Summary
在这里,我们提出通过甲骨膜培养人类牙周韧带(PDL)细胞球体的方案。三维 (3D) 细胞球体培养提供了传统组织培养聚苯乙烯 (TCPS) 培养系统的替代方案。
Abstract
牙周韧带(PDL)细胞对牙周组织再生大有希望。按照惯例,PDL细胞在二维(2D)基材上培养,如组织培养聚苯乙烯(TCPS)。然而,在体外培养过程中观察到PDL细胞的特征变化。这种现象可能是因为2DTCPS不同于体内三维(3D)微环境。与在2D基质上培养的细胞相比,在3D微环境中生长的细胞与体内细胞的相似性更大。因此,3D细胞培养模型为传统的2D单层细胞培养提供了一个有前途的替代方法。为了改进传统的PDL细胞培养模型,我们最近开发了一种3D细胞培养方法,该方法基于基托桑薄膜上PDL细胞的球形形成。在这里,我们提出了基于甲体膜的详细细胞球体培养方案。PDL细胞球体的3D培养系统克服了与传统的2D单层细胞培养相关的一些限制,因此可能适合生产PDL细胞,具有增强的疗效,为未来牙周组织再生。
Introduction
牙周炎,主要由牙菌斑1初始化,其特征是牙周韧带(PDL)、腹腔骨和水泥等牙周组织损伤。目前对牙周炎的治疗通常成功地阻止了活动性疾病的进展,但丢失的牙周组织的再生仍然是一个临床挑战。最近,在细胞为基础的牙周组织再生方法方面取得了重要进展,克服了目前治疗2、3、4的缺点。
我们以前的系统审查显示,PDL细胞显示出巨大的潜力,牙周再生5。按照惯例,PDL细胞在二维(2D)基材上培养,如组织培养聚苯乙烯(TCPS)。然而,在体外培养6中观察到PDL细胞的特征变化。这种现象可能是因为2DTCPS不同于体内三维(3D)微环境7。与在2D基质上培养的细胞相比,在3D微环境中生长的细胞与体内细胞8的相似性更大。因此,3D细胞培养模型为传统的2D单层细胞培养提供了一个有前途的替代方法。
传统的 3D 培养方法是将细胞封装在 3D 生物材料中。与封装在3D生物材料中的细胞相比,细胞球体更模仿体内的情况,因为球体是无异物生长的细胞的聚合体9、10、1112.据报道,细胞球体通过保存细胞外基质(ECM)成分,包括纤维素和拉米宁13,促进MSC生物活性。为了改进传统的PDL细胞培养模型,我们最近开发了一种3DPDL细胞培养方法,该方法基于基托桑薄膜14上的PDL细胞球体形成。球形形成增加了PDL细胞14的自我更新和成骨分化能力。在这里,我们提出了详细的PDL细胞球体培养方案基于甲酮薄膜。PDL细胞球体的3D培养系统克服了传统TCPS细胞培养的一些缺陷,因此适合生产PDL细胞,具有增强的疗效,为未来牙周组织再生。
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Protocol
该研究方案经同济大学口腔医学院和医院伦理委员会批准。所有患者均提供书面知情同意。
1. PDL细胞隔离
- 使增殖培养基培养为PDL细胞:β-MEM培养基,辅以10%FCS和100U/mL笔/链球菌。
- 准备一个装有冰的容器,以转移孤立的第三摩尔。
- 使用高压灭菌器对手术器械进行消毒。
- 在同济大学口腔医学院口腔医院牙科诊所提取正常人从第三种摩尔(18-28岁)中提取第三摩尔。
- 将第三摩尔放入增殖介质中,并在4°C时转移到实验室。
- 将提取的牙齿放入无菌的 100 mm 培养皿中,在生物危害层流罩内工作。
- 加入10 mL的PBS来清洗提取的牙齿。重复洗涤步骤两次。
- 使用无菌手术刀,轻轻地将 PDL 与根部分离。
注:PDL应从根的中间第三部分刮,以避免牙龈或牙龈组织的污染。 - 在消毒手术刀的帮助下,将 PDL 切成 1-2 毫米的碎片。
- 将 PDL 碎片放入 T-25 培养瓶中,填充 3-4 mL 的增殖介质。
- 用加湿空气在5%CO2的培养箱中培养样品37°C。
- 观察PDL细胞生长后改变培养基。PDL细胞的出生长通常需要1-2周。通过逆相对比显微镜观察PDL细胞的外生长。
- 之后每周更改两次培养媒介。
- 当PDL细胞达到汇合时,亚培养细胞以1:4的比例(通道1)。
- 每天观察细胞生长,每周改变培养基两次。
- 在细胞达到80%汇合后,以1:4的比例执行每个后续通道。使用第三至第五代 PDL 细胞进行细胞播种。
2. 制作甲山电影
- 对于制备 1% (v/v) 醋酸溶液,在干净的玻璃烧杯中加入 5 mL 的醋酸到 495 mL 的双蒸馏水中。
- 对于制备 1% w/v 甲壳溶液,称量 5 g 的甲壳粉(平均分子量 400 kDa,85% 乙酰化度),并加入 495 mL 的 1% (v/v) 醋酸溶液。
- 在60°C下用搅拌棒和磁搅拌板搅拌制备溶液24小时。
- 高压灭菌准备的解决方案,以确保完全溶解甲体。
注: 实验可以在此阶段暂停。 - 要形成甲苯甲苯薄膜,在0.25 mL/cm2的组织培养聚苯乙烯(TCPS)菜肴中加入1%的w/v甲苯溶液。例如,在 24 孔板的一口井中加入 0.5 mL 的 1% w/v 甲基桑溶液。
- 在60°C的烤箱中干燥TCPS菜肴24小时,形成甲酸薄膜。
- 准备 0.5 N 氢氧化钠 (NaOH)。用磁搅拌棒将10克NaOH一次搅拌成大量双蒸馏水,然后稀释溶液,制成0.5升。
注:将 NaOH 添加到水中-不要向固体 NaOH 添加水。不要触摸 NaOH!它可能导致化学烧伤。 - 用 0.5 N NaOH 中和甲酸薄膜。将 0.5 mL 的 0.5 N NaOH 溶液添加到一口 24 孔板的 2 小时。
- 用双蒸馏水洗三次甲苯甲醚薄膜。
注: 实验可以在此阶段暂停。 - 在细胞播种之前,在室温下,在70%酒精中消毒用的24孔板。
- 在室温下用PBS冲洗三次甲涂板。
- 在室温下在紫外线下过夜,通过消毒甲体涂层板。
3. 细胞播种
- 预热增殖介质PBS溶液和胰蛋白酶/EDTA溶液至37°C。
- 从T-75细胞培养瓶中丢弃上清液。
- 用10 mL的PBS溶液清洗结汇PDL细胞。
- 放弃 PBS 解决方案。
- 在T-75细胞培养瓶中加入1mL的胰蛋白酶/EDTA溶液。
- 用胰蛋白酶/EDTA溶液孵育细胞3分钟,在37°C下。
- 通过在T-75细胞培养瓶中加入3mL增殖培养基来终止胰蛋白酶的消化过程。
- 将制备的细胞悬浮液转移到15 mL锥形离心管中。
- 在 300 x g和室温下将悬架离心 5 分钟。
- 从 15 mL 锥形离心管中丢弃上清液,并在 500 μL 增殖培养基中重新悬浮细胞颗粒。
- 使用血细胞计计数 PDL 细胞。
- 种子PDL细胞的密度为0.5 x 104,1 x 10 4,3 x 104和6 x 104细胞/cm2。
- 在加湿空气的5%CO2中,在37°C的培养箱中培养基托桑薄膜上的PDL细胞。
- 之后每周更改两次培养媒介。
- 在第1天、第2天、第3天、第4天和第5天,每天通过逆相对比显微镜观察细胞形态。
4. 细胞存活
- 经过1天、3天和6天的培养后,使用商业活力/细胞毒性试剂盒确定细胞的存活率。
- 在 15 mL 管中,通过涡旋 5 s,在 PBS 中制备 2 mM 钙素-AM 和 4 mM ethime 二聚苯酯新鲜溶液的 2 mL。
注:将流程保持在黑暗中。 - 去除培养基,洗涤PBS中的球形。
- 在PBS中孵育球体,含有2mM钙素-AM和4 mM甲醚,在黑暗中室温下孵育30分钟。
- 在 PBS 中冲洗球体两次。对于来自一口 24 孔板的球形,每次使用 2 mL 的 PBS。
- 使用荧光显微镜使用 10 倍或 20 倍放大倍率观察样品。
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Representative Results
利用本方案,成功形成可行的PDL细胞球体。图1显示,悬浮细胞或球体代替附着细胞主要在甲酮薄膜上观察到。对于0.5 x 104细胞/cm2的种子密度,在第1天和第3天偶尔发现附着的PDL细胞,很少观察到PDL细胞球体。相反,对于3 x 104和6 x 104细胞/cm2的种子密度,从第1天起就发现了不同大小的PDL细胞球体。PDL细胞球形形成从3天后从所有播种密度被观察。如图1所示,3 x 104细胞/cm2是最佳PDL细胞播种密度,因为PDL细胞球体的大小在此细胞播种密度下是均匀的。经过5天的培养,所有细胞的播种密度都形成较大的球体。悬浮的PDL细胞很少在5天被发现。
在1天、3天和6天后,对球体中PDL细胞的存活性进行了评估。如图2所示,球体中的大多数细胞在第1、3和6天是活细胞。而在第6天,死亡细胞的数量在中心部分增加。
图 1.PDL细胞球体的形态。
对于0.5 x 104细胞/cm2的种子密度,PDL细胞球体在第1天和第3天很少观察到。对于3 x 104和6 x 104细胞/cm2的种子密度,从第1天起就发现了不同大小的PDL细胞球体。PDL细胞球形形成从3天后从所有播种密度被观察。经过5天的培养,所有细胞的播种密度都形成较大的球体。悬浮的PDL细胞很少在5天被发现。刻度条:200 μm。这个数字已由Yan等人14日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.PDL细胞球体在甲体膜上的生存能力。
在1天、3天和6天后,对球体中PDL细胞的存活性进行了评估。如此所示,球体中的大多数细胞在第1天、第3天和第6天是活细胞。而在第6天,死亡细胞的数量在中心部分增加。刻度条:200 μm。这个数字已由Yan等人14日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
本研究引入了一种三维细胞培养系统,以克服与传统的2D单层细胞培养相关的一些限制。根据该协议,PDL细胞球体通过在甲酮薄膜上培养细胞而成功形成。我们先前的研究报告说,球形的形成增加了PDL细胞14的自我更新和成骨分化能力。PDL细胞球体不用酶从TCPS中采集细胞,只需将介质移液几倍14,就可以从甲酮薄膜中收获。因此,ECM 和细胞间结可以很好地保存。
该协议的关键步骤包括:(1)确保手术器械和甲酮膜为细胞培养进行灭菌;(2) 从根的中三部分刮取PDL,避免牙龈或牙龈组织的污染;(3)需要更高的细胞播种密度(+3 x 104细胞/cm2),以成功形成PDL细胞的球形。
然而,这种方法的一个限制是,在球形形成14后观察到PDL细胞增殖减少,这与以前对脂肪基质细胞10和肝细胞癌进行的一些研究相似。细胞线15.这可能是由于球体细胞和单层细胞16之间环素依赖激酶抑制剂的调节差异造成的。为了有利于临床应用,需要进一步研究促进细胞球体的增殖。
细胞球体的另一个缺点是核心扩散不足。虽然PDL细胞主要在球体培养中存活,但第6天球体的中心部分的死细胞数量有所增加。这种现象可能是因为当PDL细胞球体变大17、18时,球形核心中的氧和营养物质的扩散受到损害。
报告诱导细胞球体的其他方法包括非粘附表面19、微井20、微调瓶21、微图案表面22、23、悬垂24和A强制聚合技术25.与上述方法相比,甲山薄膜相对经济高效,易于复制。该方法的另一个优点是甲体26的抗菌性能,对体外细胞培养有显著益处。
总之,这里我们提出了基于甲体膜的详细3D细胞球体培养方案。PDL细胞球体的培养克服了与常规2D TCPS细胞培养相关的一些限制,因此可能适合生产PDL细胞,具有增强的疗效,为未来的牙周组织再生。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究由中国国家自然科学基金委员会(国家自然科学基金委员会81700978)、中央高校基础研究基金(1504219050)、上海自然科学基金(17ZR1432800)和上海医学探索项目()共同发起。17411972600)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| Cell culture flask 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| Chitosan | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85% |
| FCS | Gibco | 26140-079 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| PBS | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsin/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| 24-well plate | Corning | 3524 |
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