Summary
Wir führen eine reproduzierbare und stabile optische Aufzeichnungsmethode für Gehirnscheiben mit spannungsempfindlichem Farbstoff ein. Der Artikel beschreibt spannungsempfindliche Farbstofffärbung und Aufzeichnung optischer Signale mit herkömmlichen Hippocampus-Scheibenpräparaten.
Abstract
Die Wide-Field Single Photon Voltage-Sensitive Dye (VSD)-Bildgebung von Hirnscheibenpräparaten ist ein nützliches Werkzeug, um die funktionelle Konnektivität in neuronalen Schaltkreisen zu bewerten. Aufgrund der bruchstückhaften Veränderung des Lichtsignals war es schwierig, diese Methode als quantitativen Test zu verwenden. Dieser Artikel beschreibt spezielle Optiken und Slice-Handling-Systeme, die diese Technik stabil und zuverlässig machen. Der vorliegende Artikel zeigt die Schnittbearbeitung, Färbung und Aufzeichnung der VSD-befleckten Hippocampusscheiben im Detail. Das System hält die physiologischen Bedingungen für eine lange Zeit, mit guter Färbung, und verhindert mechanische Bewegungen der Scheibe während der Aufnahmen. Darüber hinaus ermöglicht es die Färbung von Scheiben mit einer kleinen Menge des Farbstoffs. Die Optik erreicht eine hohe numerische Blende bei geringer Vergrößerung, die die Aufzeichnung des VSD-Signals bei einer maximalen Bildrate von 10 kHz mit einer räumlichen Auflösung von 100 Pixelx x 100 Pixel ermöglicht. Aufgrund der hohen Bildrate und räumlichen Auflösung ermöglicht diese Technik die Anwendung der Post-Recording-Filter, die ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis bieten, um die Veränderungen in neuronalen Schaltkreisen zu bewerten.
Introduction
Wide-Field Single Photon Voltage-Sensitive Dye (VSD) Imaging of bulk-stained brain slice preparations has become a useful quantitative tool to assess the dynamics of neural circuits1,2,3,4 . Nach der Analyse der Veränderungen der optischen Eigenschaften durch Membrananregung5,6,7wurde DIE VSD-Bildgebung erstmals in den frühen 1970er Jahren von Cohen und anderen6,8, 9. ; es ist eine geeignete Methode, um die Gehirnfunktionen in Echtzeit zu überwachen, da der Farbstoff direkt die Membranpotentialveränderungen (d.h. das primäre Signal der Neuronen) untersucht.
Die frühesten VSDs besaßen die wünschenswerten Eigenschaften, um das Gehirnsystem zu verstehen, wie eine schnelle Zeitkonstante, um die schnelle Kinetik neuronaler Membranpotentialereignisse zu verfolgen, und Linearität mit der Veränderung des Membranpotentials9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. Ähnlich wie bei anderen bildgebenden Experimenten erfordert diese Technik eine breite Palette spezifischer Abstimmungen, wie Kameras, Optik, Software und Slice-Physiologie, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen. Aufgrund dieser technischen Fallstricke waren die erwarteten Vorteile bei den ersten Bemühungen für die meisten Laboratorien, die sich nicht auf diese Technik spezialisiert hatten, nicht unbedingt eingetreten.
Die Urursache der technischen Schwierigkeit war die geringe Empfindlichkeit des VSD gegenüber der Membranpotenzialänderung, wenn sie auf Diemassenfärbung von Scheibenpräparaten angewendet wurde. Die Größe des optischen Signals (d.h. die fraktionierte Veränderung der Fluoreszenz) beträgt in der Regel 10-4-10-3 des Steuersignals (F0) unter physiologischen Bedingungen. Die Zeitskala der Membranpotentialänderung in einem Neuron beträgt ungefähr Millisekunden bis wenige hundert Millisekunden. Um die Veränderungen des Membranpotenzials des Neurons zu messen, sollte die kamera, die für die Aufnahme verwendet wird, in der Lage sein, Bilder mit hoher Geschwindigkeit (10 kHz bis 100 Hz) zu erfassen. Die geringe Empfindlichkeit von VSD und die Geschwindigkeit, die benötigt wird, um dem neuronalen Signal zu folgen, erfordert eine große Menge an Licht, um an der Kamera mit hoher Geschwindigkeit gesammelt zu werden, mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis (S/N)2,16.
Die Optik des Aufzeichnungssystems ist auch ein entscheidendes Element, um die Erfassung von ausreichend Licht zu gewährleisten und S/N zu verbessern. Die von der Optik erreichte Vergrößerung ist oft zu niedrig, z. B. 1X bis 10X, um einen lokalen funktionellen neuronalen Schaltkreis zu visualisieren. Um beispielsweise die Dynamik des Hippocampus zu visualisieren, wäre eine Vergrößerung von etwa 5 geeignet. Eine solche geringe Vergrößerung hat eine geringe Fluoreszenzeffizienz; daher wäre eine fortschrittliche Optik für eine solche Aufnahme von Vorteil.
Darüber hinaus ist auch die Scheibenphysiologie von wesentlicher Bedeutung. Da die bildgebende Analyse erfordert, dass die Slices intakt sind, ist eine sorgfältige Schnittverarbeitung erforderlich17. Darüber hinaus sind Maßnahmen, die ergriffen werden, um die Realisierbarkeit der Scheibe für einen längeren Zeitpunkt zu erhalten, wichtig18.
Der vorliegende Artikel beschreibt das Protokoll zur Vorbereitung von Scheiben, VSD-Färbung und Messungen. Der Artikel beschreibt auch die Verbesserungen der VSDs, des Bildgebungsgeräts und der Optik sowie andere zusätzliche Verfeinerungen des experimentellen Systems, die es ermöglicht haben, diese Methode als einfache, leistungsstarke und quantitative Assay zur Visualisierung der Veränderung der Gehirnfunktionen19,20,21,22,23,24,25. Die Technik kann auch weit verbreitet für langfristige Potenzierung im CA1-Bereich von Hippocampus-Scheiben1verwendet werden. Darüber hinaus ist diese Technik auch bei der optischen Erfassung von Membranpotentialen in einer einzelnen Nervenzelle26nützlich.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden nach Protokollen durchgeführt, die vom Animal Care and Use Committee der Tokushima Bunri University genehmigt wurden. Das folgende Protokoll für die Slice-Vorbereitung ist fast eine Standardprozedur27 , aber die Modifikationen waren die Protokolle der Färbung und Aufzeichnung mit VSD.
1. Vorbereitung vor dem Tag des Experiments
- Bereiten Sie die Lager A (Tabelle 1), Lager B (Tabelle 2), und Lager C ( Tabelle3) Lösungen und lagern sie im Kühlschrank.
- Bereiten Sie 1 L künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) (Tabelle4, siehe Schritt 3) vor und bewahren Sie sie im Kühlschrank auf.
- Bereiten Sie 1 L modified ACSF (Tabelle 5) vor und bewahren Sie es im Kühlschrank auf.
- 500 L Aliquots fetalen Rinderserums (FBS) in 2 ml Durchstechflaschen geben und in einem Gefrierschrank aufbewahren.
- 4% Agarpulver in ACSF (ca. 120 ml) in einer Mikrowelle auflösen und in eine 90 mm Einweg-Petrischale gießen. Die Agarplatte sollte vor der weiteren Verwendung gekühlt werden.
- Legen Sie am Tag vor dem Experiment folgende Gegenstände in einen Gefrierschrank: ein chirurgisches Fach, einen Schneidebehälter und einen Aluminiumkühlblock (120 x 120 x 20 mm3).
- Stellen Sie sicher, dass genügend Plexiglasringe mit Membranfiltern für das Scheibenhandhabungssystem17,28 vorhanden sind (siehe Schritt 6.12).
- 2% Agarpulver in 50 ml von 3 M KCl in einer Mikrowelle auflösen. Nehmen Sie etwa 85 l des warmen Agar-KCl-Dislöstes in 200 L-Spitzen mit einer Mikropipette für die Erdungselektrode. Lösen Sie die Spitze in das noch warme Agar 3 M KCl Gel. Wiederholen Sie den Schritt, um etwa 20-40 Spitzen mit 2% Agar zu füllen.
2. Herstellung der VSD (di-4-ANEPPS) Lagerlösung
- Bereiten Sie 1 ml 10% polyethoxylierte Rizinusöllösung mit reinem reinem Wasser vor.
- 1 ml Ethanol in eine Durchstechflasche mit Di-4-ANEPPS (5 mg Durchstechflasche), Wirbel und 10 min Schallton geben. Die Lösung verwandelt sich in eine tiefrote Farbe mit möglichen kleinen Rückständen der di-4-ANEPPS-Kristalle.
HINWEIS: Das in diesem Schritt verwendete Ethanol sollte frisch geöffnet werden. - Übertragen Sie die Lösung auf ein 2 ml Mikrorohr mit einem O-Ring. Drehen Sie die Lösung herunter und fügen Sie eine 10% polyethoxylierte Rizinusöllösung mit 500 l hinzu.
HINWEIS: Der Farbstoff ist hoch lipophiler. DMSO und Poloxamer können auch verwendet werden, um di-4-ANEPPS aufzulösen, aber in Bezug auf das optische Signal bei Änderung des Membranpotenzials haben wir festgestellt, dass die Verwendung von Ethanol-polyethoxyliertem Rizinusöl ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis liefert. Dies könnte mit der Übertragungsrate des Lösungsmittels auf die Zellmembran zusammenhängen. - Wirbel und beschallen, bis sich der Farbstoff vollständig aufgelöst hat.
- Vermeiden Sie lichtdurchinstoschützen und bewahren Sie es im Kühlschrank auf. Nicht in einem Gefrierschrank aufbewahren. Der Bestand kann einige Monate halten.
HINWEIS: Folgen Sie am Tag des Experiments den Schritten 3-9.
3. Tägliche Vorbereitung von ACSF (1 L) (Tabelle 4)
- Wiegen Sie NaCl, NaHCO3und Glukose in einem Kolben.
- 950 ml destilliertes Wasser in den Kolben geben und mit95% O 2/5% CO2-Gas sprudeln.
- 2,5 ml Lager eine Lösung in den Kolben geben und ca. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Fügen Sie 2,5 ml Lager-C-Lösung in den Kolben.
- Destilliertes Wasser hinzufügen, um die Lösung auf 1 L zu machen.
4. Tägliche Vorbereitung der Färbung VSD Ssolution
- Beschallen Sie eine 500-L-Durchstechflasche mit FBS- und VSD-Lagerlösung (Schritt 2) in einem Ultraschallgerät für 5 min.
- Fügen Sie 500 l frisch zubereiteten ACSF in die Durchstechflasche von FBS ein.
- Fügen Sie 20 (bei Mäusen) oder 40 (bei Ratten) -L der VSD-Stammlösung in die Durchstechflasche ein.
- Ultraschall und Wirbel der Durchstechflasche, bis die Lösung blass orange wird.
5. Vorbereitung auf die Operation
- Nehmen Sie 100 ml gekühlte ACSF separat in einem 300 ml Edelstahlbehälter, einem 300 ml Becher bechern und einem Kunststoffbehälter, und legen Sie sie in einen Gefrierschrank. 150 ml gekühlte ACSF (Tabelle 2) in ein anderes Becherglas geben und in den Gefrierschrank geben. Warten Sie, bis die Lösungen gekühlt sind; die zeitmessungs- und vorher-messung.
- Falten, um eine Rasierklinge (Kohlenstoffstahl, Industriequalität 0,13 mm dick, Klinge auf beiden Seiten) in die Hälfte für den Slicer zu brechen.
HINWEIS: Die andere Hälfte kann zur Zerlegung mit einem richtigen Klingenhalter verwendet werden. - Bereiten Sie einen Block von der ACSF 4% Agar-Platte mit einer Einstellungsvorrichtung vor (Abbildung 1).
- Bereiten Sie eine feuchte Inkubationskammer (eine Grenzraumkammer; eine modifizierte 1,2 L dicht versiegelte Box mit einer Silikonverpackung) vor, um die Gehirnscheiben physiologisch am Leben zu erhalten (Abbildung 2); ACSF in einen kleinen Behälter geben und mit95% O 2/5% CO2-Gas karbonatisieren und eine 90 mm x 20 mm Petrischale mit ACSF oben füllen.
HINWEIS: Eine kleinere Petrischale (60 mm x 20 mm) sollte in der Mitte der 90 mm Schale platziert werden, um ein Filterpapier auf der Schale zu unterstützen. - Setzen Sie die Box auf ein Heizgerät und warten Sie 20 min, um sie auf 28 °C zu erwärmen.
- Zerkleinertes Eis in den Behälter des Slicers geben. Legen Sie die folgenden Instrumente in eine Edelstahlwanne (klein) auf Eis: Skalpell, Klingenhalter, Ringpinzette, Agarblock und eine Stufe Slicer. Gefroren acSF und modifiziertacSF auf Eis und Blase mit 95% O2/5% CO2 Gas (aka. carbogen).
- Legen Sie die folgenden Instrumente in einen Bottich (groß): Schere (groß, klein), Pinzette, spatel, einen Löffel und eine diagonale Zange.
6. Chirurgie (Mäuse)
- Anästhetisieren Sie die Maus mit Isofluran in einer Dunstabzugshaube. Bewerten Sie den Grad der Anästhesie, indem Sie den Pedalreflex des Tieres bei zehenspitzen.
- Enthaupten Sie die Maus und tauchen Sie den Kopf in eiskalte ACSF in einem chirurgischen Tablett aus Edelstahl ein.
- Extrahieren Sie das Gehirn innerhalb von 1 min und legen Sie es in ein Becherglas mit gekühltem ACSF für 5 min.
- Nehmen Sie das Gehirn aus dem Becher und trimmen Sie mit einem Skalpell den Hirnblock (Abbildung 3A).
- Legen Sie den Hirnblock auf einen 4% Agarblock (Schritt 5.3, Abbildung 3B). Beide Hemisphären können auf einem Agarblock montiert werden. Wischen Sie den überschüssigen ACSF mit einem Filterpapier aus dem Block.
- Dünnen Kleber (Superkleber) auf den Schneidetisch auftragen. Legen Sie den Agarblock darauf und wischen Sie den überschüssigen Klebstoff mit einem Filterpapier ab.
- Tragen Sie vorsichtig eine kleine Menge eiskalten ACSF (ca. 5 ml) mit einer Pipette von der Oberseite des Gehirn-Agar-Blocks auf. Dies wird dazu beitragen, überschüssigen Superkleber zu erstarren und zu verhindern, dass der Klebstoff das Gehirn bedeckt und das Schneiden stört.
- Befestigen Sie die Slicertabelle am Slicer-Fach (Abbildung 3C) und gießen Sie den modifizierten ACSF.
- Stellen Sie den Slicer auf eine langsame Geschwindigkeit ein, wobei die Klingenfrequenz maximal ist.
- Stellen Sie die Scheibendicke auf 350-400 m ein und beginnen Sie mit dem Schneiden (Abbildung 3C). Legen Sie die Scheiben in einer Sequenz an der Ecke des Slice-Trays, damit die Tiefe der Scheiben leicht unterschieden werden kann. Normalerweise können drei bis fünf Scheiben aus einer Hemisphäre gewonnen werden.
- Schneiden Sie den Hirnstammteil mit einer 30 G Nadel ab (Abbildung 3D).
HINWEIS: Mikrochirurgie an der Hirnscheibe, wie z. B. ein Schnitt zwischen der CA3-CA1-Grenze, sollte in diesem Stadium gegebenenfalls unter einem binokularen Mikroskop durchgeführt werden. - Mit einem kleinen gekippten Pinsel die Scheibe auf die Mitte des Membranfilters (0,45 m Poren, PTFE-Membran, 13 mm Durchmesser) mit dem Plexiglasring17 (15 mm Außendurchmesser, 11 mm Innendurchmesser, 1 mm Dicke, Abbildung 3E)legen. Legen Sie den Ring in die feuchte Rückgewinnungskammer (Abbildung 2) und sichern Sie die Abdeckung, um den Innendruck hoch zu halten.
HINWEIS: Die Scheiben kleben innerhalb von 30 min an der Membran und können mit den Ringen in den nachfolgenden Schritten in der Aufnahmekammer behandelt werden. Es besteht keine Notwendigkeit, Gewichte oder andere Maßnahmen zu verwenden, um die Scheibe an Ort und Stelle zu halten. - Passen Sie die Richtung und Position der Scheibe im Ring an, um sicherzustellen, dass sie gut zentriert ist und eine konsistente Richtung hat (siehe Schritt 9.3).
- Lassen Sie die Probe bei 28 °C für 30 min, und dann bei Raumtemperatur für mindestens 10 bis 30 min für die Rückgewinnung von Scheiben.
HINWEIS: Die Scheiben können nun mindestens 15 h einen guten physiologischen Zustand behalten.
7. Färben und Spülen der Scheiben (Mäuse)
- Mit einer Mikropipette tragen Sie vorsichtig 100-110 l der Färbelösung (Schritt 4) auf jede Scheibe auf den Ring auf. Acht bis neun Scheiben können mit einer In-Schritt 4-Färbelösung gebeizt werden. Lassen Sie die Scheiben für 20 min für die Färbung.
- Bereiten Sie 50-100 ml ACSF in einem Behälter vor und legen Sie den Ring mit geschnittenen Proben hinein, um die Färbelösung zu spülen.
- Bewahren Sie die spülte Scheibe in einer anderen Inkubationskammer auf. Warten Sie mehr als 1 h auf die Wiederherstellung vor dem Experiment.
HINWEIS: Die Inkubationskammer kann vom Gas gelöst und in einem engen versiegelten Zustand an den Aufnahmeort gebracht werden. Die Scheibe kann ohne Gasversorgung mindestens 20 min am Leben bleiben. Dies ist nützlich, wenn Sie das Slice zur Aufnahme an einen anderen Ort verschieben müssen.
8. Tägliche Vorbereitung von Versuchsgeräten
- Schalten Sie den Verstärker, den Computer und das Kamerasystem ein, und überprüfen Sie, ob die Software ausgeführt wird.
- ACSF in ein 50 ml Rohr und eine Blase mit Carbogen geben.
- Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe, um die ACSF zu zirkulieren. Stellen Sie den Durchfluss auf ca. 1 ml/min ein.
- Stellen Sie die Höhe der Saugpipette so ein, dass der Flüssigkeitsstand in der Experimentierkammer immer konstant ist.
HINWEIS: Die Höhe der Lösung ist wichtig, um eine stabile Aufzeichnung zu erhalten, daher sollte die Einstellung mit einem Mikromanipulator erfolgen. - Installieren Sie die Bodenelektrode bestehend aus gelbem Chip gefüllt mit 3 M KCl Agar (2%) (Schritt 1.8) in einen Halter mit einem Ag-AgCl-Draht mit kleiner Menge von 3 M KCl Lösung.
- Füllen Sie eine kleine Menge ACSF (ca. zwei Drittel des Volumens) mit einer verjüngten dünnen gelben Spitze in die Glaselektrode (1 mm Außendurchmesser, 0,78 mm Innendurchmesser gezogen mit einem Mikropipette-Zieher) und legen Sie sie in den Elektrodenhalter.
- Befestigen Sie den Halter an der im Manipulator installierten Stange. Stellen Sie sicher, dass der Elektrodenwiderstand bei ca. 1 Mio. BETRÄGT.
HINWEIS: Die langschaftige Breite-Öffnung (4-8 m Öffnung) Patch-Typ Elektrode sollte gut für die Feldaufnahme und als stimulierende Elektrode sein.
9. Starten einer Aufnahmesitzung
- Nehmen Sie eine Scheibenzubereitung aus der feuchten Kammer mit Zange.
- Legen Sie die Scheibe schnell auf eine Versuchskammer unter dem Mikroskop (Abbildung 4).
- Drücken Sie die Kante des Rings fest in den Silikon-O-Ring. Achten Sie darauf, die Membran oder den Boden der Experimentierkammer nicht zu brechen.
HINWEIS: Die Richtung der Scheibe sollte in Bezug auf die Richtung der stimulierenden und aufzeichnungsmittelartigelten Elektroden im Sichtfeld berücksichtigt werden. Die gesunde Scheibe sollte am Membranfilter kleben, so dass es nicht notwendig ist, andere Geräte zu verwenden, um die Scheiben wie Gewichte und Nylonnetze zu fixieren. - Legen Sie die Spitze der stimulierenden Elektrode und die Feldpotential-Aufnahmeelektrode mit durchsichtiver Licht auf die Scheibe unter das Mikroskop.
- Verwenden Sie das elektrophysiologische Aufzeichnungssystem, um die Reaktion zu überprüfen. Bestätigen Sie die übliche (nicht gefleckte) elektrophysiologische Aufzeichnung mit einer bestimmten Konfiguration.
HINWEIS: Die Aufnahmeelektrode kann weggelassen werden, ist aber nützlich, um die Physiologie der Scheibe zu überprüfen. - Stellen Sie die Anregungslichtintensität auf ca. 70-80% der maximalen Kapazität an der Kamera ein, die 13-15 mW/cm2 an der Probe entspricht, wenn sie bei 10 kHz mit 5x Wassertauchobjektiv objektiv und 1x PLAN APO Rohrlinse entnommen wird. Die Anregungslichtwellenlänge beträgt 530 nm, und der Emissionsfilter muss > 590 nm betragen.
HINWEIS: Verwenden Sie einen Verschluss, um die Menge an Anregungslicht zu minimieren. Kontinuierliche Lichteinwirkung kann die Scheibenphysiologie verschlechtern. Die mögliche schädliche Wirkung des Lichts hängt von der Intensität und Dauer des Lichts ab. Verwenden Sie elektrophysiologische Aufzeichnung, um die Wirkung von Licht zu beurteilen. Bei einer Festigkeit von 13-15 mW/cm2 sollte etwa 1 s Exposition die obere Toleranzgrenze sein. - Passen Sie den Fokus mit dem Erfassungssystem mithilfe der Fluoreszenzlichtquelle an, da der Fokus je nach Wellenlänge unterschiedlich sein kann, und starten Sie die Erfassung.
- Untersuchen Sie die Daten in einer Bildaufnahmesoftware.
HINWEIS: Wir verwendeten original Mikroprogrammierung Paket von numerischen Analyse-Software für die detaillierte Analyse.
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Representative Results
Abbildung 5 zeigt das repräsentative optische Signal bei elektrischer Stimulation der Schaffer-Kollateralen im Bereich CA1 einer Maus-Hippocampusscheibe. Die aufeinanderfolgenden Bilder in Abbildung 5A zeigen das optische Signal, bevor räumliche und zeitliche Filter angewendet wurden, während Abbildung 5B die gleichen Daten nach dem Anwenden eines 5 x 5 x 5 Kubikfilters zeigt (eine Gaußsche Kernelfaltung, 5 x 5 räumliche- und 5 bis zeitliche Dimension) zweimal. Aufgrund der hohen Bildrate (0,1 ms/Frame) und der hohen räumlichen Auflösung (100 Pixel x 100 Pixel) änderte die Anwendung des Filters das Signal nicht, sondern filterte das Rauschen heraus, das auch im In-Pixel-Verlauf in einer einzigen Testversion beobachtet werden kann ( Abbildung 5C, kein Filter; Abbildung 5D, mit Filter; und Abbildung 5E, überlagert).
Abbildung 6 vergleicht die typische Reaktion im Bereich CA1 eines Hippocampus-Segments zwischen Maus (Abbildung 6A) und Ratte (Abbildung 6B). Wie in der Abbildung deutlich wird, ist eine hyperpolarisierende Reaktion aufgrund hemmender Inputs in der Hippocampus-Scheibe der Ratte sichtbar, wenn der gleiche Stimulus auf die Schaffer-Kollateralen in der Nähe der CA1/CA3-Grenze angewendet wird. Die kleine hyperpolarisierende Reaktion wird in der distalen Seite des CA1 nach 24 ms in der Maus Hippocampusscheibe beobachtet, aber massivere hyperpolarisierende Reaktion überholt die depolarisierende Reaktion in der Ratte Hippocampus-Scheibe. Die VSD-Bildgebung kann den Unterschied zwischen Mund- und Ratten-Hippocampusscheiben deutlich zeigen.
Abbildung 1 : Eine Illustration des Agar-Blocks, der verwendet wird, um Hirngewebe zum Schneiden und ein Jig zu montieren, um den Block zu machen. (A) Eine schematische Darstellung des Hirnblocks und des 4% Agarblocks (B). (C, D) Foto einer verstellbaren Jig von einer Plexiglasplatte (jeweils 5 mm dick), um den Agarblock zu machen. Bei der Vorbereitung des Agarblocks sollten die obere und die untere Platte wie in D. (E) dargestellt gestapelt werden, indem eine Klinge in die langen dünnen Schlitze (1) und (2) eingefügt wird, der dreieckige Teil ausgeschnitten wird, der Schlitz (3) wird verwendet, um die gesamte Tiefe des Blocks zu trimmen. (4) Das Entfernen der oberen Platte ermöglicht das Ausschneiden der nicht notwendigen Teile. Machen Sie mit den Steckplätzen 1 und 2 nur 5 mm tiefe Schnitte, sodass der Block wie in (A) und (B) dargestellt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Eine Abbildung der Bebrütetkammer des Schnittstellentyps, die zur Aufrechterhaltung der Scheibenphysiologie verwendet wird. (A) Überblick über das System. (B) Innendetails. (C) Abbildung der Rückgewinnungskammer. Die Probe sollte auf einem Filterpapier auf einer ACSF-gefüllten 90 mm und 60 mm Petrischale platziert werden. Letzteres Gericht soll das Filterpapier stützen. Die Teller und ACSF Sprudelbehälter werden mit einer Plexiglasplatte an Ort und Stelle gehalten. Das Filterpapier sollte weder die Wand der luftdichten Box noch den Behälter berühren. Die Luft wird durch eine sprudelnde Flasche zugeführt, die befeuchtete Gase in die Kammer einbaut. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Hippocampal Scheibenpräparate aus einem Maushirn. (A) Das isolierte Maushirn sollte zuerst an der gestrichelten Linie (a) und dann (b) geschnitten werden. Schließlich sollte der Schnitt entlang der Linie (c) gemacht werden. Der Schnitt sollte senkrecht zum Boden sein. (B) Der Hirnblock sollte auf einem Agarblock montiert werden. (C) Der Agarblock sollte auf den Slicer gelegt werden. (D) Resultierendes Slice. Das überschüssige Gewebe sollte an der gestrichelten Linie geschnitten werden. (E) Die Scheibe sollte in der Mitte des Membranfilters mit einem Plexiglashalter (Außendurchmesser 15 mm, Innendurchmesser 11 mm, PTFE-Membranfilter von 13 mm) platziert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Aufzeichnungssystem für optische Signale aus Scheibenpräparaten. (A) Ein Foto des Mikroskops, mit dem die Scheiben im aktuellen Manuskript abgebildet werden. Die Optik besteht aus einer Objektivlinse (5x NA0.60), einer Spiegelbox für dichroitische Filter (580 nm) und einer Projektionslinse (Rohr) (PLAN APO x1.0). Eine Hochgeschwindigkeitskamera wird über eine C-Mount-Halterung an der Oberseite des Projektionsobjektivs befestigt. Es gibt eine weitere übliche USB-Kamera zur Beobachtung. Das Anregungslicht wird mit Glasfaser eingeführt. (B) Foto der Linsen, die mit der Spiegelbox kompatibel sind. (C) Schematische simtorische Darstellung des Aufzeichnungssystems. Das Bildgebungssystem und das elektrophysiologische Aufzeichnungssystem werden von einem PC gesteuert. Als Lichtquelle wurde ein LED-Beleuchtungssystem mit einer Photodioden-Feedback-Steuerung eingesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5 : Repräsentatives optisches Signal im Bereich CA1 einer Maus-Hippocampusscheibe in einer einzigen Studie. (A) Die aufeinanderfolgenden Bilder zeigen die Ausbreitung des neuronalen Signals, das mit einer Bildrate von 0,1 ms/Frame entlang des Schaffer-Kollateralwegs erfasst wurde, bevor räumliche und zeitliche Filter (alle 0,2 ms) angewendet werden. Die Erregung betrug 530 nm und die Emission >590 nm. (B) Die gleichen Daten nach einer Anwendung eines dreidimensionalen Gaußschen Kerns von 5 x 5 x 5 zweimal. (C, D) Die Spuren optischer Signale in den repräsentativen Pixeln [jeweils zwei Pixel (36 m) entlang einer Linie in der Mitte der CA1 werden im Quadrat in A angezeigt, * bezeichnet das Pixel in der Stratumpyramide] aus den Daten in A und B. (E) Das überlagerte Signal aus dem optische Signale in C und D. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6 : Vergleich des optischen Signals zwischen Maus- und Ratten-Hippocampus-Scheiben. Die repräsentativen aufeinanderfolgenden Bilder bei elektrischer Stimulation des Schaffer-Kollateralwegs in der Nähe der CA3/CA1-Grenze einer Maus (A) und einer Ratte (B) Hippocampusscheibe. Video 1 zeigt die Maus-Hippocampus-Scheibe und Video 2 die Hippocampus-Scheibe der Ratte. Der Zeitverlauf des optischen Signals in der Mitte der CA1 an der Stratum pyramidale (st. pyr.) und stratum radiatum (st. rad.) ist rechts neben der Abbildung dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Finale mM | gewicht | |
| NaH2PO4 • 2H2O | 1,25 mM | 3,90 g |
| MgSO4•7H2O | 2 mM | 9,86 g |
| Kcl | 2,5 mM | 3,73 g |
| Fügen Sie H2O hinzu, um 50 ml zu machen |
Tabelle 1: Lager A.
| Finale mM | gewicht | |
| MgSO4•7H2O | 2 mM | 12,32 g |
| Fügen Sie H2O hinzu, um 50 ml zu machen |
Tabelle 2: Lager B.
| Finale mM | gewicht | |
| CaCl2•2H2O | 2 mM | 5,88 g |
| Fügen Sie H2O hinzu, um 50 ml zu machen |
Tabelle 3: Lager C.
| Finale (mM) | gewicht | |
| Nacl | 124 mM | 7,25 g |
| NaHCO3 | 26 mM | 2,18 g |
| glukose | 10 mM | 1,8 g |
| Lager A | 2,5 ml | |
| Ca. 950 mlH2O hinzufügen und mit Mischgas blasen (95 % O2/5 % CO2) (10 min) | ||
| Lager C (CaCl2) | 2 mM | 2,5 ml |
| H2O hinzufügen, um 1.000 ml zu machen | ||
Tabelle 4: Tägliche Vorbereitung von ACSF.
| Finale (mM) | gewicht | |
| NaHCO3 | 26 mM | 2,18 g |
| sacharose | 205,35 mM | 70,29 g |
| glukose | 10 mM | 1,8 g |
| Lager A | 2,5 ml | |
| Lager B | 2,0 ml | |
| Ca. 900 mlH2O hinzufügen und mit Mischgas blasen (95 % O2/5% CO2) (10 min) | ||
| Lager C | 0,4 mM | 0,5 ml |
| H2O hinzufügen, um 1.000 ml zu machen | ||
Tabelle 5: Modifiziertes ACSF (Schneidlösung).
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Discussion
Die Scheibenphysiologie ist entscheidend, um das richtige Signal zu sammeln. Die Verwendung des Ring-Membran-Filtersystems in diesem Protokoll stellt sicher, dass die Scheibe während des gesamten Verfahrens gesund und unverzerrtbleibt. Andere Systeme können verwendet werden, um die Schnittphysiologie während der Aufnahme beizubehalten, aber die Scheibe sollte zu keinem Zeitpunkt verformt werden, da die Bildgebung jeden Teil der Scheibe benötigt, um gesund zu sein. Das Ring-Membran-Filtersystem eignet sich auch besser für die Färbung, da dies uns hilft, das Volumen der benötigten Färbelösung zu minimieren. Es ist auch wichtig, die Intensität des Anregungslichts zu kontrollieren, da es in Bezug auf die Zeitfraktion niedrig sein sollte. Die kontinuierliche Beleuchtung kann die Probe beschädigen; daher ist eine angemessene Verwendung des Verschlusses erforderlich.
Die Toxizität des VSD wurde oft diskutiert29, aber es ist ein Ergebnis der nicht-linearen Multiplikation der Farbstoffkonzentration, Anregung Lichtintensität, und Dauer der Exposition gegenüber dem Licht. Das in diesem Protokoll gezeigte Färbeverfahren hat keine messbaren Veränderungen der physiologischen Parameter der Scheibe verursacht, wie z. B. die Input-Output-Beziehungen der Feld-Potential-Aufnahmen und der Langzeitpotenzierung (LTP), gepaarter Puls Erleichterung (PPF). Die Verschlechterung der Scheibenphysiologie ist besonders bei kontinuierlicher Beleuchtung16groß, kann aber durch DieÜberwachung des Feldpotenzials bewältigt werden. Mit diesen Vorsichtsmaßnahmen können wir LTP mit kontinuierlicher optischer Aufzeichnung mit VSD für mehr als 12 h24aufzeichnen, was mit den am besten konditionierten In-vitro-Experimenten vergleichbar ist.
Während der Aufnahme kann der Lufttisch nützlich sein, aber Isolierung von anderen Geräten sollte aufgrund der geringen Vergrößerung der Optik erlaubt sein. Mechanische Störungen sind jedoch eine der Hauptursachen für schlechte Bildgebung. Wenn die beträchtliche Menge an falschen Signal im Bild besteht aus entgegengesetzten Zeichen am Rand des Objekts, also die Differenz der Helligkeit, ist es die wahrscheinlich durch die mechanischen Störungen verursacht. Die Bewegungen der Probe und flüssigkeit sind die häufigsten Ursachen von Bewegungsgeräuschen und sollten daher vermieden oder minimiert werden.
Das VSD-Signal (Fraktionierungsänderung der Lichtintensität) ist klein (10-3 bis 10-4 der ursprünglichen Fluoreszenz). Um eine solche kleine Änderung zu erkennen, sollte die Fluoreszenz 105 bis 106 Photonen am Detektor im Bruchteil der Zeit überschreiten, um die Wirkung von Photonenschussgeräuschen zu überwinden. Darüber hinaus sollte die Bildrate, um der neuronalen Aktivität zu folgen, schnell sein, in der Nähe der Zeitkonstanten, die für die Durchführung elektrophysiologischer Aufnahmen wie die um den kHz-Bereich erforderlich sind. Eine Kombination dieser beiden Bedingungen erfordert die Fluoreszenzmenge, die weit umfangreicher ist als andere Arten der fluoreszierenden Bildgebung. Dies erfordert eine hohe numerische Blende in der gesamten Optik, und das übliche Mikroskop ist nicht die beste Option. Größere Pupille und Blende werden benötigt, wie in Abbildung 4dargestellt.
Das Umcodierungssystem sollte mit der größeren Photonenbrunnentiefe, der schnellen Bildrate und dem geringen Rauschen übereinstimmen. Die Wahl hängt hauptsächlich von der Geschwindigkeit des neuronalen Systems ab. Das schnellere Signal wie die Hippocampus-Signaltransduktion benötigt ein spezielles ultraschnelles, geräuscharmes System. Das langsame Signal wie die langsame Ausbreitung der Aktivität in den Kortiken kann jedoch mit den üblichen, aber wissenschaftlichen Kameras erkannt werden.
Die Auswahl der Lichtquelle ist ebenfalls kritisch. Die Wahl des Lichts hängt von seiner Intensität, Stabilität und dem Bereich der Beleuchtung ab. Bei der Großfeldbildgebung mit geringer Vergrößerung müssen Sichtlichtquellen wie Lichtbögen und Laser ausdehnen, was die Verwendung dieser Quellen erschwert. Bögen wie Quecksilber und Xenon-Lampen sind die helle Lichtquelle, sind aber in der Regel nicht stabil. Die jüngste Entwicklung von Xenon light könnte das Problem jedoch überwinden. Die Halogenlampe ist stabil und hat eine größere Filamentfläche, die leicht mit Weitfeld-Bildgebung passen kann, aber in der Stärke begrenzt ist, vor allem bei 530 nm. Die jüngste Entwicklung der Power-LED hat es uns ermöglicht, sie als potenzielle Lichtquelle zu verwenden, aber sie muss aufgrund der Temperaturabhängigkeit über den Rückkopplungsstabilisator verfügen. Laser können verwendet werden, aber die hohe Koherenz führt zu einem gesprenkelten Rauschen, das normalerweise für Die Großfeld-Bildgebung nicht akzeptabel ist.
Das in diesem Artikel vorgestellte VSD-Bildgebungsprotokoll misst einen Wert relativ zur Ruhebedingung. Eine absolute Messung des Membranpotentials kann nicht mit der aktuellen Technik durchgeführt werden. Ratiometrische Bildgebungs- und Fluoreszenzlebensdauermessungen können verwendet werden, um die absoluten Membranpotenziale zu bewerten.
Die Bildgebung von Gehirnscheiben, die bei geringer Vergrößerung mit VSD befleckt sind, kann die subschwelligen Membranpotenziale in den Mikrokreisläufen des Gehirns demonstrieren. Ein solcher funktioneller Umfang in Bezug auf die Verbindung zwischen den Mikroschaltungen bei Echtzeitauflösung wird in vielen Bereichen der Hirnforschung nützlich sein, insbesondere um die pathologischen Aspekte zu analysieren, die höchstwahrscheinlich durch solche erregenden und hemmenden funktionellen Aspekte verursacht werden. Verbindungen zwischen verschiedenen Hirnbereichen. Diese Anwendung wird entscheidend sein, um die Veränderungen in neuronalen Schaltkreisen im Zusammenhang mit bestimmten Arten von neuropsychiatrischen Erkrankungen30,31,32zu untersuchen.
Die Entwicklung der genetisch kodierten Spannungsanzeige33,34 ist die zukünftige Richtung für optische Membranpotentialaufnahmen, die den Weg für die attraktiven Anwendungen der zelltypspezifischen Analyse neuronaler Ereignisse auf Schaltungsebene.
In der Optik gibt es viel Raum für Verbesserungen, insbesondere für die Visualisierung der Weitfeld-Funktionsverbindungen. Unsere neuartige konfokale Optik35 ermöglicht die Aufzeichnung des VSD-Signals mit hoher Geschwindigkeit und einem hohen S/N-Verhältnis.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
TT erhielt den JSPS KAKENHI Grant (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 und JP15K00413) von MEXT und Zuschüssen des Ministeriums für Gesundheit, Arbeit und Wohlfahrt (MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] und H30 [18062156]). Wir danken Editage (www.editage.jp) für die Englischsprachige Bearbeitung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM - Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| Poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer/Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| Polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
References
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