Summary
電圧感受性染料を用いた脳スライスの再現性と安定した光学記録法をご紹介します。この記事では、従来の海馬スライス製剤を用いた光信号の電圧感受性染料染色と記録について説明する。
Abstract
脳スライス製剤の広視野単一光子電圧感受性色素(VSD)イメージングは、神経回路における機能的接続性を評価するのに有用なツールである。光信号の小数変化により、この方法を定量的アッセイとして用いるのは困難であった。この資料では、この技術を安定して信頼性の高い方法で行う特殊な光学およびスライス処理システムについて説明します。本稿では、VSD染色海馬スライスのスライス処理、染色、および記録について詳しく説明する。システムは良好な染色と長い時間の生理学的条件を維持し、記録の間にスライスの機械的な動きを防ぐ。また、少量の染料でスライスの染色が可能です。光学系は低倍率で高い数値絞りを実現し、100ピクセル×100ピクセルの空間解像度で最大フレームレート10kHzでVSD信号を記録できます。高いフレームレートと空間分解能により、この技術は、神経回路の変化を評価するのに十分な信号対雑音比を提供するポストレコーディングフィルタの適用を可能にします。
Introduction
バルク染色された脳スライス製剤の広視野単一光子電圧感受性色素(VSD)イメージングは、神経回路1、2、3、4のダイナミクスを評価するのに有用な定量的ツールとなっています。.膜励起5、6、7、VSDイメージングによる光学特性の変化の分析の後、コーエンらによって1970年代初頭に最初に説明された6,8、 9. ;染料が膜電位変化(すなわち、ニューロンの一次シグナル)を直接プローブするので、脳の機能をリアルタイムで監視するのに適した方法です。
最も初期のVSDは、神経膜電位事象の急速な運動性に従う速い時間定数、膜電位の変化との直線性など、脳システムを理解するために望ましい特性を有していた9、10歳,11歳,12歳,13歳,14歳,15.他のイメージング実験と同様に、この技術は、カメラ、光学、ソフトウェア、スライス生理学などの幅広い特定のチューニングを必要とし、所望の結果を達成する必要があります。これらの技術的な落とし穴のために、最初の努力の間に期待される利点は、必ずしもこの技術に特化していない研究室のほとんどのために実現しませんでした。
技術的な困難の主な原因は、スライス製剤のバルク染色に適用した場合の膜電位変化に対するVSDの低感度であった。光信号の大きさ(すなわち、蛍光の分画変化)は、通常、生理的条件下での対照(F0)信号の10-4-10-3である。ニューロンにおける膜電位変化の時間スケールは、約ミリ秒から数百ミリ秒です。ニューロンの膜電位の変化を測定するには、記録に使用されるカメラは、高速(10 kHz~100Hz)で画像を取得できる必要があります。VSDの低感度とニューラル信号に従うために必要な速度は、高い信号対雑音比(S/N)2、16で、高速でカメラに集める大量の光を必要とします。
記録システムの光学はまた十分な光のコレクションを保障し、S/Nを改善するために重要な要素である。光学系によって達成される倍率は、多くの場合、局所的な機能的な神経回路を可視化するために、1Xから10Xなど、過度に低いです。例えば、海馬回路のダイナミクスを可視化するためには、約5倍の倍率が適しているであろう。このような低倍率は、低蛍光効率を有する;したがって、高度な光学系は、このような記録のために有益であろう。
また、スライス生理学も不可欠です。イメージング解析ではスライスをそのままにする必要があるため、慎重なスライス処理が必要です17.さらに、スライスの生存率を長期間維持するための対策が重要である18.
本稿では、スライスの調製、VSD染色、および測定のためのプロトコルについて説明する。また、VSD、イメージングデバイス、光学系の改善、および実験システムに対するその他の改良点の概要を説明し、この方法を視覚化するための簡単で強力で定量的なアッセイとして使用することを可能にしました。脳機能の修飾19,20,21,22,23,24,25.この技術はまた、海馬スライス1のCA1領域における長期増強のために広く使用することができる。さらに、この技術は、単一の神経細胞26における膜電位の光学的記録にも有用である。
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Protocol
全ての動物実験は、徳島文理大学動物管理利用委員会の承認を受けた議定書に従って行われました。スライス調製のための以下のプロトコルは、ほぼ標準的な手順27であるが、変更はVSDによる染色および記録のプロトコルであった。
1. 実験日の前の準備
- ストックA(表1)、ストックB(表2)、ストックC(表3)溶液を用意し、冷蔵庫に保管します。
- 人工脳脊髄液(ACSF)の1Lを調圧し(表4、ステップ3を参照)を冷蔵庫に保管します。
- 1Lの改変ACSF(表5)を準備し、冷蔵庫に保管してください。
- 2 mLバイアルに500 μLのウシ血清(FBS)を分配し、冷凍庫に保管します。
- ACSF(約120mL)の寒天粉末の4%を電子レンジで溶かし、90mm使い捨てペトリ皿に注ぎます。寒天プレートは、さらに使用する前に冷蔵する必要があります。
- 実験の前日に、外科用トレイ、スライサー容器、アルミニウム冷却ブロック(120 x 120 x 20 mm 3)を冷凍庫に入れます。
- スライス処理システム17、28用の膜フィルター付きプレキシガラスリングが十分にあることを確認してください(ステップ6.12を参照)。
- 寒天粉末の2%を電子レンジで3M KClの50mLに溶解する。接地電極のマイクロピペットを使用して、200 μL チップで温寒天-KCl 溶解剤の約 85 μL を取ります。まだ暖かい寒天3M KClゲルに先端を取り外します。2%寒天で約20〜40のヒントを埋めるためにステップを繰り返します。
2. VSD(di-4-ANEPPS)ストックソリューションの準備
- 超純水で10%ポリエトキシ化ヒマチ油溶液の1 mLを調製します。
- di-4-ANEPPS(5mgバイアル)、渦および超音波処理のバイアルに1mLのエタノールを10分間加加えます。溶液は、di-4-ANEPPS結晶の可能な小さな残留物と深い赤色に変わります。
注:このステップで使用されるエタノールは、新たに開く必要があります。 - 溶液をOリングで2mLマイクロチューブに移します。溶液をスピンダウンし、10%ポリエトキシ化ヒマサ油溶液の500 μLを追加します。
注:染料は親油性が高い。DMSOおよびポロクサマーは、di-4-ANEPPSを溶解するためにも使用できますが、膜電位の変化に際して光信号の観点から、エタノール-ポリエトキシン化ヒマシ油の使用はノイズ比に対するより良い信号を与えることがわかりました。これは、細胞膜への溶媒の伝達速度に関連する可能性があります。 - 色素が完全に溶解するまで渦と超音波。
- 光への露出を避け、冷蔵庫に保管してください。冷凍庫には保管しないでください。在庫は数ヶ月間持続することができます。
注:実験当日は、手順3~9に従ってください。
3. ACSFの毎日の調製(1L) (表4)
- NaCl、NaHCO3、およびフラスコ内のブドウ糖の重量を量る。
- フラスコに蒸留水の950 mLを追加し、95% O2/5% CO2ガスで泡立て始めます。
- フラスコに2.5mLのストックA溶液を加え、室温で約10分間インキュベートします。
- フラスコに2.5mLのストックC溶液を追加します。
- 蒸留水を加えて溶液を1Lにします。
4. 染色VSD溶解の毎日の準備
- 超音波装置でFBSおよびVSDストック溶液(ステップ2)の500 μLバイアルを5分間超音波処理器で超音波処理します。
- FBSのバイアルに500 μLの新たに調製されたACSFを追加します。
- バイアルにVSDストック溶液の20(マウスの場合)または40(ラットの場合)μLを添加する。
- 超音波と溶液が淡いオレンジになるまでバイアルを渦。
5. 手術の準備
- 300mLのステンレス容器、300mLビーカー、プラスチック容器に100mLの冷蔵ACSFを別々に取り、冷凍庫に入れます。冷やしたACSF(表2)を150mLの別のビーカーに注ぎ、冷凍庫に入します。解決策が冷えるまで待ちます。要時間は事前に測定し、決定する必要があります。
- かみそり刃(炭素鋼、工業用グレード0.13mm、両側のブレード)をスライサーの半分に折ります。
注:残りの半分は、適切なブレードホルダーで解剖に使用することができます。 - ACSF 4%寒天プレートから調整治具でブロックを準備します(図1)。
- 湿ったインキュベーションチャンバー(インターフェイスタイプのチャンバー、シリコーンパッキング付きの修正された1.2 Lタイトな密封ボックス)を準備し、脳のスライスを生理的に生き生きと保ちます(図2)。小さな容器にACSFを入れ、95%O2/5%CO2ガスで炭酸塩を加え、90mm x 20mmのペトリ皿を上部にACSFで充填します。
注:より小さいペトリ皿(60ミリメートルx 20ミリメートル)は、皿上のフィルターペーパーをサポートするために、90ミリメートルの皿の中央に配置する必要があります。 - 加熱装置に箱を置き、20分間待って28°Cまで温めます。
- 砕いた氷をスライサーの容器に入れます。メス、ブレードホルダー、リングピンセット、寒天ブロック、スライサーのステージ:氷の上にステンレススチール製のバット(小)に次の楽器を置きます。凍結ACSFを凍結し、95%O 2/5%CO2ガス(別名炭水化物)で氷と泡の上にACSFを改変してください。
- 次の器具をバット(大)に入れます:はさみ(大、小)、ピンセット、へら、スプーン、斜めのペンチ。
6. 手術(マウス)
- ヒュームフードにイソファランを使用してマウスを麻酔する。つま先のピンチに動物のペダル反射をチェックすることにより、麻酔のレベルを評価します。
- マウスを切断し、ステンレス鋼の外科皿で氷冷ACSFに頭部を浸す。
- 1分以内に脳を抽出し、5分間冷やしたACSFを含むビーカーに入します。
- ビーカーから脳を取り出し、メスを使用して、脳ブロックをトリミングします(図3A)。
- 脳ブロックを4%寒天ブロックの上に置きます(ステップ5.3、図3B)。両方の半球は寒天のブロックに取付けることができる。余分なACSFをフィルターペーパーでブロックから拭きます。
- スライサーテーブルに薄い接着剤(スーパー接着剤)を塗布します。寒天ブロックをその上に置き、フィルターペーパーを使用して余分な接着剤を拭きます。
- 脳寒天ブロックの上部からピペットを使用して、少量の氷冷ACSF(約5mL)を静かに塗布します。これは、余分なスーパー接着剤を固め、接着剤が脳を覆い、スライスを妨げるのを防ぐのに役立ちます。
- スライサーテーブルをスライサートレイ(図3C)に固定し、変更したACSFを注ぎます。
- スライサーを遅い速度に設定し、ブレードの周波数を最大に設定します。
- スライスの厚さを 350 ~ 400 μm に設定し、スライスを開始します (図 3C)。スライストレイの隅にスライスを順番に配置して、スライスの深さを簡単に区別できるようにします。通常、1つの半球から3~5枚のスライスを得ることができます。
- 30G針(図3D)を用いて脳幹部分を切り取る。
注:CA3-CA1境界間の切断などの脳スライス上の微小手術は、必要に応じて双眼鏡の下でこの段階で行われるべきである。 - 小さな先端のペイントブラシを使用して、プレキシガラスリング17(外径15mm、内径11mm、厚さ1mm、図3E)で保持した膜フィルター(0.45μmの細孔、PTFE膜、13mm径)の中央にスライスを置きます。しっとりした回復室(図2)にリングを置き、カバーを固定して内圧を高く保ちます。
注:スライスは30分以内に膜に付く、記録室の後続のステップのリングと扱うことができる。スライスを所定の位置に保つために、ウェイトやその他の手段を使用する必要はありません。 - リング内のスライスの方向と位置を調整して、スライスが中央にしっかりと配置され、一貫した方向を持っていることを確認します(ステップ 9.3 を参照)。
- 28 °Cで30分間試料を残し、その後、スライスの回収のために少なくとも10〜30分間室温で残します。
注:スライスは今、少なくとも15時間のために良好な生理学的状態を保持することができます。
7. スライスの染色とすすり(マウス)
- マイクロピペットを使用して、リング上の各スライスに100-110 μLの染色液(ステップ4)を静かに塗布します。8~9枚のスライスをステップ4で調製した1つの染色溶液で染色することができる。スライスは20分間染色したままにしておきます。
- 容器にACSFの50-100 mLを準備し、その中にスライスされた標本でリングを入れて染色液をすすいでください。
- すすり切ったスライスを別のインキュベーションチャンバーに保管します。実験の前に回復のために1時間以上待ちます。
注:インキュベーションチャンバはガスから取り外し、密閉された状態で記録の場所に移動することができます。スライスはガス供給なしで少なくとも20分間生き続けることができる。これは、記録のためにスライスを別の場所に移動する必要がある場合に便利です。
8. 実験装置の日々の準備
- アンプ、コンピュータ、カメラシステムの電源を入れ、ソフトウェアが実行中であることを確認します。
- ACSFを50mLチューブに入れ、炭水化物を入れた泡を入れます。
- 蠕動ポンプを使用してACSFを循環させる。流量を約1mL/分に調整します。
- 実験室内の液体レベルが常に一定になるように、吸引ピペットの高さを調整します。
注:溶液のレベルは、安定した記録を得るために重要であるため、調整はマイクロマニピュレータを使用して行われるべきです。 - 3 M KCl 寒天で満たされた黄色のチップで構成された地上電極をインストールします (2%)(ステップ1.8)を、少量の3M KCl溶液を含むAg-AgClワイヤを有するホルダーに入れる。
- 少量のACSF(体積の約3分の2)をガラス電極(外径1mm、マイクロピペットプーラーで引っ張った内径0.78mm)をテーパード細いチューブ状の黄色の先端を使用して、電極ホルダーに入れます。
- マニピュレータに取り付けられているロッドにホルダーを取り付けます。電極抵抗が約1MΩであるアンプを使用してください。
注:長シャンクワイド開口部(4-8 μm開口部)パッチタイプの電極は、フィールド記録および刺激電極として良好である必要があります。
9. レコーディングセッションの開始
- 鉗子で湿った部屋からスライスの準備を取る。
- 顕微鏡下の実験室にスライスを素早く置きます(図4)。
- リングの端をシリコーンOリングにしっかりと押し込みます。実験室の膜や底を壊さないように注意してください。
注:スライスの方向は、視野における刺激および記録電極の方向に関して考慮されるべきである。健康なスライスは、重みやナイロンメシなどのスライスを固定するために他のデバイスを使用する必要はありませんので、膜フィルタに固執する必要があります。 - 刺激電極の先端と電界電位の先端を透過光で顕微鏡下のスライスに置きます。
- 電気生理学的記録システムを使用して応答を確認します。所定の構成で通常の(非染色された)電気生理学的記録を確認する。
注:記録電極は省略できますが、スライスの生理学をチェックするのに役立ちます。 - 5倍の水浸し対物レンズと1x PLAN APOチューブレンズで10kHzでサンプリングする場合は、試料で13-15 mW/cm2に対応するカメラの最大容量の約70-80%に励起光強度を調整します。励起光波長は530nmで、発光フィルタは> 590 nmでなければなりません。
注:シャッターを使用して励起光の量を最小限に抑します。連続的な光暴露は、スライス生理学を悪化させる可能性があります。光の有害な影響は、光の強度と持続時間に依存します。電気生理学的記録を使用して、光の影響を判断します。13-15 mW/cm2の強度の場合、約1sの露光は、公差の上限でなければなりません。 - 蛍光光源を用いて集録システムでフォーカスを調整します。
- 画像取得ソフトウェアのデータを調べます。
注:数値解析ソフトウェアの独自のマイクロプログラミングパッケージを用い、詳細な分析を行いました。
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Representative Results
図5は、マウス海馬スライスの領域CA1におけるシャッファー担保の電気刺激時の代表的な光信号を示す。図 5Aの連続した画像は、空間フィルタと時間フィルタが適用される前の光信号を示し、図 5Bは 5 x 5 x 5 立方フィルタ (ガウスカーネル畳み込み、5 x 5 空間- および 5 に対して 5 を適用した後の同じデータを示しています。時系列次元)を2回)高いフレームレート(0.1ミリ秒/フレーム)と高い空間解像度(100ピクセルx100ピクセル)のため、フィルタの適用は信号を変更しませんでしたが、ノイズをフィルタリングし、単一のトライアルでピクセル単位で記録されたタイムコースでも観察することができます(図5C、フィルタなし。図 5D,フィルター付き;図5E、重ね合わせ)。
図6は、マウス(図6A)とラット(図6B)の間の海馬スライスの領域CA1における典型的な応答を比較した。図に明らかなように、抑制入力による過分極応答は、CA1/CA3境界付近のシャッファー担保に同じ刺激を加えた場合、ラット海馬スライスに明らかである。小さな過分極応答は、マウス海馬スライスで24ミリ秒後にCA1の遠位側で観察されるが、より大規模な過分極応答はラット海馬スライスにおける脱分極応答を追い越した。VSDイメージングは、マウスとラットの海馬スライスの違いを明確に示すことができます。
図 1:スライスのための脳組織をマウントするために使用される寒天ブロックの図とブロックを作るために治具。(A) 脳ブロックと4%寒天ブロック(B)の模式図。(C, D)寒天ブロックを作るためにプレキシガラスプレート(各5mmの厚さ)によって作られた調節可能なジグの写真。寒天ブロックを準備する場合、上部プレートと下部プレートは、D.(E)に示すように、長い薄いスロット(1)と(2)にブレードを挿入することにより、三角形の部分が切り取られ、スロット(3)がブロックの全体の深さをトリミングするために使用される。(4)アッパープレートの取り外しにより、不要な部品のスライスが可能です。スロット 1 と 2 を使用して、(A) と (B) に示すように、5 mm の深いカットのみを行います。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:スライス生理学を維持するために使用されるインターフェースタイプのインキュベーションチャンバの図。(A) システムの概要。(B) インテリアの詳細。(C) 回収室の図。標本は、ACSFで満たされた90mmと60ミリメートルペトリ皿上に配置されたフィルターペーパー上に配置する必要があります。後者の皿は、フィルターペーパーをサポートすることです。食器およびACSFの泡立つ容器はプレキシガラス版と所定の位置に保たれる。フィルターペーパーは、エアタイトボックスや容器の壁に触れてはなりません。空気は部屋の湿ったガスを組み込む泡立つびんを通して供給される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3:マウス脳からの海馬スライス製剤。(A) 単離されたマウスの脳は、最初に破線(a)で切断し、次に(b)に切る必要があります。最後に、カットはライン(c)に沿って行われるべきです。カットは下部に垂直にする必要があります。(B) 脳ブロックは寒天ブロックに取り付けるべきである。(C) 寒天ブロックはスライサー上に置くべきである。(D) 結果のスライス。余分な組織は破線で切断する必要があります。(E) スライスは、プレキシガラスホルダー(外径15mm、内径11mm、PTFE膜フィルター13mm)を備えた膜フィルターの中央に配置する必要があります。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4:スライス調製からの光信号の記録システム。(A) 現在の原稿のスライスを画像化するために使用される顕微鏡の写真。光学系は対物レンズ(5x NA0.60)、ダイクロイックフィルター用ミラーボックス(580nm)、投影(チューブ)レンズ(PLAN APO x1.0)で構成されています。プロジェクションレンズ上部にはcマウントを介して高速カメラが取り付けられています。観察のための別の通常のUSBカメラがあります。励起光は光ファイバーを用いて導入される。(B) ミラーボックスに対応したレンズの写真。(C) 記録システムの概略図。イメージングシステムおよび電気生理学的記録システムはPCによって制御される。光ダイオードフィードバック制御システムを備えたLED照明システムを光源として用いた。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5:マウス海馬スライスの領域CA1における代表的な光信号を1回の試験で行う。(A) 連続した画像は、空間フィルタおよび時間フィルタ(0.2ミリ秒ごとに)を適用する前に、シャッファーの担保経路に沿って0.1ミリ秒/フレームのフレームレートで獲得されたニューロン信号の伝搬を示しています。励起は530nm、発光は>590 nmであった。(B) 5 x 5 x 5の3次元ガウスカーネルを2回適用した後の同じデータ。(C, D)CA1の真ん中の線に沿った代表画素内の光信号の痕跡[各2ピクセル(36 μm)]は、Aの正方形に示され、*はAとBに示すデータから「層ピラミッドのピクセルを示す」(E) AおよびB.(E)から重ね合わせた信号から C および D. の光信号は、この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6:マウスとラット海馬スライスの光信号の比較マウス(A)およびラット(B)海馬スライスのCA3/CA1境界付近のシャッファー側線経路の電気刺激時の代表的な連続画像。ビデオ1はマウス海馬スライスを示し、ビデオ2はラット海馬スライスを示す。図の右側に、地層ピラミッド(st. pyr.)と地層放射(st. rad.)のCA1の真ん中にある光信号の時間経過が示されている。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 最終 mM | 重量 | |
| NaH2PO4 • 2H2O | 1.25 メートル | 3.90グラム |
| MgSO4•7H2O | 2 mM | 9.86グラム |
| Kcl | 2.5 mM | 3.73グラム |
| 50 mL を作るために H2O を追加します。 |
表 1: ストック A.
| 最終 mM | 重量 | |
| MgSO4•7H2O | 2 mM | 12.32グラム |
| 50 mL を作るために H2O を追加します。 |
表 2: 在庫 B.
| 最終 mM | 重量 | |
| カクル2•2H2O | 2 mM | 5.88グラム |
| 50 mL を作るために H2O を追加します。 |
表 3: ストック C.
| ファイナル (mM) | 重量 | |
| 塩化 ナトリウム | 124 mM | 7.25グラム |
| ナーコ3 | 26 mM | 2.18グラム |
| グルコース | 10 mM | 1.8グラム |
| ストック A | 2.5 mL | |
| H2 Oの約950mLを加え、混合ガスで気泡を加える(95% O2/5% CO2)(10分) | ||
| ストックC (CaCl2) | 2 mM | 2.5 mL |
| H2O を追加して 1,000 mL を作成 | ||
表4:ACSFの毎日の準備。
| ファイナル (mM) | 重量 | |
| ナーコ3 | 26 mM | 2.18グラム |
| ショ糖 | 205.35メートル | 70.29グラム |
| グルコース | 10 mM | 1.8グラム |
| ストック A | 2.5 mL | |
| ストックB | 2.0 mL | |
| H2 Oの約900mLを加え、混合ガスで気泡を加える(95% O2/5% CO2)(10分) | ||
| ストック C | 0.4 mM | 0.5 mL |
| H2O を追加して 1,000 mL を作成 | ||
表5:ACSFを改変(切断液)。
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Discussion
スライス生理学は、正しい信号を収集するために不可欠です。このプロトコルでリング膜フィルタシステムを使用すると、手順2、16、17を通じてスライスが健全で歪まないままであることを保証します。他のシステムは、記録中にスライス生理学を保持するために使用することができますが、イメージングは、スライスのすべての部分が健康である必要とするために、スライスはいつでも変形してはなりません。リング膜フィルターシステムは、必要な染色液の体積を最小限に抑えるのに役立ちますので、染色にも優れています。時間分数に対して低くすべきであるので、励起光の強度を制御することも重要です。連続的な照明は標本を損傷させることができる;そのため、シャッターの適切な使用が必要です。
VSDの毒性は、しばしば29について議論されてきたが、それは色素濃度、励起光強度、および光への暴露の持続時間の非線形乗算の結果である。このプロトコルに示す染色手順は、フィールドポテンシャル記録の入力出力関係や長期増強(LTP)、ペアパルスなどのスライスの生理学的パラメータに測定可能な変化を引き起こさなかったファシリテーション (PPF)スライス生理学の劣化は、特に連続照明16の下で大きかったが、電位を監視することによって管理することができる。これらの予防措置を用いることで、12h24以上のVSDを用いた連続光学記録でLTPを記録することができ、これはインビトロ実験で最も条件付き最高の条件付きに匹敵します。
記録中、エアテーブルは有用かもしれませんが、光学系の倍率が低いため、他のデバイスからの絶縁を許可する必要があります。しかし、機械的な障害は、画像化が不十分な原因の1つです。画像中の偽信号のかなりの量が物体の端に反対の標識で構成されている場合、したがって明るさの違いは、機械的な障害によって引き起こされる可能性が最も高いです。試料と流体の動きは、モーションノイズの最も頻繁な原因であり、したがって、避けるか、または最小限にする必要があります。
VSD信号(光強度の微小変化)は小さい(初期蛍光の10-3〜10-4)。 このような小さな変化を検出するために、蛍光は光子ショットノイズの影響を克服するために、時間の数分で検出器で10 5〜106光子を超える必要があります。さらに、神経活動に従うためには、フレームレートが速く、kHz範囲の周りのような電気生理学的記録を行うために必要な時間定数に近い必要がある。これら2つの条件を組み合わせるには、他の種類の蛍光イメージングよりもはるかに広範な蛍光量が必要です。これは、全体の光学系で高い数値開口部を必要とし、通常の顕微鏡は最良の選択肢ではありません。図 4に示すように、より大きな瞳孔と絞りが必要です。
リコード システムは、より大きなフォトンの井戸深度、高速フレーム レート、および低ノイズと一致する必要があります。選択は主に神経系の速度に依存します。海馬信号の伝達のようなより速い信号は専門の超高速、低雑音システムを必要とする。しかし、皮質中の活動のゆっくりとした広がりなどの遅い信号は、通常の科学的なグレードのカメラを使用して検出されるかもしれません。
光源の選択も重要です。光の選択は、その強度、安定性、および照明の面積に依存します。低倍率の広視野イメージングの場合、アークやレーザーなどの点光源を拡大する必要があり、これらの光源を使用することが困難になります。水銀やキセノンランプなどのアークは明るい光源ですが、通常は安定していません。しかし、キセノン光の最近の開発は、問題を克服する可能性があります。ハロゲンランプは安定しており、広視野イメージングと容易に一致させることができるフィラメントのより大きな領域を有するが、特に530 nmで強度に制限されている。最近の電源LEDの開発により、潜在的な光源として使用できるようになりましたが、温度依存性のためにフィードバックスタビライザーが必要です。レーザーは使用できますが、高い一貫性は斑点のあるノイズを生み出し、広視野イメージングでは通常は受け入れられません。
この資料に示す VSD イメージング プロトコルは、休止状態に対する値を測定します。膜電位の絶対測定は、現在の技術では行うことができない。レシオメトリックイメージングと蛍光寿命測定は、絶対膜電位を評価するために使用できます。
低倍率でVSDで一括染色された脳スライスのイメージングは、脳の微小回路相互作用におけるサブ閾値膜電位変化を実証することができる。リアルタイム分解能におけるマイクロ回路間の接続に関するこのような機能的範囲は、脳研究の多くの分野で有用であり、特に興奮性および阻害機能によって引き起こされる可能性が最も高い病理学的側面を分析するために有用であろう。異なる脳領域間の接続。このアプリケーションは、神経精神疾患30、31、32の特定のタイプに関連する神経回路の変化を調査するために重要になります。
遺伝的にコードされた電圧インジケーター33,34の開発は、神経の細胞型特異的解析の魅力的な応用への道を開く光学膜電位記録の将来の方向である回線レベルのイベント。
特に広視野の機能的接続を視覚化するために、光学系の改善の余地は大きいです。私達の新しい共焦点光学35はVSD信号の高速および高S/Nの比率記録を可能にする。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
TTは、JSPSカケンヒ助成金(JP16H06532、 文部科学省の助成金(厚生労働省「15570760」、H30[180626])のJP16K21743、JP16H06524、JP16K00038、JP15K00413。英語編集の編集(www.editage.jp)に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM - Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| Poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer/Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| Polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
References
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