og bruk et stereo mikroskop for å kontrollere wafer overflaten for eventuelle photoresist rester. Hvis photoresist rester kan sees, og deretter returnere wafer til utbygger. Når den er fullt utviklet, kan du bake photoresist ved å plassere platen på en kokeplate satt til 150 ° c i 1 time.
  17. Silanize begge wafere for å hindre vedheft av PDMS under Soft-litografi prosesser. For å utføre silanisering, Pipet 2-3 dråper (per wafer) av silan i et lite hetteglass. Plasser dette hetteglasset sammen med wafere i et desikator og trekk vakuum i 5-10 min. forsegle desikator og la wafere være under vakuum i en periode på 12 – 16 timer.
    FORSIKTIG: silan er giftig og bør ikke innånding. Pass på at du arbeider i en avtrekksvifte og bruker hansker i nitril når du håndterer silan. Dette inkluderer å plassere vakuumpumpen i avtrekks panseret når du trekker vakuum på desikator.
  18. Løsne vakuum fra desikator og fjern silanized wafere. Skyll med vann og bruk en damp av N2 for å tørke av wafere. På dette punktet wafere kan plasseres i lagring inntil nødvendig.

2. mikrovæskebasert enhet fabrikasjon

Merk: Soft-litografi prosessen brukes til å dikte PDMS baserte flerlags mikrovæskebasert enheter kan deles inn i tre forskjellige trinn: 1) PDMS utarbeidelse av både flyt og kontroll lag, 2) justeringen og liming av de to PDMS-lagene, 3) ferdigstillelse av enheten.

  1. PDMS forberedelse
    1. Forbered to PDMS forløper løsninger ved å kombinere base og herding agenter i et plast beger og bruke en blanding stang å røre de to komponentene til fullt blandet. Kontroll laget krever 20 g base agent og 1 g herding agent (20:1 ratio). Strømnings laget krever 40 g av base agent og 8 g av herding agent (5:1 ratio). Degas løsningene i en desikator.
    2. Plasser Flow Layer wafer i en Petri parabol og hell 5:1 ratio PDMS blanding over wafer. Degas av PDMS i 30 min for å fjerne luftbobler.
    3. Spin coat kontroll laget wafer (tilberedt ved hjelp av negative SU8 3050photoresist) med 20:1 ratio PDMS. Hell 5-10 mL av PDMS på midten av platen og Kjør følgende spin-protokoll (Behold venstre over PDMS for senere bruk): snurr på 500 RPM for 15 s (100rpm/s), Øk spin-hastigheten til 1450 RPM (300 RPM/s) for 45 s , og avta deretter platen til 0 RPM (200 RPM/s).
    4. For å sikre en homogen PDMS filmtykkelse, plasser PDMS belagt wafer på en plan overflate i en lukket Petri parabolen (for å unngå støv forurensning). La platen sitte i 30 minutter.
    5. Fjern strømnings laget fra desikator og plasser både strømnings-og kontroll lagene i en ovn (80 ° c). Cure begge lag for 28-30 min og fjerne når PDMS er formbare nok til å manipulere, mens resterende litt klissete. Fortsett umiddelbart med Justeringsprosessen.
  2. Justering og liming
    1. Bruk en skalpell til å fjerne hver av de fire enhetene fra PDMS på flyt lag platen. Ved å fjerne PDMS laget fra silisium wafer, umiddelbart dekke funksjonen side med Scotch tape for å unngå støv partikkelforurensning.
    2. Grovt justere flyten lag blokkene på kontroll laget av øyet, plassere funksjonen siden av enheten i kontakt med kontroll laget PDMS. Deretter foreta fine justeringer i plasseringen av hver av flyten lag blokkene for å justere kanalene i strømnings laget med kontroll laget kanaler, ved hjelp av en stereo mikroskop for å hjelpe i visualisering av justeringer.
    3. Påfør Trykk for å fjerne luftlommer mellom de to PDMS-lagene. Hell de resterende 20:1 ratio PDMS lagret tidligere rundt justert flyt lag blokker. Plasser 100 g vekter på hver av enhetene for å sikre tilstrekkelig kontakt under bindingsprosessen.
    4. Returner de justerte enhetene (inkludert vektene) til 80 ° c ovnen og la dem til bånd i minst 1,5 t og ikke lenger enn 6 timer.
  3. Avslutte enheten
    1. Fjern kjeks fra ovnen og trekke ut hver av de enkelte enhetene fra kontroll laget wafer, dekker funksjonen siden av hver enhet med Scotch tape.
    2. Iteratively, punch et enkelt hull for hver av de 9 flyt laget viker, 24 kontroll lag kanal innganger, og enkelt flyt lag utløp av hver enhet. Punch enheten med funksjonen siden vendt opp, ved hjelp av et kamera for å sikre hull er stemplet innenfor funksjonen grenser.
    3. For hver enhet, rengjør et enkelt mikroskop lysbilde med isopropanol og aceton og tørk lysbildene under en strøm av N2. Deretter plasserer du objektglassene på en varm plate som er satt til 150 ° c i 15 minutter.
    4. Bruk oksygen plasma blinkende å binde PDMS enheter til glass lysbilder, bruke en blinkende effekt av 50 W for 45 s. Kontroller at funksjonssiden på enheten vender oppover når den blinker. Når du er ferdig, plasserer enheten funksjonen side ned på glasset lysbildet, legge press for å fjerne fanget gass mellom flatene.
    5. Plasser de sammenkoblede enhetene på en varm plate satt til 110 ° c for 1 t. vekter kan plasseres på toppen av enhetene for å forbedre vedheft av enheten.

3. Maskinvareoppsett

Merk: for å oppnå kontroll over mikrovæskebasert chips, mange deler av maskinvaren må være installert og koblet sammen med hverandre. Det kreves tre forskjellige maskinvare grupper: 1) pneumatisk kontrollsystem for kontroll kanalene, 2) et pneumatisk trykk regulator for å kontrollere flyten av reaksjons reagensene i enheten, og 3) et kjølesystem for å kjøle ned IVTT reaksjons løsning før injeksjon i den mikrovæskebasert enheten. Du finner en oversikt over maskinvareoppsettet i figur 1. Det bør bemerkes at protokollene gitt her forsøke å være så generell som mulig, men visse spesifikke deler av utstyr som brukes i vår forskning er referert. All maskinvare kan erstattes av alternativer i stand til å utføre den samme funksjonen. I slike tilfeller kan protokollene her brukes til å skissere de generelle trinnene som kreves for å sette opp systemet og kravene til hver av komponentene. Alternative hardware oppsett er presentert av Brower et al.48 og hvit og Streets49.

  1. Pneumatisk styringssystem (se figur 2)
    1. Ved hjelp av produsentens protokoll etablerer du en TCP-tilkobling mellom felt busskontrolleren og bruker arbeidsstasjonen. Bruk kontrollprogramvare (leveres som tilleggsfiler) til å komponere MODBUS-kommandoer som sendes via TCP-tilkoblingen til kontrolleren, og betjen magnetventilene.
    2. Utvid felt busskontrolleren med åtte 4-kanals digitale utgangs moduler, én for hver magnetventil som brukes. Hver magnetventil presiderer over en forbindelses pinne. Koble den positive ledningen til en av de fire positive utgangene på en av de digitale utgangs modulene mens du kobler den negative ledningen til en av bakke portene til de digitale utgangs modulene.
      Merk: for å få systemet til å fungere riktig, bør solenoider kobles systematisk, med den første magnet som kobles til den første utgangen, den andre magnet til den andre utgangen port og så videre. I vårt system brukes to ventil rekker med henholdsvis 8 og 22 magnetventiler. Utganger 1-8 koble til 8-ventil array, og utganger 9-30 koble til 22-ventil array.
    3. Koble begge ventil rekker til en trykkluftkilde ved hjelp av 1/4 "slange. Bruk trykk regulatorer for å sette trykket på 22-ventil array til 3 bar, og 8-ventil array til 1 bar.
  2. Regulering av strømnings trykk (se Figur 3)
    Merk: for å strømme væsker gjennom strømnings laget til den mikrovæskebasert enheten, brukes en kommersielt tilgjengelig 4-porters trykk regulator. Utgangs trykket for hver port reguleres via programvare som leveres med trykk kontrolleren. Koble trykk regulatoren til en datamaskin med den med følgende USB-kontakten.
    1. Koble trykk regulatoren til en trykkluftkilde, slik at det leverte trykket ikke overstiger det maksimale trykket som er tillatt av regulatoren.
    2. Koble en mannlig luer å 3/32 "Barb kontakt til hver av de fire kvinnelige luer låse utganger av trykk regulator. Koble en lengde på myk slange (OD: 3 mm, ID: 1 mm, L: 10 cm) til Barb.
    3. Koble en andre mannlige luer til 3/32 "Barb kontakten til den åpne enden av den myke slangen og fest dette til væsken reservoaret kontakten porter.
    4. Bruk den med følgende programvaren til å stille inn ønsket Trykk på hvert uttak av strømnings regulatoren, pressurising reagensene som er lagret i reservoarene, for å føre til at reagensene flyter inn i den mikrovæskebasert enheten. Tilkoblingen av reservoarene til den mikrovæskebasert enheten vil bli diskutert i avsnitt 4,2.
  3. Kjøle oppsett for off-chip (se Figur 4)
    1. Bruk PVC-slange (OD: 10 mm, ID: 6 mm) for å koble vann kjølesystemet til vann blokken med kald plate ved hjelp av kompresjons beslag. Fyll væsken reservoaret av vann-kjøling system med en kjølevæske og forsiktig vippe enheten for å fortrenge noen fanget luft, kontinuerlig legge kjølevæske til reservoaret for å sikre at den forblir full. Når all gassen er fjernet fra systemet, fyll reservoaret til ca 90-95% av sitt maksimale volum.
    2. Coil PTFE slange (OD: 0,042 ", ID: 0,022") på kalde ansiktet av Peltier element og sikre dette med tape. Sørg for at den ene enden av PTFE-slangen er koblet til reservoarene i strømnings lags trykk kontrollsystemet (som beskrevet i avsnitt 4,3). Den andre enden av PTFE-slangen skal ikke stikke mer enn 1 cm fra Peltier-overflaten. Sett inn en 5 – 10 cm lang PEEK-slange (OD: 0,794 mm, ID: 0,127 mm) i den utstikkende enden av PTFE-slangen. Fylling av slangen og forbindelsen til mikrovæskebasert enheten forklares nærmere i avsnitt 4,3.
    3. Plasser det varme ansiktet til Peltier-elementet på den kalde platen på vann blokken, og bruk tilstrekkelig termisk forbindelse til de to ansiktene. Sørg for at slangen, Peltier-elementet og kjøle blokken er i direkte kontakt med hverandre til enhver tid.
    4. Koble Peltier-elementet til temperatur kontrolleren (via en seriell buss kontakt), slik at spenningen som leveres til Peltier, kan reguleres. Plasser en termistor på Peltier-overflaten på en sikker måte, og koble utgangen til temperatur kontrolleren. Når du har slått på vannkjøleren, tilpasser du spenningen som følger med Peltier, til temperaturen er stabil ved 4 ° c.
      Merk: med dette oppsettet, er Peltier temperaturen styres manuelt ved å tilpasse den med følgende spenning, mens termistor tjener bare til å overvåke temperaturen.

4. klargjøre et eksperiment

Merk: før du starter et eksperiment, må den mikrovæskebasert enheten klargjøres, og reaksjons reagensene må settes inn i riktig slange for injeksjon i enheten. Denne delen vil drøfte: 1) tilkobling av kontroll kanal slangen til enheten, 2) tilkobling av ukjølt tilsig reagenser til enheten, og 3) tilkobling av avkjølt tilsig reagenser til enheten.

  1. Koble til kontroll kanal slangen
    1. For hver av kontroll kanalene til den mikrovæskebasert enheten, kutt en lengde på slangen (OD: 0,06 ", ID: 0,02"). I den ene enden, sett pinnen av en 23 G, 1/2 "luer spire og på den andre setter inn en rustfritt stål forbindelses pinne (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm).
    2. Koble luer stub til en mannlig luer til 3/32 "Barb nylon kontakt. Sett den Barb av kontakten inn i en lengde på polyuretan slange (OD: 4 mm, ID: 2,5 mm). Sett denne polyuretan slangen direkte inn i en av magnetventilene.
    3. Fest en 23 G, 1/2 "luer spire til en sprøyte og sett den inn i et kort (3-4 cm) stykke (OD: 0,06", ID: 0,02 "). Plasser den åpne enden av denne slangen i et reservoar av ultrarent vann og fyll sprøyten med ultrarent vann.
    4. Nummerere hver kontroll kanal for den mikrovæskebasert enheten som vist i figur 5. For hver kanal (unntatt kontroll kanaler 1 til 3, som ikke er fylt med vann), finne tilsvarende slange (koblet til magnetventilene) og sette inn en metallpinne i den åpne enden av slangen festet til sprøyten. Injiser vann i kontroll kanal slangen til halve lengden er fylt.
    5. Koble slangen fra sprøyten og sett koblings pinnen i rustfritt stål inn i det tilsvarende hullet på den mikrovæskebasert enheten. Gjenta for alle kontroll kanaler.
    6. Bruk kontroll grensesnittet til å åpne alle magnetventilene. Dette vil pressurize væsken innenfor kontroll kanalen slangen, tvinger den inn i mikrovæskebasert enheten og lukke alle membran basert ventiler i enheten. Et eksempel på åpne og lukkede membraner i enheten er gitt i figur 6.
  2. Koble ukjølt reagenser til enheten
    1. For hver av de ukjølt reagensene, kutt en lengde på slangen (OD: 0,06 ", ID: 0,02") for å koble reservoaret utløp til mikrovæskebasert enheten viker.
    2. Ta den ene enden av slangen og sett den inn i reservoaret, slik at slangen når bunnen av reservoaret. Rør uttaket i reservoaret skal strammes slik at det oppnås en lufttett forsegling. Sett inn en tilkoblings pinne i rustfritt stål (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm) i den åpne enden av slangen.
    3. Fest en 23 G, 1/2 "luer stub til enden av en liten (1 mL) sprøyte. Legg til en kort lengde på slangen (OD: 0,06 ", ID: 0,02") til luer stub. Plasser enden av slangen i ønsket reagens løsning, fyll sprøyten med reagens.
    4. Sett koblings pinnen i rustfritt stål inn i polyuretan slangen som er koblet til sprøyten og fyll slangen med reagens. Ved bruk av små reaksjons volumer kommer ikke reagens inn i reservoaret, og selve slangen vil fungere som reservoaret. Koble fra sprøyten og sett tilkoblings pinnen inn i et av innløps hullene på mikrovæskebasert enheten.
    5. Påfør press på hver av reservoarene ved hjelp av trykk regulator programvare for å tvinge reagensene inn i mikrovæskebasert enheten.
  3. Koble avkjølt væske til mikrovæskebasert enheten
    1. Sørg for at vannkjøleren og Peltier-elementet er slått på, med overflatetemperaturen til Peltier-settet til 4 ° c. Monter kjøle oppsettet så nær den mikrovæskebasert enheten som mulig, og minimere det ukjølt volumet mellom Peltier og enhetens innløp.
    2. Koble den åpne enden av PTFE-slangen til slangen som er koblet til et av væske reservoarene (som beskrevet i avsnitt 4,2) ved hjelp av en kontakt pinne i rustfritt stål (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm).
    3. Koble en liten sprøyte (1 mL) til en luer spire (23 G, 1/2 ") med en kort lengde på slangen (OD: 0,06", ID: 0,02 ") festet til enden. Fyll sprøyten med å-være-avkjølt reagens (her, IVTT reaksjons løsning).
    4. Koble PEEK-slangen til sprøyten via binde slangen, og bruk konstant trykk på sprøyten, og tvinger reagens gjennom PEEK-slangen og inn i PTFE-slangen. Koble PEEK-slangen fra sprøyten og sett den direkte inn i en av strømningskanal inntak på den mikrovæskebasert enheten. Når trykket er brukt via trykk regulator programvare den avkjølte reagens vil bli tvunget inn i mikrovæskebasert enheten.

5. eksperimentering

Merk: før du utfører eksperimenter, må alle maskinvare-og slange tilkoblingene som er beskrevet i protokoller 3 og 4, være fullført, og alle reagensene må være koblet til enheten. Den eksperimentelle prosedyren kan deretter deles inn i fire atskilte deler: 1) lasting av mikrovæskebasert enhet, 2) klargjøre mikroskopet, 3) kalibreringen av enheten, og 4) utføre eksperimentet. Det egendefinerte grensesnittet for virtuelt kontroll (se figur 7) som brukes i denne undersøkelsen, leveres som en tilleggsressurs via materiallisten.

  1. Legge i mikrovæskebasert enheten
    1. Plasser mikrovæskebasert enheten, med alle kontroll og Flow lag slange festet i mikroskopet scenen og lukk eventuelle åpninger på inkubator. Still inn omgivelsestemperaturen på inkubator til 29 ° c. Kontroller at kjølesystemet er slått på og at det er satt til 4 ° c før forsøket starter.
    2. Sørg for at alle strømnings-og kontroll kanalene er under trykk. Sett trykket på kontroll kanaler 1-3 på 1 bar, og pressurize kontroll kanaler 9-29 på 3 bar. Reagensene krever et trykk på mellom 20 og 100 mbar som skal brukes på væsken reservoarer ved hjelp av trykk regulator programvare.
    3. Fjern luft fra den mikrovæskebasert enheten med en av reagensene. Lukk enhetens utløp (pressurize kontroll kanal 29) og samtidig depressurize kontroll kanaler 1-3, og 15-28. Deretter depressurize kontroll kanalene i multiplekser selektivt for å la den valgte reagens strømme inn i enheten. Bruk mikroskopet til å overvåke luft fjerning.
      Merk: Hvis reagenser ikke lastes inn i enheten riktig, eller at luftboblene ikke blir fjernet, kan trykket økes til 350 mbar.
    4. Sørg for at alle reagenser flyter riktig, uten å innføre luft-ved hjelp av flush -funksjonen i Kontrollprogramvaren. Overvåking av væskestrømmen kan forenkles ved først å laste en fluoroforen og overvåke dens forskyvning av individuelle reagenser.
  2. Klargjøre mikroskopet
    1. Bruk mikroskopet til å finne noen punkter av interesse (ett enkelt punkt innenfor hver reaktor er tilstrekkelig) i den mikrovæskebasert enheten, og lagre koordinatene til disse. Disse punktene vil bli avbildet under kalibrering og eksperimentelle prosesser.
      Merk: under kalibrerings-og eksperiment prosedyrene som er inkludert i Kontrollprogramvaren, blir mikroskopet instruert til å ta bilder med jevne mellomrom før koordinatene ble lagret. For å oppnå dette kommuniserer Kontrollprogramvaren med mikroskop programvaren, og informerer den om å ta opp nye bilder. Denne kommunikasjonen er unik for hvert mikroskop oppsett, og dermed har denne funksjonaliteten blitt endret i det angitte programvaregrensesnittet. Forutsatt er en dummy kjørbar, som kan endres av sluttbrukeren for kompatibilitet med egne mikroskop system.
  3. Kalibrere mikrovæskebasert enheten
    1. Bestem væskevolumet fordrevet fra hver reaktor under et enkelt tilsig trinn (pumpe sekvens levert av peristaltically actuating kontroll kanaler 15-17, bestående 6 MODBUS kommandoer utføres sekvensielt), ved å kjøre kalibrerings protokollen som er angitt i programvarepakken.
    2. Angi følgende datafelt i Kontrollprogramvaren: eluering buffer Channel, Fluoroforen Channel, antall fortynning sykluser (standard er 10 fortynninger), antall tilsig trinn (standard er 15 trinn), antall blanding sykluser (standard er 4 sykluser), og tid mellom blandings sykluser (standard er 0 sekunder). Start kalibreringen ved å trykke på Utfør kalibrerings eksperiment.
      Merk: under kalibreringsprosessen er alle reaktorer fylt med en fluoroforen, og bildene tas opp. Deretter utføres en rekke fortynninger der en eluent måles i reaktorer (basert på det innstilte antall tilsig trinn), og dermed fortrenge fluoroforen. Etter grundig miksing, nye bilder er tatt. Denne prosessen gjentas for det angitte antallet Fortynnings sykluser.
    3. Når kalibreringen er fullført, følger du trinnene som presenteres av Kontrollprogramvaren, og fullfører analysen av kalibrerings eksperimentet.
      Merk: analysen vil gi brukerne oppdaterings forholdet for hver reaktor basert på fluorescens reduksjon som er registrert under hver fortynnings syklus. Denne verdien angir brøkdelen av reaktoren volumet fordrevne av innstilt antall tilsig trinn. Denne verdien vil i sin tur bli brukt under eksperimenter for å fastslå hvor mange tilsig trinn som kreves for å fortrenge et bestemt reaktor volum.
  4. Utføre eksperimentet
    1. Angi de nødvendige verdiene for det ønskede eksperimentet i det virtuelle kontroll grensesnittet. Kritisk er oppdaterings fraksjonen [%] som bestemmer reaktoren volum fordrevne per eksperimentell syklus og bør settes mellom 15 og 40%.
      Merk: den spesifikke eksperimentelle protokollen avgjør hvilke felter i kontroll grensesnittet som skal stilles før eksperimentet startes. Noen mindre koding vil være nødvendig for å tilpasse kontroll grensesnittet for romanen eksperimenter.
    2. Start den eksperimentelle protokollen ved å trykke på Utfør eksperiment knappen i kontroll grensesnittet.
      Merk: uendret, den med følgende programvaren initierer et enkelt protein uttrykk. Reaktorer 1 og 8 er benyttet som kontroller, mens reaktorer 2-7 huset identiske eksperimenter. 75% av reaktor volumet består av IVTT-løsning, og 25% er enten ultrarent vann eller en 2,5 nM lineær DNA-løsning. Fortynninger forekommer hvert 15. minutt, og 30% av reaktor volumet blir forskjøvet per fortynning. Bildene registreres ved slutten av hver fortynnings syklus.

6. data analyse

Merk: skript har blitt gitt for analyse av bildene (se supplerende filer eller tabellen av materialer), gjør bruk av ' bfopen ' analysepakke, som er nødvendig for gjennomgang av '. nd2' filer (levert av våre mikroskop oppsett).

  1. Løpe analysen skriften 'calibrationScript. m' og en gang spørsmål velge det ønsket '. nd2' arkiv. Et enkelt reaktor bilde vil bli vist som den korrekte bilde intensiteten kan fastslås. Bruk glidebryteren for å optimalisere bilde intensiteten slik at kantene på den mikrovæskebasert kanalen er godt synlig.
  2. Et bilde av reaktoren vil bli vist. I dette bildet velger du et område inne i reaktor kanalen der fluorescens intensitet skal fastsettes.
    Merk: fluorescens intensitet for hver reaktor, for hvert innspilte bildet vil bli bestemt med resultatene vises i et enkelt plott, slik at visualisering av resultatene.

Representative Results

For å demonstrere effektiviteten til flerlags mikrovæskebasert-plattformen for gjennomføring av IVTT-eksperimenter, ble det beskrevne oppsettet brukt til å uttrykke deGFP-proteinet. Eksperimentet ble gjennomført i en kommersielt tilgjengelig30 IVTT reaksjons blanding-bestående av alle nødvendige transkripsjon og oversettelse støpejernskomponenter-supplert med reaksjons UNDERLAG og DNA-maler. Eksperimenter ble utført ved en temperatur på 29 ° c; en temperatur funnet å være optimal for IVTT uttrykk for proteiner.

Den mikrovæskebasert enheten besitter ni unike viker, hvorav fire ble utnyttet i løpet av dette eksperimentet. Den første inneholdt kommersielt innhentet IVTT reaksjonsblandingen. IVTT reaksjons blanding passer til alle komponentene som kreves for å kunne uttrykke proteiner, men renset Ben ble tilsatt til reaksjonsblandingen-i en endelig konsentrasjon på 1,3 μM-før lasting i mikrovæskebasert enhet. Tillegg av Ben proteinet tjener til å minimere nedbrytning av lineære DNA-arter når du utfører eksperimentene. Avgjørende, IVTT blandingen ble injisert i polytetrafluoretylen (PTFE) slange spiral på et Peltier-element med en overflatetemperatur på 4 ° c for å avkjøle oppløsningen før injeksjon derav inn i mikrovæskebasert enheten; hindre nedbrytning av reaksjons løsningen før bruk. Micro-bore polyeter Eter keton (PEEK) slangen ble brukt til å koble PTFE slangen forlate Peltier element overflaten med mikrovæskebasert enheten, redusere volumet av IVTT reaksjonsblandingen ikke blir avkjølt. Den andre løsningen settes inn i enheten inneholdt den lineære DNA mal koding for deGFP-oppløst i ultrarent vann-ved en konsentrasjon på 10 nM. Den tredje løsningen, ultrarent vann, servert flere formål under eksperimentelle prosedyrer. Primært ble ultrarent vann brukt for å sikre at fordrevne volum per fortynning var lik for alle reaktorer, fungerer som en erstatning for DNA i kontroll reaksjonene. I tillegg ble ultrarent vann også brukt til å fortynne fluoroforen under kalibrering av enheten og til å skylle det døde volumet på enheten ved bytte mellom reagenser. Den endelige løsningen som ble satt inn i enheten, var en renset FITC-dextran-løsning (25 μM) som kreves for å utføre den første enhets kalibreringen. DNA, vann og fluoroforen løsninger ble injisert i rør (0,02 "ID, 0,06" OD) som senere kunne settes inn i en av tilsig kanaler av mikrovæskebasert enheten som per seksjon 4,2 av protokollene. Disse løsningene ble lagret ved 29 ° c for helheten av eksperimentene.

Aktiveringen av kontroll kanalene til den mikrovæskebasert enheten oppnås via tilpasset kontrollprogramvare der hver av kontroll kanalene kan betjenes individuelt. Utførelsen av forlenget IVTT-reaksjoner kan ikke oppnås via denne manuelle prosessen og krever bruk av automatiserte protokoller innlemmet i Kontrollprogramvaren. Når du klargjør en mikrovæskebasert enhet for eksperimenter, kan lignende automatiserte protokoller utnyttes til å utføre en rekke nyttige prosesser: Flushing av enheten døde volum med en ny reagens, blanding av reagensene i ringen reaktoren, og lasting av en ny reagens i reaktoren mens fortrenge et lik volum av den nåværende løsningen. I tillegg er to komplekse prosessen tilgjengelig: gjennomføring av en enhet kalibrering, og gjennomføringen av en langvarig celle-fri protein uttrykk. Alle de nevnte prosessene kan enkelt utføres fra de viktigste grensesnittet, sammen med muligheten til å konfigurere flere parametre for å variere spesifikke prosessinnstillinger som tilsig kanal, tilsig volum, og miksing varighet.

På grunn av svingninger i trykk og ufullkommenheter under mikrovæskebasert av enheten, kan volumet av væske som forskyves under en enkelt injeksjons syklus variere fra enhet til enhet. Som sådan, før du utfører IVTT eksperimenter, det fordrevne reaktoren volum per injeksjon syklus (refresh brøk) ble bestemt. Denne kalibreringen krever fylling av alle åtte reaktorer med en fluorescerende Referanseløsning. I dette tilfellet ble det brukt en renset FITC-dextran-løsning (25 μM). Deretter blir reaktorer fortynnet 10 ganger med ultrarent vann. Ved å måle reduksjonen i fluorescens per fortynnings syklus for hver reaktor, ble volumet av væske som ble forskjøvet under en enkelt injeksjons syklus, bestemt. I Kontrollprogramvaren ble denne verdien ( oppdaterings forholdet) registrert for bruk under IVTT-eksperimentet. Avgjørende, for å gjøre rede for variasjoner i strømningshastigheten på tvers av enheten, samt avvik i de enkelte reaktor volumene, er oppdaterings forholdet fastslått og lagret for hver enkelt reaktor. Sekvensen av fylling og fortynning av reaktorer ble utført automatisk ved hjelp av Utfør kalibrerings program som utgjør en del av Kontrollprogramvaren. Resultatene av kalibrerings eksperimentet vises i Figur 8.

Den mest komplekse pre-programmerte prosessen utfører en lang varighet IVTT eksperiment, slik at brukerne kan starte eksperimentet og deretter tillate det å operere uovervåket til ferdigstillelse. Gjennom eksperimentet, reaktorer 1 og 5 ble brukt som blanks, med bare vann legges til reaktorer under fortynninger. Reaktorer 2 og 6 ble benyttet som negative kontroller og inneholdt bare IVTT reaksjons oppløsning og ultrarent vann. De resterende reaktorer (3, 4, 7 og 8) inneholdt IVTT reaksjons løsninger og 2,5 nM for lineær DNA-koding for deGFP-genet. Initialiseringen av reaktorer oppnås ved fullt fylle alle reaktorer (unntatt 1 og 5) med IVTT reaksjons løsning, før 25% av reaktor volumet ble fordrevet med ultrarent vann. Heretter ble den periodiske injeksjon av reagenser i reaktorer igangsatt. Eksperimentet ble gjennomført slik at nye reagenser ble injisert i reaktorer hvert 14,7 minutter, med 30% av reaktoren volumet blir fordrevet under hver fortynning syklus. Sammensetningen av hver injeksjon var slik at 75% av injisert væsken bestod av frisk IVTT-oppløsning, mens de resterende 25% besto av enten DNA eller ultrarent vann. Etter hver injeksjon av nye reagenser ble reaktorer kontinuerlig blandet, hvoretter et fluorescens bilde av hver reaktor ble registrert ved hjelp av mikroskopet. Reaksjonen ble senere lov til å kjøre kontinuerlig for 68 sykluser, noe som resulterer i en eksperimentell varighet på 16,5 h. Resultatene av dette eksperimentet er gitt i figur 9.

Når du utfører forlenget IVTT eksperimenter, er det to hovedårsaker til svikt i en reaksjon; innføringen av luft inn i den mikrovæskebasert enheten eller nedbrytning av IVTT reaksjons løsning. Forekomsten av luft i mikrovæskebasert enheten er oftest det direkte resultatet av små luftbobler eksisterende i tilsig løsninger, som senere injiseres i mikrovæskebasert enheten. Ved inn i enheten, hemmer tilstedeværelsen av luft den riktige flyten av væsker, hvorved reaksjonene er ikke lenger periodevis fornyet fører til dannelsen av batch reaksjoner i reaktoren ringene. I noen tilfeller fjernes luften langsomt fra enheten ved gjentatt tømming av reagenser, hvoretter reaksjonen fortsetter etter hensikten (som vist i figur 9). I andre tilfeller luften forblir fanget, og kan bare fjernes ved å avbryte eksperimentet og deretter bruke kontinuerlig (høyt) Trykk til Flow laget av mikrovæskebasert enheten, analogt til fylling prosessen beskrevet i § 5,1 av protokollene. I løpet av våre eksperimenter lagres celle lysat i PTFE-slangen på et Peltier-element avkjølt til 4 ° c. Begge tiltakene bidrar til å begrense nedbrytning av IVTT reaksjons løsning over tid, med inert PTFE-slangen som sikrer begrenset interaksjon mellom slangen og reaksjons løsningen og de kalde temperaturene som bevarer den funksjonelle (bio) molekylære støpejernskomponenter som kreves for å utføre IVTT. Bør nedbrytning av reaksjons løsningen oppstå-som et resultat av utilstrekkelig kjøling eller uønsket interaksjon mellom reaksjons løsningen og lagringsmiljøet-da dette vil vise seg eksperimentelt som en gradvis reduksjon av protein uttrykk over tid. Når degradert, kan IVTT reaksjons løsning ikke gjenopprettes, og et nytt eksperiment bør være forberedt.

Figure 1
Figur 1. Maskinvareoppsettet som kreves for å utføre kontinuerlige IVTT-reaksjoner. A) skjematisk av maskinvareoppsettet. B) fotografiet av oppsettet som ble brukt i dette manuskriptet. Implementeringen av en flerlags mikrovæskebasert enhet for kontinuerlige IVTT-reaksjoner krever et omfattende Maskinvareoppsett for å regulere strømnings trykket, betjene kontroll kanaler, varme og kalde reaksjoner og reagenser, lagre væsker og bildeenheten under Eksperimenter. Eksperimenter utføres ved temperaturer på 30 ° c, noe som oppnås ved å plassere mikroskopet i en inkubator som er satt til denne temperaturen. For å hindre forringelse av IVTT reaksjons løsning, er det lagret i PTFE-slangen spiral over den kalde ansiktet til et Peltier-element. Temperaturen på Peltier-elementet er satt til 4 ° c, med en Vannkjøler og vann blokk som brukes til å opprettholde denne temperaturen. Reagenser som ikke krever kjøling, oppbevares i væske reservoarer utenfor inkubator. Konstant trykk er brukt på disse reservoarene av en Datastyrt Trykk regulator. På denne måten blir væskene tvunget gjennom utløps slangen av reservoarene, som kobles direkte til tilsig kanaler av mikrovæskebasert enheten. Hver av kontroll kanalene til den mikrovæskebasert enheten er koblet til en pneumatisk ventil. Hele ventil tabellen er under konstant trykk. Åpne ventilen, gjør det mulig for trykksettingen av væsken i slangen som forbinder den pneumatiske ventilen til kontroll kanalen på den mikrovæskebasert enheten, og dermed åpne og lukke PDMS-membraner som finnes i mikrovæskebasert enheten. De pneumatiske ventilene åpnes og lukkes via et brukergrensesnitt som befaler en felt busskontroller (ikke vist) for å åpne og lukke spesifikke pneumatiske ventiler. Figur tilpasset fra Yelleswarapu et al.22. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Oversikt over oppsettet av pneumatisk ventil og kontroll kanaltilkobling. En 8-ventil array er vist med Trekontroll kanal tilkoblinger montert på ventiler 1, 2 og 3. Trykkluft kan tilføres til ventil rekken via 1/4 "slange. For doser av kontroll kanaler brukes to trykk: 1 bar for lavere trykk kontroll kanaler (1, 2 og 3) og 3 bar for høyere trykk kontroll kanaler (9 til 30, ikke vist her). Slangen kan fylles med ultrarent vann og settes inn i en av kontroll kanalen viker med en rustfritt stål kontakt PIN. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Oversikt over den kommersielle strømnings trykk regulator og reservoar system. En kommersielt tilgjengelig trykk regulator brukes til å injisere væsker i strømnings laget til flerlags mikrovæskebasert-enheten. Koble trykk kontrolleren til en datamaskin gir modulering av trykket som brukes til å utføre væsken injeksjoner. Reagenser kan oppbevares i et væske reservoar som er koblet direkte til trykk reguleringsventilen. Anvendelsen av trykk til reservoaret tvinger væsken ut av reservoaret via utløps slangen. Denne utløps slangen kan kobles direkte til en av væskeinntak av mikrovæskebasert enheten ved hjelp av en rustfritt stål kontakt pinne. Dersom reagens volumet ikke er i stand til å nå væske reservoaret, fungerer utløps slangen som et reservoar for reagens. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Oversikt over kjølesystemet som brukes til å avkjøle reaksjons reagenser. (Venstre) isolert kjøle oppsett og (høyre) kjøle oppsett plassert i mikroskopet og koblet til den mikrovæskebasert enheten. Et Peltier-element brukes til å kjøle ned IVTT reaksjons løsning før injeksjon i den mikrovæskebasert enheten. Reagens er lagret i PTFE rør spiral over den kalde-forsiden av Peltier element. En lengde på PEEK slange brukes til å overføre avkjølt væske til mikrovæskebasert enheten, med den lille interne diameter (0,005 ") minimere reagens volumet ikke lenger blir avkjølt. Ved siden av den spiral PTFE-slangen er en termistor plassert, noe som åpner for sanntids temperatur overvåking på overflaten av Peltier-elementet. Spenningen brukes til Peltier er satt slik at overflatetemperaturen på Peltier forblir mellom 0 ° c og 4 ° c. For å fjerne overflødig varme produsert av Peltier-elementet, er hot-Face av Peltier plassert mot en vannkjølt blokk, med tillegg av silikon gratis kjøleribbe fett som sikrer optimal varmeoverføring mellom de to ansiktene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5. Oversikt over mikrovæskebasert enhets design. Den mikrovæskebasert strømnings reaktoren for KONTINUERLIGE IVTT-reaksjoner består av åtte reaktor ringer, hver med et volum på 10,7 nl. Ni innganger tillater tilsig av ni unike reaksjons løsninger inn i enheten. 24 kontroll kanaler regulerer væskeflyten i enheten. Kontroll kanaler 9 til 14 danner en multiplekser. Disse kontroll kanalene bør settes under trykk til enhver tid for å hemme væskestrømmen inn i enheten. Trykfall av to kontroll kanaler samtidig gir mulighet for tilsig av en enkelt reagens. Kontroll kanaler 15, 16 og 17 brukes til å peristaltically til å pumpe reagensene inn i apparatet på en kontrollert måte. Kontroll kanaler 18 til 25 hver kontroll innløpet til en av de åtte reaktorer funnet i enheten. Kontroll kanal 26 kan lukke flush kanalen, og dermed tvinge væske inn i reaktorer. Kontroll kanal 27 hjelpemidler i homogen fylling av reaktorer. Kontroll kanaler 28 og 29 regulerer ringen reaktoren utsalgssteder og den eneste enheten utløp hhv. Til slutt, kontroll kanaler 1, 2 og 3 brukes til å peristaltically pumpe væsken i ring reaktorer, noe som resulterer i blanding av reagensene. Utformingen av denne mikrovæskebasert enheten og figuren er begge tilpasset fra Neiderholtmeyer et al.29. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6. Membran basert ventil innenfor mikrovæskebasert enheten. A) Flow Channel i mikrovæskebasert enheten. To kontroll kanaler kan sees i bakgrunnen. Disse kanalene er ikke trykksatt og som sådan ventilene er åpne (væske kan flyte). B) de to kontroll kanalene krysser flyt lag kanalene er satt under trykk, lukker ventilene (dvs. væske strømning hindres). Ved trykksetting av kontroll kanaler, den tynne PDMS membranen skille flyt og kontroll lag kanaler er forandret retning oppover (kontroll laget ligger under Flow Layer) som stenger flyten laget kanalen. Avrunding av flyt lag kanalen er avgjørende for å sikre at forandret retning membranen lukker flyt kanalen helt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7. Brukergrensesnitt som brukes til å kontrollere mikrovæskebasert enhet. Gjennom denne forskningen har et tilpasset kontroll grensesnitt blitt brukt til å kontrollere flyten av væsker i de mikrovæskebasert enhetene. Grensesnittet gjør det mulig for brukere å individuelt betjene hver av kontroll kanaler (nummerert 1-3 og 9-29), eller å utføre detaljerte protokoller som resulterer i spyling og lasting av reagenser, kalibrering av mikrovæskebasert enheten, og gjennomføringen av Eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8. Resultatene av et kalibrerings eksperiment. Under et kalibrerings eksperiment er reaktorer fylt med en fluoroforen (25 ΜM FITC-Dextran), hvoretter fluorescens intensitet registreres. Deretter, en rekke fortynninger følge, hvor et sett antall tilsig trinn (15) brukes til å injisere ultrarent vann inn i reaktorer. Etter hver fortynning blandes reagensene og fluorescens måles. Reduksjonen i fluorescens intensitet per fortynning avslører volumet av reaktoren ringen forskjøvet for det angitte antallet tilsig trinn; en verdi som kalles oppdaterings forhold. A) gjennomsnittlig intensitet og standardavvik på alle åtte reaktorer er vist i rødt, med den enkelte intensiteten spor vist i grått. B) gjennomsnittlig oppdaterings forhold og standardavvik vises for hvert fortynnings trinn i rødt. Hver enkelt reaktor er vist i grått. Det kan sees at syv av de åtte reaktorer viser svært lik atferd, men en reaktor viser svingninger i oppdaterings forholdet etter den syvende fortynning syklus. Dette fremhever behovet for unike oppdaterings prosenter for hver av reaktorer, i motsetning til å bruke et gjennomsnittlig oppdaterings forhold for injeksjon av reagenser i reaktorer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9. Resultatene fra et IVTT-eksperiment uttrykker deGFP-proteinet. En langvarig IVTT reaksjon ble igangsatt slik at 30% av reaktoren volumet er forskjøvet hvert 14,6 minutter. Reaksjonen ble tillatt å kjøre i over 16 timer før den ble avsluttet. To reaktorer av mikrovæskebasert enheten ble brukt som blanks, med bare ultrarent vann blir fløyet gjennom reaktorer gjennom hele eksperimentet (reaktorer 1 og 5). Alle de andre reaktorer omfattet 75% IVTT reaksjons løsning og 25% av enten ultrarent vann (reaktorer 2 og 6) eller 2,5 nM lineær DNA maler koding for uttrykk for deGFP (reaktorer 3, 4, 7 og 8). I alle fire reaktorer der DNA ble lagt til, er det klart deGFP uttrykk. Tre av de fire reaktorer gir lignende fluorescens intensitet, med en reaktor som viser lavere fluorescens signal. Dette kan være forårsaket av et misforhold i flyt som resulterer i mindre DNA inn i reaktoren, eller på grunn av variasjoner i reaktoren dimensjoner. Etter 14 timer, er en plutselig økning sett i signalet av reaktorer som inneholder DNA. Dette er forårsaket av en luftboble inn i flyten laget av mikrovæskebasert enheten, antagelig stammer fra en av tilsig løsninger. Fangst av luft i mikrovæskebasert enheten betydelig begrenser flyten av væsker gjennom kanaler, der ingen friske reagenser kan legges til eller fjernes fra reaktorer før luften har passert. Ved gjenopptakelse av flyt, eksperimentet tilbake til sin tidligere fluorescens intensitet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tilleggsfiler. Vennligst klikk her for å laste ned disse filene. 

Discussion

En PDMS-basert flerlags mikrovæskebasert enhet har blitt presentert, og dens evne til å opprettholde IVTT reaksjoner i lengre perioder har blitt demonstrert. Selv om denne teknologien er velegnet for dette spesifikke eksempelet, kan den tenkes brukes til en rekke andre programmer. Den ekstra kontrollen over væskestrømmen-sammen med evnen til kontinuerlig å etterfylle reaksjons reagenser mens du fjerner (av) produkter-er ideell for kontinuerlig syntese reaksjoner, etterforskningen av ulike dynamiske atferd, og samtidig gjennomføring av flere varianter av en enkelt reaksjon.

Til tross for relativt enkel fabrikasjon prosessen av PDMS baserte enheter, bruk av disse krever en omfattende hardware oppsett. Bestående ventil arrays, trykk regulatorer, trykk pumper, inkubatorer, og kjøling enheter, overgangen fra fabrikasjon til bruk er ikke elementære, og krever en betydelig innledende investering. I tillegg er evnen til å konsekvent sette opp og utføre vellykkede eksperimenter med disse enhetene krever en betydelig tid-investering; et punkt som dette manuskriptet tar sikte på å ta opp. Men, en gang på plass, hele oppsettet kan endres for en rekke formål. Videre består maskinvareoppsettet av mange modulære elementer, som hver kan utvides for å gi mer komplekse mikrovæskebasert enhets design som skal benyttes. I tillegg gjør den modulære designen utskifting av maskinvarekomponenter ved tilsvarende fungerende alternativer, slik at brukerne ikke er begrenset til det spesifikke oppsettet som er beskrevet her48,49.

Variasjon mellom individuelle enheter, og i ytre forhold (for eksempel trykksvingninger) kan føre til unøyaktigheter når du utfører eksperimenter ved hjelp av disse enhetene. For å løse dette problemet, bør en kalibrering av systemet utføres før hvert eksperiment, og gir et unikt oppdaterings forhold for hver av reaktorer. Mens kalibreringen tar for seg enhets-til-enhet-og eksperiment-til-eksperiment-variantene, er det en tidkrevende prosess og ikke feilfri. Væsker med ulik viskositeter vil ikke flyte med samme hastighet når de utsettes for identiske trykk, og som sådan utføre kalibreringen med flere reagenser kan ikke gi identiske refresh prosenter. Denne effekten dempes ved å bruke Trekontroll kanaler for peristaltically å pumpe reagensene inn i den mikrovæskebasert enheten, i motsetning til å regulere strømningen ved å variere det med følgende trykket. Som en siste utvei i tilfeller der forskjellene i viskositet er svært stor, kan et unikt oppdaterings forhold implementeres for hver enkelt reagens ved å utføre flere kalibrerings eksperimenter.

Bruken av en peristaltisk pumpe for å injisere reagenser i mikrovæskebasert enheten attenuates virkningene av å bruke løsninger med varierende viskositeter, men det skaper også et sekundært problem. Ved hjelp av diskrete trinn for å pumpe væsker inn i den mikrovæskebasert enheten, betyr det at oppløsningen av injeksjoner i en enkelt reaktor, er begrenset av volumet injisert når du utfører en enkelt pumpe syklus. Innenfor vår forskning denne verdien-bestemmes under kalibrering-er omtrent lik 1%, noe som indikerer at en enkelt pumpe syklus fortrenger ca 1% av reaktoren volum (ca 0,1 nL). Som sådan, fortrenge 30% av reaktoren volumet krever utførelse av 30 pumpe sykluser, med 23 pumpe sykluser av IVTT reaksjons løsning blir lagt til, og bare 7 pumpe sykluser av DNA eller ultrarent vann blir lagt til. Selv om det er tilstrekkelig for vår forskning, kan alternative eksperimentelle protokoller støte på problemer når du prøver å legge til større antall unike reagenser, bruke en lavere oppdaterings brøkeller legge til mindre volumer av en enkelt reagens i en reaktor. I slike tilfeller kan den mikrovæskebasert enheten design tilpasses for å gi reaktorer med et større volum. Et eksempel på dette er rapportert i Niederholtmeyer et al.36.

Enheten som er skissert i dette manuskriptet, gjør det avgjørende for at reaksjonene kan opprettholdes ved lengre tidsvarighet, noe som kan føre til transkripsjon og Oversettelses rater i steady state. Ved periodisk å injisere nye reagenser i reaktorer-og fjerne reaksjon (av) produkter-reaksjonene er vedvarende og komplekse dynamisk atferd kan overvåkes. På denne måten, en plattform har blitt opprettet som-til en viss grad-etterligner mobilnettet miljøet. Videre gjør denne plattformen utforskning av systemet dynamikk, ved å tilpasse perioden mellom injeksjoner og den spesifikke sammensetningen av injeksjoner. Som et resultat, disse flerlags mikrovæskebasert enheter er et kraftig verktøy for karakterisering og optimalisering av romanen syntetiske nettverk som viser komplekse dynamisk atferd.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av European Research Council, ERC (prosjekt n. 677313 BioCircuit) en NWO-VIDI stipend fra Nederland organisasjon for Scientific Research (NWO, 723.016.003), finansiering fra departementet for utdanning, kultur og vitenskap (Gravity programmer, 024.001.035 & 024.003.013), Human Frontier Science program Grant RGP0032/2015, European Research Council under EUs Horizon 2020 forskning og innovasjon program Grant 723106, og en Swiss National Science Foundation Grant 200021_182019.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Acetone VWR 20063.365
AZ 40 XT Merck KGaA (Darmstadt, Germany) - Positive Photoresist
AZ 726 MIF Developer Merck KGaA (Darmstadt, Germany) - Developer Positive Photoresist
Isopropanol Merck KGaA (Darmstadt, Germany) 109634
Microscope slides VWR ECN 631-1550
mr Dev 600 Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany) - Developer Negative Photoresist
Silicon Free Heat Sink Grease Circuit Works CW7270 Thermal Compound
Silicon wafers Silicon Materials - <1-0-0> orientation, 100 mm diameter, 525 µm thickness
SU-8 3050 Microchem Corp. (Newton, MA) - Negative Photoresist
Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS) The Dow Chemical Company 01317318
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931-10G
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
4 channel digital input/output module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-504 8x
Camera lens The Imaging Source -
Compression fitting Koolance, Inc. FIT-V06X10 Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x
Controller end module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-600
Device connecting tubing Saint-Gobain Performance Plastics AAD04103 0.02" ID, 0.06" OD, Tygon Tubing (ND-100-80)
Device connector pins Unimed SA (Lausanne, Switserland) 200.010-A AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L
Ethernet Controller WAGO Kontakttechnik GmbH 750-881
Female bus connector Encitech DTCK15-DBS-K 15 pole female bus connector
Fluid reservoirs Fluigent Fluiwell-4C
Fluigent pressure system Fluigent MFCS-EZ 0 - 345 mbar
Hg short arc lamp Advanced Radiation Corporation - 350W
Hot plate Torrey Pines Scientific HP61
Inverted microscope Nikon Instruments Eclipse Ti-E
LabVIEW Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Liquid coolant Koolance, Inc. LIQ-705CL-B
Luer stubs Instech Laboratories, Inc. LS23
Male Luer to barb connectors Cole Parmer 45505-32 3/32" ID
Matlab Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Microcamera The Imaging Source DMK 42AUC03
Microscope camera Hamamatsu Photonics OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)
Orbital shaker Cole Parmer EW-513000-05
Oven Thermo Scientific Heraeus T6P 50045757
Oxygen plasma asher Quorum Technologies K1050X
PDMS puncher SYNEO Accu-Pucnh MP10
PEEK tubing Trajan 1301005001-5F 0.005" ID, 1/32" OD, Red
Peltier element European Thermodynamics APH-127-10-25-S
Peltier temperature controller Warner Instruments CL-100
Photomask CAD/Art Services, Inc. -
Photomask Design Maerkl Lab, EPFL https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ
Pneumatic valve array FESTO - 1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.
Power adapter Koolance, Inc. ADT-EX004S 110/220V AC Power Adapter
PTFE tubing Cole Parmer 06417-21 #24 AWG Thin Wall PTFE
Punching pin SYNEO CR0320245N21R4 OD: 0.032" (0.8128 mm), ID: 0.024" (0.6090 mm)
PVC Tubing Koolance, Inc. HOS-06CL 6 mm ID, 10 mm OD
Single edge blades GEM Scientific -
Soft tubing Fluigent - Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)
Spin coater Laurell Technologies Corporation WS-650MZ-23NPPB
Stereo microscope Olympus Corporation SZ61
Thermistor cable Warner Instruments TA-29 Cable with bead thermistor
UV exposure system ABM, USA - Near UV Exposure System, 350W
Vacuum pump Vacuumbrand GmbH MD1C
Water cooled cold plate block Koolance, Inc. PLT-UN40F
Water cooler Koolance, Inc. EX2-755
Weighing scales Sartorius M-prove

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Roekel, H. W. H., et al. Programmable chemical reaction networks: emulating regulatory functions in living cells using a bottom-up approach. Chemical Society Reviews. 44, 7465-7483 (2015).
  2. Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics. Lab on a Chip. , (2017).
  3. Del Vecchio, D., Sontag, E. D. Dynamics and control of synthetic bio-molecular networks. Proceedings of the American Control Conference. , 1577-1588 (2007).
  4. Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 410-422 (2009).
  5. Padirac, A., Fujii, T., Rondelez, Y. Bottom-up construction of in vitro switchable memories. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E3212-E3220 (2012).
  6. Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. 439, 856-860 (2006).
  7. Genot, A. J., Fujii, T., Rondelez, Y. In vitro regulatory models for systems biology. Biotechnology Advances. 31, 789-796 (2013).
  8. Elowitz, M. B., Leibler, S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature. 403, 335-338 (2000).
  9. Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403, 339-342 (2000).
  10. Montagne, K., Plasson, R., Sakai, Y., Fujii, T., Rondelez, Y. Programming an in vitro DNA oscillator using a molecular networking strategy. Molecular Systems Biology. 7, 466-466 (2014).
  11. Khalil, A. S., Collins, J. J. Synthetic biology: applications come of age. Nature Reviews Genetics. 11, 367-379 (2010).
  12. Hockenberry, A. J., Jewett, M. C. Synthetic in vitro circuits. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 253-259 (2012).
  13. Del Vecchio, D. Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits. Trends in Biotechnology. 33, 111-119 (2015).
  14. Cardinale, S., Arkin, A. P. Contextualizing context for synthetic biology - identifying causes of failure of synthetic biological systems. Biotechnology Journal. 7, 856-866 (2012).
  15. Venturelli, O. S., et al. Programming mRNA decay to modulate synthetic circuit resource allocation. Nature Communications. 8, 1-11 (2017).
  16. Scott, M., Mateescu, E. M., Zhang, Z., Hwa, T. Interdependence of cell growth and gene expression: origins and consequences. Science. 330, 1099-1103 (2010).
  17. Borkowski, O., Ceroni, F., Stan, G. B., Ellis, T. Overloaded and stressed: whole-cell considerations for bacterial synthetic biology. Current Opinion in Microbiology. 33, 123-130 (2016).
  18. Liao, C., Blanchard, A. E., Lu, T. An integrative circuit-host modelling framework for predicting synthetic gene network behaviours. Nature Microbiology. , (2017).
  19. Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).
  20. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19, 751-755 (2001).
  21. Oberholzer, T., Nierhaus, K. H., Luisi, P. L. Protein expression in liposomes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 261, 238-241 (1999).
  22. Yelleswarapu, M., et al. Sigma factor-mediated tuning of bacterial cell-free synthetic genetic oscillators. ACS Synthetic Biology. 7, (2018).
  23. Karig, D. K., Iyer, S., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Expression optimization and synthetic gene networks in cell-free systems. Nucleic Acids Research. 40, 3763-3774 (2012).
  24. Dunlop, M. J., et al. Distinct timescales of RNA regulators enable the construction of a genetic pulse generator. Biotechnology and Bioengineering. , (2019).
  25. Yoshiyama, T., Ichii, T., Yomo, T., Ichihashi, N. Automated in vitro evolution of a translation-coupled RNA replication system in a droplet flow reactor. Scientific Reports. 8, 1-8 (2018).
  26. Iyer, S., Karig, D. K., Norred, S. E., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Multi-input regulation and logic with T7 promoters in cells and cell-free systems. PLoS ONE. 8, 1-12 (2013).
  27. de los Santos, E. L. C., Meyerowitz, J. T., Mayo, S. L., Murray, R. M. Engineering Transcriptional Regulator Effector Specificity Using Computational Design and In vitro Rapid Prototyping: Developing a Vanillin Sensor. ACS Synthetic Biology. 5, 287-295 (2016).
  28. Guo, S., Murray, R. M. Construct functional feedforward loop biological circuits in a cell-free system and in cells. ACS Synthetic Biology. , (2019).
  29. Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9, (2017).
  30. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The all E. coli TX-TL toolbox 2.0: A platform for cell-free synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5, 344-355 (2016).
  31. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  32. Lee, J. W., et al. Creating single-copy genetic circuits. Molecular Cell. 63, 329-336 (2016).
  33. Gibson, D. G., et al. Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of a mycoplasma genitalium genome. Science. 319, 1215-1220 (2008).
  34. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3, 387-397 (2014).
  35. Georgi, V., et al. On-chip automation of cell-free protein synthesis: new opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip. 16, 269-281 (2016).
  36. Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15985-15990 (2013).
  37. Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242, 1162-1164 (1988).
  38. Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345, 829-832 (2014).
  39. Timm, A. C., Shankles, P. G., Foster, C. M., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Toward microfluidic reactors for cell-free protein synthesis at the point-of-care. Small. 12, 810-817 (2016).
  40. Doktycz, M. J., Foster, C. M., Retterer, S. T., Timm, A. C., Shankles, P. G. Characterization of extended channel bioreactors for continuous-flow protein production. Journal of Vacuum Science & Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 33, 06FM02 (2015).
  41. Khnouf, R., Beebe, D. J., Fan, Z. H. Cell-free protein expression in a microchannel array with passive pumping. Lab on a chip. 9, 56-61 (2009).
  42. Siuti, P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. Continuous protein production in nanoporous, picolitre volume containers. Lab on a Chip. 11, 3523-3529 (2011).
  43. Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16, 2168-2187 (2016).
  44. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: Application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synthetic Biology. 1, 29-41 (2012).
  45. Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, 1-18 (2015).
  46. Galas, J., Haghiri-Gosnet, A. -M., Estévez-Torres, A. A nanoliter-scale open chemical reactor. Lab on a Chip. 13, 415-423 (2013).
  47. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288, 113-116 (2004).
  48. Brower, K., et al. An open-source, programmable pneumatic setup for operation and automated control of single- and multi-layer microfluidic devices. HardwareX. 3, 117-134 (2018).
  49. White, J. A., Streets, A. M. Controller for microfluidic large-scale integration. HardwareX. 3, 135-145 (2018).

Tags

Bioteknologi materialer in vitro transkripsjon og oversettelse syntetisk biologi langvarige reaksjoner mikro-reaktorer protein uttrykk
En flerlags Mikrovæskebasert plattform for gjennomføring av langvarig Cell-gratis Gene Expression
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van der Linden, A. J., Yelleswarapu, … More

van der Linden, A. J., Yelleswarapu, M., Pieters, P. A., Swank, Z., Huck, W. T. S., Maerkl, S. J., de Greef, T. F. A. A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression. J. Vis. Exp. (152), e59655, doi:10.3791/59655 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter