Thorakala ryggmärgen Hemisection kirurgi och öppen-fält rörelseapparaten bedömning hos råtta

Summary

Råttan bröstkorg spinal hemisektion är en värdefull och reproducerbar modell av ensidig ryggmärgsskada för att undersöka de neurala mekanismerna för motoriska återhämtning och behandlingseffekt. Den här artikeln innehåller en detaljerad steg-för-steg-guide för att utföra hemisektionens procedur och för att bedöma rörelseresultatet i en öppen Arena.

Abstract

Ryggmärgsskada (SCI) orsakar störningar i motorisk, sensorisk och autonom funktion under nivån av lesionen. Experimentella djurmodeller är värdefulla verktyg för att förstå de neurala mekanismer som ingår i motorisk återhämtning efter SCI och för att designa terapier för kliniska populationer. Det finns flera experimentella SCI modeller inklusive kontusion, kompression, och transektion skador som används i en mängd olika arter. En hemisektion involverar den ensidiga transektionen av ryggmärgen och stör alla stigande och fallande spår på ena sidan. Spinal hemisektionen producerar en mycket selektiv och reproducerbar skada i jämförelse med kontusion eller kompressionstekniker som är användbar för att undersöka neurala plasticitet i skonade och skadade vägar i samband med funktionell återhämtning. Vi presenterar ett detaljerat steg-för-steg-protokoll för att utföra en thorakal hemisektion på den T8 vertebrala nivån hos råtta som resulterar i en initial förlamning av bakbenen på sidan av lesionen med graderad spontan återhämtning av rörelsefunktionen över flera Veckor. Vi erbjuder också ett rörelseresultat protokoll för att bedöma funktionell återhämtning i det öppna fältet. Den motoriska utvärderingen ger en linjär återhämtning profil och kan utföras både tidigt och upprepade gånger efter skada för att korrekt skärm djur för lämpliga tidpunkter där för att genomföra mer specialiserade beteendemässiga tester. Den hemisektion teknik som presenteras kan lätt anpassas till andra transektion modeller och arter, och motoriska bedömningen kan användas i en mängd olika SCI och andra skade modeller att göra mål rörelse funktion.

Introduction

Ryggmärgsskada (SCI) är förknippad med allvarliga störningar i motorisk, sensorisk och autonom funktion. Experimentella djurmodeller av SCI är värdefulla verktyg för att förstå de anatomiska och fysiologiska händelser som är involverade i SCI patologi, för att undersöka de neurala mekanismerna i reparation och återhämtning, och för att screena för effekt och säkerhet av potentiella terapeutiska Insatser. Råttan är den vanligast förekommande arten i SCI Research¹. Råtta modellerna är låg kostnad, lätt till reproducera, och en stor ackumulatorn av beteende proverna är tillgänglig till bedöma funktionell resultaten². Trots vissa skillnader i tarmkanalen platser, råtta ryggmärgen aktier övergripande liknande sensomotoriska funktioner med större däggdjur, inklusive primater^3,4. Råttor delar också motsvarande fysiologiska och beteendemässiga konsekvenser för SCI som relaterar till människor⁵. Icke-mänskliga primater och stora djurmodeller kan ge en närmare tillnärmning av Human SCI⁶ och är nödvändiga för att bevisa behandling säkerhet och effekt före mänskliga experiment, men är mindre vanligt förekommande på grund av etiska och djurskydd överväganden, utgifter och myndighetskrav⁷.

Råtta transektion Sci modeller utförs av riktade avbrott i ryggmärgen med en selektiv lesion med hjälp av en dissektion kniv eller iridektomi sax efter en laminektomi. Jämfört med en fullständig transektion, resulterar partiell transektion i råtta i en mindre allvarlig skada, lättare postoperativ Djurvård, spontan motorisk återhämtning, och närmare modeller SCI hos människor som är övervägande ofullständig med partiell sparande av vävnad som förbinder ryggmärgen och plausibel strukturer⁸. En ensidig hemisektion stör alla stigande och fallande spår på ena sidan, och producerar kvantifierbara och mycket reproducerbara rörelseunderskott, vilket förbättrar utforskandet av de bakomliggande biologiska mekanismerna. Den mest framträdande funktionella konsekvensen av hemisektionen är en initial lem förlamning på samma sida och under nivån på lesionen med graderad spontan återhämtning av rörelsefunktionen under flera veckor^{9,10, elva , 12}. hemisektionens modell är särskilt användbar för att undersöka neurala plasticitet av skadade och kvarvarande skrifter och kretsar förknippade med funktionell återhämtning^{9,11,12, 13,14,15,16,17,18}. Specifikt, hemisektion utförs på bröstkorg nivå, dvs ovanför spinal kretsar som styr bakbenet förflyttning, är särskilt användbart för att undersöka förändringar i rörelsekontroll. Som en icke-linjär relation finns mellan lesion svårighetsgrad och motoriska återhämtning efter SCI¹⁹, lämpliga beteendemässiga tester för att bedöma funktionella resultat är av största vikt i experimentella modeller.

Ett omfattande batteri av beteendemässiga tester finns för att bedöma specifika aspekter av funktionell rörelse återhämtning i råtta^2,20. Många motoriska tester ger inte tillförlitliga åtgärder tidigt efter SCI eftersom råttor är för handikappade för att stödja deras kroppsvikt. Ett mått på spontan rörelse prestanda som är känsligt för underskott tidigt efter skada, och inte kräver preoperativ utbildning eller specialiserad utrustning, är fördelaktigt för att övervaka motoriska återhämtning för lämpliga tidspunkter där för att komplettera specialiserade beteendemässiga tester. Den Martinez Open-fält bedömning Poäng¹⁰, ursprungligen utvecklades för att utvärdera motoriska prestanda efter CERVIKAL Sci hos råtta, är en 20-punkt ordningstal Poäng bedöma globala rörelseresultat under spontan Overground förflyttning i en öppen-fält. Poängsättningen utförs separat för varje lem med hjälp av kriterier som utvärderar specifika parametrar för en rad rörelse åtgärder inklusive artikulär lem rörelse, vikt stöd, siffra position, steg förmåga, forelimb-bakben samordning och svans Position. Bedömningspoängen härleds från den öppna fält Skattnings skalan Basso, Beattie och Bresnahan (BBB) för att utvärdera rörelseresultatet efter thorakal kontusion²¹. Den är anpassad för att korrekt och tillförlitligt utvärdera både forelimb och bakbenet rörelse funktion, möjliggör oberoende bedömning av de olika Poäng parametrar som inte är mottagliga med den hierarkiska scoring av BBB, och ger en linjär återhämtning profil¹⁰. Dessutom, i jämförelse med BBB, bedömningspoängen är känslig och tillförlitlig i mer allvarliga skade modeller^10,11,20,22. Bedömningspoängen har använts för att bedöma nedsatt leverfunktion hos råtta efter cervikal^10,12 och bröst⁹ Sci ensamt och i kombination med traumatisk hjärnskada²³.

Vi presenterar här en detaljerad steg-för-steg-protokollet för att utföra en thorakal hemisektionen Sci på T8 vertebrala nivån i den kvinnliga Long-Evans råtta, och för att bedöma bakbenet rörelse återhämtning i det öppna fältet.

Protocol

De experiment som beskrivs i denna artikel utfördes i enlighet med riktlinjerna från det kanadensiska rådet för djuromsorg och godkändes av etikkommittén vid Université de Montréal. 1. Thoracic hemisektionen kirurgi Använd lämplig skyddsutrustning (handskar, mask och klänning) för att upprätthålla en aseptisk miljö för kirurgi. Rengör det kirurgiska området med spritservetter och placera sterila kirurgiska draperier över Operations fältet. Sterilisera kirurgiska v…

Representative Results

Reproducerbara lesioner med hög grad av konsistens kan genereras med hemisektionsteknik. För att bedöma och jämföra lesioner storlekar mellan experimentella grupper, den maximala arean av lesionen som en procentandel av det totala tvärsnittet av ryggmärgen kan lätt beräknas med histologisk färgning av ryggmärgen avsnitt. Figur 1 visar en representativ lesion av vänster hemicord och en överlagring av den andel av maximal lesionsarea som delas mellan råttor med en genomsnittlig l…

Discussion

En stor styrka av hemisektion tekniken är selektivitet och reproducerbarhet av lesionen som leder till minskad variation i histologiska och beteendemässiga fenotyper mellan djur²⁵. För att säkerställa en ensidig lesion på lämplig spinal nivå, noggrann identifiering av både rätt vertebrala segmentet och ryggmärgen mittlinjen är kritisk. Eftersom det kan finnas en tendens för ryggmärgen att rotera i riktning mot snittet under hemisektionen förfarandet, kan det vara fördelaktigt att s…

Materials

Baytril	CDMV	11242
Blunt dissection scissors	World Precision Instruments	503669
Buprenorphine hydrochoride	CDMV
Camera lens	Pentax	C31204TH	12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount
CMOS video camera	Basler	acA2000-165uc	2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3
Compressed oxygen gas	Praxair
Cotton tipped applicators	CDMV	108703
Delicate bone trimmers	Fine Science Tools	16109-14
Dissecting knife	Fine Science Tools	10055-12
Dumont fine forceps (#5)	Fine Science Tools	11254-20
Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2  suture (J392H)	CDMV	111689
Feedback-controlled heating pad	Harvard Apparatus	55-7020
Female Long-Evans rats	Charles River Laboratories	Strain code: 006	225-250g
Gelfoam	CDMV	102348
Curved hemostat forceps	Fine Science Tools	13003-10
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Hydrogel	70-01-5022	Clear H20
Isofluorane	CDMV	118740
Lactated Ringer's solution	CDMV	116373
Lidocaine (2%)	CDMV	123684
Needle 30 ga	CDMV	4799
Open-field area	Custom		Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height
Opthalmic ointment	CDMV	110704
Personal computer			With USB3 connectivity to record video with the listed camera
Physiological saline	CDMV	1399
Proviodine	CDMV	4568
Rodent Liquid Diet	Bioserv	F1268
Scalpal blade #11	CDMV	6671
Self-retaining retractor	World Precision Instruments	14240
Vannas iridectomy spring scissors	Fine Science Tools	15002-08
Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer	Dispomed	975-0510-000
VLC media player	VideoLAN		videolan.org/vlc