Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

إعداد عينة البلازما لقياس الطيف الكتلي باستخدام محطة عمل آلية

Published: April 24, 2020 doi: 10.3791/59842
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 1
1Advanced Clinical Biosystems Institute, Smidt Heart institute, Cedars Sinai Medical Center, 2Beckman Coulter Life Sciences

Summary

هنا، نقدم طريقة هضم بروتين البلازما الآلية للتحليل البروتيني الكمي القائم على الطيف الكتلي. في هذا البروتوكول ، يتم تبسيط خطوات نقل السوائل واحتضانها لتخميد البروتين ، والحد منه ، والألكيل ، وردود فعل الهضم التربسين والآلي. يستغرق ما يقرب من خمس ساعات لإعداد لوحة 96 جيدا مع الدقة المطلوبة.

Abstract

إعداد عينة لتحليل الطيف الكتلي في البروتيوميات يتطلب انشقاق الأنزيمية من البروتينات في خليط الببتيد. تتضمن هذه العملية العديد من خطوات الحضانة ونقل السائل من أجل تحقيق التسخ ، والحد ، والألكيل ، والانقسام. ويمكن لتكييف سير العمل هذا على محطة عمل آلية أن يزيد من الكفاءة ويقلل من معاملات التباين، مما يوفر بيانات أكثر موثوقية للمقارنات الإحصائية بين أنواع العينات. وصفنا سابقا نموذج proteomic الآلي إعداد سير العمل1. هنا، نبلغ عن تطوير سير عمل أكثر كفاءة وأفضل تحكمًا مع المزايا التالية: 1) يتم تقليل عدد خطوات نقل السوائل من تسع إلى ست خطوات عن طريق الجمع بين الكواشف؛ 1) يتم تقليل عدد خطوات نقل السوائل من تسع إلى ست خطوات من خلال الجمع بين الكواشف. 2) يتم تقليل الوقت Pipetting عن طريق الأنابيب تلميح انتقائي باستخدام رئيس pipetting 96 موقف مع قنوات متعددة؛ 3) يتم زيادة الإنتاجية المحتملة من خلال توافر ما يصل إلى 45 موقف سطح السفينة؛ 4) العلبة الكاملة للنظام يوفر درجة حرارة محسنة ومراقبة البيئة ويقلل من احتمال تلوث العينات أو الكواشف؛ و 5) إضافة النظائر المستقرة المسمى الببتيدات، فضلا عن بروتين α-galactosidase، إلى كل عينة يجعل الرصد ومراقبة الجودة ممكن طوال العملية بأكملها. توفر هذه التحسينات في الأجهزة والعمليات قابلية جيدة للاستنساخ وتحسين دقة القابلية داخل الإحصاءات والدقة بين الإحصاءات (السيرة الذاتية أقل من 20٪) لبروتين LC-MS القائم والكمي الببتيد. يمكن إكمال سير العمل بأكمله لهضم 96 عينة في لوحة 96 بئرفي غضون 5 ساعات تقريبًا.

Introduction

يتم تطبيق قياس الطيف الكتلي (MS) القائم على البروتين وقياس الببتيد بشكل متزايد كأداة تحليلية بيولوجية لتحليل البلازما في الأبحاث الأساسية والمختبرات السريرية2,3. وقد تقدمت الأجهزة والمعلوماتية المطلوبة بسرعة كما أصبحت MS الطريقة المفضلة لقياس البروتينات أو البروتينات المعدلة عن طريق استهداف تسلسل الببتيد محددة نظرا لقدرته على قياس مئات الببتيدات في تشغيل MS واحد4. إعداد العينة بمثابة الأساس لأي تحليل البروتيني. قبل تحليل التصلب المتعدد ، عادة ما يتم تشويه البروتينات في العينة البيولوجية ، وتقليلها ، وتحليلها ، وهضمها في الببتيدات التربكية ، وإزالة الملح5. الألكيلية كتل السيستين لمنع التعديلات غير المنضبطة وضمان جميع السيستينات لديها نفس الكتلة. بعد ذلك ، يتم إضافة التربسين إلى بروتينات الهضم في الببتيدات. كل من هذه الخطوات يتطلب التحسين ، ويتم تنفيذ العملية بأكملها بشكل تقليدي يدويًا ، مما يسمح بإدخال أخطاء تحليلية.

يتكون خط أنابيب تطوير المؤشرات الحيوية التقليدي من عمليتين رئيسيتين: البروتيوميك البنادق لاكتشاف البروتين العالمي لإنشاء مخزون البروتين المتعمق6 والبروتيوميات المستهدفة للتحقق والتحقق من صحة تهدف إلى كمية البروتين عالية الدقة والإنتاجيةالعالية 7. بغض النظر عن نهج التصلب المتعدد، إعداد العينة هو نفسه ويتركز على الانقسام الأنزيمي من البروتينات في خليط الببتيد. كما اقترح من قبل فان إيك وSobhani8، وجود طريقة تسمح لتحليل دقيق ودقيق واستنساخي لكل من الاكتشاف والمقالات المستهدفة هو المطلوب لنقل المؤشرات الحيوية الاكتشاف على نحو فعال إلى المقالات المنفذة السريرية. للقيام بذلك ، فإن أتمتة إعداد العينة تكون مفيدة وتوفر القدرة على زيادة الكفاءة للتحليل عالي الإنتاجية. الأساليب اليدوية عادة إدخال الأخطاء التحليلية وراء الحدود المقبولة المحددة من قبل إدارة الغذاء والدواء (FDA) في مراجعة إرشادات التحقق من صحة الطريقة التحليل الحيوي، والتي تشمل المؤشرات الحيوية والتشخيص2،9. سيكون من الضروري تطوير سير عمل إعداد عينات بروتين MS سريع ودقيق للغاية وحر اليدين لتسهيل أبحاث العلامات الحيوية ، والتي تتطلب إعداد وتحليل الآلاف من العينات البيولوجية. لدى إعداد عينة MS العديد من الخطوات حيث يمكن إدخال الأخطاء، والعملية مملة وتستغرق وقتًا طويلاً.

في طريقتنا المحسنة ، تم برمجة محطة عمل آلية لتنفيذ جميع إجراءات إعداد عينات البلازما اللازمة في ما مجموعه 6 خطوات(الشكل 1)لضمان: 1) عمليات نقل دقيقة للسوائل؛ 2) يتم بدء رد الفعل وتوقف في وقت ثابت؛ 3) يتم تنفيذ رد الفعل في درجة حرارة تسيطر عليها (أي حاضنة)؛ و4) رد فعل لديه خلط موحد لجميع ردود الفعل. كما قمنا بتنفيذ إضافة بروتينات مراقبة الجودة الخارجية والمعايير الداخلية (معايير الببتيد المستقرة المسماة النظائر) لضمان جودة وإنتاجية قابلة للتكرار من البروتين القائم على LC-MS وقياس كمي الببتيد في شكل 96 بئرًا. وسيلزم، بما في ذلك إعداد الكاشف، وساعات العمل، وما مجموعه 000 000 1 خطوة من خطوات الأنابيب لمعالجة 96 عينة في أنابيب فردية. تقلل الأتمتة من الوقت العملي وعدد التفاعلات البشرية المعنية.

Protocol

1. برمجة لمعالج السائل الآلي

  1. إنشاء طريقة جديدة من قائمة الملفات(ملف | طريقة جديدة)
    ملاحظة: إكمال الخطوات بالترتيب المعطى. يشير الخط المائل إلى نص للكتابة في برنامج Biomek. يرجى الاتصال بالمؤلفين للحصول على معلومات حول تقنيات وقوالب الأنابيب.
  2. اكتب متغيرات خطوة البدء وقيمها في خطوة البدء كما هو مدرج في الجدول 1.
  3. تعيين أعمدة للتوجيه تلميح انتقائي. للخطوات 1.3-1.7، انقر فوق الخطوة تعيين عمومية في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب.
    1. باستخدام الخطوة تعيين عمومية، تعيين القيمة = العمود الأول إلى FirstColumn_Globalالمتغير، القيمة = LastColumn إلى متغير LastColumn_Global،القيمة =LastColumn-FirstColumn+1 إلى أعمدةمتغيرة، والقيمة = الأعمدة*8 إلى الآبار المتغيرة.
    2. حدد خطوة البرنامج النصي في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب. اكتب البرنامج النصي VB كما هو مبين في الشكل 2.
  4. تعيين وحدات التخزين للخلطات تعيين العمومية والحلول.
    1. باستخدام الخطوة تعيين عمومية، قم بتعيين القيم المقابلة لمتغيرات مزيج وحدة التخزين كما هو موضح في الجدول 2.
    2. انقر فوق الخطوة إذا في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب. في ظل الظروف، اكتب Autosampler.
    3. ضمن ثم، انقر فوق الخطوة تعيين عمومية في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبها إلى الأسلوب.
    4. باستخدام الخطوة تعيين العمومية، تعيين القيمة =(MobilePhase*أعمدة))+10 إلى متغير MobilePhaseWell.
    5. ضمن وإلا، انقر فوق الخطوة تعيين عمومية في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب.
    6. باستخدام الخطوة تعيين العمومية، تعيين قيمة = 0 إلى متغير MobilePhaseWell
  5. تكوين إعداد أدوات اللابوير الموجهة (GLS)
    1. انقر فوق خطوة محرر سطح السفينة في شريط الأدوات تحت المرافق. إنشاء سطح السفينة جديدة لتتوافق مع تخطيط سطح السفينة في الشكل 3 وتسميته على سطح السفينة 1.
    2. انقر فوق خطوة الإعداد الموجه في شريط الأدوات ضمن الإعداد والأجهزة واسحبه إلى الأسلوب. سحب وإسقاط أنواع labware في مواقف سطح السفينة كما هو مبين في الجدول 3. بعد ذلك، قم بتعبئة علامات التبويب في الجدول كما هو موضح في الجدول 3 والشكل 4 (إعداد الإعداد الموجه).
  6. إعداد إجراء عد البقشيش
    1. انقر فوق خطوة تحديد الإجراء في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب. إجراء الاسم كـ TipCount.
    2. انقر فوق خطوة البرنامج النصي في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب. اكتب البرنامج النصي VB كما هو مبين في الشكل 5 (البرنامج النصي لحساب تلميح).
    3. انقر فوق الخطوة إذا في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب.
    4. في ظل الشروط، اكتب TL5 = 0.
    5. ضمن ثم، انقر فوق خطوة نقل Labware في شريط الأدوات ضمن خطوات الإعداد والجهاز واسحبه إلى الأسلوب. نقل أدوات المختبرات من TL5 إلى TR3. انقر فوق خطوة نقل Labware في شريط الأدوات، ضمن خطوات الإعداد والجهاز واسحبه إلى الأسلوب. نقل أدوات المختبرات من TL2 إلى TL5. وأخيراً، انقر فوق خطوة نقل Labware في شريط الأدوات ضمن خطوات الإعداد والجهاز واسحبه إلى الأسلوب. نقل أدوات المختبرات من BC90 إلى TL2.
  7. تحديد الإجراء للحاضنة
    1. انقر فوق خطوة تحديد الإجراء في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب. إجراء الاسم كحاضنة.
    2. اكتب في HalfTime كاسم متغير و 1800 كقيمة افتراضية.
    3. اكتب في NextTemp كاسم متغير و 22 كقيمة افتراضية.
    4. اكتب المؤقت كاسم متغير و 60 كقيمة افتراضية.
    5. انقر فوق خطوة اللاوير النقل المحسن ة في شريط الأدوات ضمن خطوات الإعداد والجهاز واسحبه إلى الأسلوب. نقل أدوات اللاب من P11 إلى INHECO1.
    6. انقر فوق خطوة إجراء التشغيل في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب. إجراء الاسم كـ TipCount.
    7. انقر فوق خطوة INHECO الحاضنة في شريط الأدوات ضمن عمليات التكامل واسحبه إلى الأسلوب. اكتب INHECO1 لاستخدام الجهاز في الموضع ، = halfTime للاحتضان ل، = درجة الحرارة لـ °C و 3 لـ °C من درجة الحرارة المستهدفة. حدد اهتزاز في حين احتضان الخيار والمداري (في اتجاه عقارب الساعة)هزة النمط. بالنسبة للإعدادات، اكتب في 1.00 مم من جانب إلى جانب، و6.6 مرات في الثانية، و1.00 مم إلى الأمام إلى الوراء، و6.6 مرات في الثانية.
      ملاحظة: تأكد من تثبيت برنامج حاضنة INHECO.
    8. انقر فوق خطوة INHECO الحاضنة في شريط الأدوات ضمن عمليات التكامل واسحبه إلى الأسلوب. اكتب INHECO1 لاستخدام الجهاز في الموضع ، = halfTime للاحتضان ل، = درجة الحرارة لـ °C و 3 لـ °C من درجة الحرارة المستهدفة. حدد اهتزاز في حين احتضان الخيار والمداري (عكس عقارب الساعة)هزة النمط. للإعدادات، اكتب في 1.00 مم جنبا إلى جنب، 6.6 مرات في الثانية، 1.00 مم إلى الأمام وإلى الوراء في 6.6 مرات في الثانية.
    9. انقر فوق خطوة الإيقاف المؤقت في شريط الأدوات ضمن خطوات الإعداد والجهاز واسحبه إلى الأسلوب. إيقاف النظام بأكمله مؤقتًا لمدة 1 s.
    10. انقر فوق خطوة تحديد الإجراء في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب. إجراء الاسم كحاضنة.
    11. انقر فوق خطوة INHECO الحاضنة في شريط الأدوات ضمن عمليات التكامل واسحبه إلى الأسلوب. اكتب INHECO1 لاستخدام الجهاز في الموضع، 1 للاحتضان لـ، = NextTemp لـ °C و 3 لـ °C من درجة الحرارة المستهدفة.
  8. تحديد الإجراء المداري.
    1. انقر فوق خطوة اللاوير النقل المحسن ة في شريط الأدوات ضمن خطوات الإعداد والجهاز واسحبه إلى الأسلوب. نقل أدوات المختبرات من P11 إلى Orbital1.
    2. انقر فوق خطوة إجراء التشغيل في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب. حدد عدد تلميح الإجراء.
    3. انقر فوق خطوة إجراء الجهاز في شريط الأدوات ضمن خطوات الإعداد والجهاز واسحبه إلى الأسلوب. حدد الجهاز OritalShaker0، الأمر TimedShake. أدخل اهتزاز السرعة 1000، الوقت للوصول إلى السرعة الكاملة 2، والوقت لزعزعة 30.
    4. انقر فوق خطوة اللاوير النقل المحسن ة في شريط الأدوات ضمن خطوات الإعداد والجهاز واسحبه إلى الأسلوب. نقل أدوات المختبرات Orbital1 إلى P11.
  9. إعداد المزيج الأول
    1. انقر فوق خطوة تحديد تلميح في شريط الأدوات ضمن خطوات معالجة السائل واسحبه إلى الأسلوب. حدد إعادة ترتيب الموضع TL4.
    2. انقر فوق خطوة INHECO الحاضنة في شريط الأدوات ضمن عمليات التكامل واسحبه إلى الأسلوب. اكتب INHECO1 لاستخدام الجهاز في الموضع، 1 للاحتضان ل، 60 ل°C و 3 ل°C من درجة الحرارة المستهدفة.
    3. انقر فوق خطوة حلقة في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب، ضمن خطوة تحديد تلميح. اكتب col كمتغير = العمود الأول كبداية، =LastColumn كنهاية، و 1 كزيادة.
    4. انقر فوق خطوة تحديد تلميحات تحميل النصائح في شريط الأدوات ضمن خطوات معالجة السائل واسحبه إلى الأسلوب، ضمن خطوة حلقة. حدد BC90 نصائح، TL5 الموقع وTL2 النسخ الاحتياطي نصائح الموقع من القائمة المنسدلة. حدد عمودًا واحدًا (أعمدة) واكتب في 1.
    5. انقر فوق خطوة تحديد نصائح تنسخ في شريط الأدوات تحت خطوات معالجة السائل واسحبه إلى الأسلوب، ضمن خطوة حلقة. حدد BCDeep96Round نوع Labware وموقف لوحة الكاشف. اكتب في وحدة التخزين = FirstMix، تستنشق في العمود 1 والصف 1. حدد تقنية محسنة من القائمة المنسدلة التقنية.
    6. انقر فوق خطوة تحديد نصائح الاستغناء في شريط الأدوات تحت خطوات معالجة السائل واسحبها إلى الأسلوب، ضمن خطوة حلقة. حدد BCDeep96Round نوع Labware وموقف لوحة الكاشف. اكتب في وحدة التخزين = FirstMix، الاستغناء في العمود = كول والصف 1. حدد تقنية محسنة من القائمة المنسدلة التقنية.
    7. انقر فوق خطوة إلغاء تحميل النصائح المحددة في شريط الأدوات ضمن خطوات معالجة السائل واسحبه إلى الأسلوب، ضمن خطوة الحلقة. حدد إلغاء تحميل النصائح إلى TR1.
  10. إعداد العينات
    1. انقر فوق الخطوة إذا في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب. اكتب SamplePlate كشرط.
    2. ضمن ثم، انقر فوق خطوة تحديد تلميحات تحميل النصائح في شريط الأدوات ضمن خطوات معالجة السائل واسحبه إلى الأسلوب. حدد BC90 نصائح، TL5 الموقع وTL2 النسخ الاحتياطي نصائح الموقع من القائمة المنسدلة. حدد عمودًا واحدًا (أعمدة) واكتب في =أعمدة تلميح.
    3. انقر فوق خطوة تحديد نصائح تنسخ في شريط الأدوات ضمن خطوات معالجة السائل واسحبه إلى الأسلوب، في غضون ذلك الحين. حدد Greiner96RoundPS نوع Labware وموقف العينات. اكتب في وحدة التخزين = عينة، تقرصن في العمود = العمود الأول والصف 1. حدد تقنية محسنة من القائمة المنسدلة التقنية.
    4. انقر فوق خطوة تحديد نصائح الاستغناء في شريط الأدوات تحت خطوات معالجة السائل واسحبها إلى الأسلوب، داخل ذلك الحين. حدد BCDeep96Round نوع Labware وموقف لوحة رد الفعل. اكتب في وحدة التخزين = عينة، الاستغناء في العمود = العمود الأول والصف 1. حدد تقنية محسنة من القائمة المنسدلة التقنية.
    5. انقر فوق خطوة إلغاء تحميل النصائح المحددة في شريط الأدوات ضمن خطوات معالجة السائل واسحبه إلى الأسلوب، في غضون ذلك الحين. حدد إلغاء تحميل النصائح إلى TR1.
    6. بعد نهاية الخطوة If، انقر فوق خطوة إجراء التشغيل في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب. حدد حاضنة الإجراءات. اكتب في HalfTime كاسم متغير و 1800 كقيمة افتراضية. اكتب في NextTemp كاسم متغير و 22 كقيمة افتراضية. اكتب المؤقت كاسم متغير و 60 كقيمة افتراضية.
  11. إعداد كتلة سيستين
    1. انقر فوق خطوة حلقة في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب، ضمن خطوة تلميح حدد. اكتب col كمتغير = العمود الأول كبداية، =LastColumn كنهاية و 1 كزيادة.
    2. ضمن حلقة، انقر فوق تحديد نصائح تحميل الخطوة في شريط الأدوات تحت خطوات معالجة السائل واسحبها إلى الأسلوب. حدد BC90 نصائح، TL5 الموقع وTL2 النسخ الاحتياطي نصائح الموقع من القائمة المنسدلة. حدد عمودًا واحدًا (أعمدة) واكتب في 1.
    3. انقر فوق خطوة تحديد نصائح تنسخ في شريط الأدوات ضمن خطوات معالجة السائل واسحبه إلى الأسلوب، داخل الحلقة. حدد BCDeep96Round نوع Labware وموقف لوحة الكاشف. اكتب في حجم = CysteineMix، تستنشق في العمود 2 والصف 1. حدد تقنية محسنة من القائمة المنسدلة التقنية.
    4. انقر فوق خطوة تحديد نصائح الاستغناء في شريط الأدوات تحت خطوات معالجة السائل واسحبها إلى الأسلوب، داخل الحلقة. حدد BCDeep96Round نوع Labware وموقف لوحة رد الفعل. اكتب في حجم = السيستينميكس، الاستغناء في العمود = كول والصف 1. حدد تقنية محسنة من القائمة المنسدلة التقنية.
    5. انقر فوق خطوة إلغاء تحميل النصائح المحددة في شريط الأدوات ضمن خطوات معالجة السائل واسحبه إلى الأسلوب، في غضون ذلك الحين. حدد إلغاء تحميل النصائح إلى TR1.
    6. بعد نهاية حلقة If، انقر فوق خطوة إجراء التشغيل في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب. حدد حاضنة الإجراءات. اكتب في HalfTime كاسم متغير و 300 كقيمة افتراضية. اكتب في NextTemp كاسم متغير و 43 كقيمة افتراضية. اكتب المؤقت كاسم متغير و 25 كقيمة افتراضية.
  12. إعداد المزيج الثاني
    1. انقر فوق خطوة حلقة في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب، ضمن خطوة تلميح حدد. اكتب col كمتغير = العمود الأول كبداية، =LastColumn كنهاية و 1 كزيادة.
    2. ضمن الحلقة، انقر فوق خطوة تحديد تلميحات تحميل النصائح في شريط الأدوات ضمن خطوات معالجة السائل واسحبه إلى الأسلوب. حدد BC90 نصائح، TL5 الموقع وTL2 النسخ الاحتياطي نصائح الموقع من القائمة المنسدلة. حدد عمودًا واحدًا (أعمدة) واكتب في 1.
    3. انقر فوق خطوة تحديد نصائح تنسخ في شريط الأدوات ضمن خطوات معالجة السائل واسحبه إلى الأسلوب، داخل الحلقة. حدد BCDeep96Round نوع Labware وموقف لوحة الكاشف. اكتب في وحدة التخزين = SecondMix، تقرصن في العمود 3 والصف 1. حدد تقنية محسنة من القائمة المنسدلة التقنية.
    4. انقر فوق خطوة تحديد نصائح الاستغناء في شريط الأدوات تحت خطوات معالجة السائل واسحبها إلى الأسلوب، داخل الحلقة. حدد BCDeep96Round نوع Labware وموقف لوحة رد الفعل. اكتب في حجم = SecondMix، الاستغناء في العمود = كول والصف 1. حدد تقنية محسنة من القائمة المنسدلة التقنية.
    5. انقر فوق خطوة إلغاء تحميل النصائح المحددة في شريط الأدوات ضمن خطوات معالجة السائل واسحبه إلى الأسلوب، في غضون ذلك الحين. حدد إلغاء تحميل النصائح إلى TR1.
    6. بعد نهاية إذا كانت الحلقة، انقر فوق خطوة إجراء التشغيل في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب. حدد الإجراء المداري.
    7. انقر فوق خطوة الإيقاف المؤقت في شريط الأدوات ضمن خطوات الإعداد والجهاز واسحبه إلى الأسلوب. إيقاف النظام بأكمله مؤقتًا لمدة 1 s.
  13. إعداد إضافة التربسين
    1. انقر فوق خطوة حلقة في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب، ضمن خطوة تلميح حدد. اكتب col كمتغير = العمود الأول كبداية، =LastColumn كنهاية و 1 كزيادة.
    2. ضمن حلقة، انقر فوق تحديد نصائح تحميل الخطوة في شريط الأدوات تحت خطوات معالجة السائل واسحبها إلى الأسلوب. حدد BC90 نصائح، TL5 الموقع، وموقع نصائح النسخ الاحتياطي TL2 من القائمة المنسدلة. حدد عمودًا واحدًا (أعمدة) واكتب في 1.
    3. انقر فوق خطوة تحديد نصائح تنسخ في شريط الأدوات ضمن خطوات معالجة السائل واسحبه إلى الأسلوب، داخل الحلقة. حدد BCDeep96Round نوع Labware وموقف لوحة الكاشف. اكتب في وحدة التخزين = التربسين، تقرصن في العمود 4 والصف 1. حدد تقنية محسنة من القائمة المنسدلة التقنية.
    4. انقر فوق خطوة تحديد نصائح الاستغناء في شريط الأدوات تحت خطوات معالجة السائل واسحبها إلى الأسلوب داخل الحلقة. حدد BCDeep96Round نوع Labware وموقف لوحة رد الفعل. اكتب في وحدة التخزين = التربسين، الاستغناء في العمود = كول والصف 1. حدد تقنية محسنة من القائمة المنسدلة التقنية.
    5. انقر فوق خطوة إلغاء تحميل النصائح المحددة في شريط الأدوات ضمن خطوات معالجة السائل واسحبه إلى الأسلوب، في غضون ذلك الحين. حدد إلغاء تحميل النصائح إلى TR1.
    6. بعد نهاية حلقة If، انقر فوق خطوة إجراء التشغيل في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب. حدد حاضنة الإجراءات. اكتب في HalfTime كاسم متغير و 3600 كقيمة افتراضية. اكتب في NextTemp كاسم متغير و 25 كقيمة افتراضية. اكتب درجة الحرارة كاسم متغير و43 كقيمة افتراضية.
    7. انقر فوق خطوة INHECO الحاضنة في شريط الأدوات ضمن عمليات التكامل واسحبه إلى الأسلوب. تأكد من تثبيت برنامج حاضنة INHECO. اكتب INHECO1 لاستخدام الجهاز في الموضع، 1 للاحتضان ل، 25 ل°C و 5 ل°C من درجة الحرارة المستهدفة.
  14. إعداد التبريد
    1. انقر فوق خطوة حلقة في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب، ضمن خطوة تحديد تلميح. اكتب col كمتغير = العمود الأول كبداية، =LastColumn كنهاية و 1 كزيادة.
    2. ضمن حلقة، انقر فوق تحديد نصائح تحميل الخطوة في شريط الأدوات تحت خطوات معالجة السائل واسحبها إلى الأسلوب. حدد BC90 نصائح، TL5 الموقع وTL2 النسخ الاحتياطي نصائح الموقع من القائمة المنسدلة. حدد عمودًا واحدًا (أعمدة) واكتب في 1.
    3. انقر فوق خطوة تحديد نصائح تنسخ في شريط الأدوات ضمن خطوات معالجة السائل واسحبه إلى الأسلوب، داخل الحلقة. حدد BCDeep96Round نوع Labware وموقف لوحة الكاشف. اكتب في وحدة التخزين = إخماد، تقرصن في العمود 5 والصف 1. حدد تقنية محسنة من القائمة المنسدلة التقنية.
    4. انقر فوق خطوة تحديد نصائح الاستغناء في شريط الأدوات تحت خطوات معالجة السائل واسحبها إلى الأسلوب، داخل الحلقة. حدد BCDeep96Round نوع Labware وموقف لوحة رد الفعل. اكتب في وحدة التخزين = إخماد، الاستغناء في العمود = كول والصف 1. حدد تقنية محسنة من القائمة المنسدلة التقنية.
    5. انقر فوق الخطوة "حدد تلميحات تفريغ" في شريط الأدوات ضمن خطوات معالجة السائل واسحبه إلى الأسلوب، داخل ثم. حدد إلغاء تحميل النصائح إلى TR1.
    6. بعد نهاية إذا كانت الحلقة، انقر فوق خطوة إجراء التشغيل في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب. حدد الإجراء المداري.
    7. انقر فوق خطوة الإيقاف المؤقت في شريط الأدوات ضمن خطوات الإعداد والجهاز واسحبه إلى الأسلوب. إيقاف النظام بأكمله مؤقتًالمدة 1 s .
    8. انقر فوق خطوة الإيقاف المؤقت في شريط الأدوات ضمن خطوات الإعداد والجهاز واسحبه إلى الأسلوب. حدد إيقاف النظام بأكمله مؤقتًا وعرض هذه الرسالة. اكتب الرسالة "متابعة بعد الطرد المركزي".
  15. إعداد لوحة لAutosampler
    1. انقر فوق الخطوة إذا في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب، ضمن خطوة تحديد تلميح. اكتب Autosampler كشرط.
    2. ضمن ثم، انقر فوق الخطوة حلقة في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبها إلى الأسلوب. اكتب col كمتغير = العمود الأول كبداية، =LastColumn كنهاية و 1 كزيادة.
    3. ضمن حلقة، انقر فوق تحديد نصائح تحميل الخطوة في شريط الأدوات تحت خطوات معالجة السائل واسحبها إلى الأسلوب. حدد نصائح BC230 والموقع TL6 وموقع نصائح النسخ الاحتياطي TL2 من القائمة المنسدلة. حدد عمودًا واحدًا (أعمدة) واكتب في 1.
    4. انقر فوق خطوة تحديد نصائح تنسخ في شريط الأدوات ضمن خطوات معالجة السائل واسحبه إلى الأسلوب، داخل الحلقة. حدد BCDeep96Round نوع Labware وموقف لوحة الكاشف. اكتب في وحدة التخزين = MobilePhase، تقرصن في العمود 6 والصف 1. حدد تقنية محسنة من القائمة المنسدلة التقنية.
    5. انقر فوق خطوة تحديد نصائح الاستغناء في شريط الأدوات تحت خطوات معالجة السائل واسحبها إلى الأسلوب، داخل الحلقة. حدد Bio_RadPCR96 نوع Labware وموقف لوحة Autosampler. اكتب في وحدة التخزين = MobilePhase، الاستغناء في العمود = كول والصف 1. حدد تقنية محسنة من القائمة المنسدلة التقنية.
    6. انقر فوق الخطوة "حدد تلميحات تفريغ" في شريط الأدوات ضمن خطوات معالجة السائل واسحبه إلى الأسلوب، داخل ثم. حدد إلغاء تحميل النصائح إلى TR1.
    7. بعد نهاية حلقة If، انقر فوق خطوة إجراء التشغيل في شريط الأدوات تحت خطوات التحكم واسحبه إلى الأسلوب. حدد إجراء TipCount.
    8. انقر فوق خطوة تحديد تلميحات تحميل النصائح في شريط الأدوات ضمن خطوات معالجة السائل واسحبه إلى الأسلوب. حدد BC90 نصائح، TL5 الموقع، وموقع نصائح النسخ الاحتياطي TL2 من القائمة المنسدلة. حدد عمودًا واحدًا (أعمدة) واكتب في =أعمدة تلميح.
    9. انقر فوق خطوة تحديد نصائح تنسخ في شريط الأدوات ضمن خطوات معالجة السائل واسحبه إلى الأسلوب داخل الحلقة. حدد BCDeep96Round نوع Labware وموقف لوحة رد الفعل. اكتب في وحدة التخزين = DigestTransfer، تقرصن في العمود = العمود الأول والصف 1. حدد تقنية محسنة من القائمة المنسدلة التقنية.
    10. انقر فوق خطوة تحديد نصائح الاستغناء في شريط الأدوات تحت خطوات معالجة السائل واسحبها إلى الأسلوب، داخل الحلقة. حدد Bio_RadPCR96 نوع Labware وموقف لوحة Autosampler. اكتب في وحدة التخزين = MobilePhase، الاستغناء في العمود = العمود الأول والصف 1. حدد تقنية محسنة من القائمة المنسدلة التقنية.
    11. انقر فوق الخطوة "حدد تلميحات تفريغ" في شريط الأدوات ضمن خطوات معالجة السائل واسحبه إلى الأسلوب داخل ثم. حدد إلغاء تحميل النصائح إلى TR1. تنتهي خطوة النصائح المحددة هنا.
    12. حفظ الأسلوب وتسميته.

2. إعداد العينة، الأدوات المختبرية، والكواشف

  1. نقل 5 ميكرولتر من البلازما البشرية الصحية المجمعة إلى بولي بروبلين، 96 جولة ديب جيدا.
    ملاحظة: راجع جدول المواد للكواشف والإمدادات المستخدمة في هذا البروتوكول. TPCK تم شراء التربسين المعالجة والتربسين إلى نسبة الركيزة ووقت الحضانة تم تحسينه على وجه التحديد. إذا تم استخدام درجة مختلفة من التربسين، مثل التربسين المؤتلف من الدرجة التسلسلية، يجب اختبار نسبة الإنزيم إلى الركيزة ووقت الحضانة وتحسينها.

3- إجراءات التشغيل

  1. انقر نقرًا مزدوجًا على رمز البرنامج.
  2. ضمن علامة التبويب الأسلوب، حدد الصفحة الرئيسية جميع المحاور لتوجيه وإعداد معالج السائل الآلي. تأكد من أن جميع محاقن محطات العمل لا تحتوي على فقاعات هواء مرئية.
  3. ضمن الملف، حدد فتح | الطريقة.
  4. حدد الطريقة(الشكل 6).
  5. ابدأ الأسلوب بالنقر فوق رمز التشغيل على شكل مثلث أخضر.
  6. للحصول على لوحة autosampler أعدت في نهاية الأسلوب، أدخل القيمة 'صحيح' في إدخال قيمة لاستخدامها لمطالبة 'Autosampler' ثم انقر فوق موافق. إذا لم يتم إعداد لوحة autosampler، أدخل القيمة "خطأ"، ثم انقر فوق موافق.
  7. أدخل القيمة '1' في إدخال قيمة لاستخدامها في موجه "العمود الأول" ثم انقر فوق موافق.
  8. أدخل القيمة '12' في إدخال قيمة لاستخدامها لمطالبة "العمود الأخير"، ثم انقر فوق موافق.
    ملاحظة: هذه الخطوة والخطوة 4.7 تخبر محطة العمل بإجراء عملية هضم على 12 عمودًا من لوحة 96 بئرًا ، مما يؤدي إلى استخدام جميع آبار اللوحة للهضم
  9. إذا تم استخدام لوحة عينة مع وحدات تخزين عينة لا تقل عن 20 ميكرولتر، أدخل القيمة "true" في إدخال قيمة لاستخدامها في موجه "SamplePlate"، ثم انقر فوق موافق. إذا لم يتم استخدام لوحة عينة، أدخل القيمة "خطأ"، ثم انقر فوق موافق.
    ملاحظة: إذا لم يتم استخدام لوحة عينة، أضف 5 ميكرولتر من العينة إلى كل بئر مناظرة من لوحة التفاعل.
  10. اتبع التوجيهات في إطار إعداد Labware الموجه وانقر فوق متابعة.
    ملاحظة: تصف النافذة التالية تخطيط "لوحة الكاشف" التي سيتم إعدادها(الشكل 7، الجدول التكميلي 1). سيتم نقل المجلدات التالية إلى كل بئر من الآبار الثمانية لعمود واحد في لوحة Deep Round 96-well ذات الـ 1 مل:
    العمود 1: 540 ميكرولتر من مزيج التفاعل 1.
    العمود 2: 50 ميكرولتر من كتلة السيستين.
    العمود 3: 730 ميكرولتر من مزيج التفاعل 2.
    العمود 4: 130 ميكرولتر من التربسين.
    العمود 5: 130 ميكرولتر من محلول إخماد.
    العمود 5: 1090 ميكرولتر من حل المرحلة المتنقلة (إذا دخل المستخدم "صحيح" في الخطوة 6).
  11. انقر فوق التالي ويصف الإطار التالي الحد الأدنى للحجم (20 ميكرولتر) اللازمة للتسعير في لوحة العينة. إذا أدخل المستخدم قيمة "خاطئة" للمطالبة التي تتضمن لوحة العينة (الخطوة 9)، ستتم مطالبة المستخدم بإضافة عينة 5 ميكرولتر إلى لوحة التفاعل.
  12. انقر فوق التالي.
    ملاحظة: الإطار التالي يظهر أنه يجب وضع مربع تلميح 90 μL فارغة على سطح معالج السائل الآلي.
  13. انقر فوق التالي مرة أخرى، ووضع سطح معالج السائل الآلي كما هو محدد وموضح(الشكل 8)بما في ذلك لوحة الكاشف، لوحة رد الفعل، لوحة عينة، لوحة Autosampler، 6 كامل 90 μL مربع تلميح، مربع تلميح 90 μL فارغة، وكامل 230 μL مربع تلميح.
  14. انقر فوق إنهاء لبدء الأسلوب.
    ملاحظة: بعد النقر فوق إنهاء، لا يمكن للمستخدم الوصول إلى معالج السائل الآلي. هذا سوف 'كسر الستار ضوء' من الجهاز ووقف معالج السائل كإجراء وقائي السلامة.
  15. في متابعة بعد الطرد المركزي موجه، استرداد لوحة رد الفعل والطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 3،000 دورة في الدقيقة.
  16. بعد اكتمال الطرد المركزي، أعد لوحة رد الفعل إلى معالج السائل الآلي إلى الموضع الذي كان عليه قبل الطرد المركزي، وانقر فوق متابعة.
    ملاحظة: سيتم إيقاف معالج السائل الآلي مرة أخرى عند اكتمال الأسلوب. إذا دخل المستخدم "صحيح" للخطوة 6، يمكن بعد ذلك إزالة لوحة Autosampler من محطة العمل ووضعها في autosampler من أداة الكروماتوغرافيا السائلة للتحليل.

4- LC-MSMS

  1. حل الببتيدات على تدفق عالية HPLC تتألف من C18 2.1 مم × 100 ملم، 3.5 ميكرومتر مع معدل تدفق 0.25 مل / دقيقة وتحليلها مضمنة على مطياف كتلة رباعية ثلاثية.
    ملاحظة: بعد هضم الببتيد، يتم وصف طريقة LC-MSMS المستهدفة لقياس الببتيدات من العينات المعدة الروبوتية بالتفصيل1 بعد وصف موجز لـ LC-MSMS.
  2. تعيين درجة حرارة الفرن العمود إلى 40 درجة مئوية. استخدام المخزن المؤقت A (2% ACN, 98% المياه, 0.1% حمض الفورميك) والمخزن المؤقت B (95% ACN, 5% الماء, 0.1% حمض الفورميك) كمرحلتين متنقلتين.
  3. معادلة العمود مع 5٪ B لمدة 5 دقائق بعد التحميل. يلمع الببتيدات أكثر من 30 دقيقة مع خطي 5٪ إلى 35٪ الانحدار من المخزن المؤقت B.
    1. أعد تدوير العمود قبل تحميل العينة التالية عن طريق الغسيل بنسبة 98% ب لمدة 10 دقائق ثم 5% ب لمدة 5 دقائق.
    2. لتحويل على الخط، تحويل eluent ما بعد العمود إلى النفايات قبل أن يدخل مصدر أيون باستخدام صمام التبديل على مرحلتين.
  4. معالجة بيانات MRM.

Representative Results

تم تكييف سير عمل إعداد عينة proteomics الآلي على محطة العمل الآلية لدينا من البروتوكول الآلي السابق مع طريقة اقتناء LC-SRM-MS قوية1 للزل، وبروتين البلازما المحدد، وα-galactosidase (α-gal)، وهو بروتين خارجي يستخدم لمراقبة الجودة. بعد المعالجة ، تم تشغيل العينات على رباعيثلاثيLC-MS في مجرى SRM يستهدف ألبوم المصل ، α-galactosidase. تم استخدام معامل الاختلاف (CV) لإشارة SRM لكل انتقال لمراقبة قابلية استنساخ بروتوكول الهضم الآلي.

قمنا بأتمتة إضافة الكاشف وخلط الخطوات لهضم عينات بلازما 5 ميكرولتر مع حضانة التربسين على سطح السفينة لمدة ساعتين. لتحديد قابلية الاستنساخ ، تم تحويل 5 ميكرولتر من بركة البلازما إلى آبار متعددة من لوحة رد الفعل مع رأس متعدد القنوات (96 دبوس). لمراقبة للاتساق، أضفنا البروتين α-غال قبل الحد وردود الفعل alkylation. تم اختبار سير عمل إعداد عينة proteomics الآلي مع طريقة اقتناء LC-SRM-MS قوية بما في ذلك الألبومين ، أعلى وفرة بروتين البلازما ، وبروتين α-gal ، المستخدم لمراقبة الجودة. تم رصد ثلاثة ببتيدات وببتيدات اثنين من الببتيدات الزلبين المعالجة من بروتينات الزلين البلازما المعالجة والبروتين الأعلى(الجدول 4).

في محاولة لتوفير الوقت وتبسيط الإجراء ، قمنا بتخفيض خطوات نقل السائل لإضافة / خلط / حضانة خليط الكاشف والتفاعل مع محطة العمل من سير العمل من تسع خطوات إلى سير العمل من ست خطوات(الشكل 1). ويتألف مجموع سير العمل البروتيني من عنصرين تجريبيين: إعداد العينة الآلية وLC-MS/MS. أولاً، قمنا بتقييم دقة الحصول على بيانات LC-MS/MS SRM من خلال ثماني حقن متتالية من نفس بئر الهضم للوحة العينات الذاتية. تم حساب دقة سير عمل إعداد العينة الآلي بنسبة معامل التباين (%CV) لإجمالي سير عمل SRM البروتيني ناقص % السيرة الذاتية لـ LC-MS/MS(الشكل 9B). مع تبسيط إجراءات الهضم البلازما على محطة العمل الآلية، كانت الدقة التجريبية لإعداد العينات الآلية أقل من 11.4٪ للبروتينات الخارجية ارتفعت α-gal (10.0٪ كمتوسط)، وأقل من 14.9٪ لألبوم المصل البشري الأكثر وفرة (9.9٪ كمتوسط)(الشكل 9). ولوحظت كثافة إشارة جيدة لكل من الألبومين المصل البشري والبروتينات α-غال كما هو متوقع(الشكل 9C).

لكل خطوة نقل الأنابيب والسائلة ، تم تحسين التقنيات على وجه التحديد. لمراقبة دقة نقل الخطوات السائلة، ارتفعت لدينا النظائر المستقرة المسمى (SIL) معايير الببتيد لبروتين مصل الإنسان الذاتي ة وبروتين α-gal الخارجية في ثلاث خطوات نقل كاشف مستقل: التفاعل ميكس 1، مانع السيستين، وميكس رد الفعل 2(الشكل 10). تم الحصول على إشارات MRM من هذه الببتيدات الخمسة SIL لمراقبة دقة خطوات نقل السائل الآلي. متوسط %CV للببتيدات، DDNPNLPR^، وGDFQFNISR^ (^ يمثل N15 المسمى الأحماض الأمينية) من التفاعل ميكس 1 خطوة تراوحت من 1.8٪ إلى 11.2٪. متوسط %CV من ببتيد واحد (IDPNAWVER^) من خطوة مانع السيستين تراوح بين 6.6 إلى 8.8٪. وتراوح متوسط نسبة السيرة الذاتية لاثنين من الببتيدات (WVGYGQDSR^ وLVNEVTEFAK^) من 6.2٪ إلى 11.9٪(الشكل 10).

للتحقق من صحة سير عمل إعداد عينة البروتيوميات الآلي ، قمنا بتقييم قابلية الاستنساخ عبر بروتينات متعددة وأيام متعددة لألبوم المصل البشري ، والبروتينات الخارجية ، و40 بروتينات بلازما إضافية. قمنا بمعالجة 21 عينة تكرار (البلازما البشرية العادية المجمعة) ، موقع جيد هو مبين في الشكل 11A، في ثلاثة أيام مختلفة. تم حساب السير الذاتية خلال اليوم من 21 بئرًا تم إعدادها في نفس اليوم. وتراوح متوسط السير الذاتية خلال اليوم لـ 40 بروتيناً بين 4% و20%(الشكل 11ب). لتقييم تأثير حافة سير العمل الآلي المستند إلى اللوحة، تم حساب %CV من آبار محددة داخل الأعمدة والصفوف المعينة(الشكل 12A لخريطة العمود والصف). كانت كثافة إشارات MRM متشابهة في جميع تكوينات الأعمدة والصفوف مع %CV تتراوح بين 3٪ - 22٪(الشكل 12B).

وباختصار، فإن سير العمل الآلي الأمثل ينتج 96 عينة مجهزة بشكل موحد في أقل من خمس ساعات بدقة تجريبية ممتازة. للتوافق مع سير العمل الآلي، اخترنا الكواشف التي لها ردود فعل جانبية غير محددة لا تذكر، ومستقرة في الإضاءة المحيطة، ومريحة LC-MS/MS، ويمكن تخزينها كأليوت المجمدة.

Figure 1
الشكل 1: مخطط سير عمل إعداد العينة. يتم سرد الخطوات الرئيسية 6 نقل السائل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تلميح تحميل البرنامج النصي. يتم عرض تفاصيل VB Script هنا. يحدد البرنامج النصي شروط تحميل البقشيش. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تخطيط سطح محطة العمل الآلي. يتكون سطح السفينة من 1x1 ALPs ، Tip Loading Loading ، القمامة ، غسيل البقشيش ، Peltier وحاضنة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: خصائص لوحة الكاشف. تظهر هي الخصائص اللازمة لLabware لوحة الكاشف عند الوصول إليها باستخدام إعداد Labware الموجه. حدد العمود والنوع المقابلين في المتغيرات كما هو مبين في الشكل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: السيناريو العد تلميح. هذا السيناريو يساعد على تتبع عدد من النصائح على سطح السفينة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: نظرة عامة على طريقة هضم عينات البلازما وتسعيرها. خطوات لحسابات الكاشف وإعداد أدوات المختبرات والتلاعب بالسائل في طريقة معالج السائل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: تخطيط لوحة الكاشف. تظهر هي الكواشف الكيميائية اللازمة لهضم البلازما وإعداد autosampler وتوزيعها عبر labware لوحة الكاشف. تم تعديل هذا الرقم من الملاحظة الفنية10. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: تخطيط لlabware على سطح محطة العمل الآلي. يظهر هو تخطيط سطح السفينة لطريقة الهضم البلازما لمعالج السائل. تم تعديل هذا الرقم من الملاحظة الفنية10. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: تتكون دقة سير العمل الإجمالي للبروتيوميات من السيرة الذاتية لمحطة العمل والسيرة الذاتية LC MS/MS المستهدفة.
تم رصد خمسة ببتيدات من α-gal وalbumin ، تم حساب الكروماتوجرامات ووقت الاحتفاظ بالببتيد لكل ببتيد (A) ، تم تحديد الدقة من 30 بئرًا / عينة تجربة تمثيلية لمعالجة ، والسير الذاتية ٪ لإجمالي سير العمل البروتيني ، وتحليل LC MS / MS ومعالجة العينة الآلية(B). عموما، أظهرت الببتيدات هضم إشارات جيدة تراوحت بين 1x105 تصل إلى 1x108. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 10
الشكل 10: تحديد الدقة لخطوات نقل السوائل. تم ارتفاع الببتيدات الاصطناعية في الكواشف المحددة خطوة، وتم تحديد نقل السائل الآلي من قبل إجمالي٪ CV. من 30 بئر / عينة تجربة ناقص ٪ CV LC MSMS (التي تحددها 8 تكرار LC MSMS الحقن. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 11
الشكل 11: استنساخ متعدد الأيام لسير عمل إعداد عينة البروتين الآلي مع 42 تحليل MRM البروتين. (A)خريطة لوحة رد الفعل لكل من ثلاثة أيام هو عرض هنا، تمت إضافة 5 ميكرولتر البلازما إلى كل من 21 بئرا. واستخدمت 3 آبار تلقت 5 مياه ul كضوابط سلبية/فارغة. (ب)متوسط كثافة 190 انتقالات تتألف من 75 الببتيدات و 42 بروتين (يسار) و%CV لكل انتقال MRM تم حسابها من 21 بئر هضم لكل يوم (يمين). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 12
الشكل 12: استنساخ مواقع محددة من الآبار (موضع الأعمدة والصفوف). (أ)يظهر موقع الأعمدة والصفوف مع خريطة لوحة هنا. (ب)عمود والصف موقع إشارات MRM محددة من متوسط كثافة من آبار محددة (يسار) والسيرة الذاتية٪ (يمين) من هضم لوحة واحدة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 13
الشكل 13: لقطة شاشة لمحرر التقنية. لكل قالب Pipetting، حدد خصائص استشعار مستوى السائل، كشف الجلطة، ثقب، نوع السائل، العام، النذيب، الاستغناء، ميكس والمعايرة. يتم عرض القالب والتقنيات المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول التكميلي 2). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

متغير متغير قيمه وصف
العينات الذاتية منطقيه صحيح استخدام العينات التلقائية
بيتاغال صحيح 5 حجم بيتاغال
BG1 صحيح 0.8 حجم BG1
BG2 صحيح 0.8 حجم BG2
BG3 صحيح 0.8 حجم BG3
سيشتاين لاينر صحيح 1.25 حجم مانع السيستين
سيستينسيتون صحيح 0.45 وحدة تخزين العازلة السيستين
ديناتورانت صحيح 5 حجم المسخ
نقل الدايت صحيح 10 حجم نقل الملخص
المخزن المؤقت الأول صحيح 25.9 وحدة التخزين المؤقت الأولى
العمود الأول صحيح 1 العمود الأول
HSA1 صحيح 0.8 حجم HSA1
HSA2 صحيح 0.8 حجم HSA2
العمود الأخير صحيح 12 العمود الأخير
MobilePhase صحيح 90 حجم المرحلة المتنقلة
اخماد صحيح 10 عمود إخماد
الحد من العوامل صحيح 5 تقليل عمود العامل
عينه صحيح 5 نموذج العمود
لوحة عينات منطقيه صحيح استخدام لوحة عينة
SecondBuffer صحيح 58.4 وحدة التخزين المؤقت الثانية
التربسين صحيح 10 عمود التربسين

الجدول 1: متغيرات خطوة البدء

قيمه متغير
=FirstBuffer +Denaturant+ReduceAgent+Betagal+BG1+HSA1 FirstMix
=سيستينلاينر+سيستينBuffer+BG2 سيستين ميكس
=SecondBuffer+BG3+HSA2 ثانميكس
=(FirstMix*أعمدة)+30 فيرست ميكسويل
= (سيستينميكس * أعمدة)+20 سيستينويل
=(SecondMix*أعمدة)+10 SecondMixWell
=(التربسين*أعمدة)+10 تريبسينويل
=(إخماد*أعمدة)+10 يرويويل
=(FirstMixWell*8)+100 فيرست ميكسستوك
=سيستينويل*8+20 سيستين ميكسستوك
=(SecondMixWell*8)+100 SecondMixStock

الجدول 2: متغيرات مزيج الحجم

نوع اسم موقف عمق خصائص استخدام؟
BCDeep96Round لوحة كاشف P5 1 (أعلى) # =لا SamplePlate
BCDeep96Round لوحة كاشف P5 1 (أعلى) # = لوحة عينات
BCDeep96Round لوحة رد الفعل P11 1 (أعلى) صحيح
Bio_RadPCR96* عينات P9 1 (أعلى) = لوحة عينات
Bio_RadPCR96* لوحة العينات الذاتية P10 1 (أعلى) = نموذج تلقائي
BC90 فارغه 1 (أعلى) صحيح
BC90 1 (أعلى) صحيح
BC90 1 (أعلى) صحيح
BC230 1 (أعلى) = نموذج تلقائي
BC90 1 (أعلى) = أعمدة > 1
BC90 1 (أعلى) = أعمدة > 3
BC90 1 (أعلى) = أعمدة > 5
BC90 1 (أعلى) = أعمدة > 7
BC90 1 (أعلى) = أعمدة > 9
ملاحظه:
*: يتوافق مع 96 بئر بيو راد لوحة.
#: انقر فوق الخصائص ثم أدخل متغيرات وحدة التخزين كما هو مبين في الشكل 6.

الجدول 3: إعداد الإعداد الموجه

بروتين ID تسلسل الببتيد Q1 قداس (دا) Q3 قداس (دا) الوقت (دقيقة) جزء أيون إلغاء التجميع المحتملة طاقة الاصطدام احتمال خروج خلية الاصطدام
sp | P00722| BGAL_ELOCI GDFQFNISR 542.3 262.1 19.7 +2y2 61 21 8
542.3 636 19.7 +2y5 61 25 12
542.3 764.2 19.7 +2y6 61 25 18
IDPNAWVER 550.3 436.1 18.1 +2y7+2 61 23 8
550.3 871.2 18.1 +2y7 61 25 18
550.3 774.2 18.1 +2y6 61 33 8
WVGYGQDSR 534.3 782.1 12.1 +2y7 51 25 6
534.3 562.1 12.1 +2y5 51 27 6
534.2 505.2 12.1 +2y4 90 25 8
sp | P02768| ALBU_HUMAN DDNPNLPR 470.8 596.2 9.2 +2y5 61 27 16
470.8 499.3 9.2 +2y4 61 27 18
470.8 710.4 9.2 +2y6 61 27 18
LVNEVTEFAK 575.3 694.4 18.2 +2y6 73.1 29.6 18
575.3 937.5 18.2 +2y8 73.1 29.6 18
575.3 823.4 18.2 +2y7 73.1 29.6 18

الجدول 4: معلمات MRM

الجدول التكميلي 1: لوحة كاشف يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 2: قالب البروتوكول يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Discussion

معالجة العينة لspectrometry الشامل يتطلب تسخ البروتين، والحد والألكيلية لمنع السيستين، وهضم التربسين لشكيس البروتينات في الببتيدات. يجب البدء في كل تفاعل كيميائي أو أنزيمي في وقت معين وإجراؤه في درجة حرارة خاضعة للرقابة ، وكل خطوة في العملية تنطوي على خطوات نقل سائلة متعددة حيث يمكن إدخال الاختلاف التجريبي. توفر معالجة العينة التلقائية حلاً لهذه المعضلة. أنظمة مناولة السائل المتاحة حاليا لديها القدرة على نقل الكواشف إلى لوحات 96 بئر مع دقة ودقة أقل من 5٪، اعتمادا على نوع الرأس والبقشيش المستخدمة، واحتضان العينات، مع اهتزاز إذا رغبت في ذلك، تحت درجات حرارة خاضعة للرقابة تتراوح بين 14 درجة مئوية إلى 70 درجة مئوية. استخدمنا معالج سائل آلي لمعالجة البلازما لمقالات SRM بتنسيق 96 بئرًا.

هناك عدة آلاف من مواقع انشقاق البروتياز داخل الخلائط المعقدة من البروتينات في المصل والبلازما والعينات البيولوجية الأخرى. ولكل من هذه البروتينات خصائص فريدة من نوعها تؤثر على إمكانية الوصول إلى موقع الانقسام واستقرار الببتيدات الناتجة. لذلك، من المستحيل تصميم إجراء معالجة عينة هو الأمثل لكل بروتين. أفضل بديل هو أن تكون متسقة قدر الإمكان.

لتحقيق الاتساق، قمنا بتحسين كل خطوة الأنابيب التي يؤديها معالج السائل الآلي. نظرنا أولاً في الحجم المطلوب والقيود المفروضة من قبل نوع السائل (البلازما أو المائية أو العضوية) والخصائص المقابلة (اللزوجة والتماسك والتقلبات) والأجهزة (محطة العمل pipetting الرأس ولوحة الاستيلاء على الأسلحة) ، وlabware. ثم قمنا بالتنوع في السرعة والفجوة الجوية الزائدة للطموح ، وحجم السرعة والانفجار للاستغناء ، وقوة ومدة الاختلاط ، مع دمج لمسة تلميح بعد الطموح و / أو الاستغناء ، إذا لزم الأمر ، للقضاء على التمسك السائل بالجزء الخارجي من النصائح(الشكل 13، الجدول التكميلي 1). تم تثبيت ببتيد SIL فريد من نوعه ، تم فحصه مسبقًا للاستقرار ، في كل كاشف لجعل من الممكن مراقبة دقة كل خطوة من اول معالجة سائلة. بعد التحسين ، كانت السير الذاتية للعملية لغالبية التحولات أقل من 10 ٪ ، مما يدل على إعادة إنتاج جيدة مع محطة العمل الآلية(الشكل 9، الشكل 10، الشكل 11 والشكل 12).

يوفر سير العمل الآلي المعروض هنا الهضم الأنزيمي المتناسق مع تحسين قابلية الاستنساخ والإنتاجية مقارنة بالطرق اليدوية(الشكل 9، الشكل 10). ويعد هذا النهج بتحسين دقة وموثوقية اكتشاف العلامات الحيوية والتحقق من صحتها عن طريق قياس الطيف الكتلي.

Disclosures

اي.

Acknowledgments

اي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A Pooled healthy human plasma Bioreclamation Inc. human plasma tested in the manuscript
Acetonitrile, HPLC Grade Thermo Fisher Scientific A998SK1 LC MS/MS solvent
B-Galactosidase Recombinant from E.Coli Sigma-Aldrich G3153-5MG exogenous control proteins.
Biomek i7 Automated Workstation Beckman Coulter, Inc. The proteomic sample preparation workstation: Biomek automated workstations are not intended or validated for use in the diagnosis of disease or other conditions
Biomek i-Series Tips 230µL Non-Sterile Beckman Coulter, Inc. B85903  Tips, i7 consumable
Biomek i-Series Tips 90µL Non-Sterile Beckman Coulter, Inc. B85881  Tips, i7 consumable
FG, Kit Trypsin TPCK Sciex 4445250 Trypsin used in digestion
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear  Bio-Rad #hsp9641 Autosampler plate
Octyl B-D-Glucopyranoside Sigma-Aldrich O9882-5G detergent used in digestion
Polypropylene, 96-Round Deep Well Plates Sterile Beckman Coulter, Inc. 267007 Reagent and digestion plate
Prominence UFLCXR HPLC system Shimadzu, Japan High flow LC sytem
QTRAP 6500 SCIEX Mass spectrometer
Water, HPLC Grade Thermo Fisher Scientific W54 LC MS/MS solvent
Xbridge BEH30 C18 2.1mm x 100mm Waters 186003564 LC MSMS column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fu, Q., et al. Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation Workflow for Quantitative Mass Spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
  2. Lehmann, S., et al. Clinical mass spectrometry proteomics (cMSP) for medical laboratory: What does the future hold? Clinica Chimica Acta. 467, 51-58 (2017).
  3. Abbatiello, S. E., et al. Large-Scale Interlaboratory Study to Develop, Analytically Validate and Apply Highly Multiplexed, Quantitative Peptide Assays to Measure Cancer-Relevant Proteins in Plasma. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2357-2374 (2015).
  4. Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (7), 577-583 (2005).
  5. Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).
  6. Yates, J. R. 3rd Pivotal role of computers and software in mass spectrometry - SEQUEST and 20 years of tandem MS database searching. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1804-1813 (2015).
  7. Nilsson, T., et al. Mass spectrometry in high-throughput proteomics: ready for the big time. Nature Methods. 7 (9), 681-685 (2010).
  8. Van Eyk, J. E., Sobhani, K. Precision Medicine. Circulation. 138 (20), 2172-2174 (2018).
  9. Hoofnagle, A. N., et al. Recommendations for the Generation, Quantification, Storage, and Handling of Peptides Used for Mass Spectrometry-Based Assays. Clinical Chemistry. 62 (1), 48-69 (2016).
  10. Wijayawardena, B., Fu, Q., Johnson, C., Van Eyk, J. E., Kowalski, M. Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation on Biomek i-Series. Technical note, Beckman Coulter Life Science. Document # AAG-4890APP02. 19, (2019).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 158، قياس الطيف الكتلي اللوني السائل-الترادفي (LC/MS/MS)، مراقبة التفاعل السائل ة اللونية المختارة (LC-SRM)، الأتمتة، إعداد عينة البروتين، التكرار، الإنتاجية العالية
إعداد عينة البلازما لقياس الطيف الكتلي باستخدام محطة عمل آلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fu, Q., Johnson, C. W.,… More

Fu, Q., Johnson, C. W., Wijayawardena, B. K., Kowalski, M. P., Kheradmand, M., Van Eyk, J. E. A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation. J. Vis. Exp. (158), e59842, doi:10.3791/59842 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter