L'articolo descrive un protocollo rapido per l'etichettatura dei vasi sanguigni in un pesce teleostico da perfusione cardiaca di DiI diluito in fissativo, utilizzando Medaka (Oryzias latipes) come modello e concentrandosi sul tessuto del cervello e dell'ipofisi.
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Articolo metodologico
Etichettatura dei vasi sanguigni nel cervello teleost e pituitario utilizzando la perfusione cardiaca con un DiI-fissativo
In questo articolo
Sommario
Abstract
I vasi sanguigni innervano tutti i tessuti nei vertebrati, permettendo la loro sopravvivenza fornendo i nutrienti necessari, ossigeno, e segnali ormonali. È uno dei primi organi ad iniziare a funzionare durante lo sviluppo. I meccanismi di formazione dei vasi sanguigni sono diventati un argomento di alto interesse scientifico e clinico. Negli adulti, tuttavia, è difficile visualizzare la vascolarizzazione nella maggior parte degli animali viventi a causa della loro localizzazione in profondità all'interno di altri tessuti. Tuttavia, la visualizzazione dei vasi sanguigni rimane importante per diversi studi come l'endocrinologia e la neurobiologia. Mentre diverse linee transgeniche sono state sviluppate nel pesce zebra, con i vasi sanguigni visualizzati direttamente attraverso l'espressione delle proteine fluorescenti, non esistono strumenti simili per altre specie di teleostico. Utilizzando Medaka (Oryzias latipes) come modello, il protocollo attuale presenta una tecnica rapida e diretta per etichettare i vasi sanguigni nel cervello e nell'ipofisi che irrora attraverso il cuore con fissativo contenente dii. Questo protocollo consente di migliorare la nostra comprensione su come le cellule cerebrali e ipofisi interagiscono con la vasculatura del sangue in tessuto intero o fette di tessuto spesso.
Introduzione
I vasi sanguigni giocano una parte essenziale del corpo dei vertebrati in quanto forniscono i nutrienti necessari, ossigeno e segnali ormonali a tutti gli organi. Inoltre, dal momento che la scoperta del loro coinvolgimento nello sviluppo del cancro1, hanno ricevuto molta attenzione nella ricerca clinica. Sebbene alcune pubblicazioni abbiano indagato sui meccanismi che consentono la crescita e la morfogenesi dei vasi sanguigni, e un gran numero di geni importanti per la loro formazione sono stati identificati2, molto resta da intendere per quanto riguarda l'interazione tra cellule o tessuti e il sangue circolante.
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Protocollo
Tutta la manipolazione degli animali è stata eseguita secondo le raccomandazioni per la cura e il benessere degli animali di ricerca presso l'Università norvegese di Scienze della vita, e sotto la supervisione di investigatori autorizzati.
1. preparazione di strumenti e soluzioni
- Preparare la soluzione di stock DiI dissolvendo 5 mg di cristallo DiI in 1,5 mL di tubo di plastica con 1 mL di 96% EtOH. Vortex per 30 s e tenere coperto con foglio di alluminio.
Nota: La soluzione di azioni DiI può essere conservata al buio a-20 ° c per diversi mesi. - Preparare il supporto per pesci (Fig....
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Risultati
Questo protocollo dimostra una procedura passo per passo per etichettare i vasi sanguigni nel cervello Medaka e ipofisi, e allo stesso tempo fissare il tessuto. Dopo l'etichettatura mediante iniezione cardiaca di una soluzione fissativa contenente DiI nel cuore, i vasi sanguigni possono essere osservati su fette utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente (Figura 4) o su tessuto intero utilizzando un microscopio confocale (Figura 5). Sia sulla fetta di tessut.......
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Discussione
La perfusione cardiaca con DiI in precedenza è stata utilizzata per etichettare i vasi sanguigni in diverse specie di modello24, tra cui il pesce teleostico13.
Come DiI è direttamente consegnato alla membrana cellulare endoteliale per perfusione nella vasculatura, è possibile aumentare il rapporto segnale-rumore aumentando la concentrazione DiI nella soluzione fissativa. Inoltre, il fluoroforo fornisce una colorazione intensa quando ec.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare
Ringraziamenti
Ringraziamo Dr Shinji Kanda per la dimostrazione di perfusione cardiaca con soluzione fissativa in Medaka, Sig. ra Lourdes Carreon G Tan per l'aiuto con l'allevamento di Medaka, e il signor Anthony Peltier per le illustrazioni. Questo lavoro è stato finanziato da NMBU e dal Consiglio di ricerca della Norvegia, Grant Number 248828 (programma Digital Life Norway).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 16% paraformaldeide Microscopia | elettronica Sciences | RT 15711 | |
| Siringa da 5 mL PP/PE senza ago | Siringhe | Sigma | Z116866-100EA |
| Aghi per siringa BD Precisionglide Aghi | Sigma | Z118044-100EA | 18G (1.20*40) |
| Vetro borosilicato 10 cm OD 1.2 mm | strumento sutter | BF120-94-10 | pipetta |
| in vetroDiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocianina perclorato) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tubo O.D 1,7 mm e I.D 1,1 mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| salina tampone fosfato (PBS) | Sigma | D8537-6X500ML | |
| Estrattore per pipette | Narishige | PC-10 | |
| Piastre di Petri in plastica | VWR | 391-0442 | |
| Super gel colla | loctite | c4356 | |
| Tricaina (ms-222) | sigma | E10521-50G |
Riferimenti
- Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. Angiogenesis in cancer. Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).
- Simon, M. C. Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks. Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).
- Magi....
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Ristampe e permessi
