Summary
نعرض طريقة لتشريح وتشريح نماذج سرطان البروستاتا الماوس، مع التركيز على تشريح ورم البروستاتا. كما يتم تقديم بروتوكول خطوة بخطوة لتوليد الأعضاء ورم البروستاتا الماوس.
Abstract
وقد أدت الأساليب القائمة على إعادة التركيب المتجانس لتعديل الجينات إلى تعزيز البحوث البيولوجية إلى حد كبير. نماذج الماوس المهندسة وراثيا (GEMMs) هي طريقة صارمة لدراسة تطور الثدييات والمرض. وقد طور مختبرنا العديد من GEMMs من سرطان البروستاتا (PCa) التي تفتقر إلى التعبير عن واحد أو عدة جينات قمع الورم باستخدام موقع محدد Cre-loxP نظام إعادة الكومبوماومر والمروج البروستاتا محددة. في هذه المقالة، ونحن نصف طريقتنا لnecropsy من هذه GEMMs PCa، مع التركيز في المقام الأول على تشريح أورام البروستاتا الماوس. وقد سهلت الأساليب الجديدة التي تم تطويرها على مدى العقد الماضي ثقافة الخلايا المستمدة من الظهارة إلى نموذج أنظمة الأعضاء في المختبر في ثلاثة أبعاد. كما نقوم بتفصيل طريقة زراعة الخلايا ثلاثية الدنابية لتوليد أعضاء الورم من الماوس PCa GEMMs. وقد هيمنت أبحاث السرطان قبل السريرية من قبل ثقافة الخلايا 2D ونماذج xenograft المستمدة من خط الخلية أو المريض المستمدة. هذه الطرق تفتقر إلى البيئة الدقيقة الورم، والحد من استخدام هذه التقنيات في الدراسات ما قبل السريرية. GEMMs هي أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية لفهم الأورام وتطور السرطان. ثقافة الجهاز الورم هو نظام نموذج في المختبر الذي يلخص الهندسة المعمارية الورم وخصائص سلالة الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، تسمح أساليب زراعة الخلايا ثلاثية الدمن بنمو الخلايا الطبيعية للمقارنة مع ثقافات الخلايا السرطانية، ونادراً ما يكون ذلك ممكناً باستخدام تقنيات زراعة الخلايا ثلاثية الد. في تركيبة، استخدام GEMMs وثقافة الخلايا ثلاثية الد في الدراسات ما قبل السريرية لديه القدرة على تحسين فهمنا لبيولوجيا السرطان.
Introduction
منذ أواخر الثمانينات، وقد تقدمت القدرة على تغيير الجينات عن طريق إعادة تركيب متجانسة إلى حد كبير دراسة النظم البيولوجية1. وقد تقدمت الدراسات الجينية من خلال تسهيل السيطرة على التعديلات الجينية من الناحيتين الزمنية والمكانية2و3، 4. وقد خلق الجمع بين هذه الاستراتيجيات الوراثيةمجموعة واسعة من أنظمة النماذج التجريبية 5،6،7.
نماذج الماوس المهندسة وراثيا (GEMMs) هي أداة متكاملة لتقييم كيفية تأثير الجينات الفردية أو مجموعات الجينات على نمو الثدييات والمرض. في أبحاث السرطان قبل السريرية، GEMMs هي الطريقة الأكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية وصارمة لدراسة تطور السرطان، والتقدم، والعلاج8. لدينا مختبر متخصص في توليد وتميز السرطان GEMMs.
السرطان غير الجلدي الأكثر تشخيصا ً بين الرجال في الولايات المتحدة هو سرطان البروستاتا (PCa). غالبية المرضى الذين يعانون من مرض PCa يعانون من مرض منخفض المخاطر واحتمال كبير للبقاء على قيد الحياة، ولكن معدلات البقاء على قيد الحياة تنخفض بشكل كبير عندما يتم تشخيص المرض في مراحل متقدمة أو إذا كان العلاج الهرموني المستهدف يحفز على التقدم إلى العدوانية، غير قابلة للشفاء PCa الأنواع الفرعية9،10. وقد وضعت مختبرنا GEMMs التي تستخدم الأليلات floxed من واحد أو أكثر من الجينات قمع الورم. إعادة تركيب وفقدان التعبير الجيني المثبط للورم يحدث على وجه التحديد في البروستاتا لأننا قد أدخلت transgene مع Cre recombinase المصب من المروج probasin تفعيلها فقط في الخلايا الظهارية البروستاتا11، 12.لقد ولدت أيضا لدينا GEMMs لاحتواء transgene مراسل كري دعا mT / mG، الذي يحفز الطماطم التعبير البروتين الفلورسنت في الخلايا التي تفتقر إلى Cre والأخضر بروتين الفلورسنت (GFP) التعبير في الخلايا مع كري13. في حين أن عرض هذه الطريقة ونتائجنا التمثيلية تظهر GEMMs ندرس في مختبرنا، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتوليد الأعضاء سرطان البروستاتا من أي نموذج الماوس. ومع ذلك، كما نوقش بالتفصيل في قسم النتائج التمثيلية لدينا، لاحظنا أن بعض خصائص الورم هي الأمثل لتوليد سرطان البروستاتا العضوية.
في العقد الماضي ، أدت أساليب جديدة لزراعة الخلايا من الأنسجة ذات المنشأ الظهاري إلى تقدم كبير في قدرتنا على نموذج أنظمة الأعضاء في المختبر14،15. وقد عُزي مصطلح "ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد" إلى التقنيات التي ينطوي عليها إنشاء الأعضاء وصيانتها، والتي يمكن تعريفها عموماً بأنها هياكل تتكون من خلايا تجمع الهندسة المعمارية الثانوية التي تحركها سلالة الخلايا الخاصة بالأعضاء. 16. هذه الأساليب الجديدة تختلف عن الكلاسيكية 2D ثقافة الخلية في أن الخلايا لا تتطلب التحول أو الخلود للنمو على المدى الطويل. وهكذا، يمكن مقارنة الثقافات 3D من الخلايا الطبيعية إلى الخلايا المريضة. وهذا أمر ذو قيمة خاصة في أبحاث السرطان حيث الثقافات العادية للسيطرة على الخلايا عادة لم تكن متاحة. وبالإضافة إلى ذلك، تشكل الأعضاء تلقائيا الأنسجة الثانوية مع أنواع الخلايا المتمايزة بشكل مناسب، مما يجعلها أفضل نظام نموذج لفهم السرطان في المختبر من خطوط الخلايا 2D17. وقد أنشأ مختبرنا خطوط عضوية ثلاثية الدنابية من قضية الورم معزولة عن نظام PCa GEMMs لدينا لاستكمال بياناتنا في الجسم الحي وإجراء التجارب التي لن تكون مجدية في GEMMs.
في هذه المقالة، نقدم بروتوكولات مكتوبة ومرئية للنخر الكامل من GEMMs PCa، بما في ذلك تشريح فصوص البروستاتا الماوس متميزة والآفات النقيلية. نحن نصف ونظهر طريقة خطوة بخطوة لتوليد الأوجانات من أورام البروستاتا الماوس على أساس بروتوكول نشر سابقا من قبل Drost وآخرون لاشتقاق اتوجينيات من الأنسجة الظهارية البروستاتا الماوس العادي18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ الإجراءات الحيوانية الموصوفة هنا بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في قسم الموارد الحيوانية المختبرية، مركز روزويل بارك الشامل للسرطان، بوفالو، نيويورك.
ملاحظة: الفئران الذكور التي سيتم تشريحها لعزل البروستاتا أو أورام البروستاتا لتوليد من الأعضاء يجب أن يكون على الأقل قد وصلت إلى سن النضج الجنسي — حوالي 8-10 أسابيع من العمر. يمكن أن تختلف أعمار محددة من الفئران بين الدراسات. وتشمل بعض العوامل التي يجب مراعاتها عند اختيار العمر التغيرات المعتمدة على العمر في مجموعات خلايا البروستاتا، والتعبير المعتمد على العمر من الجينات المتحولة التي يقودها المروج محددة، ومعدل تطور ورم البروستاتا في GEMM معينة.
1. تشريح وتصوير الأورام وأورام الأورام النقيلية للفأر
- الاعمال التحضيريه
- الحصول على أدوات التشريح المعقمة اللازمة. منطقة تشريح المرحلة على سطح معقم نظيف مع مسطرة 15 سم، توازن دقيق، توازن تحليلي، زجاجة رذاذ مع 70٪ إيثانول، محلول ملحي بـ فوسفو (PBS)، ومناشف ورقية.
-
إعداد حلول إصلاحية للأعضاء الحشوية والعظام التي لا تستخدم لتوليد الأعضاء
- للأعضاء الحشوية: إعداد 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) في PBS. لفأر واحد، وجعل 20 مل من 4٪ PFA، aliquot في اثنين من أنابيب مخروطية 15 مل والحفاظ على درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
- للعظام الطويلة: Aliquot 10 مل من قبل-- صنع محايد 10% محايدة المخزنة الرسمية (NBF) في أنبوب مخروطي 15 مل واحد والحفاظ على درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
- الحصول على أطباق 10 سم غير المعالجة وملء مع PBS غير معقمة - وهذه سوف تكون بمثابة حاويات مؤقتة للأعضاء أثناء تشريح غرامة باستخدام المجهر تشريح.
ملاحظة: وتستخدم أدوات معقمة لتشريح الأنسجة لتوليد الأعضاء. يتم استخدام الأدوات غير المعقمة للشق الأولي وتشريح الأطراف الخلفية.
- القتل الرحيم والشق الأولي
- قتل الفأر عن طريق خنق CO2 باستخدام معدل تدفق 2.0 لتر / دقيقة لمدة 5 دقائق. استخدم توازن الدقة لقياس وزن الجسم والسجل الخاص بالماوس.
- ضع الماوس فوق منشفة ورقية والموجه على الجانب البطني السطحي للتشريح مع مواجهة رأس الماوس بعيداً عن المحقق. تثبيت الماوس إلى المجلس عن طريق تمتد أطرافه وثقب كل من الأرجل الأمامية والكفوف الخلفية مع إبرة واحدة يمكن التخلص منها.
- باستخدام زجاجة رذاذ، قم بتخدير فرو الفأر مع الإيثانول بنسبة 70%. باستخدام مقص تشريح غير معقمة وملقط مستقيم، قرصة فقط فوق القضيب الماوس وجعل شق صغير من خلال الفراء فقط.
- مواصلة شق خط الوسط حتى عنق الماوس من خلال الفراء فقط. إجراء شقوق ثنائية من نقطة الشق الأولي من خلال الطائرة البطنية للفأر من خلال الفراء فقط.
- فهم الفراء وسحب بعناية بعيدا عن جلد الماوس. دبوس أسفل الفراء إلى المجلس للسماح بالوصول إلى كل من تجاويف البطن والصدر.
- استخراج الجهاز البولي التناسلي الذكري في الكتلة
- باستخدام مقص تشريح معقم وملقط مستقيم، قطع بعناية من خلال الجلد حوالي 0.75 سم فوق المستقيم. مواصلة شق خط الوسط حتى القفص الصدري دون إزعاج أي أعضاء في تجويف البطن. سحب بعناية الجلد بعيدا ودبوس إلى المجلس لفضح تجويف البطن بأكمله.
ملاحظة: لا تسمح لهذه الأدوات للمس خارج الماوس أو أي سطح في منطقة التدريج، كما سيتم استخدام هذه الأنسجة لتوليد organoids. - تشريح الجهاز البولي التناسلي والأعضاء الأخرى وفقا للرسم البياني في الشكل 1A، مع أرقام تشير إلى ترتيب سيتم إزالة الأعضاء من الماوس.
- العثور على المثانة، ثم فهم وسادة الدهون إما إلى اليسار أو اليمين وسحب صعودا لفضح الخصية. تشريح بعناية بعيدا الخصية من بقية المنطقة البولية التناسلية ووضعها جانبا. قم بنفس الإجراء على الجانب الآخر.
ملاحظة: تحقيق الجودة المثلى للأنسجة وتوصيف الورم المفصل لأورام البروستاتا يتطلب إزالة المنطقة البولية التناسلية بأكملها من الماوس في الكتلة19. من المستحسن أن تتم إزالة المنطقة البولية التناسلية أولاً (الشكل1A). - فهم المثانة وسحب بعناية حتى أن المنطقة البولية التناسلية يرفع معا، وفضح مجرى البول تحتها. أثناء عقد المثانة، توجيه مقص حتى تكون ضد الجانب السفلي من البروستاتا الظهرية وقطع مجرى البول. ثم سيتم الإفراج عن المنطقة البولية التناسلية بأكملها من تجويف البطن.
- ضع المنطقة البولية التناسلية في طبق 10 سم مليئة PBS. إذا كانت لا تزال مليئة البول، واستنزاف المثانة عن طريق إجراء شق صغير. باستخدام التوازن التحليلي، وتزن الجهاز البولي التناسلي وسجل.
- باستخدام مقص تشريح معقم وملقط مستقيم، قطع بعناية من خلال الجلد حوالي 0.75 سم فوق المستقيم. مواصلة شق خط الوسط حتى القفص الصدري دون إزعاج أي أعضاء في تجويف البطن. سحب بعناية الجلد بعيدا ودبوس إلى المجلس لفضح تجويف البطن بأكمله.
- استخراج العقد الليمفاوية الحوضية والطحال والكبد والكلى والرئة والساق والفخذ
- إزالة الجهاز البولي التناسلي يعرض العقد الليمفاوية الحوض، المتمركزة مباشرة وراء الجهاز البولي التناسلي (الشكل1A)وعلى جانبي العمود الفقري. لن تكون العقد الليمفاوية مرئية إلا إذا كانت تحتوي على آفات خبيثة أو إذا كان هناك التهاب محلي. توجيه ملقط مستقيم تحت العقدة الليمفاوية وسحب ما يصل لإزالة العقدة الليمفاوية. قم بنفس الإجراء على الجانب الآخر.
- فهم المستقيم مع ملقط مستقيم وقطع. سحب على المستقيم لكشف القولون بأكمله والأمعاء الدقيقة، وتبحث عن الآفات النقيلية في العقد الليمفاوية mesenteric. عندما تتم إزالة اللفائفي بأكمله، استمر في سحب الاثني عشر لفضح المعدة. قطع المريء لإزالة المعدة تماما وتجاهل. إذا لوحظت أي آفات النقيليفية في العقد الليمفاوية، تشريح بعناية بعيدا عن الأمعاء وتخزينها في طبق 10 سم من PBS.
- وتعريض وإزالة المعدة سحب الطحال من الجانب الردورفي من البطن (الشكل1A). إزالة الطحال ووضعها في 4٪ PFA. الطحال بمثابة عنصر تحكم تلطيخ للهيموتوكسيلين كما هو الخلوية للغاية.
ملاحظة: سيتم إصلاح الأنسجة الحشوية التي لا تستخدم لتوليد الأعضاء بين عشية وضحاها في 4٪ PFA، وغسلها مع PBS، ومن ثم وضعها في 70٪ الإيثانول. - إزالة الكبد في الجزء العلوي من البطن (الشكل 1A). استنادًا إلى الحمل النقيلي في الكبد، يمكن تشريح الفصوص الفردية، أو يمكن إزالة الكبد بأكمله عن طريق القطع بعناية على طول الحجاب الحاجز. (لا تقطع من خلال الحجاب الحاجز في هذا الوقت). ضع الكبد في طبق 10 سم من PBS.
- إزالة الكبد سوف يعرض تماما الكلى على جانبي العمود الفقري (الشكل1A). إزالة الكلى — جنبا إلى جنب مع العقد الليمفاوية الكلوية، إذا كانت العقد لديها آفات النقيلي — عن طريق وضع ملقط مستقيم تحت الكلى وسحب ما يصل. قم بنفس الإجراء للجانب الآخر.
- لفضح تجويف الصدر، قطع الحجاب الحاجز بعناية على طول القفص الصدري. ثقب الحجاب الحاجز سوف تطلق الضغط السلبي في تجويف الصدر وفضح القلب والرئتين (الشكل1A).
- أمسك القص واسحب حتى يفتح تجويف الصدر أكثر. مراقبة الوجه البطني للتجويف الصدري على طول القفص الصدري للآفات النقيلية في العقد الليمفاوية الصدرية وتشريح، إذا كان موجودا.
- بينما لا يزال عقد القص، وقطع بعيدا القفص الصدري البطني للوصول إلى القلب والرئتين. أمسك القلب، اسحب ويقطع تحت الرئتين. لإزالة القلب والرئتين بالكامل، قطع جميع الأوعية الدموية الأمامية والقصبة الهوائية. وضع الأنسجة في PBS وإزالة القلب بعناية دون الإضرار أنسجة الرئة أو الآفات النقيلية الرئة.
- خذ ملقط مستقيم غير معقمة ومقص تشريح وقطع الساق الخلفية على رأس عظم الفخذ. فهم بعناية عظم الفخذ وإزالة الساق الخلفية من الفراء.
- وضع الساق الخلفية على منشفة ورقية واستيعاب مخلب الخلفية. استخدم شفرة الحلاقة أحادية الحافة لكشط/قطع جميع العضلات والأنسجة الضامة من الساق وعظم الفخذ. إزالة عظم الفخذ من الساق عن طريق قطع الخلفي إلى الرضفة وإزالة الساق عن طريق إزالة مخلب الخلفية. ضع الساق وعظم الفخذ في 10٪ NBF. قم بنفس الإجراء على الجانب الآخر.
ملاحظة: لأغراض فحص العظام الطويلة للماوس للآفات النقيلية ، لا تحتاج الفيبولا إلى أن تكون سليمة. وسيتم إصلاح العظام الطويلة في 10٪ NBF لمدة أسبوع واحد، ثم decalcified باستخدام حل EDTA محايدة20. بعد ثلاثة أسابيع، سيتم نقل العظام إلى 70٪ الإيثانول. - بعد إزالة الأطراف الخلفية، خذ الأذن أو الذيل قطع للكتابة الجينية في المستقبل. تجاهل الذبيحة الماوس وجميع الأنسجة لا يمكن إصلاحها أو استخدامها لتوليد الجهازية.
- تشريح ورم البروستاتا
ملاحظة: تشريح فصوص البروستاتا الماوس لا يمكن أن يتحقق إلا باستخدام المجهر تشريح19. ومع ذلك، يمكن أن يكون الحمل ورم البروستاتا عالية بحيث لا يمكن تمييز الفصوص الفردية، ويمكن إجراء تشريح دون المجهر. ومع ذلك، يتم وصف البروتوكول الكامل لتشريح فصوص البروستاتا الفردية أدناه.- ضع المنطقة البولية التناسلية في طبق 10 سم من PBS تحت المجهر تشريح وتوجيه الجانب البطني حتى مع المثانة والحويصلات المنوية التي تواجه بعيدا عن المحقق. وينبغي أن يتم كل التلاعب في المنطقة البولية التناسلية باستخدام أدوات معقمة.
- تقييم النمط الظاهري العام لورم البروستاتا- على الأرجح، إما سيتم ملاحظة ورم مملوء بالسوائل أو صلب في PCa GEMMs (الشكل2A، B).
ملاحظة: غالبًا ما توجد الأورام المملوءة بالسوائل في منطقة البروستاتا الأمامية (الشكل2A). تتكون الأورام المملوءة بالسوائل من الأنسجة الضامة في المقام الأول مع مكونات ظهارية ضئيلة — وبالتالي فإن هذه الأورام ليست مثالية لتوليد الأعضاء بسبب انخفاض عدد الخلايا الظهارية الورم، كما سيتم مناقشتها في النتائج التمثيلية قسم. - إذا كانت الأورام المملوءة بالسوائل موجودة، قم بثقب صغير في الورم. ضع المنطقة البولية التناسلية في طبق جديد من PBS 10 سم.
- خذ زوج من الملقط المستقيم في اليد غير المهيمنة وملقط منحنية في اليد المهيمنة. قلب المنطقة البولية التناسلية إلى وجهها الظهري. ابحث عن منطقة البروستاتا القريبة (الشكل1B)،والتي يمكن تحديدها من قبل اللون الوردي / الأحمر من مجرى البول. فهم مجرى البول وعقد بحزم حتى التلاعب الأنسجة البولية التناسلية مع ملقط منحني.
ملاحظة: أثناء تشريح البروستاتا، دائما ً ما تحيط علماً بموقع المثانة، لأن هذه هي أبسط طريقة لتحديد موقع فصوص البروستاتا الفردية (الشكل1B).
- إزالة الأنسجة غير البروستاتا من المنطقة البولية التناسلية
- بينما لا يزال على الوجه الظهري للمنطقة البولية التناسلية، والعثور على قاعدة الحويصلة المنوية. إزالة بعناية الحويصلة المنوية وتجاهل. تنفيذ نفس الإجراء على الجانب الآخر.
ملاحظة: تجنب ثقب الحويصلة المنوية، لأن ذلك سوف يطلق السائل السري لزجة وغير شفافة التي تتداخل مع تشريح البروستاتا. إذا تم ثقب الحويصلة المنوية، نقل المنطقة البولية التناسلية المتبقية إلى طبق جديد 10 سم مع PBS الطازجة. - إزالة وتجاهل الأوعية الدموية والأنسجة الدهنية والضامة قدر الإمكان باستخدام الجانب المنحني من ملقط.
- في حين لا يزال عقد بحزم مجرى البول / منطقة البروستاتا القريبة، واستخدام زوج من غرامة، مقص وأشار لإزالة المثانة من مجرى البول.
- بينما لا يزال على الوجه الظهري للمنطقة البولية التناسلية، والعثور على قاعدة الحويصلة المنوية. إزالة بعناية الحويصلة المنوية وتجاهل. تنفيذ نفس الإجراء على الجانب الآخر.
- عزل فصوص البروستاتا الفردية
- تحديد موقع البروستاتا الأمامية (الشكل1ب). تأكد من الاحتفاظ بقوة منطقة البروستاتا القريبة / مجرى البول مع ملقط مستقيم. إزالة منطقة البروستاتا الأمامية عن طريق استيعاب مباشرة الأنسجة مع الجانب المنحني من ملقط وسحب بحزم بعيدا عن المثانة وبقية البروستاتا. ضع الأنسجة في PBS.
ملاحظة: بالنسبة لجميع مناطق البروستاتا، قد تكون هناك حاجة إلى مقص تشريح لإزالة الأنسجة، اعتمادا على حجم الورم. - تحديد موقع منطقة البروستاتا البطني (الشكل1ب). إزالة منطقة البروستاتا البطني بنفس الطريقة كما في الخطوة 1.5.7.
- عند هذه النقطة في تشريح، فقط مناطق البروستاتا الجانبية والظهرية يجب أن تكون موجودة، في حين أن منطقة البروستاتا القريبة لا يزال يتم استيعابها من قبل ملقط مستقيم. تقييم مناطق البروستاتا الجانبية والذهبية (الشكل1باء). إذا كان يمكن تمييز المنطقة الجانبية عن المنطقة الظهرية، قم بإزالة منطقة البروستاتا الجانبية كما هو موضح في الخطوة 1.5.7. قم بنفس الإجراء على الجانب الآخر.
- إزالة منطقة البروستاتا الظهرية كما هو موضح في الخطوة 1.5.7. وضع منطقة البروستاتا القريبة في 4٪ PFA، كما هيكلها داخل الأنسجة العضلية من مجرى البول يجعلها غير مناسبة لتوليد الجهازية.
- تحديد موقع البروستاتا الأمامية (الشكل1ب). تأكد من الاحتفاظ بقوة منطقة البروستاتا القريبة / مجرى البول مع ملقط مستقيم. إزالة منطقة البروستاتا الأمامية عن طريق استيعاب مباشرة الأنسجة مع الجانب المنحني من ملقط وسحب بحزم بعيدا عن المثانة وبقية البروستاتا. ضع الأنسجة في PBS.
2. توليد الأعضاء 3D من أنسجة أورام البروستاتا
ملاحظة: ويبين الشكل 3 وصفاً تصويرياً لإجراء توليد الأعضاء السرطانية.
- اعداد
- إعداد الماوس البروستاتا الوسائط العضوية وفقا لDrost وآخرون18 مع التعديلات التالية. استخدام المتوسطة مكيفة بدلا من البروتينات المؤتلفة نوجين وR-سبوندين واستخدام تركيز نهائي من 1٪ (V / V)، بدلا من 10٪، لكل من نوجين- وR-Spondin المتوسطة مكيفة.
ملاحظة: يتم استخدام خلايا HEK293 المنقولة بشكل لا يُسلَّم بـ HA-mouse Noggin-Fc أو HA-mouse Rspo1-Fc لإنتاج Noggin- أو R-Spondin- متوسطة مكيفة، على التوالي. وكانت هذه الخطوط الخلوية هدية من مختبر كالفين كو في جامعة ستانفورد. - إعداد محلول الهضم في أنبوب 15 مل عن طريق تخفيف 20 ملغ / مل كولاجيناز الثاني مع متقدمة DMEM / F12 (+++) وسائل الإعلام إلى تركيز نهائي من 5 ملغ / مل. إضافة مثبطات الصخور Y-27632 إلى محلول الكولاجين الثاني بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر.
ملاحظة: نسبة التخزين المؤقت الهضم إلى الأنسجة هو 1 مل إلى 50 ملغ، والتي نستخدمها وفقا لDrost وآخرون18.
- إعداد الماوس البروستاتا الوسائط العضوية وفقا لDrost وآخرون18 مع التعديلات التالية. استخدام المتوسطة مكيفة بدلا من البروتينات المؤتلفة نوجين وR-سبوندين واستخدام تركيز نهائي من 1٪ (V / V)، بدلا من 10٪، لكل من نوجين- وR-Spondin المتوسطة مكيفة.
- فرم وهضم أنسجة الورم
- في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، وضع أنسجة ورم البروستاتا في طبق ثقافة معقمة 10 سم، تشريح وتجاهل الأنسجة النخرية.
- قم بتقطيع أنسجة أورام البروستاتا المتبقية إلى 1 مم3 مكعبات عن طريق عقد قطع الأنسجة مع الملقط المنحني المعقمة وقطع مع مقص تشريح.
- ضع قطع الورم المفروم في أنبوب 15 مل مع المخزن المؤقت للهضم عن طريق جمعها مع الجانب المنحني من الملقط. هضم أنسجة الورم في 37 درجة مئوية مع الهز لمدة 1.5 إلى 2 ح. تحقق من تقدم الهضم كل 20 دقيقة.
ملاحظة: في هذا الوقت، إخراج ما لا يقل عن 2 مل من المصفوفة من -20 درجة مئوية التخزين وذوبان على الجليد. 1 مل aliquots من المصفوفة سوف يستغرق ما يقرب من 3 ح لإذابة. - بعد هضم الأنسجة، أنبوب الطرد المركزي في 175 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية لتشكيل بيليه الخلية.
- إزالة supernatant، نفض الغبار أنبوب لتخفيف بيليه الخلية، وإعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من التربسين قبل الاحماء تستكمل مع 10 μM Y-27632 مثبطات الصخور. وضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- بعد الحضانة، ماصة صعودا وهبوطا 5 مرات مع تلميح P1000 القياسية. العودة الأنبوب إلى 37 درجة مئوية حمام المياه لمدة 5 دقائق أخرى وكرر الخطوة 2.2.6.
ملاحظة: في هذا الوقت في الإجراء، وتسخين طبق ثقافة الخلية معقمة 6-جيدا عن طريق وضعه في حاضنة 55 درجة مئوية.
- خلايا العد وإعادة التعليق في المصفوفة
- غسل الخلايا عن طريق إضافة 9 مل من الباردة AdDMEM / F12 (+++) والطرد المركزي الأنبوب في 175 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
- بعد الطرد المركزي، وإزالة supernatant، نفض الغبار أنبوب لتخفيف بيليه، وغسل الخلايا مرة أخرى عن طريق إضافة 10 مل من AdDMEM الباردة / F12 (+++). الطرد المركزي الأنبوب في 175 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
- بعد الطرد المركزي، وإزالة supernatant، نفض الغبار أنبوب لتخفيف بيليه، وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من AdDMEM / F12 (+++)،وعد عدد الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيتوماتوفقا للإجراء القياسي.
- تتسع القباب من سبعة إلى ثمانية قباب في بئر واحد من طبق بئر 6 عندما تكون الأعضاء مطلية في مصفوفة عبر طريقة من حكمة الهبوط. ما يقرب من 200 درجة مئوية من المصفوفة سوف تنتج 7-8 القباب. تحديد عدد الآبار اللازمة للأغراض التجريبية المستقبلية وحساب حجم المصفوفة المطلوبة. ثم، حساب حجم الحل الذي يحتوي على الخلية اللازمة أن يكون التركيز النهائي من 1.0 × 106 خلايا / مل من المصفوفة.
- بعد عد الخلايا، الطرد المركزي في 175 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. إزالة supernatant، نفض الغبار أنبوب لتخفيف بيليه، وإعادة تعليق الخلايا في حجم مصفوفة محسوبة في الخطوة 2.3.4.
ملاحظة: المصفوفة لا تزال في شكل سائل فقط في 4 درجة مئوية; الحفاظ على أنابيب الأسهم مصفوفة وحلول مصفوفة الخلية على الجليد في جميع الأوقات.
- طلاء القباب مصفوفة وتطبيق وسائل الإعلام
- مزيج مصفوفة خلية الحل مع الأنابيب P200 لتوزيع الخلايا بالتساوي دون إدخال فقاعات. قم بإزالة طبق الثقافة 6-well من حاضنة 55 درجة مئوية.
- ماصة بعناية 200 درجة مئوية من حل مصفوفة الخلية وإسقاط الحل بسرعة في بئر لخلق القباب.
- كرر الخطوة 2.4.2. حتى يتم إنفاق حجم حل خلية المصفوفة. السماح للقباب لتترسخ في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
- قلب الطبق 6-جيدا رأسا على عقب ووضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمواصلة التصلب لمدة 20 دقيقة.
- بعد الحضانة، إضافة 2 مل من وسائل الإعلام العضوية البروستاتا الماوس إلى كل بئر. إضافة الاندروجين الاصطناعية R1881 إلى كل بئر لتركيز نهائي من 1 NM و Y-27632 مثبطات الصخور إلى تركيز نهائي من 10 درجة مئوية. يُمزج المزيج بعناية ويُوضع الطبق في حاضنة بزاوية 37 درجة مئوية للزراعة.
ملاحظة: وسائل الإعلام ثقافة العضوية يحتاج إلى أن تستكمل مع 10 μM Y-27632 مثبطات الصخور لمدة أسبوع واحد فقط بعد توليد الجهازية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تظهر في الشكل 2Aصور المحاصيل التمثيلية للفأر مع ورم البروستاتا الأولي الكبير المملوء بالسوائل في منطقة البروستاتا الأمامية . وعلى النقيض من ذلك، يظهر الشكل 2B، صور ًا تمثيلية للفأر مع ورم كبير قوي في البروستاتا لا يمكن تمييزه من مناطق البروستاتا الفردية. تظهر صور تشريح الفلورسنت نفس ورم البروستاتا الصلب من الشكل 2B معبرًا عن GFP، مما يشير إلى أن الخلايا الأورام تعبر عن Cre (الشكل2C). الأنسجة التي لا تعبر عن probasin، مثل المثانة، والتعبير عن الطماطم وبالتالي لا تعبر عن كري (الشكل2C). الكبد والرئتين من الماوس من الشكل 2B لديها أورام النقيلي ة تعبر عن GFP، مما يدل على أنها نشأت من ورم البروستاتا الأولية، وتحيط بها الأنسجة العادية التي تعبر عن الطماطم (الشكل2C ). وأخيرا، فإن العقدة الليمفاوية الحوض من هذا الماوس يعبر GFP وليس الطماطم، مما يدل على أن هذا الورم النقيلي قد تجاوزت هذا الجهاز ولا يبقى الأنسجة الطبيعية (الشكل2C).
نعرض الصور في الشكل 4 من الأعضاء التي قمنا بتوليدها من ورم البروستاتا الصلب. في اليوم الأول، تتشكل الأعضاء الصغيرة، كما يتضح من صور التباين في المرحلة التمثيلية. تظهر الصور الفلورية في اليوم الأول أن كلاً من خلايا الطماطم وGFP التي تعبر عن وجودها في ثقافة الجهاز ية الورم (الأسهم). ومع ذلك، بحلول اليوم 7 عندما تكونت الأعضاء ورم البروستاتا بشكل كامل، وهذه الأعضاء تعبر GFP وليس الطماطم. تشير هذه البيانات إلى أن هذه الأعضاء قد نشأت من الخلايا السرطانية التي كانت تعبر عن Cre وليس من الخلايا الظهارية العادية. هذه الأعضاء الورم لا تزال فقط GFP إيجابية ونحن نوسع ثقافتنا إلى مرور 1 و 2.
في الشكل 5، نعرض صور الأعضاء التي قمنا بتوليدها من ورم البروستاتا المملوء بالسوائل. في اليوم الأول، تتشكل الأعضاء الصغيرة، وتظهر الصور الفلورية أن كلاً من الخلايا التي تعبر عن الطماطم وGFP موجودة في الثقافة العضوية— على غرار ملاحظتنا في اليوم الأول للأعضاء الناتجة عن ورم البروستاتا الصلب (الشكل 4). ومع ذلك، فإن الأعضاء من ورم البروستاتا المملوء بالسوائل تعبر إما GFP أو الطماطم في اليوم 7 — مما يشير إلى أن الأعضاء قد تشكلت من الخلايا التي لا تعبر عن كري. يستمر هذا النمط عند المقطع 1 والمقطع 2، حيث الثقافة لديها كل من الطماطم وGFP التعبير عن الأعضاء. مزيد من التحليل لهذه الأعضاء محدودة للغاية لأن الخط هو خليط من الأعضاء الظهارية العادية والأعضاء الورم. ونحن نعتقد أن أورام البروستاتا مليئة بالسوائل هي دون المستوى الأمثل في توليد الأعضاء الورم ببساطة لأن هناك نسبة مئوية أكبر من الخلايا الظهارية البروستاتا العادية. منذ كل من الخلايا الظهارية البروستاتا العادية وخلايا سرطان البروستاتا تشكل الأعضاء، والخطوط المتولدة من أورام البروستاتا مليئة بالسوائل هي مزيج من الأعضاء العادية والسرطان. نحصل على خطوط الجهاز ية الورم النقي من أورام البروستاتا مليئة بالسوائل عن طريق فرز التدفق للخلايا الإيجابية GFP وتوليد الأعضاء من تلك المجموعة من الخلايا. تتكون أورام البروستاتا الصلبة في المقام الأول من الخلايا السرطانية، وبالتالي فإن الأعضاء الناتجة عن هذه الأورام هي مجموعة أكثر نقاء من الأعضاء السرطانية دون فرز مسبق لGFP.
الشكل 1 لدينا ترتيب تشريح الموصى بها لسرطان البروستاتا (PCa) نماذج الماوس هندسيا وراثيا (GEMMs) وتشريح البروستاتا الماوس. (أ) الترتيب الذي نوصي به في بروتوكولنا لتشريح الأعضاء الرئيسية من GEMM PCa. 1- المنطقة البولية التناسلية. 2. العقد الليمفاوية الحوض. 3. الطحال. 4. الكبد. 5. الكلى. 6. الرئتين. 7. الطيبية وعظم. (ب) خريطة لمنطقة الفئران البولية التناسلية وتشريح البروستاتا. صور تشريح الفلورسنت من فأر 12 أسبوعا من العمر التعبير عن probasin-Cre وmT / mG Cre مراسل transgene. المثانة (BL)، الحويصلات المنوية (SV)، البروستاتا الأمامية (AP)، البروستاتا البطني (VP)، البروستاتا الجانبية (LP)، البروستاتا الدسيرية (DP)، والبروستاتا القريبة (PP). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 صور تشريح تمثيلية لسرطان البروستاتا (PCa) نماذج الماوس المهندسة وراثيا (GEMMs). (أ) تجويف البطن قبل إزالة المنطقة البولية التناسلية والمنطقة البولية التناسلية مع ورم البروستاتا مليئة بالسوائل. (ب) تجويف البطن قبل إزالة المنطقة البولية التناسلية والمنطقة البولية التناسلية مع ورم البروستاتا الصلبة. (C) الطماطم التمثيلية وصور GFP الفلورية لورم البروستاتا الصلب، الكبد، الرئة، والعقدة الليمفاوية الحوض من GEMM PCa التي تطور الآفات النقيلية. شريط مقياس = 5 مم المثانة (BL)، البروستاتا الأمامية (AP)، والبروستاتا الظهرية (DP). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 مخطط تدفقي للبروتوكول لتوليد الأعضاء ورم البروستاتا: بعد تشريح ورم البروستاتا، يُقطّع الأنسجة إلى قطع 1 مم. هضم قطع الورم في كولاجيناز، وجمع الخلايا، وهضم في التربسين للحصول على تعليق خلية واحدة. بعد عد الخلايا، إعادة تعليق في حجم المصفوفة المطلوبة لتركيز الخلية 1.0 × 10 6/مل. القباب لوحة في طبق باستخدام طريقة قطرة الحكمة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 الصور التمثيلية من جيل من الأعضاء ورم البروستاتا الماوس من ورم البروستاتا الصلبة. تباين المرحلة التمثيلية، الطماطم، وصور الفلورسنت GFP من اليوم 1، اليوم 7، الممر 1، والممر 2 من الأعضاء المتولدة من ورم البروستاتا الماوس الصلبة. شريط المقياس = 100 درجة مئوية. تشير الأسهم إلى الخلايا الفردية في صور الفلورسنت. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 الصور التمثيلية من جيل من الأعضاء ورم البروستاتا الماوس من ورم مليئة بالسوائل. تباين المرحلة التمثيلية، الطماطم، وصور الفلورسنت GFP من اليوم 1، اليوم 7، الممر 1، والممر 2 من الأعضاء المتولدة من ورم البروستاتا الماوس مليئة بالسوائل. شريط المقياس = 100 درجة مئوية. تشير الأسهم إلى الخلايا الفردية في صور الفلورسنت. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول تشريح أورام البروستاتا وتوليد الجهازية
إزالة الأنسجة غير البروستاتا وتشريح غرامة من ورم البروستاتا الماوس أمر بالغ الأهمية للجيل الأمثل من الأعضاء السرطان ية منذ كل من الخلايا الظهارية غير البروستاتا والخلايا الظهارية البروستاتا الطبيعية سوف تولد الأعضاء. لأورام البروستاتا الصلبة على وجه التحديد، فمن الأهمية بمكان لعزل مناطق الورم قابلة للحياة لإزالة التلوث مع الأنسجة النخرية التي من شأنها أن تقلل من عدد الخلايا القابلة للحياة. خلال توليد الأعضاء، يجب مراقبة هضم الأنسجة مع الكولاجين بجد، كما التعرض لفترات طويلة للكولاجيناز سوف تحد من بقاء الخلية. مع الأعضاء المستمدة من السرطان GEMMs، فمن الأهمية بمكان أن النمط الجيني الكامل كل خط لضمان أن جميع الجينات وalleles المعدلة التي تم هندستها في الماوس موجودة في الأعضاء. كما أن تكرار الأنماط الجينية بعد التمر لفترات طويلة ضروري لضمان الحفاظ على التعديلات الجينية.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من تشريح ورم البروستاتا وتوليد الجهازية
لقد لاحظنا الماوس لتقلب الماوس في خصائص ورم البروستاتا، حتى بين الحيوانات مع نفس النمط الجيني. لذلك، قد تكون التعديلات المحددة على بروتوكول تشريح البروستاتا الموضحة هنا ضرورية لكل ماوس. وبالإضافة إلى ذلك، القدرة على التكيف ضروري عند تشريح الأورام النقيلية لأنه من الصعب التنبؤ بخطورة هذه الآفات قبل بدء تشريح.
في مناسبات قليلة، لاحظنا التلوث الزائد من بيليه الخلية لدينا مع ما يبدو أن النسيج الضام، حتى بعد الهضم مع كل من الكولاجين والتربسين. عندما يحدث هذا، ونحن إعادة تعليق بيليه في ما لا يقل عن 2 مل من AdDMEM F12 (+++) واستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر لإزالة النسيج الضام. وبما أن هناك تبايناً كبيراً في معدل تقوية المصفوفة، فقد يكون من الضروري زيادة أو تقليل وقت تقوية القبة قبل تطبيق الوسائط العضوية.
القيود في استخدام GEMMs
في حين أن GEMMs هي الطريقة الأكثر صرامة لدراسات السرطان قبل السريرية، وهذا النهج يتطلب وقتا كبيرا، والنفقات، والتدريب. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للفأرلة لتقلب الماوس، كما هو الحال في دراسة البشر، تعقيد تفسير البيانات.
القيود في استخدام ثقافة الخلايا ثلاثية الد
بالمقارنة مع ثقافة الخلايا 2D، وتوليد وصيانة خطوط الجهازية تتطلب زيادة الوقت والتكلفة. على سبيل المثال، يتم تمرير خطوط الورم العضوية لدينا كل 2-3 أسابيع، في حين يمكن تمرير خطوط الخلايا كل 2-3 أيام. هذا المعدل أبطأ من معدل النمو من الأعضاء يزيد من الوقت اللازم لإكمال التجارب إلى حد كبير. وسائل الإعلام ثقافة العضوية يحتوي على العديد من عوامل النمو المتخصصة والكواشف، والتي يمكن أن تكون مكلفة اعتمادا على المصدر، وبالتالي توليد والحفاظ على الأوجانويدات أكثر تكلفة من خطوط الخلايا التقليدية 2D. وأخيرا، لاحظ مختبرنا وآخرون الكثير من الاختلافات في الكثير في المصفوفة وغيرها من الكواشف - خلق تحديا للحفاظ على الاتساق في النمو العضوي للتجارب على المدى الطويل.
أهمية في استخدام ثقافة الخلايا ثلاثية الدّالة فيما يتعلق بالأساليب القائمة/البديلة
وقد هيمنت أبحاث السرطان قبل السريرية من قبل ثقافة الخلايا 2D ونماذج xenograft الخلية المستمدة من خط. يتطلب نمو الخلايا في 2D التحول / الخلود — وبالتالي على حد سواء في المختبر وxenograft الدراسات باستخدام الثقافات 2D عادة لا يكون خطوط الخلايا العادية دون تغيير لتكون بمثابة ضوابط غير السرطان. العقد الأخير من البحوث في ثقافة العضوية 3D من الأنسجة الطبيعية المستمدة من الظهارة قد سمح الآن لنمو الأنسجة الظهارية غير السرطانية التي يمكن استخدامها للمقارنة مع الأعضاء مماثلة مشتقة من أنسجة السرطان. كما يمكن استخدام الأعضاء السرطانية لإنشاء xenografts لزيادة فهم تطور الورم. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الأعضاء غير السرطانية لتوليد xenografts التحكم - وهو ما لم يكن ممكنا قبل تطوير أساليب ثقافة الخلايا 3D16.
أهمية في استخدام ثقافة الخلايا ثلاثية الد في أبحاث سرطان البروستاتا
في الدراسات الحديثة، وقد استخدمت الأعضاء لتلخيص خصائص ورم البروستاتا GEMM. Dardenne وآخرون تظهر أن الأعضاء التي تم إنشاؤها باستخدام أورام البروستاتا من GEMMs التي تفتقر في وقت واحد إلى المثبط الورم باتن وoverexpress oncogene MYCN كان أكبر من إمكانات النمو من الأعضاء التي تم إنشاؤها باستخدام البروستاتا من السيطرة على GEMMs. وبالإضافة إلى ذلك، أظهر كل من التسلسل والكيمياء المناعية أن الأعضاء الورم يلقم ملامح التعبير عن أورام البروستاتا على حد سواء تفتقر إلى Pten وoverexpressing MYCN21. Blattner وآخرون تظهر أن الإفراط في البروستاتا في وقت واحد من متحولةoncogenic من نوع سبيكل BTB / POZ البروتين (SPOP) وحذف Pten يزيد من معدل تكوين الأورام في GEMMs. عندما تم إنشاء الأعضاء البروستاتا إلى الإفراط في التعبير عن متحولة SPOP، تم زيادة انتشارها مقارنة مع السيطرة على عضوية البروستاتا والتعبير علامة النسب تلخيص أورام البروستاتا الأصلية22. معا، تبين هذه الدراسات أن الأعضاء هي النموذج الأمثل لمزيد من الدراسة لخصائص ورم البروستاتا في GEMMS.
كما تم استخدام الثقافة العضوية كأداة لتقييم التجمعات السكانية الفردية لخلايا أورام البروستاتا. باستخدام أورام GEMM التي تفتقر إلى Pten وPten و Trp53 مثبطات الورم في الخلايا الظهارية البروستاتا، أغاروال وآخرون الخلايا المجزأة في النسل القاعدية واللوملية، نشرت هذه التجمعات الفرعية كأعضاء، و كذلك تتميز الأنماط الظاهرية المحددة23. وبالتالي باستخدام ثقافة الخلايا ثلاثية الد، فمن الممكن أن تميز التجمعات السكانية الفرعية من الخلايا السرطانية التي قد تكون محدودة في وفرة داخل أورام البروستاتا نفسها.
كما هو موضح أعلاه، تقنيات زراعة الخلايا ثلاثية الد تسمح بنمو الخلايا الظهارية الطبيعية. وبالتالي، فإن الأعضاء البروستاتا المتولدة من GEMMs تفتقر إلى سائق Cre توفر نموذجا فريدا لرصد في الوقت الحقيقي من تكوين الأورام عن طريق الحث من Cre recombinase في المختبر. في الواقع، قام داردن وآخرون بتقييم كيف يؤثر التعبير المفرط NMYC على إمكانات النمو في سياق فقدان Pten مع مرور الوقت من خلال التعبير عن ERT2-Cre بشكل ectopically وعلاج مع تاموكسيفين21. بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم تأثير التعبير المفرط NMYC على مستقبلات الاندروجين (AR)، الهدف الرئيسي للعلاج لسرطان البروستاتا، بعد الحث على إعادة الكومبوما في الأعضاء المتولدة من GEMMs21. تم استخدام نفس نظام Cre اللاإحتياج من قبل Blattner وآخرون في أجهزة البروستاتا لقياس كيفية الإفراط في التعبير عن متحولة SPOP يؤثر على انتشار خلايا سرطان البروستاتا والتعبير AR22. وتجدر الإشارة إلى أن التجارب التي تحفز تعبير Cre في المختبر تحتوي على جهاز تحكم مدمج غير مصاب بالسرطان مع الأعضاء المعالجة بالمركبات.
قيود محددة في استخدام ثقافة الخلايا ثلاثية الد في أبحاث سرطان البروستاتا
في حين أن النمو العضوي للخلايا الظهارية الطبيعية هو ميزة استخدام تقنيات زراعة الخلايا ثلاثية الدنامدة، فإن القدرة على نمو الأعضاء الطبيعية قد شكلت أيضا تحديا في الدراسات البحثية لسرطان البروستاتا. كما هو مبين في قسم النتائج التمثيلية لدينا، لاحظنا نمو الأعضاء البروستاتا الطبيعية في خطوطولدت من أورام البروستاتا التي هي أقل عدوانية (الشكل 5). إحدى الطرق لمعالجة هذه الظاهرة هي توليد الأعضاء من GEMMs التعبير عن transgene مراسل Cre، مثل mT /mG. يمكن استخدام الفحص المجهري الفلورسنت لتقييم النسبة النسبية للأعضاء العادية إلى الأعضاء الورم من خلال مراقبة التعبير عن الطماطم وGFP. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام التعبير GFP لتدفق فرز الخلايا العضوية لتوليد خطوط الورم العضوي البروستاتا النقية. أغاروال وآخرون تظهر طريقة الفرز لفصل الخلايا الظهارية الطبيعية والخلايا السرطانية من أورام البروستاتا GEMM دون مراسل كري. أنها تبين أن الخلايا الظهارية التصاق الجزيئي (EpCAM) -الخلايا الإيجابية من أورام البروستاتا لم تنفصل إلى مجموعات فرعية عند فرزها باستخدام إما CD24 أو Sca-1 علامات سطح الخلية23 - وبالتالي، يمكن استخدام هذه العلامات لاستبعاد العادية خلايا البروستاتا الظهارية من أورام البروستاتا GEMM قبل توليد الجهازية. وقد لاحظ مختبرنا وآخرون أن الظروف التي تشكل فيها خلايا سرطان البروستاتا أعضاء يبدو إما اختيار أو تعزيز برامج التعبير الجيني محددة النسب مميزة للخلايا الظهارية القاعدية البروستاتا. هذا هو تحد كبير لأن أورام البروستاتا في كل من الفئران والبشر هي في المقام الأول الإنارة في الطبيعة، والتعبير عن AR، CK8، وغيرها من علامات الإنارة، ونادرا ما تعبر عن علامات النسب القاعدية مثل p63 أو CK5. في حين أن هذه الظاهرة لم تنشر بعد بالتفصيل, تحليل الكيمياء المناعية يظهر أن يتم تقليل AR في Ptenf/+ organoids بالمقارنة مع Ptenf/+ البروستاتا21. إن نمو الخلايا الظهارية القاعدية في الأعضاء السرطانية البروستاتا يشكك فيما إذا كانت هذه الخطوط هي حقانموذج دقيق قبل السريرية لسرطان البروستاتا.
في حين تم توثيق الأعضاء سرطان البروستاتا لنموذج الورم الذي يتم اشتقاقها أفضل من الثقافة التقليدية 2D، وهناك إمكانية للأعضاء للخضوع للتغيرات الوراثية في الثقافة، وخاصة بعد عدة ممرات. حاليا، نحن لسنا على علم بأي دراسات منشورة التي وثقت الطفرات الوراثية العفوية، والمكاسب الوراثية أو الخسائر، أو التغيرات الجينية التي هي شائعة بعد تمرير طويلة من الأعضاء سرطان البروستاتا. للحد من التباين نتيجة للتغيرات الوراثية أو الجينية التي قد تحدث بسبب التمر لفترات طويلة، ينبغي إجراء التجارب في الأعضاء المبكرة من الممرات المبكرة (<10) كلما كان ذلك ممكناً.
التطبيقات المستقبلية لثقافة الخلايا ثلاثية الجوانب
في حين أنه من المستحيل التنبؤ بجميع التطبيقات المستقبلية التي سيتم تطويرها باستخدام ثقافة الخلايا ثلاثية الد في أبحاث السرطان، هناك العديد من السبل التي يبدو أن لديها أكثر الإمكانات. كما هو الحال مع خطوط الخلايا 2D، وتنفيذ التعديل الوراثي في المختبر هو واضح نسبيا في الأعضاء. تعديل جينات محددة في الأعضاء العادية أو السرطانية يفتح العديد من الاحتمالات في دراسة الآليات التي تحكم تكوين الأورام، وتطور السرطان، والعلاج — خاصة عندما يتم استخدام الأعضاء المعدلة وراثيا لتوليد الأعضاء الطعوم. التعديل الجيني للأعضاء مفيد جداً عندما لا توجد GEMMs لجين معين أو إنشاء GEMM جديدة خارج نطاق دراسة معينة.
ثقافة السرطان العضوية لديها أيضا العديد من التطبيقات المحتملة للبحوث السريرية. يمكن استخدام مكتبة من الأنواع الفرعية للأورام ذات الصلة داخل كل جهاز من المرضى والنماذج الحيوانية لتقييم فعالية دواء جديد أو مزيج جديد من الأدوية الموجودة بسرعة. كما تصبح ثقافة الخلايا ثلاثية الد من التيار وزيادة في الكفاءة، وتوليد الأعضاء المشتقة من المريض لغرض الطب الشخصي لديه القدرة على المساعدة في تكييف العلاج لكل مريض السرطان عن طريق اختبار جميع الأدوية المتاحة وتركيبات من المخدرات باستخدام له أو لها خط العضوية الفردية16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ علاقات مالية للكشف عنها.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا مختبر كالفين كو في جامعة ستانفورد على توفير خلايا HEK293 التي تم نقلها بشكل لا يُنقل بعد ة إما مع HA-mouse Noggin-Fc أو HA-mouse Rspo1-Fc. كما نود أن نشكر الدكتور دين تانغ على السماح لنا بالوصول إلى مجهر تشريح الفلورسنت في مختبره. وقد تم دعم هذا العمل من قبل CA179907 إلى D.W.G. من المعهد الوطني للسرطان. تم دعم الموارد المشتركة في مركز روزويل بارك الشامل للسرطان من قبل المعاهد الوطنية لدعم مركز السرطان الصحي CA016056.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 inch, 23 G, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| 32% paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
| Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
| HEPES (1 M) | Sigma | 25-060 | |
| human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
| Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
| Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |
References
- Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).
- Furth, P. A., et al. Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).
- Aranda, M., et al. Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway. Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).
- Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice. Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K.
- Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice. Genesis. 56 (8), 23242 (2018).
- Brocard, J., et al. Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Bluemn, E. G., et al. Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling. Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).
- Zhou, Z., et al. Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer. Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
- Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology. The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).
- Dardenne, E., et al. N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).
- Blattner, M., et al. SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling. Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).
- Agarwal, S., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).
