Summary
Les interactions des facteurs de transcription (TF) avec la polymérase d'ARN sont habituellement étudiées utilisant des essais de retrait. Nous appliquons une technologie d'interférométrie biocouche (BLI) pour caractériser l'interaction de GrgA avec la polymérase d'ARN chlamydial. Par rapport aux essais de retrait, BLI détecte l'association et la dissociation en temps réel, offre une sensibilité plus élevée et est très quantitatif.
Abstract
Un facteur de transcription (TF) est une protéine qui régule l'expression des gènes en interagissant avec la polymérase d'ARN, un autre TF, et/ou l'ADN de modèle. GrgA est un nouvel activateur de transcription trouvé spécifiquement dans l'agent pathogène bactérien intracellulaire obligatoire Chlamydia. Les essais de retrait de protéines utilisant des perles d'affinité ont révélé que GrgA lie deux facteurs de ', à savoir'66 et'28, qui reconnaissent différents ensembles de promoteurs pour les gènes dont les produits sont différemment requis aux stades de développement. Nous avons utilisé BLI pour confirmer et caractériser davantage les interactions. BLI démontre plusieurs avantages par rapport au retrait : 1) Il révèle l'association et la dissociation en temps réel entre les partenaires liants, 2) Il génère des paramètres cinétiques quantitatifs, et 3) Il peut détecter les liaisons que les essais de retrait ne détectent souvent pas. Ces caractéristiques nous ont permis de déduire les rôles physiologiques de GrgA dans la régulation de l'expression génique en Chlamydia, et les mécanismes d'interaction détaillés possibles. Nous envisageons que cette technologie relativement abordable peut être extrêmement utile pour étudier la transcription et d'autres processus biologiques.
Introduction
La transcription, qui produit des molécules d'ARN en utilisant l'ADN comme modèle, est la toute première étape de l'expression des gènes. La synthèse bactérienne de l'ARN commence après la liaison de l'holoenzyme de polymérase d'ARN (RNAP) à un promoteur cible1,2. L'holoenzyme RNAP (RNAPholo) est composé d'un noyau catalytique multi-subunit (RNAPcore) et d'un facteur de ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' Les activateurs et répresseurs de transcription, collectivement appelés TFs, règlent l'expression de gène par les composants de liaison du RNAPcore, des facteurs de ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' Selon l'organisme, une partie importante de son génome peut être consacrée aux TF qui régulent la transcription en réponse aux besoins physiologiques et aux indices environnementaux3.
La chlamydia est une bactérie intracellulaire obligatoire responsable d'une variété de maladies chez les humains et les animaux4,5,6,7,8. Par exemple, Chlamydia trachomatis est sans doute le principal agent pathogène transmis sexuellement chez l'homme dans le monde entier, et l'une des principales causes de cécité dans certains pays sous-développés4,5. La chlamydia a un cycle de développement unique caractérisé par deux formes cellulaires alternées appelées le corps élémentaire (EB) et le corps réticulé (RB)9. Alors que les EB sont capables de survivre dans un environnement extracellulaire, ils sont incapables de prolifération. Les EB pénètrent dans les cellules hôtes par endocytose et se différencient en rBs plus grands dans un vacuole dans le cytoplasme hôte dans les heures suivant l'inoculation. N'infectieux plus, les RB prolifèrent par fission binaire. Autour de 20 h, ils commencent à se différencier de nouveau aux EB, qui sortent des cellules d'hôte autour de 30-70 h.
La progression du cycle de développement chlamydiale est réglée par transcription. Alors qu'une supermajorité des près de 1 000 gènes chlamydiales s'expriment au cours du cycle intermédiaire au cours duquel les RB se reproduisent activement, seul un petit nombre de gènes sont transcrits immédiatement après l'entrée des EB dans les cellules hôtes pour initier la conversion de Les EB dans les RB, et un autre petit ensemble de gènes sont transcrits ou de plus en plus transcrits pour permettre la différenciation des RB en IS10,11.
Le génome chlamydial code trois facteurs, à savoir66,28 et54. 66, ce qui équivaut à l'entretien ménager de70 de E. coli et d'autres bactéries, est responsable de la reconnaissance des promoteurs des gènes du début et du milieu du cycle ainsi que de certains gènes en retard, alors que28 et54 sont nécessaires pour la transcription de certains gènes tardifs. Plusieurs gènes sont connus pour porter à la fois un promoteur de66-dépendants et un promoteur de28-dépendants12.
Malgré un cycle de développement compliqué, seul un petit nombre de TF ont été trouvés dans le chlamydiae13. GrgA (précédemment annoté comme une protéine hypothétique CT504 dans C. trachomatis serovar D et CTL0766 dans C. trachomatis L2) est une Chlamydia-spécifique TF initialement reconnu comme un activateur de66gènes dépendants14. Les essais d'affinité ont démontré que GrgA active leur transcription en liant à la fois l'ADN66 et l'ADN. Fait intéressant, il a été trouvé plus tard avec que GrgA co-précipite également avec28, et active la transcription à partir de28-promoteurs dépendants in vitro15. Pour déterminer si GrgA a des affinités similaires ou différentes pour66 et28euros, nous avons eu recours à bli. Les essais DE BLI ont montré que GrgA interagit avec66 à une affinité 30 fois plus élevée qu'avec28, suggérant que GrgA peut jouer des rôles différentiels dans la transcription de'66-dépendant et '28 -transcription dépendante 15.
BLI détecte le modèle d'interférence de la lumière blanche qui se reflète à partir d'une couche de protéine immobilisée à l'extrémité d'un biocapteur et la compare à celle d'une couche de référence interne16. Grâce à l'analyse de ces deux modèles d'interférence, BLI peut fournir des informations précieuses et en temps réel sur la quantité de protéines liées à la pointe du biocapteur. La protéine immobilisée à l'extrémité du biocapteur est appelée ligand, et est généralement immobilisée à l'aide d'un anticorps ou d'une étiquette épitope commune (p. ex., un poly-his- ou biotine-tag) qui a une affinité pour une particule associée (comme ntA ou Streptavidin) sur la pointe du biocapteur. La liaison d'une protéine secondaire, appelée analyte, avec le ligand à l'extrémité du biocapteur crée des changements dans l'opacité du biocapteur et entraîne donc des changements dans les modèles d'interférence. Lorsqu'il est répété sur différentes concentrations de l'analyte, BLI peut fournir non seulement des informations qualitatives mais aussi quantitatives sur l'affinité entre le ligand et l'analyte16.
Au meilleur de notre connaissance, nous avons été les premiers à employer BLI pour caractériser les interactions protéine-protéine dans la transcription15. Dans cette publication, nous démontrons qu'un fragment de GrgA, qui était auparavant démontré comme étant nécessaire pour28-contraignant, en effet médiatise la liaison. Ce manuscrit se concentre sur les étapes des essais BLI, et la génération de graphiques BLI et les paramètres de la cinétique de liaison. Les méthodes de production (et de purification) de ligands et d'analytes ne sont pas couvertes ici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Préparation des protéines
- Utilisez un sac de dialyse (avec une taille de coupure appropriée) pour dialyser chaque protéine à utiliser pour les essais BLI (y compris le ligand his-marqué et l'analyte) contre 1 000 volumes du tampon BLI (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl2 , 0,1 mM DTT, pH 8,0, pré-réfrigéré à 4 oC) à 4 oC pour 4 h.
REMARQUE : Les essais BLI exigent que le ligand soit présent à des concentrations qui saturent les sites de liaison sur le biocapteur et l'analyte pour être fortement purifiés de sorte que les concentrations molaires de l'analyte qui réagissent avec le ligand soient connues. Les méthodologies pour l'expression et la purification des protéines his- et Strep-tagged ne sont pas couverts ici, mais peuvent être trouvés dans les publications précédentes14,15. Bien que ce système n'exige pas que le ligand soit sous une forme très purifiée, il est essentiel de dialyser même les ligands non purifiés au tampon BLI afin de minimiser les changements dans les modèles d'interférence de lumière blanche causés par les changements de mémoire tampon pendant l'évaluation. - Passez au tampon BLI frais et continuez la dialyse pendant 4 h.
2. Hydratation et analyse des biocapteurs
- Environ 10 min avant le début d'un essai, pipette 200 'L du tampon BLI dans un tube PCR.
- Retirez un biocapteur Ni-NTA de l'emballage d'origine en tenant la grande partie du biocapteur à l'aide d'une main gantée.
- Placez le biocapteur sur le tube PCR de sorte que seule la pointe de verre du biocapteur est immergée dans le tampon BLI.
- Gardez la pointe du biocapteur immergée pendant au moins 10 min pour assurer une hydratation complète.
- Vérifiez que la pointe de verre du biocapteur Ni-NTA ne touche rien d'autre que le tampon BLI pendant l'étape ci-dessus.
REMARQUE: Ce protocole utilise un ni-NTA-biocapteur en conjonction avec un ligand His-tagged. Si nécessaire, un sA-Streptavidin-biocapteur peut être utilisé en conjonction avec un ligand biotinylated à la place si: (i) à la fois le ligand et l'analyte portent une étiquette De Son ou (ii) aucun d'eux ne le fait.
- Vérifiez que la pointe de verre du biocapteur Ni-NTA ne touche rien d'autre que le tampon BLI pendant l'étape ci-dessus.
- Allumez la machine BLItz.
- Assurez-vous que la machine est connectée à l'ordinateur par un port de sortie de données USB à l'arrière de la machine.
- Sur l'ordinateur, ouvrez le logiciel associé (p. ex. BLItz Pro) et cliquez sur Advanced Kinetics sur le côté gauche de l'écran.
- Sur le logiciel, tapez toutes les informations appropriées sur l'expérience (y compris le nom de l'expérience, la description, l'iD d'échantillon et la concentration de protéines) sous chaque rubrique respective.
- Cliquez sur Le type de biocapteur et choisissez Ni-NTA dans le menu déroulant.
- Sous le cap Paramètres d'exécution, vérifiez que le Shaker est réglé pour activer.
- Sous le titre De la liste de type d'étape, vérifiez qu'il y a 5 éléments énumérés : Baseline initial, Chargement, Baseline, Association et Dissociation.
REMARQUE : La durée de chaque étape peut être modifiée par défaut au besoin. Pour obtenir des résultats optimaux, utilisez un minimum de 30 s pour la base initiale et la ligne de base; et 120 s pour association et dissociation. La durée de l'étape de chargement (allant de 120 à 240 s) dépendra de la concentration du ligand et de l'affinité de l'étiquette His-epitope sur le ligand au biocapteur Ni-NTA.
- Retirez le biocapteur Ni-NTA hydraté du tube PCR et apposez-le à la monture de biocapteur sur la machine en glissant la grande partie du biocapteur sur la monture.
REMARQUE : Ne laissez pas le biocapteur sécher pendant l'expérience. - Placez un tube microcentrifuge noir de 0,5 ml dans le support du tube de la machine et la pipette 400 l du tampon BLI.
- Vérifier que le curseur de la machine est positionné de telle sorte que le support de tube est situé en face de la flèche noire sur la machine.
- Fermez le couvercle de la machine de sorte que la pointe du biocapteur soit immergée dans le tampon dans le tube de microcentrifuge.
- Cliquez ensuite sur le logiciel pour commencer à enregistrer la base initiale.
3. Chargement de ligand sur biocapteur
- Une fois l'étape de base initiale terminée, ouvrez la couverture de la machine.
- Déplacez le curseur vers la droite de sorte que le porte-goutte (au lieu du support de tube) est situé en face de la flèche noire.
- Pipette 4 L d'un ligand dialysé His-tagged (à partir de l'étape 1.1) sur le porte-goutte et fermer le couvercle de la machine.
REMARQUE : La concentration optimale du ligand à utiliser peut varier pour chaque protéine. Une concentration entre 1,0 et 2,0 mg/mL est généralement suffisante pour saturer la NTA à l'extrémité du biocapteur en 240 s. - Sur le logiciel, cliquez ensuite pour commencer le chargement.
4. Laver le ligand supplémentaire
- Une fois l'étape de chargement terminée, ouvrez la couverture de la machine.
- Déplacez le curseur vers la gauche de telle sorte que le support de tube est de nouveau situé devant la flèche noire.
- Fermez le couvercle de la machine et assurez-vous que la pointe du biocapteur est immergée dans le tampon BLI du tube dans le support du tube.
- Cliquez sur Suivant une fois de plus sur le logiciel pour commencer l'enregistrement de la ligne de base.
5. Association d'analyte à ligand
- Une fois l'étape Baseline terminée, ouvrez la couverture de la machine.
- Retirez le porte-goutte s'il nettoyait toute protéine et en la rinçant à l'eau à double déionisation (ddH2O) pour un total de 5 fois.
- Utilisez une lingette à tissu pour nettoyer la surface du porte-goutte après le lavage.
- Remplacez le porte-goutte sur la machine.
- Déplacez le curseur sur la machine vers la droite de telle sorte que le porte-goutte est de nouveau situé devant la flèche noire.
- Pipette 4 L d'un analyte dialysé (à partir de l'étape 1.1) sur le porte-goutte et ferme le couvercle de la machine.
- Sur le logiciel, cliquez sur Suivant pour commencer association.
6. Dissociation de l'analyte du ligand
- Une fois l'étape de l'Association terminée, ouvrez la couverture de la machine.
- Déplacez le curseur sur la machine vers la droite de telle sorte que le support de tube est de nouveau situé en face de la flèche noire.
- Sur le logiciel, cliquez ensuite pour commencer la dissociation.
- Une fois l'étape de dissociation terminée, ouvrez la couverture de la machine.
- Retirez le porte-goutte set et le porte-tube.
- Rincer les deux avec ddH2O à fond pour laver toute protéine.
- Retirez le biocapteur et jetez-le en toute sécurité.
7. Répéter les interactions avec différentes concentrations
- Répétez les étapes 2-7 pour la même paire ligand-analyte en utilisant différentes concentrations d'analytes.
REMARQUE : La concentration de l'analyte peut devoir être ajustée sur plusieurs pistes avant d'obtenir des résultats optimaux. D'après notre expérience, un rapport de 1:5:10 de concentrations d'analytes, à partir de 75 nM, est généralement suffisant.
8. Analyse des données à l'aide du logiciel
- Une fois toutes les exécutions terminées, enregistrez les données sur le logiciel en cliquant sur Fichier, puis enregistrez l'expérience comme sur le côté gauche de l'écran.
- Sous le titre Run Data, sélectionnez Correction et montage d'étape (1:1) et cliquez sur Analyser pour générer des données cinétiques.
- Pour extraire les données quantitatives dans une feuille de travail et générer des graphiques, cliquez sur Export vers CSV et enregistrez les données enregistrées sous forme de fichier .csv. Ouvrez le fichier .csv à l'aide d'un logiciel de tableur.
- Pour afficher le plus efficacement la cinétique de l'Association et de la Dissociation, supprimez tous les points de parcelle avant l'étape baseline et normalisez tous les points de parcelle suivants à partir de la valeur de base finale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Grâce à des essais BLI, nous avons déjà établi que la liaison de GrgA à28 dépend d'une région moyenne de 28 acides aminés (résidus 138-165) de GrgA15. En conséquence, par rapport à N-terminally Sa pleine longueur GrgA (NH-GrgA), une construction de suppression GrgA manquant de cette région (NH-GrgA-138-165) avait un taux d'association diminué et un taux de dissociation accrue, conduisant à une perte de 3 millions de fois affinité (tableau 1). Ici, nous démontrons que cette région moyenne se lie directementà 28 en l'absence du reste de la protéine GrgA. Dans ces expériences, la région du milieu marquée d'un N-terminally His-tag (NH-GrgA138-165) a été utilisé comme ligand, qui a d'abord été immobilisé à la pointe d'un biocapteur Ni-NTA (Figure 1A). Après avoir lavé NH-GrgA138-165 du biocapteur, l'association en temps réel avec l'analy28 a été enregistrée à la suite de l'ajout de28. Enfin, la dissociation en temps réel a été enregistrée après le lavage. Les enregistrements d'expériences avec trois concentrations d'analytes différentes commençant 30 s avant la liaison de ligand et se terminant 2 minutes après le début du lavage sont montrés dans la figure 1A. Pour mieux visualiser l'interaction ligand-analyte, nous supprimons les données avant l'ajout du ligand et réinitialisons la ligne de base à 0 pour dériver la figure 1B.
Les valeurs des paramètres cinétiques pour l'interaction du fragment NH-GrgA138-165 avec28 sont présentées dans le tableau 1. Par rapport à l'interaction NH-GrgA X'28, l'interaction NH-GrgA138-165 X'28 a montré une tendance statistiquement significative de 60% de réduction de ka, une augmentation très statistiquement significative de 64% de kd , et une augmentation très significative de 3,5 fois de KD. Ces changements démontrent que par rapport à NH-GrgA, NH-GrgA138-165 se lieà 28 plus lentement, se dissocie de28 plus rapidement, et a une affinité globale diminuée avec28. Par conséquent, les résidus 138-165 dans GrgA lie28, mais avec une affinité réduite par rapport à la pleine longueur GrgA.
Figure 1 : Une région moyenne d'acide aminé 28 de GrgA se lie à28 in vitro.
(A) Changements en temps réel des modèles d'interférence sinisme enregistrés en quatre étapes : (i) liaison de NH-GrgA138-165 (Ligand) à un biocapteur Ni-NTA, (ii) lavage, (iii) liaison de NS-28 (Analyte) à différentes concentrations de l'immobilisé NH-GrgA-138-165 (Ligand), et (iv) lavage ultérieur. (B) Visualisation améliorée de l'association et de la dissociation ligand-analytes après suppression des valeurs dans les deux premières étapes de (A) et réinitialisation de la ligne de base. Le panneau B est modifié à partir de Desai et coll., 201815. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Ligand | n | ka | kd | KD | Références | |||||||||||
| 1/Ms | % de contrôle | 1/s | % de contrôle | m | % de contrôle | |||||||||||
| NH-GrgA (en) | 8 Annonces | (1,5 à 1,7) x 104 | 100 ans | (2,8 à 0,8) x 10-3 | 100 ans | (2,2 à 0,3) x 10-7 | 100 ans | Desai et coll., 2018 | ||||||||
| NH-GrgA 138-165 | 2 (en) | (5,6 à 0,1) x 103 | 37 Ans, états-unis ( | (4,1 à 0,3) x 102 | 1,5 x 107 | (6,9 à 4,5) x 10-2 | 3,1 x 108 | Desai et coll., 2018 | ||||||||
| 0,125 p. | p-lt;0,002 | p-lt;0,001 | ||||||||||||||
| NH-GrgA138-165 | 3 (en) | (6,0 à 1,0) x 103 | 40 ans, états-unis ( | (4,6 à 0,4) x 10-3 | 164 Annonces | (7,7 à 0,3) x 10-7 | 350 Annonces | Cette étude | ||||||||
| 0,074 p. 0,074 | 0,006 p. 0,006 | p-lt;0,001 | ||||||||||||||
Tableau 1 : Un mutant de GrgA, ne contenant que des résidus d'acides aminés 138-165, se lie à28 euros malgré une affinité plus faible par rapport à la GrgA pleine longueur.
Les essais BLI ont été effectués avec des biocapteurs Ni-NTA utilisant son GrgA pleine longueur étiquetée ou mutants de suppression comme ligands et purifié Strep-marqué s'est né28 comme analyte. Les graphiques d'enregistrements sont affichés à la figure 1. Les valeurs des paramètres cinétiques (moyennes et écarts types) ont été générées avec le logiciel associé17. k (en) a (taux d'association constant) est défini comme le nombre de complexes formés par s dans une solution 1 molaire de A et B. kd (taux de dissociation constante) est défini comme le nombre de complexes qui se désintègrent par seconde. K (en) D (dissociation constante), définie comme la concentration à laquelle 50% des sites de liaison ligand sont occupés par les analytes, est kd divisé par ka. n, nombre de répétitions expérimentales. p les valeurs ont été calculées à l'aide des tests t de l'étudiant à 2 queues. Les paramètres cinétiques de NH-GrgA et de NH-GrgA-138-165 provenaient de Desai et coll., 201815.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les interactions protéines-protéines sont cruciales pour la régulation de la transcription et d'autres processus biologiques. Ils sont le plus souvent étudiés par des essais de retrait. Bien que les essais de retrait soient relativement faciles à effectuer, ils sont peu quantitatifs et peuvent ne pas détecter les interactions faibles mais biologiquement significatives. En comparaison, en détectant l'association et la dissociation en temps réel entre un ligand et un analyte, BLI fournit des constantes de taux d'association et de dissociation, ainsi que, affinité globale.
Par rapport aux essais de retrait, les essais BLI offrent une sensibilité plus élevée. Par exemple, les interactions GrgA-28 sont détectées avec des concentrations plus faibles d'analytes nM par BLI, mais pas par des essais de retrait (données non publiées). Contrairement au retrait, BLI ne s'appuie pas sur un anticorps de détection, ce qui peut affecter considérablement la sensibilité.
Plus important encore, les analyses BLI peuvent fournir des informations mécanistes sur l'interaction entre les protéines, tandis que les essais de retrait ne peuvent pas. Ceci est illustré par les interactions de28 avec différentes constructions GrgA. Par rapport à NH-GrgA, NH-GrgA 138-165 et NH-GrgA138-165 ne subissent qu'une perte de 60% en ka en liaison28. Ces résultats sont compatibles avec nos données PRÉCÉDENTEs DE BLI montrant que GrgA n'a pas ses résidus N-terminal 64 a une affinité diminuée avec28, suggérant que la séquence N-terminale de GrgA contribue à la liaisonde 28. Bien que NH-GrgA-138-165 et NH-GrgA138-165 aient des valeurs similaires ka dans la liaison28, le premier a un kd 91 000 fois plus élevé que le second. Ces résultats indiquent que la liaison de 138-165 déclenche des changements structurels dans GrgA, stabilisant considérablement le complexe.
Avec une histoire plus longue que BLI, la résonance plasmon de surface (SPR) peut également quantifier les interactions protéines-protéines en temps réel18,19. Alors que la sensibilité de BLI est considérée comme inférieure à celle de SPR20, le premier surpasse actuellement le second en matière de rentabilité. Par exemple, les coûts des biocapteurs SPR sont beaucoup plus élevés que ceux des biocapteurs BLI.
En raison de la nature du principe sous-jacent de SPR, il est fortement influencé par la microfluidique des médias entourant la protéine. Par conséquent, les expériences impliquant certains instruments SPR nécessitent une perception considérable de la part du chercheur pour assurer des conditions tampon optimales21,22,23,24. D'autre part, les instruments BLI actuels disposent d'une plage de contrôle de la température très limitée25 et, en tant que tel, sont mal équipés pour déterminer les paramètres thermodynamiques (tels que l'enthalpie et l'énergie libre Gibbs) pour une interaction donnée.
Le glycérol, un cryoprotecteur couramment utilisé, est incompatible avec BLI, malgré sa large compatibilité chimique. Par conséquent, il est essentiel d'enlever le glycérol du ligand et l'analyte par dialyse. Les protéines sans glycérol qui en résultent doivent être stockées à 4 oC, ce qui peut entraîner une instabilité accrue et des paramètres cinétiques inexacts. Nous recommandons que les tests BLI soient effectués peu de temps après la dialyse, en particulier si des paramètres cinétiques incohérents sont obtenus à partir de différents moments. Le délai exact dans lequel les analyses BLI devraient être effectuées variera d'une protéine à l'autre et sera affecté par leurs concentrations.
Comme avec SPR, BLI a été utilisé pour le dépistage des petites molécules26. Considérant que les nouveaux instruments BLI offrent des options de débit élevé pour le dépistage, nous envisageons que BLI peut devenir très utile pour l'identification et la caractérisation de petites molécules qui facilitent ou interfèrent avec les interactions protéines-protéines.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (Grants - AI122034 et AI140167) et la New Jersey Health Foundation (Grant - PC 20-18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
References
- Vvedenskaya, I. O., et al. Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).
- Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective. Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).
- Visweswariah, S. S., Busby, S. J. Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones. Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).
- Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H.
- WHO. Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).
- Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children. The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).
- De Puysseleyr, K., et al. Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse. BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).
- Hulin, V., et al. Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry. Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).
- Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I.
- Belland, R. J., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).
- Tan, M. Intracellular pathogens I: Chlamydiales. Tan, M., Bavoil , P. M. , ASM Press. 149-169 (2012).
- Domman, D., Horn, M. Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation. Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).
- Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).
- Desai, M., et al. Role for GrgA in regulation of σ28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).
- Joy, C., et al. Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).
- Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA). Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).
- Nelson, R. W., Krone, J. R. Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS). Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).
- Visentin, J., et al. Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance. Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).
- Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers. ACS Applied Materials & Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).
- Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).
- Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications. Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).
