Summary
लेख DiI के कार्डियक छिड़काव द्वारा एक teleost मछली में रक्त वाहिकाओं लेबलिंग के लिए एक त्वरित प्रोटोकॉल का वर्णन है fixative में पतला, एक मॉडल के रूप में medaka (ओरिज़ियस latipes) का उपयोग कर और मस्तिष्क और पिट्यूटरी ऊतक पर ध्यान केंद्रित ।
Abstract
रक्त वाहिकाओं कशेरुकी में सभी ऊतकों में अंदर आना, आवश्यक पोषक तत्वों, ऑक्सीजन, और हार्मोनल संकेतों को उपलब्ध कराने के द्वारा अपने अस्तित्व को सक्षम करने । यह विकास के दौरान काम शुरू करने वाले पहले अंगों में से एक है । रक्त वाहिका गठन के तंत्र उच्च वैज्ञानिक और नैदानिक ब्याज का एक विषय बन गए हैं । वयस्कों में हालांकि, यह अन्य ऊतकों के भीतर गहरे अपने स्थानीयकरण के कारण सबसे जीवित जानवरों में वाहिनीन्यास कल्पना करने के लिए मुश्किल है । फिर भी, रक्त वाहिकाओं के दृश्य एंडोक्राइनोलॉजी और न्यूरोबायोलॉजी के रूप में कई अध्ययनों के लिए महत्वपूर्ण रहता है । जबकि कई ट्रांसजेनिक लाइनों zebrafish में विकसित किया गया है, रक्त वाहिकाओं सीधे फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से कल्पना के साथ, कोई ऐसे उपकरण अंय teleost प्रजातियों के लिए मौजूद हैं । एक मॉडल के रूप में medaka (ओरिज़ियस लतीप्स) का उपयोग करते हुए, वर्तमान प्रोटोकॉल एक त्वरित और प्रत्यक्ष तकनीक प्रस्तुत करता है मस्तिष्क और पिट्यूटरी में रक्त वाहिकाओं लेबल करने के लिए लगानेवाला युक्त dii के साथ दिल के माध्यम से perfusing । इस प्रोटोकॉल पर हमारी समझ में सुधार की अनुमति देता है कैसे मस्तिष्क और पिट्यूटरी कोशिकाओं को पूरे ऊतक या मोटी ऊतक स्लाइस में रक्त वाहिकीय के साथ बातचीत ।
Introduction
रक्त वाहिकाओं कशेरुकी शरीर का एक आवश्यक हिस्सा खेलने के रूप में वे सभी अंगों के लिए आवश्यक पोषक तत्वों, ऑक्सीजन और हार्मोनल संकेतों प्रदान करते हैं । इसके अलावा, कैंसर के विकास में उनकी भागीदारी की खोज के बाद से1, वे नैदानिक अनुसंधान में बहुत ध्यान मिला है । हालांकि प्रकाशनों की एक संख्या रक्त वाहिका वृद्धि और morphogenesis की अनुमति तंत्र की जांच की है, और उनके गठन के लिए महत्वपूर्ण जीन की एक बड़ी संख्या2की पहचान की गई है, बहुत से बातचीत के बारे में समझ में आ रहा है कोशिकाओं या ऊतकों और परिसंचारी रक्त के बीच ।
मस्तिष्क और पिट्यूटरी में रक्त वाहिकीय का दृश्य महत्वपूर्ण है । मस्तिष्क में ंयूरॉंस ऑक्सीजन और3ग्लूकोज की एक उच्च आपूर्ति की आवश्यकता होती है, और पिट्यूटरी आठ महत्वपूर्ण हार्मोन उत्पादन कोशिका प्रकार है कि रक्त के प्रवाह का उपयोग करने के लिए मस्तिष्क से संकेत प्राप्त करने के लिए और अलग करने के लिए उनके संबंधित हार्मोन भेजने के लिए होता है परिधीय अंगों4,5। जबकि स्तनधारियों में, हाइपोथैलेमस के आधार पर पोर्टल प्रणाली, मीडियन एमिनेंस के नाम से, मस्तिष्क और पिट्यूटरीको जोड़ता है, इस तरह के एक स्पष्ट रक्त सेतु का वर्णन टेलिसेंट मछलियों में नहीं किया गया है । वास्तव में, टेलीलोस्ट्स में, preoptico-hypothalamic ंयूरॉंस सीधे पिट्यूटरी के परस नर्वोसा में अपने axons परियोजना7 और ज्यादातर विभिंन endocrine कोशिका प्रकार सीधे अंदर आना8,9। तथापि, इन ंयूरॉंस के कुछ अपने तंत्रिका अंत संवहनी अंतरिक्ष में स्थित है, करीब में रक्त केशिकाओं10के आसपास है । इसलिए, teleost मछली और स्तनधारियों के बीच अंतर इतना स्पष्ट नहीं है, और रक्त vasculature और मस्तिष्क और पिट्यूटरी कोशिकाओं के बीच संबंध teleost मछली में अधिक से अधिक जांच की आवश्यकता है ।
Zebrafish कई पहलुओं में, अंय कशेरुकी प्रजातियों के लिए एक शारीरिक रूप से और कार्यात्मक तुलनीय संवहनी प्रणाली है11। यह हृदय अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली कशेरुकी मॉडल बन गया है ज्यादातर कई ट्रांसजेनिक लाइनों के विकास के लिए धन्यवाद, जहां संवहनी प्रणाली के घटकों फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के साथ लेबल रहे हैं12. हालांकि, सटीक संचार प्रणाली शरीर रचना विज्ञान प्रजातियों के बीच भिंन हो सकते हैं, या यहां तक कि एक ही प्रजाति से संबंधित दो व्यक्तियों के बीच । इसलिए, रक्त वाहिकाओं के दृश्य उच्च ब्याज की अन्य teleost प्रजातियों में भी हो सकता है जिसके लिए transgenesis उपकरण मौजूद नहीं हैं ।
कई तकनीकों के लिए दोनों स्तनधारियों और teleosts में रक्त वाहिकाओं लेबल करने के लिए वर्णित किया गया है । इनमें वसचर-विशिष्ट जीन के लिए सीटू संकरण में शामिल हैं, alkaline फॉस्फेट धुंधला हो जाना, माइक्रोएंजियोग्राफी, और डाई इंजेक्शन (एक समीक्षा के लिए13देखें) । प्रतिदीप्त lipophilic धनायनी indocarbocyanine डाई (dii) पहले झिल्ली लिपिड पार्श्व गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था के रूप में यह लिपिड bilayers में बनी हुई है और इसके माध्यम से विस्थापित कर सकते हैं14,15,16. दरअसल, डीआईआई का एक अणु दो हाइड्रोकार्बन चेन्स और क्रोमोफोज से बना होता है । जबकि हाइड्रोकार्बन श्रृंखलाएं कोशिकाओं की लिपिड बिलिलेयर कोशिका झिल्ली में इसके संपर्क में एकीकृत हो जाती हैं, जबकि क्रोमोफोस इसकी सतह17पर बने रहते हैं । झिल्ली में एक बार, DiI अणुओं laterally लिपिड बिलेयर जो झिल्ली संरचनाओं कि DiI समाधान के साथ सीधे संपर्क में नहीं हैं दाग करने में मदद करता है के भीतर फैलाना । कार्डियक छिड़काव के माध्यम से एक DiI समाधान इंजेक्शन, इसलिए यौगिक रक्त वाहिकाओं के प्रत्यक्ष लेबलिंग की अनुमति के साथ संपर्क में सभी endothelial कोशिकाओं को लेबल होगा । आज dii भी ऐसे एकल अणु इमेजिंग, भाग्य मानचित्रण, और न्यूरोनल अनुरेखण के रूप में अंय धुंधला प्रयोजनों, के लिए प्रयोग किया जाता है । दिलचस्प है, कई fluorophores (उत्सर्जन की विभिंन तरंग दैर्ध्य के साथ) मौजूद अंय फ्लोरोसेंट लेबल के साथ संयोजन की अनुमति है, और शामिल करने के साथ ही DiI के पार्श्व प्रसार दोनों रहते है और तय ऊतकों में हो सकता है18, १९।
Formaldehyde, १८९३ में फर्डिनाड blum द्वारा की खोज की, ऊतक निर्धारण20,21के लिए पसंदीदा रसायन के रूप में वर्तमान दिन के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है । यह सबसे सेलुलर लक्ष्य के लिए व्यापक विशिष्टता से पता चलता है और सेलुलर संरचना को बरकरार रखता है22,23। यह भी सबसे fluorophores के फ्लोरोसेंट गुणों को बरकरार रखता है, और इस प्रकार के लिए जो लक्षित कोशिकाओं को व्यक्त फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन fixate करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
इस पांडुलिपि में, एक पूर्व प्रोटोकॉल के लिए छोटे प्रयोगात्मक स्तनधारी मॉडल24 में रक्त वाहिकाओं लेबल विकसित मछली में इस्तेमाल के लिए अनुकूलित किया गया है । पूरी प्रक्रिया केवल कुछ घंटों का प्रदर्शन करने के लिए लेता है । यह कैसे करने के लिए सीधे मस्तिष्क में सभी रक्त वाहिकाओं और मॉडल मछली medaka के पिट्यूटरी लेबल के क्रम में मछली दिल में dii युक्त formaldehyde के एक लगानेवाला समाधान शवद करने के लिए दर्शाता है । Medaka एक छोटे मीठे पानी में मछली एशिया के लिए देशी है, मुख्य रूप से जापान में पाया जाता है । यह एक अनुसंधान मॉडल जीव है जिसमें आणविक और आनुवंशिक उपकरणों की एक सुईटउपलब्ध है । इसलिए, इस प्रजाति में रक्त वाहिकाओं की पहचान के साथ ही दूसरों में कैसे मस्तिष्क और पिट्यूटरी कोशिकाओं को पूरे ऊतक या मोटी ऊतक स्लाइस में रक्त वाहिकीय के साथ बातचीत पर हमारी समझ में सुधार करने के लिए अनुमति देगा ।
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Protocol
सभी पशु हैंडलिंग नार्वे जीवन विज्ञान विश्वविद्यालय में अनुसंधान पशुओं की देखभाल और कल्याण के लिए सिफारिशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था, और अधिकृत जांचकर्ताओं के पर्यवेक्षण के अंतर्गत ।
1. उपकरणों और समाधान की तैयारी
- डीआईआई स्टॉक घोल तैयार करें 5 मिलीग्राम डीआईआई क्रिस्टल को १.५ मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में 1 मिलीलीटर ९६ 30 एस के लिए भंवर और एल्यूमीनियम पंनी का उपयोग कर कवर रहते हैं ।
नोट: डीआईआई स्टॉक समाधान को अंधेरे में-20 ° c कई महीनों के लिए संरक्षित किया जा सकता है । - 5 सेमी लंबाई, 3 सेमी चौड़ाई, और 2 सेमी मोटाई, और एक 9 सेमी व्यास प्लास्टिक डिश के लिए gluing करने के लिए पॉलीस्टाइरीन का एक टुकड़ा काटने से मछली धारक तैयार (चित्रा 1एक) । पॉलीस्टाइरीन में एक स्केलपेल ब्लेड के साथ एक 3 सेमी नाव के आकार का छेद बनाओ ।
- Perfusing प्रणाली तैयार (चित्रा 2) सुई के छोर पर एक 30-50 सेमी लंबे प्लास्टिक प्रवेशनी जोड़कर ।
- ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में 30 मिलीलीटर फास्फेट बफर खारा घोल (पीबीएस) के साथ 16% पीएफए के 10 मिलीलीटर को कमजोर करके पैराफार्मल डिहाइड सॉल्यूशन (पीएफए) की ४० मिलीलीटर की ताजा 4% मात्रा तैयार करें ।
- 10 मिलीलीटर की एक प्लास्टिक ट्यूब में 9 मिलीलीटर की ताजा तैयार 4% पीएफए में DiI स्टॉक समाधान के 1 मिलीलीटर को पतला करके तैयार/ अंधेरे में उपयोग तक रखें ।
नोट: DiI क्रिस्टल कि भंग नहीं कर रहे है स्टॉक समाधान ट्यूब में रखा जा सकता है, और नए इथेनॉल नई DiI स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए जोड़ा जा सकता है (१.१ कदम देखें) । -
५० मिलीलीटर ट्राइकैन (MS-२२२) स्टॉक तैयार करें ।
- भंग २०० मिलीग्राम ट्राइकेन पाउडर एच2ओ के ४८ मिलीलीटर में 2 मिलीलीटर 1 मीटर Tris बेस (पीएच 9) जोड़ें । 1 एम एचसीएल के साथ पीएच 7 में समायोजित करें और-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
- एक छोटे गिलास में स्वच्छ पानी की ५० मिलीलीटर में Tricaine स्टॉक के 5 मिलीलीटर तनु ।
- कई 5 सेमी ग्लास पिपेट तैयार (चित्रा 2) निर्माता के निर्देशों का पालन एक पिपेट डांड़ी के साथ एक गिलास केशिका खींच द्वारा ।
2. विच्छेदन और छिड़काव
नोट: पीएफए एक विषाक्त वाष्पशील यौगिक है, इसलिए विच्छेदन और छिड़काव एक हुड में या एक हवादार कमरे में प्रदर्शन किया जाना चाहिए, और उपयोगकर्ता एक गैस मास्क पहने होना चाहिए ।
- विच्छेदन से पहले छोटी कैंची, और एक तेज और एक मजबूत संदंश सहित विच्छेदन उपकरण तैयार ।
- ५० एमएल ट्यूब में रखकर और ड्राइंग बनाकर पीएफए/डीआईआई के तैयार घोल से सिरिंज भरें । तो सिरिंज के छोर पर प्रवेशनी के साथ सुई जगह (चित्रा 2) ।
- अलग दिशाओं में रखा टेप के कई टुकड़ों का उपयोग कर पीठ को सिरिंज फिक्स, खुर्दबीन के लिए और सिरिंज पिस्टन दबाने के लिए एक अच्छी स्थिति प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप और सीट की स्थिति को समायोजित (चित्रा 1बी).
नोट: इस प्रोटोकॉल में, कोहनी नीचे सिरिंज पिस्टन दबाने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन अन्य संभावनाओं के विकल्प का इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, किसी अन्य व्यक्ति से सहायता. - कदम १.७ में तैयार समाधान में मछली रखकर tricaine की एक अधिक मात्रा के साथ मछली euthanize । 30 एस रुको और मछली की सजगता को संदंश के साथ अपने पुच्छ पंख कब्जाने द्वारा परीक्षण । जब उत्तेजको का प्रत्युत्तर देना बंद कर दिया है तो मछली का उपयोग किया जा सकता है ।
- मछली धारक में मछली अपने पेट का सामना करना पड़ के साथ प्लेस और सिर के छोर में एक सुई पिन और एक दूसरे को पूंछ के ऊपर एक जगह में मछली रखने के लिए ।
- क्षैतिज त्वचा की परत को काटने से कैंची के साथ पूर्वकाल पेट खोलें ।
- Forceps का उपयोग करना, हृदय के ऊपर की त्वचा को दूर करने के लिए एक स्पष्ट पहुँच तक वेंट्रिकल और बल्बस धमरिओसस प्रदान की जाती है (चित्रा 3).
- केशिका के सिरा में काँच का पिपेट डालिए और काँच के पिपेट की नोक के सिरे को तोड़िए ।
नोट: टूटे हुए टिप के छेद पर्याप्त बड़ा करने के लिए तरल बाहर जाना चाहिए, लेकिन अभी भी काफी छोटा करने के लिए आसानी से ऊतक दर्ज करें । कांच के पिपेट को अगर तोड़ा या भरा न जाए तो फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है । - ग्लास पिपेट वेंट्रिकल के करीब लाने के लिए और कोहनी के साथ सिरिंज पिस्टन के लिए दबाव जोड़ने के लिए तरल बाहर बल ।
- सिरिंज के लिए दबाव डालते हुए ग्लास पिपेट के साथ दिल वेंट्रिकल पिन करें ।
- सीधे के बाद, संदंश के साथ साइनस शिरा छिद्रण रक्त परिसंचरण छोड़ने के लिए सक्षम करने के लिए ।
नोट: स्थिरक के कारण हृदय वेंट्रिकल अधिक नाजुक हो जाता है । यह भी कम लाल हो जाता है के रूप में रक्त fixative/ - वेंट्रिकल से, कांच पिपेट के कोण को समायोजित करने के लिए बल्बस arteriosus के प्रवेश द्वार खोजने के लिए । चित्र 2में दिखाया गया है, और सिरिंज के लिए और अधिक दबाव जोड़ने के रूप में बल्बस धमरिओसस अंदर पिपेट खोलने लाओ ।
नोट: बल्बस आर्टीरियोसस पारदर्शी और ऊतक लोचदार है । जब खून की जगह dii/fixative, कांच पिपेट दिल के अंदर और अधिक दृश्यमान हो जाना चाहिए और दबाव जोड़ने के द्वारा, बल्बस धमनी का आकार का विस्तार करना चाहिए । यह कदम सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि पर्याप्त दबाव के साथ सभी रक्त को बदलने के लिए इस्तेमाल किया गया है fixative/ अक्सर जब सफल, पीएफए मांसपेशी संकुचन भड़काती और मछली जा रहा होगा । - जारी रखने के लिए सिरिंज पर दबाव जोड़ने के लिए 30-60 s अभी भी गिलास पिपेट के अंदर बल्बस arteriosus रखते हुए.
- गिलास पिपेट और मछली से सुई निकालें ।
- मस्तिष्क और पिट्यूटरी काटना, और PBS में कमरे के तापमान पर अंधेरे में 2 ज के लिए ताजा 4% पीएफए में ऊतकों सेबेट ।
नोट: मस्तिष्क और पिट्यूटरी के विच्छेदन पहले विस्तार से Fontaine एट अल.26 और अजर-बाती एट अल.27द्वारा दो विभिंन तरीकों में वर्णित किया गया है । निर्धारण की वजह से ऊतक काफी मुश्किल हो जाता है और मस्तिष्क और पिट्यूटरी के बीच नाजुक कड़ी टूट सकता है । विच्छेदन के बाद, पोस्ट निर्धारण प्रसंस्करण भी 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर किया जा सकता है । - दो बार पीबीएस में इमेजिंग के लिए तैयार करने से पहले 10 मिनट के लिए ऊतक कुल्ला ।
नोट: ऊतक तो स्लाइड और बीच में spacers के साथ कवर पर्ची के बीच घुड़सवार और संनाभि इमेजिंग के लिए मध्यम बढ़ते ( चित्रा 4देखें) कर सकते हैं, या एक vibratome के साथ sectioned के रूप में विस्तार से fontaine एट अल में वर्णित के बीच बढ़ते से पहले26 स्लाइड और एक stereomसूक्ष्मदर्शी के साथ इमेजिंग के लिए कवर स्लिप ( चित्रा 4देखें) ।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल को दर्शाता है कदम प्रक्रिया से एक कदम medaka मस्तिष्क और पिट्यूटरी में रक्त वाहिकाओं लेबल करने के लिए, और एक ही समय में ऊतक को ठीक. दिल में dii युक्त एक फिक्टिव समाधान के कार्डियक इंजेक्शन द्वारा लेबल के बाद, रक्त वाहिकाओं एक फ्लोरोसेंट stereomसूक्ष्मदर्शी का उपयोग कर स्लाइस पर मनाया जा सकता है (चित्रा 4) या पूरे ऊतक पर एक संनाभि माइक्रोस्कोप का उपयोग (चित्रा 5). या तो मोटी ऊतक स्लाइस पर या पूरे ऊतक पर, रक्त वाहिकीन्यास की वास्तुकला तीन आयामों में देखा जा सकता है । ऊतक स्लाइसें निर्धारण के अंत के बाद मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल का उपयोग विशिष्ट लक्षित प्रोटीन के लिए लेबल किया जा सकता है, और ट्रांसजेनिक लाइनों पर जहां ब्याज एक्सप्रेस फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन की कोशिकाओं (चित्रा 6). यह रक्त वाहिकाओं और अंय विशिष्ट कोशिका प्रकार के बीच बातचीत पर जांच की अनुमति देता है । यहां उदाहरण के लिए, medaka जहां ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) का उत्पादन कोशिकाओं की एक ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग पीयूषिका Lh कोशिकाओं के स्थान का पता चला28। एक का पालन कर सकते है कि इन कोशिकाओं को रक्त वाहिकाओं की ओर एक्सटेंशन भेजें । कुछ रक्त वाहिकाओं अगर छिड़काव उप इष्टतम है ठीक से लेबल नहीं किया जा सकता है । यह मामला हो सकता है, उदाहरण के लिए, यदि समाधान दिल वेंट्रिकल के बजाय बल्बस धमनी में इंजेक्शन है, या यदि बहुत कम दबाव का उपयोग कर और/ अंत में, एक ही इमेजिंग मापदंडों के साथ एक ही ऊतक इमेजिंग द्वारा, लेबलिंग की तीव्रता चार दिनों के बाद कम करने के लिए दिखाया गया था, संकेत के साथ और अधिक फैल (चित्रा 8).
चित्रा 1 : मछली के छिड़काव के लिए होल्डिंग प्लेट की छवियां (एक) और इंजेक्शन सेटअप (ख) । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 : Medaka मछली दिल और छिड़काव प्रणाली की स्कीमा सफल छिड़काव के लिए दिल में गिलास सुई के idel स्थान के साथ दिखाया गया है । तीर सिर शो जहां दिल छिद्रन करने के लिए रक्त परिसंचरण छोड़ने के लिए अनुमति देने के लिए । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 : मछली के अधर पक्ष की छवि खोला, दिल के साथ छिड़काव के लिए उजागर । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4 : Medaka से मस्तिष्क और पिट्यूटरी ऊतक के एक स्लाइस में रक्त वाहिकीय की छवि । एक वयस्क medaka एक फिक्टिव समाधान DiI युक्त के साथ perfused त किया गया था । मस्तिष्क और पिट्यूटरी विच्छेदित और रातोंरात तय कर रहे थे । ऊतकों को 3 प्रतिशत आगारोस में रखा गया और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप से इमेजिंग करने से पहले एक वाइटहोम से विभाजित किया गया । सभी रक्त वाहिकाओं DiI के साथ लेबल पूरे मस्तिष्क और पिट्यूटरी में वाहिकाएँ दिखा अनुभाग के माध्यम से देखा जाता है. OT = ऑप्टिक टेक्टम; दूरभाष = telencephalon; Hyp = हाइपोथैलेमस; पिट = पीयूषिका; सीबी = सेरिबैलम; हिंद = हिमब्रेन । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5 : medaka पीयूषिका में रक्त वाहिकाविन्यास से एक संनाभि z-स्टैक के 3 डी प्रतिपादन. एक वयस्क medaka एक फिक्टिव समाधान DiI युक्त के साथ perfused त किया गया था । मस्तिष्क पिट्यूटरी विच्छेदित और रातोंरात तय कर रहे थे । पिट्यूटरी मस्तिष्क से विच्छेदित था और एक संनाभि माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग से पहले एक स्लाइड और spacers आईबी के साथ coverslip के बीच घुड़सवार । Z-स्टैक दर्ज किया गया था, और एक 3 डी प्रतिपादन फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर बनाया गया था और 3 डी दर्शक29प्लगइन । पूरे पिट्यूटरी ब्लड वेस्क्युलेशन को 3डी में देखा जा सकता है । RPD = रोस्ट्रल पार्स डिस्ट्रॉलिस; Ppd = समीपस्थ परस डिटैलिस; पीआई = परस intermedia. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6 :, संनाभि जेड की जेड प्रक्षेपण ट्रांसजेनिक medaka जहां lhβ प्रमोटर हरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है की एक ऊतक टुकड़ा से ढेर । एक वयस्क टीजी (एलएचबी: hrgfpii) medaka एक फिक्टिव dii युक्त समाधान के साथ perfused त किया गया था । मस्तिष्क पिट्यूटरी विच्छेदित और रातोंरात तय कर रहे थे । ऊतकों 3% agarose में घुड़सवार और एक vibratome के साथ sectioned थे । कुछ कोशिकाओं का उत्पादन हार्मोन, इस मामले में Lh कोशिकाओं, रक्त वाहिकाओं की ओर एक्सटेंशन (तीर सिर) भेजने के लिए देखा जा सकता है, शायद रक्त से संकेतों को समझने के लिए और/या संचलन में अपने हार्मोन रिलीज. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 7 : मस्तिष्क और पिट्यूटरी ऊतक के एक स्लाइस में रक्त वाहिकीय की छवि खराब perfused medaka से । एक वयस्क medaka खराब केवल वेंट्रिकल में समाधान इंजेक्शन द्वारा DiI युक्त समाधान के साथ perfused त किया गया था । मस्तिष्क पिट्यूटरी विच्छेदित और रातोंरात तय कर रहे थे । ऊतकों 3% agarose में घुड़सवार और एक संनाभि माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग से पहले एक vibratome के साथ sectioned थे । रक्त वाहिकाओं खराब DiI के साथ लेबल थे और उनमें से कुछ बिल्कुल पर लेबल नहीं थे । OT = ऑप्टिक टेक्टम; दूरभाष =, telencephalon; Hyp = हाइपोथैलेमस; पिट = पीयूषिका; सीबी = सेरिबैलम; हिंद = हिमब्रेन । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
अंक 8 : Medaka मस्तिष्क पीयूषिका ऊतक अनुभाग में लेबल रक्त वाहिकीय के समय चूक इमेजिंग. एक वयस्क medaka एक फिक्टिव समाधान DiI युक्त के साथ perfused त किया गया था । मस्तिष्क पिट्यूटरी विच्छेदित और रातोंरात तय कर रहे थे । ऊतकों 3% agarose में बढ़ रहे थे और एक स्टीलओमाइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग से पहले एक vibratome के साथ sectioned के बाद सीधे बढ़ते (ए), और 4 दिनों के बाद बढ़ते (ख) एक ही इमेजिंग मापदंडों के साथ । ध्यान दें कि लेबलिंग में कमी आई है और समय के साथ बाहर फैल गया है । OT = ऑप्टिक टेक्टम; दूरभाष = telencephalon; Hyp = हाइपोथैलेमस; पिट = पीयूषिका; सीबी = सेरिबैलम; हिंद = हिमब्रेन । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
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Discussion
Dii के साथ कार्डिएक छिड़काव पहले कई मॉडल प्रजातियों24में रक्त वाहिकाओं लेबल इस्तेमाल किया गया है, teleost मछली13सहित।
के रूप में dii सीधे endothelial कोशिका झिल्ली में छिड़काव द्वारा वैस्क्युलेशन में दिया जाता है, तो यह संभव है कि लगानेवाला समाधान में dii एकाग्रता में वृद्धि द्वारा संकेत करने के लिए शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए । इसके अलावा, फ्लोरफोर तीव्र धुंधला जब कम से अपेक्षाकृत लंबे समय से स्थाई उत्सर्जन की अनुमति विरंजन के साथ उत्तेजित प्रदान करता है18,30। इसके अलावा, लेबलिंग कई दिनों के लिए रह सकते हैं और अन्य लेबलिंग तकनीकों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है कि हल्के उपचार की आवश्यकता होती है, जैसे immuofluorescence में (यदि)31।
हालांकि इस तकनीक की कुछ सीमाएं हैं । स्थिरता समाधान से हटाने के बाद, लेबलिंग और ऊतकों की इमेजिंग के रूप में जल्दी संभव के रूप में प्रदर्शन किया जाना चाहिए क्योंकि लेबलिंग की तीव्रता कमजोर हो जाएगी, और संकेत समय के साथ फैलाना होगा (चित्रा 8) । इस प्रक्रिया को भी तेजी से होगा जब डिटर्जेंट का उपयोग करते हुए कि झिल्ली की सरंध्रता वृद्धि हुई है । इसके अलावा, क्योंकि पीएफए एक विषाक्त वाष्पशील यौगिक है, इस प्रयोग को करते समय कई सावधानियां बरती जानी चाहिए । इस प्रोटोकोल के खतरनाक पहलुओं को कम करने के लिए, कोई भी ब्याज के ऊतक को विच्छेदन से पहले डीआईआई और पीबीएस का समाधान कर सकता है और इसे छिड़काव के ठीक बाद पीएफए समाधान के साथ ठीक कर सकते हैं । हालांकि, यह केवल छोटे आकार के ऊतकों के लिए किया जा सकता है, के रूप में बड़े ऊतक नमूनों में पीएफए के प्रवेश के दौरान छिड़काव की तुलना में कम कुशल हो जाएगा ।
इस प्रोटोकॉल की सफलता दर प्रशिक्षण द्वारा सुधार हुआ है, इसलिए यह उम्मीद है कि शोधकर्ताओं को तकनीक के विभिन्न चरणों से परिचित होने के लिए कुछ समय की आवश्यकता होगी । उदाहरण के लिए, बल्बस आर्टीरियोसस में समाधान का छिड़काव प्रोटोकॉल का एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण कदम है और एक अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए कुछ प्रशिक्षण की आवश्यकता है । इसके अलावा छिड़काव के दौरान काफी लंबे समय के लिए सही स्थिति में सुई रखते हुए तुच्छ नहीं है, और manipulator द्वारा प्रशिक्षण की आवश्यकता होगी ।
अंत में, इस प्रोटोकॉल वयस्क medaka के लिए अनुकूलित है, लेकिन यह कुछ रूपांतरों के साथ अंय प्रजातियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । ब्याज के विभिंन ऊतकों, या यहां तक कि एक ही ऊतक के भीतर जानवर के विभिंन जीवन चरणों भी dii की एकाग्रता के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होगी और छिड़काव के समय के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया सामग्री (सुई और उदाहरण के लिए सिरिंज आकार) ।
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Disclosures
लेखकों को प्रकट करने के लिए कुछ भी नहीं है
Acknowledgments
हम डॉ शिंजी कांडा को मेडाका में फिक्टिव सॉल्यूशन के साथ हृदय के छिड़काव के लिए धन्यवाद देते हैं, मेडका पशुपालन और श्री एंथनी पेल्टियर के साथ मदद के लिए सुश्री लूर्डेस कैरेऑन जी टैन का उदाहरण देते हैं । यह काम NMBU द्वारा वित्त पोषित किया गया था और नॉर्वे के अनुसंधान परिषद द्वारा, अनुदान संख्या २४८८२८ (डिजिटल जीवन नॉर्वे कार्यक्रम).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| Borosilicate glass 10 cm OD 1.2 mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7 mm and I.D 1.1 mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| Pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Plastic Petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| Tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
References
- Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M.
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