Summary
여기에 제시된 펩티드 계의 작은 unilamellar 소포의 생성을 위한 프로토콜은 성장할 수 있다. 막 펩티드의 vesiculo 생산을 용이하게하기 위해, 이들 소포는 전사 번역 시스템 및 펩티드 인코딩 플라스미드를 구비한다.
Abstract
생화확적인 반응의 구획화는 합성 세포의 중앙 양상입니다. 이러한 목적을 위해, 펩티드 기반 반응 구획은 리포좀 또는 지방산 계 소포에 대한 매력적인 대안으로 작용한다. 외부 또는 소포 내에서 펩티드는 쉽게 발현되고 막 전구체의 합성을 단순화 할 수 있습니다. 여기에 제공된 것은 유리 비드로부터탈수화-재수화를 활용하는 양친애 엘라스틴 유사 폴리펩티드(ELP)에 기초하여 ~200 nm의 직경을 가진 소포의 생성을 위한 프로토콜이다. 또한 역온도 사이클링을 통한 세균 ELP 발현 및 정제프로토콜뿐만 아니라 형광 염료를 통한 공유 기능화에 대한 프로토콜도 제시되어 있다. 더욱이, 본 보고서는 생화학반응에 대한 덜 복잡한 예로서 ELP 소포 내부의 RNA aptamer dBroccoli의 전사를 가능하게 하는 프로토콜을 기술한다. 마지막으로, 프로토콜이 제공되어 형광 단백질과 막 펩티드의 베시큘로 발현이 허용되는 반면, 후자의 합성은 소포 성장을 초래합니다.
Introduction
합성 생활 셀룰러 시스템의 창조는 일반적으로 두 개의 다른 방향에서 접근. 하향식 방법에서는, 박테리아의 게놈은 그것의 필수적인 분대로 감소되고, 궁극적으로 최소한의 세포로 이끌어 냅니다. 상향식 접근법에서 인공 세포는 일관된 세포와 같은 시스템으로 기능적으로 통합되어야 하는 분자 성분 또는 세포 하위 시스템에서 조립된 de novo입니다.
de novo 접근법에서, 필요한 생화학 적 성분의 구획화는 일반적으로 인지질 또는 지방산1,2,3,4로만든 멤브레인을 사용하여 달성된다. 이는 "현대적" 세포막이 주로 인지질로 구성되기 때문이며, 지방산은 프리바이오틱 멤브레인인클로저 5,6의그럴듯한 후보로 간주되기 때문이다. 새로운 멤브레인의 형성을 위해 또는 멤브레인 성장을 촉진하기 위해, 양과 성 빌딩 블록은 외부에서 제공되어야7 이상적으로 해당 근육 과정을 사용하여 membranous 구획 내에서 생산을 통해4 ,8.
지질 합성은 비교적 복잡한 대사 과정이지만, 펩타이드는 세포없는 유전자 발현 반응을이용하여 매우 쉽게 생성될 수 있다 9,10. 따라서, 양과성 펩티드에 의해 형성된 펩티드 막은11을성장시킬 수 있는 인공 세포 모방을 위한 인클로저로서 지질막에 대한 흥미로운 대안을 나타낸다.
양과성 엘라스틴 과 같은 디블록 공중합체(ELPs)는 펩티드의 매력적인 부류이며, 이는 이러한멤브레인(12)에 대한 빌딩 블록으로서 작용할 수 있다. ELPs의 기본 아미노산 서열 모티프는 (GaGVP) n이며, 여기서 "a"는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이 될 수 있고 "n"은 모티프 반복 횟수13,14,15,16,17입니다. . ELP는 주로 글루탐산(11)으로 구성된 친수성 블록에 대해 주로 페닐알라닌을 함유하는 소수성 블록으로 생성되었다. pH 및 염 농도와 같은 용액 파라미터 및 용액 파라미터에 따라,ELPs는 펩티드가 친수성에서 소수성으로 완전히 가역적 위상 전이를 겪는 온도 Tt에서 소위 역온도 전환을 나타낸다. 상태. 펩타이드의 합성은 "TX-TL" 세균 세포 추출물11,18,19,20,21을사용하여 소포 내부에서 쉽게 구현될 수 있다. 결합 된 전사 및 번역 반응에 필요한 모든 구성 요소.
TX-TL 시스템은 ELP를 ELP 소포로 인코딩하는 DNA 템플릿과 함께 캡슐화되었으며, 유리 구슬에서 탈수-재수화를 견고한 지지체로 활용합니다. 소포의 형성은 비드 표면(11)으로부터 건조된 펩티드의재수화를 통해 발생한다. 소포 형성을 위한 다른 방법(22)은 잠재적으로 더 낮은 다분산성 및 더 큰 소포 크기(예를 들어, 전기 형성, 에멀젼 상 전달, 또는 미세 유체학 기반 방법)를 나타내는 데 사용될 수 있다. 캡슐화 방법의 생존가능성을 시험하기 위해, 형광 압타머 dBroccoli23의 전사는 대안적으로 TX-TL 시스템으로 유전자 발현보다 덜 복잡한11을사용할 수 있다.
vesiculo에서 막 빌딩 블록의 발현과 그 이후의 멤브레인으로의 통합으로 인해 소포는11을 성장하기 시작합니다. ELP의 멤브레인 혼입은 FRET 분석을 통해 입증될 수 있다. 이를 위해, 초기 소포 집단의 형성에 사용되는 ELP는 FRET 쌍을 구성하는 동등한 공유에서 형광 염료와 결합된다. vesiculo에 있는 비 표지된 ELPs의 발현 및 막으로 의 한 그 혼입, 막에 있는 표지된 ELPs는 희석되고 그 결과로 FRET 신호는11감소합니다. 활용에 대한 다재다능하고 일반적인 방법으로, 구리 촉매 아지드 알키네 사이클로추가가 사용된다. 트리스(benzyltriazolylmethyl)-아민과 같은 안정화 리간드를 사용하여, 반응은 반응물(11)의 가수분해 없이 생리학적 pH에서 수성 용액으로 수행될 수 있으며, 이는 응축 반응에 적합합니다. 펩티드를 포함.
다음 프로토콜은 ELP 기반 펩티도솜 성장에 대한 준비에 대한 자세한 설명을 제시한다. 유리 비드 방법을 이용한 펩티드 및 소포 형성의 발현이 설명된다. 더욱이, ELP 소포 내부의 단백질 발현을 위한 형광 성 dBroccoli aptamer 및 전사 번역 반응의 전사를 구현하는 방법에 대해 설명된다. 마지막으로, 제공된 FLUP를 플루오로포어로 컨쥬게이션하는 절차이며, 이는 FRET 분석(11)을통해 소포 성장을 입증하는데 사용될 수 있다.
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Protocol
1. 엘라스틴과 같은 폴리펩티드의 발현
- 1일차: 펩타이드 발현을 위한 스타터 배양 및 소모품 준비
- LB 배지의 발현 배양 플라스크(4 x 2.5 L) 및 3L을 준비하고 오토클레이브 배양한다. LB 배지 1L의 경우, 25 g의 LB 파우더를 초순수 1L에 넣으세요.
- LB 배지 100 mL, 멸균 여과(0.22 μm 필터) 클로람페니콜 용액(EtOH의 25 mg/mL), 50 μL의 멸균 여과(0.22 μm 필터) 카베니실린 용액(50% EtOH 및 50% EtOH 및 50% 울트라 워터)으로 스타터 배양을 준비합니다.
- 폴리펩티드 서열 MGHGVP(GEGVP)를 인코딩하는 pET20b(+) 발현 벡터를 사용하여 대장균 균주 BL21(DE3)을 포함하는 미리만들어진 세균 성 스톡으로부터 작은 줄무늬를 추가((GFGVP) 4(GVGVP))3 (GFGVP)4GWP(EF로 축약)를 미리 온난100 mL 스타터 배양하고 37°C에서 16시간 동안 배양하고 250 rpm을 흔들림 인큐베이터에서 배양한다(E.coli 균주 및 벡터는 요청시 사용할 수 있다).
- 발현 배양 플라스크 및 LB 배지를 밤새 37°C에서 예온하여 다음날 준비되도록 한다.
- 2일차: 단백질 발현
- 각 발현 배양 플라스크에 750 mL의 LB 배지를 추가하고, 375 μL의 멸균 여과 (0.22 μm 필터) 클로람페니콜 스톡 (EtOH의 25 mg / mL), 375 멸균 여과 (0.22 μm 필터) 카베니실린 스톡 (50% Etoh 및 50% Etoh 의 100 mg/mL)을 추가합니다.
- 항생제를 분배하기 위해 교반 후, 600 nm(OD600)에서광학 밀도 측정을 위한 기준 샘플로서 2 mL의 매체를 취한다.
- 시작 배양의 7.5 mL을 플라스크 발현에 넣고 250 rpm으로 37°C에서 1시간 동안 배양한다.
- 이 단계 후 각 플라스크의 OD600은 20분마다 확인될 것이다.
- 광학 밀도가 약 0.8°C에 도달하면 온도를 16°C로 낮추고 각 발현 플라스크에 초순수에 1M 멸균 여과된 β-이소프로필 티오갈락토시드(IPTG)의 750 μL을 첨가하여 펩타이드 발현을 유도한다.
- 16°C에서 유도된 박테리아를 250 rpm으로 16시간 동안 배양하였다.
- 3 일 : 발현 폴리 펩타이드의 추출
- 수확 후 세포 펠릿의 질량을 측정할 수 있도록 원심분리 플라스크를 미리 칭량합니다.
- 4,000 x g 및 4°C에서 미리 냉각된 원심분리기를 사용하여 20분 동안 원심분리에 의해 발포로부터 모든 박테리아를 수확한다.
- 상급물을 붓고 멸균 된 종이 타월에 원심 분리기 병을 얼룩.
- 원심 분리 플라스크의 무게를 측정하고 셀 펠릿 질량을 계산합니다.
- 원래 세포 배양 750 mL에서 펠렛된 세포를 파이펫팅에 의해 인산완충 식염수(PBS, pH 7.4)의 15mL에서 다시 중단하고, 4°C에서 20분 동안 4,000 x g에서 원심분리기를 한다. 상급물을 붓고 멸균 된 종이 타월에 원심 분리기 병을 얼룩.
- 리소자임(1 mg/mL), 1 mMMMMMm페닐설포닐 불소(PMSF), 1 mMM벤자미드, 및 0.5 U 의 DNase I를 사용하여 PBS(pH 7.4)를 사용하여 세포 펠릿 1그램당 2 mL의 완충액으로 용해 단계에 대한 세포 펠릿을 다시 중단시켰다.
- 10s 초음파 처리 및 20 초 일시 정지 단계를 번갈아 9 W에서 9 W에서 초음파 처리하여 얼음에 추가 용해하기 위해 세포를 초음파 처리한 다음 9 분 동안 샘플을 얼음에서 냉각시켜야합니다. 9분 초음파 처리 단계를 한 번 더 반복합니다.
- 핵산 침전을 위해 원래 세포 배양 1L당 10%(w/v) 폴리에틸렌네이민(PEI)의 2 mL을 추가합니다.
- 샘플을 2 mL 원심분리기 튜브에 분배하고 60°C에서 10분 동안 배양한 다음 4°C에서 10분 동안 배양하였다.
- 용액을 4°C에서 10분 동안 16,000 x g에서 원심분리하고 ELP를 함유하는 상위를 수집한다.
- 역온도 사이클링을 통한 단백질 정제:
- 상급을 2의 pH로 조정하여 펩티드의 친수성 부분을 소수성으로 전환하고 응집을 유도한다. pH를 조절하기 위해 인산과 수산화나트륨이 사용됩니다. pH 스트라이프는 pH 레벨을 결정하기에 충분합니다.
- 샘플을 정화하는 수율을 높이기 위해 샘플을 60°C로 가열하고 염화나트륨을 최대 2M까지 첨가합니다.
- 그 후, 실온(RT)에서 10분 동안 16,000 x g의 시료를 원심분리한다.
- 상급체를 버리고 펠릿을 PBS에서 다시 용해시다(하지만 초기 부피의 절반만 이전 단계에 비해 사용됨).
- 인산및수산화나트륨으로 pH를 7로 조절한다. pH 스트라이프는 pH를 결정하기에 충분히 정확합니다.
- 샘플을 4°C에서 10분 동안 16,000 x g에서 이어서 원심분리한다.
- 상급 을 수집하고 단계 1.4.4의 마지막 반복에서 제외, 총 3 배까지 1.4.1- 1.4.6 반복 단계, 단지 물 대신 PBS가 추가됩니다.
- 흡수 분광계로 펩타이드의 농도를 측정합니다. 280 nm에서 5500/M/cm의 소멸 계수를 사용합니다.
- ELP의 농도를 700 μM으로 조정합니다.
2. 유리 구슬 방법을 사용하여 소포 생산
- 원심 진공 농축기를 사용하여 ELP 용액을 1.1 mM에 농축하십시오.
- 농축 ELP 용액의 200 μL을 2:1 클로로폼/메탄올 혼합물 1,250 μL과 혼합한 다음 와류를 혼합합니다.
- 구형 유리 구슬 1.5g(크기 212-300 μm)을 10mL 둥근 바닥 플라스크에 추가합니다.
- ELP와 클로로폼/메탄올 혼합물을 함유한 용액을 둥근 바닥 플라스크에 넣고 부드럽게 흔들어 섞습니다.
- 플라스크를 회전 식 증발기에 연결합니다. 속도를 150rpm으로 조정하고 액체가 실온에서 증발할 때까지 약 4분 동안 압력을 -0.2 x 105 Pa(-200 mbar)로 조절합니다.
- 잔류 클로로포름과 메탄올이 증발되도록 하기 위해 둥근 바닥 플라스크를 적어도 1시간 동안 건조기에 놓습니다. 유리 구슬의 손실을 방지하기 위해 느슨하게 부착 된 알루미늄 호일은 둥근 바닥 플라스크 개구부 주위에 싸여야합니다.
- 단일 실험의 경우, 100 mg의 펩티드 덮은 유리 비드를 PBS와 같은 팽윤용액의 60 μL과 혼합한다. 이 샘플을 25°C에서 5분 동안 배양합니다.
- 유리 구슬을 퇴적시키기 위해 탁상 원심분리기로 신속하게 샘플을 원심분리합니다.
- 피펫을 사용하여 소포가 들어있는 상급체를 수집합니다.
3. VESICLES 안쪽에 RNA Aptamer dBroccoli의 전사
- RNase 오염 제거 솔루션이 포함된 물티슈로 실험실 벤치를 청소하여 RNase가 없는 작업 환경을 조성합니다.
- T7 프로모터 및 드브로콜리 서열을 포함하는 ssDNA(5 μM)를 혼합(GAGACGGTGTCTGTGTGTTTTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTGGGAGAGGGGGGGGGGGGGGGCCC) 뿐만 아니라, 핵이 없는 물 보충제에서 비코딩 가닥(5 μM)을 혼합한다. RNAPol 반응 완충제 [40 mM Tris-HCl (pH=7.9), 6 mM MgCl2,1 mM 디티오트레이톨(DTT), 및 2 mM 스페르미딘], 전사 반응을 위한 DNA 템플릿을 준비한다.
- 용액을 90°C에서 5분 동안 배양한 다음 30분 동안 20°C로 느린 온도를 감소시입니다.
- DMSO의 5 mL에서 DFHBI 1.26 mg을 용해시킴으로써 1 mM (5Z)-5-(3,5-디플루오로-4-하이드록시벤지리덴)-2,3-디메틸-3,5-디하이드로-4H-이미다졸-4-1(DFHBI) 용액을 준비한다.
- RNAPol 반응 완충액 [40 mM Tris-HCl [pH = 7.9), 6 mM MgCl2,1 mM 디티오트레이톨 (DTT), 및 2 mM MM 스페르미딘]을 125 mM KCl으로 혼합하여 전사 반응을 준비, 15 mM MgCl2,4 mM rNTP, 10 μM DFHBI, 200 nM DNA 템플릿, 0.5 U/μL RNase 억제제 뮤린, 및 물.
- 반응이 시작되기 직전에 4 U/μL T7 폴리머라제를 첨가하십시오.
- 이 반응 혼합물을 단계 2.7에서 팽윤 용액으로서 사용하고 실험 기간 동안 37°C에서 배양하며, 이는 전형적으로 1시간이다.
4. 전사 번역 (TX-TL) 반응
참고: 전사-번역 반응을 위해, 조세포 추출물은 반응 완충제 및 DNA뿐만 아니라 요구된다. 상기 조세포 추출물은 Sun et al.18에기재된 바와 같이 제조된다. TX-TL 반응의 경우, 원유 대장균 추출물의 33%(v/v), 반응 완충액 42%(v/v), 페놀-클로로포름 정제 DNA 플러스 첨가제를 사용하십시오. 최종 농도는 약 9 mg/mL 단백질, 50 mM HEPES (pH = 8), 1.5 mM ATP, 1.5 mM GTP, 0.9 mM CTP, 0.9 mM UTP, 0.2 mg/mL tRNA, 26 mM 코엔자임 A, 0.33 mM NAD, 0.75 mM CAMP, 68 mmmm, miacid 1mm , 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2 % PEG-8000, 13.3 mM 말토오스, T7 RNA 폴리머 라제의 1 U, 및 초순수에서 50 nM 플라스미드 DNA.
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DNA 템플릿의 페놀 클로로포름 정제
- LB 배지 5mL와 멸균 여과(0.22 μm 필터) 카르베니실린 용액(50% EtOH 50% EtOH 및 50% 초순수 100 mg/mL)으로 6개의 야간 배양을 준비합니다.
- PET20b(+) 발현 벡터를 함유하는 미리 만들어진 세균 스톡으로부터 작은 줄무늬를 각각 미리 데운 5 mL 하룻밤 배양하고 37°C에서 250 rpm으로 배양한다. 어떤 펩티드(EF) 또는 단백질(YPet 또는 mVenus)이 발현되는지에 따라, 특정 인코딩 플라스미드가 사용된다.
- 사용자 매뉴얼에 기재된 바와 같이 미니 준비 키트로 플라스미드를 추출하거나 장 외24에의해 제공되는 프로토콜을 따로 따로 따로.
- 미리 정제된 플라스미드 DNA(농도는 200-600 ng/μL 범위)의 100 μL을 준비하고 100 μL의 로티 페놀/클로로폼/이소아밀 알코올(pH = 7.5-8.0)을 미세원심지 튜브에 혼합하여 더 나은 상 분리를 가능하게 합니다.
- 튜브를 최대 6배까지 부드럽게 반전시키고 RT에서 16,000 x g에서 5분 동안 원심분리기를 부드럽게 뒤집습니다.
- 튜브의 상부에 클로로폼 200 μL을 추가하고 튜브를 최대 6배까지 반전시다.
- RT에서 5분 동안 16,000 x g의 샘플을 원심분리합니다.
- 상급체를 별도의 튜브에 피펫하고 에탄올 침전을 위해 아세테이트 나트륨 3M의 10 μL을 첨가한다.
- -80°C의 1 mL을 추가하고 샘플을 -80°C에서 1시간 동안 저장합니다.
- 4 °C에서 15 분 동안 16,000 x g에서 샘플을 원심 분리합니다.
- 상온액을 데내디하고 -20°C 의 1 mL을 차가운 70% (v/v) 에탄올을 첨가한다.
- 4 °C에서 5 분 동안 16,000 x g의 원심 분리기.
- 파이펫팅하여 액체를 제거합니다. DNA 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.
- 샘플을 RT에 약 15분 동안 저장하여 나머지 에탄올을 증발시다.
- 샘플에 초순수를 추가하여 시료 농도를 약 300 nM으로 조정하고, 260 nm에서 흡수로 측정합니다.
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TX-TL 반응의 준비
- 얼음상에서 제조된 조세포 추출물 및 반응 완충액을 해동한다.
- 60 μL 반응 믹스의 경우, 플라스미드 DNA(페놀-클로로포름 정제)를 반응 완충액의 37.5 μL에 첨가 [50 mM HEPES (pH = 8), 1.5 mM ATP, 1.5 mM GTP, 0.9 mM CTP, 0.9 mM UTP, 0.2 mg/mL tRNA, 26 mm, 36 mM , 0.75 mM cAMP, 68 mM 엽산, 1 mM 스페르미딘, 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000 및 13.3 mM 말토오스, 28.7 μL의 원유 세포 추출물을 첨가하였다. 58.8 μL의 초순수로 최종 부피를 채웁니다.
- 반응이 시작되기 직전에 T7 RNA 폴리머라제 용액의 1.2 μL을 추가하고 위아래로 파이펫팅하여 샘플을 혼합합니다.
- 이 반응 혼합물을 단계 2.7에서 팽윤 용액으로 사용하고 실험 기간 동안 29°C에서 배양하며, 이는 전형적으로 4-8시간이다.
5. 구리 촉매 아지드 알키네 후이스겐 사이클로추가를 통해 플루오로포레스와 엘라스틴 같은 폴리펩티드의 융합
- DMSO에서 20 mM NHS-아지드 링커(γ-아지도부티르산 N-하이드록시수치니미드 에스테르) 용액을 준비한다.
- ELP 용액(600 μM)을 PBS(8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 1.42 g/L Na2HPO4,0.27 g/L K2 HPO4,pH = 7.2)와 NHS-아지드(1.2 mM)와 혼합하고 RT에서 12시간 동안 인큐베이팅합니다.
- 샘플을 10 kDa 투석 카세트에 적재하고 12 시간 동안 12 시간 동안 12 시간 동안 초순수에 저장하여 소금과 잔류 NHS-azide를 제거합니다.
- 활성화된 ELP(500 μM)를 알키네-컨쥬게이드 염료(500 μM), Cy5-알키네 또는 Cy3-알키네와 혼합한다.
- 이 샘플을 1 mM TBTA (트리스 (벤실트리아졸메틸)아민), 10 mM TCEP (트리스 (2-카박스체틸)-포스핀 염산염)과 10 mM CuSO 4와 12 시간 동안 4 °C에서 배양하십시오.
- 샘플을 10 kDa 투석 카세트에 적재하고 초순수 1 L에서 12 시간 동안 4 °C에서 저장하여 염염 및 잔류 알키네 컨쥬게이드 염료를 제거합니다.
- 이들 염료 변형 ELPs는 2부에서 펩티드와 유사한 Cy3 표지 된 ELPs 및 Cy5 표지 된 ELPs의 1:1 혼합물에서 사용된다.
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Representative Results
소포 생산
도 1은 상이한 부종 용액 및 유리 비드 방법으로 제조된 소포의 투과 전자 현미경(TEM) 영상을 나타낸다(또한 Vogele et al.11참조). 도 1A의샘플에 대해, 소포의 형성을 증명하고 그들의 크기를 결정하기 위해 부종 용액으로 만 PBS를 사용했다. TX-TL이 팽윤용액(도1B)으로사용되었을 때, 소포도 형성되었다. 동적 광 산란(DLS) 측정은 유리 비드 방법이 소포 형성에 영향을 미친다는 것을 보여주기 위해 수행되었다. 도 2는 PBS(파랑)에서 유리 비드 없이 제조된 EF 샘플의 측정된 강도 자기상관 곡선과 팽윤용액으로서 PBS를 이용한 유리 비드 법으로 제조된 EF 샘플을 도시한다( 적색). 크기는 적당한적합도(25)로부터 계산되었고, 유리 비드 법없이 소포를 제조했을 때 25%의 다분산성을 가진 134 nm의 직경을 초래하였다. 유리 구슬을 사용했을 때, 적당함은 21%의 다분산성을 가진 168 nm의 직경을 초래하였다.
베시큘로 전사 11세
도 3은 EF 소포(green) 내부의 dBroccoli 압타머의 전사에 대해 시간이 지남에 따라 형광 강도 프로파일을 나타낸다. 음성 대조군으로서, DNase I는 부종 용액에 첨가되었고, 따라서 소포 형성(blue) 동안에도 통합되었다. 측정은 480 nm에서 여기와 520 nm에서 방출형 플레이트 리더에서 수행되었다.
베시큘로 단백질 발현 11세
도 4는 형광 플레이트 리더를 사용하여 ELP 소포 내부에 발현된 2개의 형광 단백질의 형광 강도를 나타낸다. 여기는 520 nm에서 500 nm 및 방출을 수행했다. mVenus(도 4A)의전사-번역은 ELP 소포에서 단백질의 발현 역학 및 발현 수준을 조사하기 위해 수행되었다. 소포 형성 후 소포 및 외부 용액의 내용이 동일하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서, 소포 외부의 단백질 발현을 억제하기 위해, 항생제 카나마이신을 외부 용액에 첨가하였다. 대조군으로서, 카나마이신은 또한 부종 용액에 첨가되었고, 이 경우 소포 내부의 단백질 발현이 억제되었다. 이것은 더 작은 분자 카나마이신이 소포 안쪽에 머무르고 막이 이 실험의 시간 규모에 걸쳐 이 분자를 투과하지 않다는 것을 건의한다는 것을 추가로 나타냅니다. 카나마이신이 막을 통해 확산되면, mVenus 발현이 억제되지 않았을 것이고 5 시간에서 형광이 더 높을 것이다. 제2 실험에서, YPet(도4B)의 발현을 수행하였다. 두 단백질 은 GFP보다 더 빠른 성숙 시간을 나타내기 때문에 선택되었습니다. 더욱이, T7 프로모터는 유도성 및 연속발현이 모두 가능하다는 것을 보여주기 위해 YPet 전사에 사용되는 mVenus 전사 및 구성 프로모터를 사용하였다.
FRET 분석 11세
도 5A는 ELP가 멤브레인 내로 혼입된 것을 입증하기 위해 수행된 FRET 분석의 결과를 나타낸다. 따라서, 소포는 2개의 동등하게 농축된 플루오로포어-펩티드 구조의 혼합물을 사용하여 제조되었다. 이들은 Cy3-EF (기증자) 및 Cy5-EF (수락자)이었다. 시간 t = 0에서, 시작 FRET 레벨을 측정했다. 공여기와 FRET 신호의 신호는 막내의 염료 사이의 평균 거리에 의존한다. 막 ELPs의 발현시, 추가 펩티드는 멤브레인에 통합되어, FRET 쌍 사이의 평균 거리를 증가시킨다. 후자는 공여체 형광의 증가 및 시간 t=2.5 h. 도 5B에서의 FRET 신호의 감소를 통해 측정되었다. 여기서, 카나마이신은 소포 형성 전에 팽윤용액에 첨가되었다. 카나마이신은 단백질 발현을 억제한다; 따라서 FRET의 변화가 보이지 않았습니다. 이 분석에서는 EF 통합만 표시됩니다.
그림 1: 대표 TEM 이미지. (A) 붓기 용액 PBS에서 형성된 EF 소포. (B) 팽윤액 TX-TL에 형성된 EF 소포. 배율 막대 = 200 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 대표 DLS 데이터. DLS로 측정된 강도 자기상관 곡선입니다. 청색 곡선은 유리 비드 공법 없이 제조된 PBS에서 EF 펩티드를 나타낸다. 적색 곡선은 유리 비드 방법 및 PBS를 팽윤 용액으로 생산된 EF 용액을 묘사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: dBroccoli 전사. EF 소포 내부의 dBroccoli 압타머의 전사의 대표적인 데이터. 녹색 곡선은 형광 신호와 파란색 곡선을 캡슐화 된 DNase I. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 펩티드 소포 내부의 단백질 발현. (a) 플라스미드 인코딩 mVenus 및 TX-TL 발현 믹스를 ELP 소포에 캡슐화하였다. 약 5 시간 후, 형광이 포화. 항생제 카나마이신을 캡슐화했을 때 형광이 관찰되지 않았습니다. (B) YPet 플라스미드의 캡슐화 시 유사한 결과를 얻었다. 오류 막대는 15분 동안 표시된 시간에 측정된 값의 표준 편차를 나타냅니다.
그림 5: FRET 분석. (a) 공여체 방출 및 FRET 신호(수락자 방출)에 대해 시간 t = 0에서 형광 레벨을 시작한다. t =2.5h에서, 공여체는 증가된 방출을 보였고, FRET 신호는 감소하였다. (b) 소포 내부에 친수성 ELP만 발현되었을 때, FRET 신호 및 공여방출은 일정하게 유지되었다. 오류 막대는 15분 동안 표시된 시간에 측정된 값의 표준 편차를 나타냅니다.
추가 파일: 모든 플라스미드 서열resp. 유전자 서열을 함유하고 있다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
필름 재수화는 작은 unilamellar 소포의 생성을위한 일반적인 절차입니다. 고장의 주요 원인은 절차에 사용되는 재료의 잘못된 취급입니다.
처음에, ELPs는 대장균 세포에 의해 생성됩니다. ELP 정제 후 의제는 중요한 단계에서 프로토콜이 얼마나 신중하게 수행되는지에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 이들은 강수 후 반온도 사이클링(ITC) 단계와 ElP의 재서스펜션이다. 정화를 위해, 우리는 산화성으로 pH를 변경하고 친수성 블록에 있는 글루탐산 측사슬의 protonation에 이끌어 내는 인산의 추가를 통해 펩티드의 소수성 붕괴를 시작했습니다. 이 단계 후, 두 블록은 RT에서 소수성이다. 이온 강도를 일정하게 유지하기 위해 용액에 이미 소금이 있는 산을 사용하는 것이 바람직하지만 염산과 같은 다른 산도 사용할 수 있습니다. ELP 생산의 수율을 높이기 위해 소금이 전이 온도 T t를 감소시키고 ELP를 더 소수화하게 하기 때문에 응집 공정을 향상시키기 위해 추가 염을 첨가할 수 있습니다. 일반적으로 염화나트륨이 사용되지만 황산나트륨과 같은 코스모트로픽 염은 훨씬 더 나은 반면 염 농도는 용액 한계에 가까울 수 있습니다. 수조를 사용하여 추가 가열은 더 수율을 증가시킬 수있다.
또 다른 중요한 단계는 ELP 펠릿의 재배포입니다. 최대 ELP 용해도를 위해 용액을 미리 냉각해야 하며 빠른 pH 조정은 펠릿을 더 빨리 용해시키는 데 도움이 될 수 있습니다. pH는 이 프로세스 도중 여러 번 재조정될 필요가 있습니다. 추가 개선을 위해, 샘플은 4 °C에서 냉장고에 저장될 수 있고 견본의 동요는 피해야 한다. 염을 교환하기 위해, 정제 프로토콜의 끝에서 기재된 투석 단계가 바람직해야 한다. 원칙적으로, ITC는 펩티드를 염 함유 상층부로부터 분리하는데 사용될 수 있다. 그러나 이전 소금 농도에 따라 잔류 염은 여전히이 펠릿에서 찾을 수 있습니다. 더욱이, 투석은 앞서 언급한 바와 같이 손실 없이 실험에 필요한 펩티드를 농축하는데 사용될 수 있다.
다음 중요한 단계는 클로로포름/메탄올 혼합물의 증발입니다. 감소된 압력에서 증발하는 동안 끓는 지연은 스플래터 또는 난류를 유발하여 유리 구슬이 크게 손실될 수 있습니다. 이것은 필터 또는 조직을 사용하여 방지할 수 있습니다. 건조기를 사용할 때도 동일한 문제가 발생하지만, 둥근 바닥 플라스크의 개구부에서 알루미늄 호일을 사용하여 이를 방지할 수 있다. ELP 코팅 유리 구슬의 처리를 위해, 또한 손실을 줄이고 절차를 단순화 일회용 정전기 방지 마이크로 주걱을 사용하는 것이 좋습니다.
PBS 및 전사 혼합과 같은 다양한 팽윤 용액을 사용하여 소포의 팽윤은 간단하고 적은 오류가 발생하기 쉽습니다. 그러나 TX-TL 시스템의 경우 최대 10%의 일괄 처리에서 배치까지의 변형이 발생할 수 있습니다. 이 문제를 최소화하기 위해 모든 실험은 최대 3,000개의 반응에 사용할 수 있는 무세포 추출물 한 배치로만 수행되어야 합니다. 재수화 후, 소포 함량 및 외부 용액은 팽윤 용액입니다. 외부 용액의 정제는 소포 내부와 외부 사이의 삼투압 차이를 변경할 수 있기 때문에 수행되어서는 안됩니다. 그 결과 제어되지 않는 크기 변경또는 소포파열이 발생합니다. 따라서 외부에서 가능한 반응은 억제되어야합니다. 반응에 따라, 이것은 예를 들어, 현재 DNA를 소화하기 위해 DNase I을 추가하거나 번역을 억제하는 카나마이신과 같은 항생제를 첨가하여 수행 될 수 있습니다.
유리 비드로부터의 필름 재수화는 다른 제제 방법에 비해 몇 가지 장점이 있다. 용매 주입과 는 달리, 초기 용매가 완전히 증발하고 펩티드가 수성 용액에서 재수화되기 때문에 용매의 에멀젼 상 전달 또는 미세 유체학적 변위가 필요하지 않습니다. 따라서, 유리 비드 방법은 다른 방법에 사용되는 잔류 유기 용매에 의해 크게 영향을 받거나 심지어 파괴 될 수있는 TX-TL과 같은 민감한 샘플에 특히 적합합니다. 또한 프로토콜은 간단하고 오류가 적으며 쉽게 확장할 수 있습니다. 큰 표면 대 체적 비 때문에 소량의 유리 비드만 필요하며 높은 처리량으로 높은 수준의 병렬화를 허용합니다.
그것의 주요 단점으로, 유리 구슬 방법은 형광 현미경 검사법을 통해 관찰 될 수없는 작은 unilamellar 소포의 생성에만 유용합니다. 기재된 방법은 단일 소포의 역학에 대한 현미경 관찰이 필요할 때 다소 제한적이며, 이는 때때로 필요하다(예를 들어, 잠재적소포 분열 과정을 관찰할 때). 더욱이, SUV의 작은 크기는 펩티드 인코딩 플라스미드와 같은 저농축 성분의 캡슐화를 제한하며, 이는 펩타이드의 상대적으로 낮은 발현을 설명한다. 기본 캡슐화 과정은 푸아송 공정이므로 특정 성분의 농도는 95%의 캡슐화 확률을 보장하기 위해 150 nM 이상이어야 합니다. 따라서 이러한 실험에서 소포 크기의 큰 증가를 관찰 할 수 있다는 것은 매우 놀라운 일입니다.
여기에 제시된 프로토콜은 연구원이 엘라스틴 같이 폴리펩티드에서 펩티드 기지를 둔 소포를 만드는 가능하게 할 것입니다. 그것은 또한 펩 티 드 막에 의해 캡슐화 된 인공 세포 같은 구조를 생산 하는 기회를 열어, 지방산 또는 인지질에서 만든 고전적인 구획에 매력적인 대안을 나타내는. 펩타이드는 세포가 없는 환경(예를 들어, 여기에 사용되는 TX-TL 시스템에서)에서 쉽게 발현될 수 있다는 점에서 유리하며, 이는 소포 내부의 전사-번역 과정에 직접 막 성장을 결합할 수 있게 한다. 또한, ELP는 사용되는 차단 해제의 윤곽 길이, 소수성/ 친수성, pH 또는 이온 강도와 같은 자극에 대한 민감도와 같은 특정 물리 화학 적 매개 변수로 설계 및 조정할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 DFG TRR 235 (생명의 출현, 프로젝트 P15), 유럽 연구 위원회 (보조금 협정 번호 694410 AEDNA), 그리고 TUM 국제 과학 공학 IGSSE 대학원 (프로젝트 번호 9.05)을 통해 재정적 지원을 감사하게 인정합니다. . 샘플 준비에 도움을 주신 E. 팔겐하우어에게 감사드립니다. 우리는 TX-TL 시스템과 유용한 토론에 대한 도움에 대한 A. 듀핀과 M. 슈바르츠 쉴링에게 감사드립니다. 우리는 유용한 토론에 대한 N. B. 네덜란드 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
| 3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| 5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
| alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
| alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
| BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
| Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
| Chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
| DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
| LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| Methanol | Carl Roth | 82.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
| PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
| pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
| Phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| Polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
| Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
| Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
| RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
| RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
| rNTP | NEB | N0466S | |
| Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
| RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
| T7 polymerase | NEB | M0251S | |
| TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Tris base | Fischer | BP1521 | |
| tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 |
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