Summary
Interaksjoner mellom transkripsjon faktorer (TFs) med RNA polymerase er vanligvis studert ved hjelp av rullegardin analyser. Vi anvender en Biolayer laboratoriefasiliteter (BLI)-teknologi for å karakterisere samspillet mellom GrgA med den Klamydia RNA-polymerase. Sammenlignet med rullegardin analyser, oppdager BLI i sanntid forening og dissosiasjon, gir høyere følsomhet, og er svært kvantitativ.
Abstract
En transkripsjon Factor (TF) er et protein som regulerer genuttrykk ved å samhandle med RNA polymerase, en annen TF, og/eller mal DNA. GrgA er en roman transkripsjon aktivator finnes spesielt i forplikte intracellulære bakteriell patogen chlamydia. Protein rullegardin analyser ved hjelp av affinitet perler har avdekket at GrgA binder to σ faktorer, nemlig σ66 og σ28, som anerkjenner ulike sett medarrangører for gener som produkter er differensielt kreves på utviklingstrinn. Vi har brukt BLI for å bekrefte og ytterligere karakterisere samspillet. BLI demonstrerer flere fordeler fremfor rullegardin: 1) det avslører sanntids forening og dissosiasjon mellom bindende partnere, 2) det genererer kvantitative kinetisk parametre, og 3) den kan oppdage bindinger som rullegardin analyser ofte ikke klarer å oppdage. Disse egenskapene har gjort oss i stand til å utlede de fysiologiske rollene til GrgA i gen uttrykks regulering i chlamydia, og mulige detaljerte interaksjons mekanismer. Vi ser for oss at dette relativt rimelig teknologi kan være svært nyttig for å studere transkripsjon og andre biologiske prosesser.
Introduction
Transkripsjon, som produserer RNA molekyler ved hjelp av DNA som mal, er det aller første trinnet av genuttrykk. Bakteriell RNA syntese begynner etter binding av RNA polymerase (RNAP) holoenzyme til et mål arrangøren1,2. RNAP holoenzyme (RNAPholo) består av en multi-delenhet katalysator (RNAPcore) og en σ faktor, som er nødvendig for å anerkjenne arrangøren sekvensen. Transkripsjon Aktivator og repressors, kollektivt betegnet TFs, regulerer genuttrykket gjennom bindende komponenter av RNAPcore, σ faktorer, og/eller DNA. Avhengig av organismen, en betydelig del av sine Genova kan være viet til TFs som regulerer transkripsjon som svar på fysiologiske behov og miljømessige pekepinner3.
Chlamydia er en forplikte intracellulære bakterie ansvarlig for en rekke sykdommer hos mennesker og dyr4,5,6,7,8. For eksempel, Chlamydia trachomatis er uten tvil nummer én seksuelt overførbare patogen hos mennesker over hele verden, og en ledende årsak til blindhet i noen underutviklet land4,5. Chlamydia har en unik utviklingssyklus preget av to vekslende cellulære skjemaer betegnes elementære kroppen (EB) og reticulate kroppen (RB)9. Mens EBs er i stand til å overleve i et ekstracellulære miljø, er de ute av stand til spredning. EBs inn verts celler gjennom endocytose og differensiere til større RBs i en vacuole i verten cytoplasma i løpet av timer post-inoculation. Ikke lenger smittsomme, RBs sprer gjennom binære fisjon. Rundt 20 h, begynner de å skille tilbake til EBs, som avslutter verten cellene rundt 30-70 h.
Progresjon av Klamydia utviklingsmessige syklus er regulert av transkripsjon. Mens en supermajority av nesten 1 000 Klamydia gener uttrykkes under midcycle der RBs er aktivt replikere, bare et lite antall gener er kopieres umiddelbart etter oppføring av EBs i verts cellene å initiere konvertering av EBs til RBs, og et annet lite sett med gener blir transkribere eller i økende grad transkribere for å muliggjøre differensiering av RBs i EBs10,11.
Den Klamydia Genova koder tre σ faktorer, nemlig σ66, σ28 og σ54. σ66, som tilsvarer housekeeping σ70 av E. coli og andre bakterier, er ansvarlig for å anerkjenne arrangører av tidlig og mid-syklus gener, samt noen sene gener, mens σ28 og σ54 er nødvendig for transkripsjon av visse sene gener. Flere gener er kjent for å bære både en σ66-avhengig promoter og en σ28-avhengig promoter12.
Til tross for en komplisert utviklingsmessige syklus, bare et lite antall TFs har blitt funnet i chlamydiae13. GrgA (tidligere kommentert som en hypotetisk protein CT504 i c. trachomatis serovar D og CTL0766 i c. trachomatis L2) er en chlamydia-spesifikk TF først anerkjent som en aktivator av σ66-avhengige gener14. Affinitet rullegardin analyser har vist at GrgA aktiverer sin transkripsjon ved å binde både σ66 og DNA. Interessant, det ble senere funnet med at GrgA også co-precipitates med σ28, og aktiverer transkripsjon fra σ28-avhengige arrangører in vitro15. For å undersøke om GrgA har lignende eller forskjellige slektskap for σ66 og σ28, SØKTE vi å bruke bli. BLI-analyser har vist at GrgA samhandler med σ66 på en 30-fold høyere affinitet enn med σ28, noe som tyder på at GrgA kan spille differensial roller i σ66-avhengig transkripsjon og σ28-avhengig transkripsjon 15av dem.
BLI oppdager forstyrrelsen mønster av hvitt lys som reflekterer fra et lag av immobilisert protein på tuppen av en Biosensor og sammenligner det som i en intern referanselag16. Gjennom analysen av disse to forstyrrelser mønstre, kan BLI gi verdifull og Real-Time informasjon om mengden protein bundet til spissen av Biosensor. Proteinet som er immobilisert til spissen av Biosensor er referert til som ligand, og er generelt immobilisert ved hjelp av en felles antistoff eller epitope tag (f. eks en Poly-hans-eller biotin-tag) som har en affinitet for en tilknyttet partikkel (for eksempel NTA eller Streptavidin) på tuppen av Biosensor. Bindingen av et sekundært protein, referert til som analytt, med ligand på spissen av Biosensor skaper endringer i opacity av Biosensor og dermed resulterer i endringer i forstyrrelser mønstre. Når gjentatt over ulike konsentrasjoner av analytt, BLI kan gi ikke bare kvalitative men også kvantitativ informasjon om affinitet mellom ligand og analytt16.
Til beste av vår kunnskap, var vi de første til å ansette BLI å karakterisere protein-protein interaksjoner i transkripsjon15. I denne publikasjonen viser vi at en GrgA fragment, som tidligere var vist å være nødvendig for σ28-binding, faktisk formidler bindingen. Dette manuskriptet fokuserer på trinn i BLI-analysene, og generering av BLI-grafer og parametre for bindende Kinetics. Metoder for produksjon (og rensing) av ligander og analytter er ikke dekket her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utarbeidelse av proteiner
- Bruk en pose med dialyse (med en passende skjære størrelse) for å dialyze hvert protein som skal brukes til BLI-analyser (inkludert både hans-kodede ligand og analytt) mot 1 000 volumer av BLI-bufferen (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl2 , 0,1 mM DTT, pH 8,0, pre-kjølt til 4 ° c) ved 4 ° c for 4 t.
Merk: BLI-analyser krever at ligand er til stede ved konsentrasjoner som mette bindings stedene på Biosensor og analytt for å være svært renset slik at molar konsentrasjonen av analytt som reagerer med ligand er kjent. Metoder for uttrykk og rensing av hans-og strep proteiner dekkes ikke her, men finnes i tidligere publikasjoner14,15. Selv om dette systemet ikke krever at ligand er i svært renset form, er det viktig å dialyze selv urenset ligander til BLI buffer for å minimere skift i hvitt lysforstyrrelser mønstre forårsaket av eventuelle buffer endringer under analysen. - Bytt til frisk BLI buffer og Fortsett dialyse for en annen 4 h.
2. Biosensor hydration og analysen oppsett
- Cirka 10 minutter før en analyse starter, Pipetter 200 av BLI-bufferen til et PCR-rør.
- Fjern en ni-NTA-Biosensor fra originalemballasjen ved å holde den brede delen av Biosensor ved hjelp av en hansker hånd.
- Plasser Biosensor over PCR-røret slik at bare glass spissen på Biosensor er nedsenket i BLI-bufferen.
- Hold Biosensor spissen under vann i minst 10 minutter for å sikre full hydrering.
- Kontroller at glass spissen på ni-NTA-Biosensor ikke berører noe annet enn BLI-bufferen i løpet av trinnet ovenfor.
Merk: denne protokollen bruker en ni-NTA-Biosensor i forbindelse med en hans-merket ligand. Hvis det er nødvendig, en SA-Streptavidin-Biosensor kan brukes i forbindelse med en biotinylated ligand stedet hvis: (i) både ligand og analytt bære en hans tag eller (II) ingen av dem gjør.
- Kontroller at glass spissen på ni-NTA-Biosensor ikke berører noe annet enn BLI-bufferen i løpet av trinnet ovenfor.
- Slå på BLItz-maskinen.
- Kontroller at maskinen er koblet til datamaskinen via en USB-utgang på baksiden av maskinen.
- Åpne den tilknyttede programvaren (for eksempel BLItz Pro) på datamaskinen, og klikk på Avansert Kinetics på venstre side av skjermen.
- På programvaren skriver du inn all relevant informasjon om eksperimentet (inkludert Eksperimentnavn, beskrivelse, prøve-ID og protein konsentrasjon) under hver respektive overskrift.
- Klikk på Biosensor type og velg ni-nTa fra rullegardinmenyen.
- Under Kjør innstillinger overskriften, kontroller at shaker er satt til å aktivere.
- Under trinn type liste -overskriften kontrollerer du at det er 5 elementer oppført: første opprinnelig plan, innlasting, opprinnelig plan, tilknytning og dissosiasjon.
Merk: varigheten av hvert trinn kan endres fra standard etter behov. Du oppnår optimale resultater ved å bruke minimum 30 s for opprinnelig opprinnelig plan og opprinnelig plan. og 120 s for foreningen og dissosiasjon. Varigheten av lasting trinn (alt fra 120 til 240 s) vil avhenge av konsentrasjonen av ligand og affinitet av hans-epitope koden på ligand til ni-NTA-Biosensor.
- Fjern hydrert ni-NTA-Biosensor fra PCR-slangen og fest den til Biosensor festet på maskinen ved å skyve den brede delen av Biosensor inn på braketten.
Merk: ikke la Biosensor tørke ut under eksperimentet. - Sett et 0,5 mL svart mikrosentrifugen rør inn i rør holde ren på maskinen og Pipetter 400 μL av BLI-bufferen i den.
- Kontroller at glidebryteren på maskinen er plassert slik at rør holde ren er plassert foran den svarte pilen på maskinen.
- Lukk dekslet på maskinen slik at Biosensor spissen blir nedsenket i bufferen i mikrosentrifugen røret.
- Klikk neste på programvaren for å starte innspillingen av første baseline.
3. lasting av ligand på Biosensor
- Når det første planlagte trinnet er ferdig, åpner du dekslet på maskinen.
- Flytt glidebryteren til høyre slik at dråpe holderen (i stedet for rør holde ren) ligger foran den svarte pilen.
- Pipetter 4 μL av en dialyzed-kodet ligand (fra trinn 1,1) på dråpe holde ren og Lukk dekslet på maskinen.
Merk: den optimale konsentrasjonen av ligand som skal brukes kan variere for hvert protein. En konsentrasjon mellom 1,0 til 2,0 mg/mL er vanligvis tilstrekkelig til å mette NTA på tuppen av Biosensor i 240 s. - På programvaren, klikker du på neste for å starte lasting.
4. vaske bort ekstra ligand
- Når innlastings trinnet er ferdig innspilt, åpner du dekslet på maskinen.
- Flytt glidebryteren til venstre slik at røret holder igjen ligger foran den svarte pilen.
- Lukk lokket på maskinen og påse at Biosensor spissen er nedsenket i BLI-bufferen til røret i rør holde ren.
- Klikk neste gang på programvaren for å starte innspillingen av Baseline.
5. sammenslutning av analytt til ligand
- Etter at planlagt-trinnet er ferdig innspilt, åpner du dekslet på maskinen.
- Fjern dråpe holderen og rengjør den ved pipettering ut noe protein og skyll det med deionisert vann (ddH2O) for totalt 5 ganger.
- Bruk en vevs tørke for å rengjøre overflaten på dråpe holde ren etter vasken.
- Sett dråpe holde ren tilbake på maskinen.
- Flytt glidebryteren på maskinen til høyre slik at dråpe holde ren igjen ligger foran den svarte pilen.
- Pipetter 4 μL av en dialyzed analytt (fra trinn 1,1) på dråpe holde ren og Lukk dekslet på maskinen.
- Klikk neste for å starte tilknytningen på programvaren.
6. dissosiasjon av analytt fra ligand
- Når tilknytnings trinnet er ferdig, åpner du dekslet på maskinen.
- Flytt glidebryteren på maskinen til høyre slik at røret holderen er igjen plassert foran den svarte pilen.
- Klikk neste for å starte dissosiasjon på programvaren.
- Når dissosiasjon-trinnet er ferdig innspilt, åpner du dekslet på maskinen.
- Fjern dråpe holde ren og rør holde ren.
- Skyll begge med ddH2O grundig for å vaske bort protein.
- Fjern Biosensor og kast den på en sikker måte.
7. repeterende interaksjoner med ulike konsentrasjoner
- Gjenta trinn 2-7 for det samme ligand-analytt paret ved hjelp av ulike analytt konsentrasjoner.
Merk: konsentrasjonen av analytt må kanskje justeres på tvers av flere løyper før du oppnår optimale resultater. I vår erfaring er et forhold på 1:5:10 av analytt konsentrasjoner, som starter med 75 nM, vanligvis tilstrekkelig.
8. analysere data ved hjelp av programvaren
- Når alle kjøringer er fullført, lagrer du dataene på programvaren ved å klikke på fil og deretter Lagre eksperimentet som på venstre side av skjermen.
- Under Kjør data-overskriften velger du trinn korrigering og-tilpassing (1:1) og klikker analyser for å generere kinetisk data.
- For å trekke ut kvantitative data i et regneark og generere grafer, klikk på Eksporter til CSV og lagre de innspilte dataene som en. CSV-fil. Åpne CSV-filen ved hjelp av regnearkprogram vare.
- Hvis du vil vise tilknytningen og dissosiasjon Kinetics på en effektiv måte, fjerner du alle plott punktene før planlagt-trinnet, og normaliserer alle etterfølgende plott poeng fra den endelige verdien for opprinnelig plan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gjennom BLI-analyser har vi tidligere fastslått at bindingen av GrgA til σ28 er avhengig av en 28 aminosyre midtre region (rester 138-165) av GrgA15. Følgelig, sammenlignet med N-uhelbredelig hans-merket full lengde GrgA (NH-GrgA), en GrgA sletting konstruere mangler denne regionen (NH-GrgAΔ 138-165) hadde en redusert tilknytnings hastighet og økt dissosiasjon rate, fører til en 3 000 000-fold tap av samlede affinitet (tabell 1). Her viser vi at denne midtre regionen binder direkte σ28 i fravær av resten av GrgA protein. I disse eksperimentene ble den midtre regionen merket med en N-uhelbredelig His-tag (NH-GrgA138-165) brukt som ligand, som først ble immobilisert til spissen av en ni-NTA Biosensor (figur 1a). Etter vask ubundet NH-GrgA138-165 av Biosensor, Real-Time tilknytning til analytt σ28 ble spilt inn etter tilsetting av σ28. Endelig, sanntids dissosiasjon ble registrert etter vask. Opptak av eksperimenter med tre ulike analytt konsentrasjoner som starter 30 s før ligand binding og slutter 2 minutter etter at vask er vist i figur 1a. For å bedre visualisere ligand-analytt interaksjon, fjerner vi data før tillegg av ligand og tilbakestille Baseline til 0 for å utlede figur 1B.
Verdier av kinetisk parametre for samhandling av NH-GrgA138-165 fragment med σ28 er presentert i tabell 1. Sammenlignet med NH-GrgA X σ28 interaksjon, den NH-GrgA138-165 X σ28 interaksjon vist en trending statistisk signifikant 60% reduksjon i ka, en svært statistisk signifikant 64% økning i kd , og en svært statistisk signifikant 3,5-fold økning i KD. Disse endringene viser at i forhold til NH-GrgA, NH-GrgA138-165 binder σ28 saktere, dissociates fra σ28 raskere, og har en redusert samlet affinitet med σ28. Rester 138-165 i GrgA binder derfor σ28 , men med redusert affinitet sammenlignet med full lengde GrgA.
Figur 1: en 28-aminosyre midtre region av GrgA binder σ28 in vitro.
(A) Real-Time endringer i lysforstyrrelser mønstre spilt inn av i fire etapper: (i) binding av NH-GrgA138-165 (ligand) til en ni-nTa Biosensor, (II) vask, (III) binding av NS-σ28 (analytt) i ulike konsentrasjoner til immobilisert NH-GrgA-138-165 (ligand) og (IV) påfølgende vask. (B) forbedret visualisering av ligand-analytt forening og dissosiasjon etter fjerning av verdier i de to første stadiene fra (A) og reset av Baseline. Panel B er modifisert fra Desai et al., 201815. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Ligand | N | ka | kd | KD | Referanser | |||||||||||
| 1/MS | % kontroll | 1/s | % kontroll | M | % kontroll | |||||||||||
| EIENDOMMER i GrgA | 8 | (1,5 ± 1,7) x 104 | 100 | (2,8 ± 0,8) x 10-3 | 100 | (2,2 ± 0,3) x 10-7 | 100 | Desai et al, 2018 | ||||||||
| NH-GrgAΔ 138-165 | 2 | (5,6 ± 0,1) x 103 | 37 | (4,1 ± 0,3) x 102 | 1,5 x 107 | (6,9 ± 4,5) x 10-2 | 3,1 x 108 | Desai et al, 2018 | ||||||||
| p = 0.125 | p < 0.002 | p < 0.001 | ||||||||||||||
| NH-GrgA138-165 | 3 | (6,0 ± 1,0) x 103 | 40 | (4,6 ± 0,4) x 10-3 | 164 | (7,7 ± 0,3) x 10-7 | 350 | Denne studien | ||||||||
| p = 0.074 | p = 0.006 | p < 0.001 | ||||||||||||||
Tabell 1: en mutant av GrgA, som bare inneholder aminosyrer rester 138-165, binder σ28 til tross for lavere affinitet i forhold til full lengde GrgA.
BLI analysene ble utført med ni-NTA biosensors ved hjelp av hans-Tagged full lengde GrgA eller sletting mutanter som ligander og renset strep-Tagged σ28 som en analytt. Grafer av innspillinger vises i figur 1. Verdier av kinetisk parametre (gjennomsnitt ± standardavvik) ble generert med tilhørende programvare17. k a (Association rate konstant) er definert som antall komplekser dannet per s i en 1 molar løsning av a og B. kd (dissosiasjon rate Constant) er definert som antall komplekser som forfall per sekund. K D (dissosiasjon likevekt konstant), definert som konsentrasjonen der 50% av ligand bindende områder er okkupert av analytter, er kD dividert med ka. n, antall eksperimentelle repetisjoner. p -verdier ble beregnet med 2-hale student t -tester. Kinetic parametre for NH-GrgA og NH-GrgAΔ 138-165 var fra Desai et al., 201815.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein-protein interaksjoner er avgjørende for regulering av transkripsjon og andre biologiske prosesser. De er oftest studert gjennom rullegardin analyser. Selv om rullegardin analysene er relativt enkle å utføre, de er dårlig kvantitative og kan unnlate å oppdage svake, men biologisk meningsfulle interaksjoner. Til sammenligning, ved å oppdage sanntids tilknytning og dissosiasjon mellom en ligand og en analytt, gir BLI forening og dissosiasjon rate konstanter, samt generelle affinitet.
Sammenlignet med rullegardin analyser tilbyr BLI-analyser høyere følsomhet. GrgA-σ28 -interaksjoner oppdages for eksempel med lavere nM-konsentrasjoner av analytter ved å bli, men ikke av rullegardin analyser (upubliserte data). I motsetning til rullegardin, er ikke BLI avhengig av et gjenkjennings-antistoff, som kan påvirke følsomheten betydelig.
Enda viktigere, kan BLI-analyser gi mekanistisk innsikt i samspillet mellom proteiner, mens rullegardin analyser ikke kan. Dette er et forbilde på samspillet mellom σ28 og ulike GrgA konstruksjoner. Sammenlignet med NH-GrgA, NH-GrgAΔ 138-165 og NH-GrgA138-165 lider bare en 60% tap i ka i binding σ28. Disse funnene er i samsvar med våre tidligere BLI-data som viser at GrgA mangler N-Terminal 64 rester har en redusert affinitet med σ28, noe som tyder på at N-Terminal sekvensen av GrgA bidrar til σ28 binding. Selv om NH-GrgAΔ 138-165 og NH-GrgA138-165 har lignende ka -verdier i binding σ28, har det tidligere en 91 000-fold høyere kd enn sistnevnte. Disse resultatene tyder på at bindingen av 138-165 utløser strukturelle endringer i GrgA, sterkt stabilisere komplekset.
Med en lengre historie enn bli, kan Surface Plasmon resonans (spr) også kvantifisere Real-Time protein-protein interaksjoner18,19. Mens følsomheten til BLI antas å være lavere enn for SPR20, den tidligere for tiden overgår sistnevnte i kostnadseffektivitet. For eksempel kostnader av SPR biosensors er mye høyere enn for BLI biosensors.
På grunn av innholdet i det underliggende prinsippet om SPR, er det sterkt påvirket av materialer av mediene rundt proteinet. Derfor, eksperimenter som involverer noen spr instrumenter krever betydelig oppfatning på den delen av forskeren å sikre optimale buffer forhold21,22,23,24. På den annen side, nåværende BLI instrumenter har en svært begrenset temperaturkontroll rekkevidde25 og, som sådan, er dårlig tilpasset for å bestemme termodynamisk parametere (for eksempel entalpi og Gibbs fri energi) for en gitt interaksjon.
Glyserol, en ofte brukt kryoprotektant, er uforenlig med BLI, til tross for sin brede kjemiske kompatibilitet. Derfor er det avgjørende å fjerne glyserol fra ligand og analytt av dialyse. De resulterende glyserol-frie proteinene må oppbevares ved 4 ° c, noe som kan føre til økt ustabilitet og unøyaktige kinetisk parametre. Vi anbefaler at bli-analyser utføres kort tid etter dialyse, spesielt hvis inkonsekvent kinetisk parametre er innhentet fra til forskjellige tider. Den nøyaktige tidsrammen som BLI-analyser skal være ferdig vil variere mellom proteiner og bli påvirket av deres konsentrasjoner.
Idet med SPR, BLI har blitt anvendt for liten molekyl skjermen26. Tatt i betraktning at nyere BLI instrumenter tilbyr høy gjennomstrømning alternativer for screening, ser vi at BLI kan bli svært nyttig for identifisering og karakterisering av små molekyler som letter eller forstyrrer protein-protein interaksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (Grants # AI122034 og AI140167) og New Jersey Health Foundation (Grant # PC 20-18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
References
- Vvedenskaya, I. O., et al. Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).
- Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective. Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).
- Visweswariah, S. S., Busby, S. J. Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones. Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).
- Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H.
- WHO. Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).
- Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children. The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).
- De Puysseleyr, K., et al. Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse. BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).
- Hulin, V., et al. Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry. Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).
- Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I.
- Belland, R. J., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).
- Tan, M. Intracellular pathogens I: Chlamydiales. Tan, M., Bavoil , P. M. , ASM Press. 149-169 (2012).
- Domman, D., Horn, M. Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation. Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).
- Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).
- Desai, M., et al. Role for GrgA in regulation of σ28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).
- Joy, C., et al. Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).
- Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA). Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).
- Nelson, R. W., Krone, J. R. Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS). Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).
- Visentin, J., et al. Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance. Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).
- Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers. ACS Applied Materials & Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).
- Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).
- Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications. Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).
